Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Феномен парадоксального снижения антивирусного действия ремантадина и ряда других карбоциклических соединений

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Феномен парадоксального снижения антивирусного действия ремантадина и ряда других карбоциклических соединений"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ ПОЛИОМИЕЛИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ

' Г"" На правах рукописи

УДК 578.832.1:578.282:578.287

ПАВЛОВА Наталья Ильинична

ФЕНОМЕН ПАРАДОКСАЛЬНОГО СНИЖЕНИЯ АНТИВИРУСНОГО ДЕЙСТВИЯ РЕМАНТАДИНА И РЯДА ДРУГИХ КАРБОЦИКЛИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ

03.00.06 — вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1993

О

Работа выполнена в Белорусском Ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларуси

Научные руководители: академик Российской АМН, профессор В.И.ВОТЯКОВ кандидат медицинских наук Е.И.БОРЕКО

Официальные оппоненты: член-корреспондент Российской АМН доктор медицинских наук профессор В.А.ЛАШКЕВИЧ

доктор биологических наук профессор Г.А.ТАЛЕРОВ

Ведущее учреждение: Институт вирусологии им. Д.И.Ивановского Российской АМН

Защита состоится 19эХ. в ^ ^

часов на заседании специализированного совета Д 001.27.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН России по ■ адресу: 142782, Московская область, п/о Институт полиомиелита.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН России >

Автореферат разослан "^^ 99^г.

Ученый секретарь Специализированного совета

О.А.МШЭДШНА

Актуальность проблемы.

С момента открытия противовирусных свойств амантадина и ремантадина усилия исследователей направлены на изучение механизма действия этих препаратов. На основании многочисленных данных сформировалось представление о том, что их активность проявляется на ранних стадиях Еирусной репродукции (Бубович В.И. и др., 1987; Козелецкая К.Н. И др., 1982; Bukrinskaya A.G. et al., 1982; Hay A.J, et al., 1985).

Одним из факторов, опрэделящих характер действия производных адамантана, является используемая концентрация. Рядом исследователей показано, что в малых количествах эти вещества селективно ингибируют размножение вирусов гриппа А, затрагивая М-белок, в больших - действуют по типу лизосомотропных веществ, подавляя репродукцию многих оболочечных вирусов (Бубович В.И. и др., 1987). В промежуточном диапазоне нетоксических концентраций отмечается снижение антивирусного действия этих препаратов (Вотяков В.И. и соавт. 19Э1, 1982, 1984; Soiioltissek С. et al. 1979). При этом причина такой необычной дозовой зависимости признается неизвестной (Hay A.J. et al. 1986).

До настоящей работы этот факт практически не изучался. Вместе с тем его углубленное исследование имеет существенное значение. Новые синтетические соединения ряда адамантана, как и карбоциклические структуры в целом, остаются перспективным источником ингибиторов возбудителей целого ряда вирусных инфекций (Вотяков В.И., Галегов Г.А., 1983; Индулен М.К. и др., 1986; Бореко E.IÍ. и др., 1989). В связи с этим изучение особенностей их антивирусного действия необходимо для правильного понимания роли ингибиторов этого класса в подавлении вирусопосредовэнних процессов на различных уроЕнях организации биологических струн-

тур. Не меньшее значение такое исследование имеет для разработки новых противовирусных средств на основе производных карбоцикли-ческого ряда.

Цель и задачи исследования.

Цель работы заключалась в выявлении закономерностей антивирусного действия ремантадина и других карбоциклических соединений в диапазоне нетоксических концентраций, превышающих максимально аффективную.

Основные задачи работы состояли в следующем: I). определить границы диапазона концентраций ремантадина, в пределах которого выявляется снижение антивирусного действия с увеличением используемых доз; 2) выявить распространенность этого явления в экспертов нтах с различными штаммами вирусов гриппа, парамиксовирусом, различными клеточными культурами и противовирусными веществам! различных химических классов; 3) исследовать возможность проявления снижения эффективности ремантадина на куриных эмбрионах.I лабораторных животных; 4) изучить функциональные особенности ви руса гриппа, репродуцировавшегося в присутствии ремантадина : концентрациях, превышающих максимально эффективную; 5) выявит структурные особенности данного вируса.

Научная новизна.

Показано, что особенностью антивирусного действия реманта дина является снижение эффективности в нетоксичных концентрат: ях, .превышающих максимально ингибирующую. Впервые установлено что подобная зависимость эффекта от дозы характерна также д; ряда известны-х и оригинальных веществ карбоциклического строеш с противовирусными свойствами и не проявляется в экспериментах ингибиторами других химических групп (серу-, германийсодержаиц органические соединения, производные акридина, нуклеозиды и др:

гие гетероциклические вещества). Снижение антивирусного действия ремантадина в упомянутых концентрациях установлено в различных лабораторных тест-системах с вирусами гриппа А, В и впервые - с РС-вирусом. Также впервые этот эффект зарегистрирован в экспериментах на куриных эмбрионах и лабораторных животных.

Учитывая, что исследуемая особенность антивирусного действия характерна для соединений определенного строения и воспроизводится в различных тест-системах, известные и полученные нами факты обобщены как феномен парадоксального снижения антивирусного действия веществ карбоциклического строения.

Выделен вариант вируса, репродуцирующийся в присутствии нетоксичных концентраций ремантадина, превышающих максимально ин-гибирующую. Разработан способ его получения и впервые установлены структурно-функциональные отличия от исходного гту.

Практическая значимость работы.

Полученные научные данные дополняют сложившиеся в химиотерапии вирусных инфекций представления о характере действия известных противовирусных препаратов. Возможность проявления описанного в работе феномена следует учитывать при разработке и поиска новых противовирусных препаратов карбоциклического ряда. Это нашло отражение в методических рекомендациях "Первичное изучение антивирусных свойств синтетических и природных соединений" (Минск, 1986) и используется в повседневной практической работе лаборатории доклинического изучения специфической активности ин~ гиб. торов вирусов БелНШЭМ.

Основные положения, выносимые на защиту.

I) Феномен парадоксального снижения антивирусного действия карбоциклических веществ с противовирусными свойствами и его проявление в различных лабораторных тестах с представителями се-

- и -

мвйств орто- и парамиксовирусов. 2) Структурно-функциональные отличия вируса, репродуцирующегося в присутствии нетоксических концентраций ремантадина, превыыаюидах максимально действущую, от исходного ГРУ.

Апробация работы.

Материалы по теме диссертации доложены на Всесоюзных конференциях, приуроченных к заседаниям проблемных комиссий "Химиотерапия и химиопрофилактика вирусных инфекций; особо опасные и медленные (вирусные) инфекции" (Минск, 1988), "Грипп и гриппопо-добные заболевания, их профилактика и лечение" (Ленинград, 1989), а также на Всесоюзной конференции "Перспективы развития химии каркасных соединений и их применение в народном хозяйстве" (Куйбышев, 1989), Всесоюзном симпозиуме "Новые подходы к химиотерапии вирусных инфекций" (Рига, 1939), XX Всесоюзном симпозиуме по целенаправленному изысканию лекарственных вещестЕ (Рига, 1991 ).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 8 работ, получены 1 авторское свидетельство СССР на изобретение, изданы 1 союзные методические рекомендации.

Объем и структура работ.

Диссертация изложена на 140 с. машинописного текста, иллюстрирована 13 рисунками и 17 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав собственных исследований, обсу-адения результатов, выводов и списка литературы, Еключающего 213 источников.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы.

В работе использовали Еирусы гриппа типа A: FPV/Rostook/34 ;H7N1), A/Bangkook/1 /79 (H3N2), А/СССР/05/80 (H3N2), A/Aiohi/2/ i8 (H3N2), А/Т ехав/1 / 82 (H1N1 ) И B/Hong Kong/75, полученные ИЗ 'осударственной коллекции вирусов (Институт вирусологии им. [.И.Ивановского Российской АМН), FPV/Weybridge (Н7Н7) из НШ ¡ирусных препаратов, а также респираторно-синцитиальный вирус ,'Long) из ВНИИ гриппа Минздрава России. В качестве представителя :емейства Orthomysoviridae для большинства экспериментов исдаль-ювали fpv/Rostook. RDse-вариант fpv получали размножением fpv/ tostook в присутствии 10-20 мкг/мл ремантадина (внесение прэ-гарата после инфицирования); резистентный к действию ремантадина ¡TV - многократным пассированием в присутствии возрастающих кон-дентраций препарата; материал fpv, обогащенный ДИ-частицами, -гассированием неразведенной культуральной жидкости.

Эксперименты с fpv выполняли на монослойных культурах ФЭК, : остальными вирусами гриппа - на mdcx, с PC-вирусом - на kl-эз.

В качестве основного представителя веществ карбоцикличес-юго строения использовали гидрохлорид а-метил-1-аминометилада-лантана (ремантадин) из Института органического синтеза АН Натвии (ИОС). Изучали также гидрохлорида 1-аминоадамантана (амантадин) и а-этил-1-аминометиладамантана (адапромин) произ-зодства экспериментального завода ИОС, гидрохлорид '-аминометил)-бицикло [2.2.1]гептаня (дейтифорин), синтезированный в Институте органической химии АН Украины, гидрохлорид х-метил-1 -аминометилциклогексана из Института Физико-органической химии АН Республики Беларуси, гидрохлорид 5.5.6-триметилби-дикло[2.2.1Згепт-2-ил-амина, синтезированный в БелНШЗМ Мин-

здрава Республики Беларуси, другие алициклические производные из разных учревдений.

Вещества других химических классов представлены i-ß-D-ри-бофуранозил-1 ,г,4-триазол-з-карбоксамидом (рибавирин) из ИОС, оригинальными серо- и германийсодержащими соединениями из Иркутского Института органической химии СО АН России, производным акридина из ВНИХФИ, другими оригинальными гетероциклическими веществами.

Противовирусный аффект на клеточных культурах исследовали методами "скрининг-тест" и редукции количества бляшек, на куриных эмбрионах и лабораторных жиеотных - известными методами (Ильенко В.И., 1977). ЛД50 определяли графически методом пробит-анализа (Беленький М.Л., 1963). Инфэкционность и гемагглютиниру-одую активность вариантов fpv определяли общепринятыми методами, нейраминидазную активность - по Warren z. (1959). Способность интерферировать с исходным fpv исследовали, используя различные модификации известного теста (Spindler K.R., Holland i.i., 1982; Frieiie D.w et al., 1984). Концентрирование и очистку вируса проводили центрифугированием в разноплотностных растворах тарт-рата калия (Kingßbury D.w., 1966). Препараты цитоплазматических мембран инфицированных клеток получали методом, описанным Klenk N.D. (1983). Количество белка в вирусных препаратах определяли методом Lowry о.н. et al. (1951). Количественное соотношение белков вирусов определяли сканированием полипептидного профиля в ПААГ (Laemmii U.K., 1970). Морфологию вирионов исследовали на микроскопе ли- юосх методом негативного контрастирования (Brenner S., Hörne R.W., 1959). Изоплотностной анализ вирусов проводили в линейном градиенте урографина.

Зависимость антивирусного действия некоторых производных кар-Социклического ряда от концентрации в различных тест-систеиах.

Противовирусную активность ремантадина исследовали в экспериментах на культурах клеток, куриных эмбрионах и лабораторных животных. Методом редукции количества бляшек показано, что в зависимости от концентрации препарат обладает двояким характером действия (табл. 1).

Таблица 1

Сравнительная характеристика противовирусной активности ремантадина и рибавирина в отношении РРУ/нов1;оок:

Название Концентра- Титр ви- Разница

ция, мкг/ руса,^ БОЕ/мл 4 с контро-

мл лем, 1е БОЕ/мл

Ремантадин

50 25

12,5 6,25 0,78 0,1 0,01 0

6,46x0,08 6,41±0,05 6,37±0,04 6,02±0,07 4,60±0,Н 4,87±0,07 6,45±0,05 6,69±0,04

0,23 0,28 0,32 0,67 2,09 1,81 0,24

Рибавирин

400 200 100 50 25

12,5 6,25 О

<4,0 <4,0 <4,0 4,54^,07 5,13±0,02 6,44±0,16 6,57±0Д0 6,60*0,02

>2,6 >2,6 >2,6 2,06 1,47 0,25 0,03

» - максимальная перекосимая концентрация (МЛН). Примечание: клетки ФЭК инфицировали 0,00003 БОЕ/клетка вируса, препарат включали в состав агарового покрытия.

С одной стороны, в низких концентрациях (от 1/5000 до 1/5< МПК), он- ингибирует размножение РРУ/Иов^ок, с другой стороны, при повышении 'доз от максимально ингибиругацей (0,78 мкг/мл) дс максимальной переносимой концентрации (50 мкг/мл) вновь наблюдается размножение вируса.

Поскольку снижение антивирусного действия препарата регистрируется в диапазоне нетоксических (или субтоксических) концентраций, превышающих максимально ингибируюцую, он обознач&1 нами как диапазон субтоксических надингибирующих (виЪ1;ох1< Бирга1гЛ1ЪЗЛогу) концентраций, или, сокращенно, вв.

При исследовании методом "скрининг-тест" снижение противовирусного действия проявляется в виде зоны четких бляшек вокру: источника ремантадина. Изменение размера и четкости бляшек пр] приближении к источнику препарата имеет место и в случае инфицирования ремантадннустойчиЕым вариантом ГРУ.

Такая же зависимость противовирусного эффекта от концентра ции установлена с амантадином, адапромином, дейтифоринил, гидрохлоридом а-метил-1-аминометилциклогексана, гидрохлоридом 5.5.6 триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил-амина, другими алициклическим: веществами.

Для сравнения исследованы представители других химически классов: известный препарат ряда нуклеозидов рибавирин, ориги нальше серо- и германийсодержащие соединения, производное акри дина, другие гетероциклические вещества. Показано, что с увели чением концентрации наблюдается нарастание противовирусного дей ствия утих веществ, причем уровень его не меняется после дости жения максимально активной дозы (в таблице приведены данные, по лученные с рибавирином). . .

Таким образом, снижение антивирусного действия в нетокси

ческих концентрациях, превышающих максимально ингибируюцую, характерно для соединений карбоциклического строения.

Описанная Ешие дозовая зависимость антивирусного действия ремантадина зарегистрирована также в экспериментах с вирусами гриппа А/Бап^1соок/1 /79, А/СССР/05/80, А/Техав/82, Ъ/Нотщ Коп^/75 и респираторно-синцитиальным. Значение максимально действующей концентрации и диапазоны доз ингибирования при этом значительно варьируют, что определяется чувствительностью Еирусов к действию препарата.

Следует подчеркнуть, что описанный Еыше характер действия ремантадин приобретает при внесении после инфицирования клеточной культуры. В случае обработки клеток ингибитором до инфицирования снижение антивирусного действия не имеет места. о рру/йоз-^ок установлено, что все концентрации ремантадина в диапазоне от 0,01 до 50 мкг/мл (от 1/50 до 1 МПК) при этом являются высокоактивными.

Снижение эффективности ремантадина в пределах диапазона нетоксических доз выявлено и в экспериментах на куриных эмбрионах. Так, ремантадин, введенный через I час после шфицирования в дозах о,5 - 1,5 мг/эмбрион, ингибирует размножение вируса А/А1оМ/ 2/68. В более высоких дозах (2,0-- 4,0 мг/эмбрион) зарегистрировано снижение антивирусного действия препарата.

В экспериментах на животных установлена такая же зависимость лечебного эффекта препарата от использованной дозы. Раст-Еоры ремантадина вводили белым мышам внутрижелудочно через 24 час после инфицирования и в последующие 5 дней один раз в сутки. Наиболее выраженный защитный эффект установлен при применении препарата в дозе 50 - юо мг/кг/сутки. Снижение летальности животных, инфицированных ю ЛДад вируса, составляет 70$, инфлциро-

ванных юо ДД50 вируса - ъо%, снижение титра вируса в легких достигает 1,э ig Э«'Щ50. Доза юо мг/кг/сутки является границей, выше которой следует снижение эффективности препарата, сопровождающееся размножением Еируса в легких до уровня контроля без лечения. препарата для животных, инфицированных юо ЛД50

вируса, составляет 115(253+52) мг/кг, для инфицированных ю ЛД50 вируса - 185(265+127) мг/кг, для неинфицкрованных животных -440(580+333) мг/кг.

Таким образом, полученные данные позволяют считать, что снижение антивирусного действия в нетоксических концентрациях, превышающих максимально действующую, является общим свойством ингибиторов вирусов карбоциклического строения. Распространенность среди производных определенного класса, воспроизводимость в различных тест-системах дают основание определить это сеойство как феномен парадоксального снижения антивирусного действия.

Дальнейшие исследования посвящены изучению свойств вируса, репродуцировавшегося в присутствии ремантадина в упомянутом диапазоне доз. Данный вирус назван Юев-вариантом fpv (вариант еи-руса, полученный в присутствии ss-концентраций ремантадина).

Характеристика основных свойств вируса гриппа, полученного в присутствии ремантадина в нетоксических концентрациях, превышающих максимально эффективную.

Свойства fpv и его вариантов определяли непосредственно в культуральной жидкости, а также в очищенных и концентрированных препарзтах. Установлено значительное снижение инфекционной, гем-агглютинирующей и, в меньшей степени, нейраминидазной активности RDbb-варианта по сравнению с исходным и ремантадинрезистентным вирусами (табл. 2).

Таблица 2

Характеристика fpv и его вариантов

Вариант Инфекци-

FPV/Rostook онность, lg БОЕ/мкг

Гемагглюти- Нейрамини-нирующая даэная ак~ активность, тивн., мкМ log, ГАЕ/МКГ NANA/МИН/МКГ

RDss

2,06±0,38 4,73±0,355 0,0000155t 0,0000095

Исходный

4,14±0,26 8,83±0,44 0,0000245± О,"000142

Ремантадин-

рвзистентный 4,56±0,29 8,43±0,60 0,000022± (fpvr) 0,00001

Обозначение: nana - N-ацеталнейрамшовая кислота.

Наряду с этими изменениями установлена способность RDss-варианта вируса интерферировать с исходным fpv. Наиболее высокий уровень интерференции (84,5%) имеет место при одновременном инфицировании клеточной культуры. Для сравнения определена степень интерференции fpv, обогащенного ДИ-частицами, и стандартного вируса (13,1%) а также межшгаммовая интерференция fpv/ Rostock И fpv/Weybridge (90,9%).

Кроме того, зарегистрировано, что RDes-вариант хуже размножается при 40°С в сравнении с 33°. После 16 - 20 час инкубации инфицированной клеточной культуры при 33° и 40° разность инфекционных титров достигает i,? lg БОЕ/мл, гемагглютинирунцей активности - 2,2 iog2 ГАЕ/мл. Размножение fpv, устойчивого к действию ремантадина, незначительно затруднено также при температуре 40°. Для исходного fpv различия при таких условиях инкубации несущественны.

Исследована чувствительность вариантов fpv к температурному воздействию. Прогревание при бо°С приводам к резкому снижению

гемагглютинирующей актирности М)вв-варианта и ремантадинрези-стентного вируса ухе через 30 - 60 мин и к полному ее исчезновению через 2 час. В то же время исходный рру даже через з час сохраняет 50& исходной гемагглютинирующей активности.

При изучении чувствительности к ремантадину установлено, что новй-вариант, полученный при инфицировании клеточной культуры исходным гру, становится более устойчивым к действию препарата. В среднем максимальное снижение титра для него на 0,61 БОЕ/мл ниже, чем для рру, а средне эффективная доза препарата -выше в 146 раз.

В то же время, у Щ)зз-варианта, родительским для которого является ремантадинустойчивый рру, зарегистрировано повышение чувствительности к действию ремантадина. Об этом свидетельствует возрастание величины максимального снижения титра в среднем на 0,34 1« БОЕ/мл и уменьшение средне эффективной дозы в 4,65 раз.

Известны литературные данные о быстрой, в. ходе одного пассажа, выработке резистентности вируса гриппа к производным ада-мантана (Владыко А.С. и др., 1982; Соойгап К.«, et а1., 1965). Поэтому снижение чувствительности к ремантадину Вдвв-варианта, полученного из исходного рру, можно объяснить пассированием в присутствии препарата. В то же время повышение чувствительности к препарату ковз-варианта из ремантадинустойчивого РРУ объяснить литературными данными не представляется возможным. По-видимому, приобретение устойчивости в одном случае и ее утрата в другом -могут свидетельствовать о наличии изменений в структурах ЯЛее-варианта, связанных с признаком ремантадинрезистентности.

Исследована чувствительность шзвв-варианта к рибавирину. Клеточную культуру, инфицированную уру или его ремантадинустой-чибым вариантом, обрабатывали ремантадином в концентрациях, спо-

собствутцх образованию га>5з-варианта. Одновременно вносили ри-бавирин. В присутствии только рибавирина (бе? ремантадина) полное подавление размножения обоих вирусов зарегистрировано в концентрации 25 мкг/мл. Характерно, что препарат в данной концентрации не проявлял такого ингибирующего эффекта при одновременном внесении ремантадина. Это свидетельствует об устойчивости образовавшегося яовз-варианта к рибавирину.

Аналогичные результаты получены методом "скрининг-тест" при установке на чашку источников ремантадина и рибавирина. При полном подавлении образования вирусных бляшек в пределах области сочетанного действия препаратов зона размножения Тозз-варианта сохранялась.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о ряде свойств юбв-варианта, отличающих его от исходного рру. Многие признаки ШЭзв-варианта, такие как тенденция к темлературочувст-вительности, термолабильность гемагглютинина, устойчивость к действию ремантадина, характерны и для ремантёдинустойчивого КРУ. Однако от последнего ШЗвв-вариант отличается сниженной инфекционной, гемагглютинирующей и нейраминидазной активностью и устойчивостью к действию рибавирина.

Структурные особенности мн*- варианта гру.

Отличия щэзз-варианта от исходного вируса могут быть обусловлены структурными изменениями. Об этом прежде всего свидетельствуют плотностные характеристики вариантов РРУ. Плавучая плотность козз-варианта в градиенте урогрзфина* составляет 1,20 г/см3. У ремантадинустойчивого и исходного рру сна равна 1,175 и 1,18 г/см3 соответственно.

При изучении структурных белков выявлено, что у

RDss-варианта снижено количество гемагглютинина и М-белка,. нарушено соотношение нерасщепленного гемагглютинина и гликопротеинов НА1 И НА2 (табл. Э).

Таблица э

Количественное соотношение белков различных вариантов fpv

Вариант FPV/Rostook Полипептиды

НА НА1 НА2 M NP

RDes 0,50 0,64 0,24 0,44 1

Исходный 0,30 1,04 0,39 0,66 1

Ремантадин-устойчивый 0,22 1.12 0,25 0,67 1

Примечание: за 1 принято содержание белка мр.

При электронномикроскопическом исследовании установлено, что RDsa-вариант вируса имеет морфологические отличия от исходного ppv, заключающиеся в сниженной плотности шипов гликопротеинов на поверхности вирионов.

Поскольку для -RDss-варианта fpv характерно сниженное количество М-белка, выполняющего роль структурирующего компонента (Букринская А.Г., 1985), возможной причиной количественного изменения гликопротеинов может явиться повышенная хрупкость вирионов. Это должно отразиться на структуре вируса, подвергающегося достаточно жестким воздействиям в процессе очистки и концентрирования. вНацш данные свидетельствуют о повышенной чувствительности BDss-варианта к препаративной обработке, в результате которой полученный вирус сохранял в 5-ю раз меньше первоначальной гемагглютинирующей активности, чем исходный и ремантадинре-зистентный ppv. Такие же свойства описаны для вируса гриппа, по-

лученного в условиях абортивной инфекции (Асадуллаев Т.А., 1986).

Характер структурных изменений вирионов №вв~варианта КРУ и тенденция к температурочувствительности позволили предположить, что одной из возможных причин выявленных отличий, по аналогии С ts-мyтaнтaш (ЭсЬсаизеек С. et а1., 1984; Раипа1к А.К. ег а1., 1986), может быть нарушение транспорта гемагглютинина в клетке к гладким мембранам и клеточной поверхности Например, для известного гз-мутанта вируса гриппа а/у/бн блокирование выхода гемагглютинина из шероховатого эндоплазматиче ского ретикулума в аппарат Гольдки при непермиссивной температуре приводит к образованию вирионов, содержащих менее о,2# гемагглютинина от количества, присутствующего на поверхности вирионов дикого типа (Раипа1к А.К. et а1., 1986).

В наших исследованиях при анализе фракций препаратов гомогенизированных клеток в ступенчатом градиенте плотности сахарозы обнаружено, что у исходного уру с шероховатыми мембранами связано 2,3$ гемагглютинирующей активности, у ЮзБ-варианта -г 5.ей. Основное же количество гемагглютинина, и приблизительно в равных соотношениях, у всех вариантов рру ассоциировано с гладкими мембранами.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о существенных структурных отличиях иззз-варианта от исходного рру, а также от вируса, устойчивого к действию ремантадина. Условия получения и комплекс специфических признаков дают основание считать исследуемый вариант самостоятельной дефектной формой вируса гриппа.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что некоторые ингибиторы вируса гриппа характеризуются наличием диапазона нетоксичных доз, превышающих максимально эффективную, в пределах которого наблюдается ослаб' ление противовирусного действия с увеличением концентрации вещества. Распространенность этого свойства среди соединений определенного строения и воспроизводимость в различных тест-системах позволяют определить его как феномен парадоксального снижения антивирусного действия. Необходимым условием проявления феномена является инфицирование биологической системы перед внесением ингибитора.

2. Показано, что снижение антивирусного действия в диапазоне концентраций от максимально ингибирующей до максимальной нетоксичной характерно для синтетических соединений карбоцикличес-кого строения: амантадина, ремантадина, дейтифорина и других производных этого ряда и не регистрируется в экспериментах с ингибиторами размножения вируса гриппа других классов химических вер'чств (серу-, германийсодержащие органические соединения, производные акридина, нуклеозиды и другие гетероциклические вещества).

3. Феномен парадоксального снижения антивирусного действия ремантадина выявляется различными методами лабораторного тестирования на культурах клеток ФЭК, ьюск, м>33, на куриных эмбрионах и лабораторных животных с вирусами гриппа А различной антигенной формулы, вирусом гриппа В, РС-вирусом.

4. В экспериментах на белых мышах, инфицированных 10-100 ДЦзд вируса гриппа А/А1оЬ1/2/6э, феномен проявляется в виде снижения лечебного эффекта ремантадина в дозах более 100 мг/кг массы (максимально эффективная доза), сопровождающегося повышением

летальности животных вследствие усиления репродукции вируса в легких и увеличения интенсивности пневмоний.

5. Вирус, репродуцирующийся в присутствии 10-20 мкг/мл ремантадина (концентрации максимального ослабления действия препарата), отличается от исходного уру сниженной инфекционной, гем-агглютинирующей и нейраминидазной активностью, тенденцией к зависимости размножения от температурных условий, сниженной чувствительностью к действию ремантадина и рибавирина, "н способен интерферировать с рру. Его структурные особенности заключаются в уменьшении количества М-белка и гемагглютинина, неполном расщеплении гемагглютинина.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАКУ1, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Карако Н.И., Бореко Е.И. Повышенная чувствительность животных, инфицированных вирусом гриппа, к токсическому действию ремантадина // Химиотерапия и химиопрофил. вирус, инфекций. Особо опасные и медленные инфекции: Сб. мат. проблем, комиссии.-Минск, 1985.- С. 50 - 52.

2. Вотяков В.И., Бореко Е.И., Владако Г.В., Карако Н.И., и др. Первичное изучение антивирусных свойств синтетических и природных соединений: Методические рекомендации.- Минск, 1986,24 С.

3. Бореко Е.И., Карако Н.К., Кириллов В.А., Вотяков В.И. Сравнительная структурно-функциональная характэристика вариантов вируса гриппа с различной чувствительностью к ремантадину // Abstr. 7-th Int. Symp. on Antiviral Subst. Oot. 12-14 1987.- Varna, Bulgaria, 1987.-P. 41.

4. Карако Н.И., Бореко Е.И., Кириллов В.А., Вотяков В.И. Изменение вируса гриппа при размножении в присутствии высоких концентраций ремантадина // Вопр. вирусол.- 1989.- N 1.- С. 43 -46.

5. Бореко Е.И., Карако Н.И. Модификация вирусов в присутствии карбоциклических соединений с противогриппозными свойствами // Перспективы развития химии каркасн. соединений и их применен, в нар. хоз.: Тез. докл. Всесоюз. науч. конф. 19-21 апреля 1989.- Куйбышев. 1989.- С. 7.

6. Бореко Е.И., Карако Н.И., Вотяков В.И. Температуро-чувствительность и интерферирующая способность варианта вируса гршша, полученного в присутствии высоких концентраций ремантадина // Новые подходы к химиотерапии вирус, инфекций,- Рига:

Зинатне, 1991С.' 115-122.

7. Бореко Е.И., Карако Н.И. Репродукционная способность и чувствительность к действию ремантадина потомства вариантов вируса гриппа, измененных под влиянием высоких концентраций ремантадина // Тез. докл. Всесоюз. симп. целенаправл. изысканию лекарств. веществ 22-24 янв. 1991.- Рига, 1991С. 79.

8. А. С. 1751204 СССР. МКИ5 С 12 N 7/00, С 12 Q 1/70. Способ получения ремантадинзависимого варианта вируса г^чппа / Бореко Е.И., Павлова К.И., Вотяков В.И., Рытик П.Г. (СССР).- ю е.: ил.

9. Boreko E.I., Karako N.I., Votyakov V.I. Influenza virus modification during reproduotion in ohicken embrlo cells in the presence of high concentrations of rimantadine // Abstr. 6-th Int. Symposium on Antiviral Subst. May 20-24 1985.- Smolenice, Chechoslovakia, 1995.- P. 19.

10. Boreko E.I., Pavlova N.I., Nikolaeva S.N., Votjakov V.I. Paradoxal effect or antiviral carbocyclic substances in subtoxic concentrations // Antiviral Research Proceeding of Internat. Conf. for Antiviral Res. Apr. 25-30 1993.- Venice, Italy, 1993.-P. 129.