Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фенольные соединения каллусной ткани солодки голой и регуляция их биосинтеза

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Валиева, Райля Далифовна, Уфа

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УФИМСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ОТДЕЛ БИОХИМИИ И ЦИТОХИМИИ

На правах рукописи УДК 581. 143.6.

В АЛИЕВА РАЙЛЯ ДА ЛИФ ОВНА

Фенольные соединения каллусной ткани солодки голой и регуляция их биосинтеза

(03. 00. 12. - Физиология растений)

ДИССЕРТАЦИЯ На соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

кандидат биологических наук А. Г. Мардамшин Научный консультант: доктор химических наук, профессор Ю. И. Муринов

Уфа -1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

Введение 4

1. Обзор литературы 8 1.1. Культура изолированных клеток и тканей

растений - продуцент веществ вторичного метаболизма 8 1. 2. Солодка - источник биологически активных веществ in vivo

и in vitro 10 1.3. Физические и физиологические факторы регуляции процесса

биосинтеза фенольных соединений в культуре in vitro 15

1.3. 1. Свет 15

1.3.2. Регуляторы роста 18

1. 3. 3. Минеральные элементы 22

1. 3.4. Другие факторы физиологической регуляции

i. •• • ••••

вторичного метаболизма •. г ♦ • 25

1. 4. Генетическая регуляция вторичного метаболизма 27

1.4. 1. Сомаклональная изменчивость 27

1. 4. 2. Клеточная селекция 33

1.5. Антибиотическая активность фенольных соединений 37

2. Объект и методы исследований 42

2. 1. Объект исследований 42

2.2. Получение и условия культивирования каллусной ткани 42

2. 3. Условия стерилизации 44

2. 4. Методы исследований 44

2. 4. 1. Определение прироста сырой биомассы 44

2. 4. 2. Определение сухого веса каллуса 45 2. 4. 3. Определение суммарного содержания фенольных соединений 45

2. 4. 3. 1. Спектрофотометрический метод 45

2. 4. 3. 2. Хроматографический метод 46 2. 4. 4. Определение фунгицидной активности

экстрактов каллусов 46

2. 4. 5. Статистическая обработка данных 47

2. 4. 6. Использованные реактивы 47

3. Результаты исследований и их обсуждение 49

3.1. Получение линий каллусной ткани 49

3.2. Анализ зависимости прироста сырой биомассы каллусов и накопление в них фенольных соединений 54

3.3. Регуляция образования фенольных соединений в каллусной ткани солодки голой 61

3.3. 1. Синтез полифенолов и регуляторы роста 61 3. 3. 2. Связь между скоростью роста каллусной ткани и содержанием

фенольных соединений 64 3.3.3. Зависимость накопления фенольных соединений

от консистенции каллусной ткани 66

3.3.4. Действие света и концентраций азота и фосфора в среде на

биосинтез полифенолов

3.3.5. Влияние длительного культивирования каллусных

тканей на содержание фенольных соединений 3.4. Фунгицидная активность экстрактов каллусных тканей Заключение Выводы

Список литературы Приложения

67

73 80 85

87

88 ИЗ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Солодковый корень является общепризнанным источником лечебных средств медицины многих народов мира. Экстракты корней солодки обладают антибиотическими, противовирусными и антиоксидантными свойствами, однако, их фунгицидная активность мало изучена. Из корней солодки изготавливаются различные препараты, обладающие отхаркивающим, противоязвенным, противовоспалительным, антисептическим и другими свойствами (Машковский, 1993). Это обусловлено присутствием в ее составе комплекса биологически активных веществ, число которых доходит до 48. Из них значительная часть приходится на тритерценовые сапонины и фенольные соединения - флавоноиды и изофлавоноиды (Ам-мосов, Литвиненко, 1995).

Корни лакрицы всегда имели большой спрос как на внутреннем, так и на внешнем рынке. Экспорт сырья из этого растения в отдельные годы достигал 30 тыс. тонн. Однако в результате длительной эксплуатации естественные запасы солодки в настоящее время заметно сократились. В местах интенсивной заготовки сырья резко уменьшилось содержание глицир-ризиновой кислоты в корнях (Худайбергенов, 1990). Поэтому в настоящее время разрабатываются технологии семенного, вегетативного и микрокло-нального размножения. Особый интерес представляет использование метода культуры клеток и тканей для разработки экономически оправданных технологий промышленного производства продуктов из солодки. Основанием для таких разработок являются особенности культивируемых клеток растений, выражающиеся в их способности синтезировать соединения, характерные для целого растения или совершенно новые вещества, которые не образуются в интактном растении, а также биотрансформировать дешевые предшественники биосинтеза в ценный конечный продукт (Бутенко, 1986). Однако, как правило, в каллусных и суспензионных культурах про-

исходит снижение содержания соединений вторичного метаболизма. Использование различных факторов, таких как, регуляторы роста, свет, температура, введение в среду предшественников, обработка элиситорами и др. может привести к повышению содержания искомого вещества. К 1991 году были известны клеточные культуры около 15 видов растений, являющихся суперпродуцентами ценных прдуктов (Носов, 1991).

Целью настоящей работы являлось получение линий каллусной ткани солодки голой (Glycyrrhiza glabra L.) с повышенным содержанием фенольных соединений и высокой скоростью роста.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

- получение путем поддерживающего отбора линий каллусной ткани солодки голой - продуцентов фенольных соединений;

- изучение влияния различных факторов на образование полифенолов в каллусной ткани;

- анализ содержания основных групп фенольных соединений каллусных тканей солодки.

Научная новизна.

В культуре клеток солодки голой получены линии каллусных тканей, обладающие высоким содержанием фенольных соединений.

Изучено влияние различных факторов на накопление полифенолов в каллусных тканях. Установлено, что уменьшение (двухкратное) азота и фосфора в питательной среде способствует увеличению содержания полифенолов в каллусах. Показано, что более интенсивный прирост сырой биомассы каллусов наблюдается при их культивировании на свету.

Установлено, что в состав фенольных соединений каллусной ткани солодки входят флавоны, изофлавоны, флавононы, изофлавононы и фла-вонолы, халконы не обнаруживаются.

Практическая ценность.

Результаты исследований расширяют представления об обмене фе-нольных соединений в культивируемых клетках растений и влиянии различных факторов на этот процесс.

Полученные линии каллусных тканей солодки голой с повышенным содержанием полифенолов и высокой скоростью роста могут быть рекомендованы как исходное сырье для промышленного получения фенольных соединений.

Апробация работы.

Материалы диссертационной работы докладывались на II Международной конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология" (Алматы, 1993); на III Съезде Всероссийского общества физиологов растений (С.- Петербург, 1993); на ежегодном отчете по программе "Новейшие методы биоинженерии" (Москва, 1994); на II съезде Биохимического общества РАН (Москва, 1997), на международной конференции "Состояние и перспективы развития биотехнологии растений" (Алматы, 1997).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 12 работ.

Автор выражает искреннюю признательность научному руководителю к.б.н. А. Г. Мардамшину, научному консультанту д.х.н., профессору Ю. И. Муринову за всестороннюю помощь на всех этапах работы. Я также благодарна бывшим сотрудникам лаборатории биотехнологии растений Отдела биохимии и цитохимии УНЦ РАН Д.Ф. Ильгуловой и С.А. Шай-хутдиновой, сотрудникам лаборатории координационной химии ИОХ УНЦ РАН к.х.н. , с.н.с. О. А. Колядиной и м.н.с. С. Б. Денисовой за помощь в проведении анализов. Благодарю своих коллег Н. А. Уразбахтину,

Г. Г. Шарафутдинову, С. В. Чибиряева, а также моих родных и близких за моральную поддержку и помощь в процессе работы.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Культура изолированных клеток и тканей растений -продуцент веществ вторичного метаболизма.

Наряду с белками, жирами и углеводами в тканях растений образуются и нередко накапливаются в значительных количествах вещества, характерные только для растений. Это так называемые вещества вторичного обмена. К ним относятся алкалоиды, эфирные масла, смолы, полифенолы, регуляторы роста и многие другие соединения. Вторичные метаболиты растений часто являются носителями высокой биологической активности и имеют большую практическую значимость. Они успешно применяются в медицине, парфюмерии, пищевой промышленности, в сельском хозяйстве. По данным на 1994 год идентифицировано более 30 тыс. вторичных продуктов растений (Березнеговская и др., 1978; Носов, 1994). Однако нет полной ясности по поводу физиологических функций вторичных метаболитов и их жизненной необходимости для растений. Для изучения этой проблемы может применяться метод изолированных клеток и тканей, который позволяет исследовать обмен веществ высших растений на клеточном уровне. Как модельная система, культура клеток и тканей позволяет изучать такие вопросы, как соотношение между ростом и развитием клетки с одной стороны и образование, накопление в ней метаболитов- с другой. Облегчается также изучение влияния различных факторов на синтез вторичных метаболитов (Березнеговская и др., 1978).

История изучения вторичного метаболизма в культуре клеток растений начинается с 1940 г. , когда Дж. Боннер сообщил о синтезе каучука клетками гваюлы (цит. по Носову, 1994). Начало 70-х годов стало поворотной точкой в технологии культивирования клеток. В это время возросло число сообщений о синтезе значительного количества вторичных мета-

болитов в культуре клеток. Резко расширился круг веществ, получаемых в культуре in vitro. Становилось очевидным, что практически все классы соединений вторичного обмена могут быть синтезированы культивируемыми клетками растений (Фаулер, 1987; Носов, 1991).

Основанием для использования культуры клеток высших растений в качестве альтернативного пути синтеза вторичных соединений являются следующие специфические особенности клеток в условиях in vitro (Бутен-ко, 1986; Фаулер 1987):

- возможность возникновения новых путей синтеза уже известных соединений;

- способность к синтезу совершенно новых веществ, которые не образуются в интактном растении;

- биотрансформация дешевых предшественников синтеза в ценные конечные продукты.

Однако, в культивируемых клетках растений, как правило, происходит снижение содержания вторичных соединений, что, вероятно, связано с частичной потерей или ослаблением генетической информации о вторичном обмене (Запрометов, 1981). Для увеличения биосинтеза вторичных метаболитов в культивируемых клетках применяются так называемые факторы "запускания" (Лукнер, 1979; Запрометов, 1981; Носов, 1991). С одной стороны, это факторы физиологической регуляции вторичного синтеза: условия культивирования, применение предшественников, использование элиситоров, воздействие стрессов и др. (Мэнтелл, Смит, 1987). С другой стороны - факторы генетической регуляции: использование трансформированных клеток, мутагенов, селекция на клеточном уровне и др. (Widholm, 1977; Каранова и др., 1978; Булгаков, Журавлев, 1992).

Понятие о культуре каллусной ткани.

В культуре in vitro каллусом принято называть ткань, возникшую в результате деления дедифференцированных клеток изолированных сегментов различных органов растений. Обязательным условием образования каллусной ткани является присутствие в среде ауксинов и цитокининов. Образовавшийся на изолированных сегментах (эксплантах) каллус называется первичным. Его отделяют и пересаживают на новую питательную среду, в результате чего получают стерильную культуру каллусной ткани. Культуры, возникшие из одного экспланта, различающиеся по одному или нескольким признакам, называются клеточными линиями (Бутенко, 1977).

Каллусную ткань можно поддерживать в культуре неограниченно длительное время, периодически пересаживая ее на новую среду. Аспекты использования каллусных культур очень разнообразны. Культура каллусной ткани, как модельная система, успешно применяется при изучении физиологического состояния растительной клетки. С помощью этого метода проводятся исследования по изучению основного и вторичного метаболизма, нормального и патологического роста, дифференцировки и морфогенеза, по изучению генетики соматических клеток, взаимодействия растительной клетки с патогенами, а также цитологические и цитогенетические исследования (Бутенко, 1978; Калинин и др., 1980).

1.2. Солодка - источник биологически активных веществ in vivo и in vitro

Солодка голая - Glycyrrhiza glabra L. из сем. Бобовых (Fabaceae) один из самых известных и широко распространенных видов растений. Это многолетнее растение с ежегодно отмирающими побегами, которые вновь развиваются из пазушных почек главного корня и корневищ. Солодка имеет

мощную корневую систему, состоящую из многочисленных боковых корней, длина их может достигнуть до 2 и более метров (Худайбергенов, 1990). Именно корни и корневища солодки представляют большую ценность и считаются древнейшим лекарственным средством, применяемым в народной медицине (Гаммерман, 1968). Корень солодки включен в фармакопеи 33 стран мира, в том числе и в нашу отечественную фармакопею (Госуд. фарм. , 1968; Гранкина, Надежина, 1991). Медицинской промышленностью выпускается ряд оригинальных флавоноидных препаратов из солодки. Это "Ликвиритон", Тлицирам", "Флакарбин", обладающие противовоспалительными и противоязвенными действиями, а также " Лавалон" с желчегонным и гепатозащитным действием (Регистр... , 1993; Машков-ский, 1993). Кроме того, солодковый корень широко применяется и в других отраслях народного хозяйства, в частности, в табачной промышленности, при производстве смесей для пенных огнетушителей, для изготовления красок и др. (Растительные ресурсы, 1987). Интерес к этому растению настолько велик, что в настоящее время получено более 400 патентов, связанных с солодкой (Степанова, Сампиев, 1997). Хотя род Солодка включает в себя более 30 видов, промышленный интерес представляет только три вида - солодка голая, солодка уральская и солодка щетинистая (Тшуопеп, К.08еоду1з1:, 1995).

Многогранный спектр применения солодки обусловлен содержанием в различных частях растения биологически активных соединений, которые включают в себя две большие группы (Аммосов, Литвиненко, 1995). Первая группа соединений в основном представлена тритерпеновыми сапонинами, большей частью которых являются производные глицирретиновой кислоты, а именно ее гликозид - глицирризиновая кислота. В корнях и корневищах солодки содержание глицирризиновой кислоты составляет от 7,3 до 23,6 % (Муравьев, Соколов, 1966). Вторую группу биологически активных веществ солодки составляют фенольные соединения - флавоноиды

и изофлавоноиды. К 1995 году для видов рода Солодка были выделены и идентифицированы более 120 фенольных соединений, в том числе для солодки голой около 70 полифенолов (Аммосов, Литвиненко, 1995).

Флавоноиды это многочисленные фенольные соединения, синтезируемые высшими растениями. Молекула флавоноидов имеет два бензольных кольца (А и В), соединенных друг с другом трехуглеродным фрагментом: С6 - СЗ - Сб. Образование флавоноидов осуществляется по ацетатно-шикиматному пути биосинтеза: предшественником кольца А флавоноидов является ацетил КоА (или малонил КоА), а кольца В - шикимовая кислота (или Ь-фенилаланин) (Запрометов, 1993).

Образование наиболее важных групп флавоноидов можно представить по следующей схеме (Лукнер, 1979):

малонил КоА + ацетил КоА

флавононы

дигидрофлавонолы * (флавонолы)

халконы

флавоны

флаван-3,4-диолы катехины антоцианидины флавонолы

Наиболее широко распространенными флавоноидами являются флавонолы, флавоны, антоцианидины. Меньше распространены проантоциа-ниды, флаван-3-олы, флаван-3,4-диолы. Халконы, ауроны, дигидрохалко-ны, флавонолы и дигидрофлавонолы относятся к минорным соединениям и встречаются реже (Harborne, 1967; Wollenweber, 1982; Böhm, 1982).

Характерными для солодки флавоноидами являются соединения халкон-флавононовой природы и их гликозиды (Аммосов, Литвиненко, 1995). При этом в подземных органах растений встречаются 5-дезокси(дегидроокси) производные халкон-флавононов, а в надземных

частях - 5-окси(гидроокси) замещенные флавоны и флавонолы (Аммосов и др. , 1972; Надежина и др. , 1975). Наиболее известными флавоноидами, выделенными из корней солодки голой являются ликвиритигенин, ликви-ритин, изоликвиритигенин и изоликвиритин (цит. по Аммосову, Литви-ненко, 1995а). Многие фенольные соединения солодки считаются "мажорными" соединениями и содержатся в растениях в довольно больших количествах (до нескольких процентов) (Аммосов, Литвиненко, 1995). Вместе с тем, в солодке обнаружены "ретро" соединения, имеющие некоторые отклонения от общего пути синтеза. Так, японскими учеными была установлена структура и прослежен путь биосинтеза "ретрохалконов" эхи-натина и ликодиона в культуре клеток солодки щетинистой (Furuya et al. , 1971; Saitoh et al. , 1975; Ayabe, Furuya et al. , 1976; Ayabe et al. , 1980; Furuya, 1981). Подробно изучая ход биосинтеза эхинатина и обычного флавоноида - изофлавона формононет�