Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

ФЕНОЛКАРБОНОВЫЕ КИСЛОТЫ РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ ПРИ ПОРАЖЕНИИ СТЕБЛЕВОЙ РЖАВЧИНОЙ

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "ФЕНОЛКАРБОНОВЫЕ КИСЛОТЫ РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ ПРИ ПОРАЖЕНИИ СТЕБЛЕВОЙ РЖАВЧИНОЙ"

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА. СССР

, ---V

- ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФИТОПАТОЛОГИИ

— : ; — ; : ' " ;

\

На правах рукописи Лидия Владимировна РОЗУМ . ■ ■ 4 .

ФЕНОЛКДРБОНОВЫЕ КИСЛОТЫ РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ ПРИ ПОРАЖЕНИИ СТЕБЛЕВОЙ РЖАВЧИНОЙ

(06,01.11 —фитопатология и защита растений)

Автореферат ' -

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук ■

МОСКВА —1977

Работа выполнена в лаборатории биохимии и физиологии растений ■ Северо-Кавказского научно-исследовательского института фитопатологии. * -

Научные руководители: доктор биологических нзук^ профессор М. И. Запрометов, кандидат сельскохозяйственных наук В. В. Чигрии.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук^про-, фессор В, И. Кефели, кандидат биологических наук В..В. Ма-

ЗИН, '

Ведущее учреждение ~ Всесоюзный научно-исследовательский институт защиты растений.

Автореферат разослан

Защита диссертации состоится « 197 г.

в 10 час. на заседании специализированного Совета Всесоюзного научно-исследовательского института фитопатологии,

Отзывы на автореферат (в двух экземплярах, заверенных печатью) просим направлять по адресу: 143050, Московская область, Одинцовский район, п/о Большие Вяземы, ВНИИФ. Ученому секретарю специализированного Совета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. , ''

Ученый секретарь— ;

кандидат сельскохозяйственных

-. наук ; . ■ ^

Г. В. Пыжнкова

J

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время веб большей значение приобретает защита урожая от вредителей и болезней, Одним из вредоносных заболеваний зерновых культур является стеблевая ржавчина пшеницы, вызывающая огромные потери урожая и снижающая товарные качества зерна (Петерсон, 1958; Чумаков и др., 1965). Основной способ борьбы с этим заболеванием — выведение устойчивых сортов. Однако, несмотря на несомненные успехи, одни только селекционные мероприятия не могут привести к радикальному решению этой ^проблемы, поскольку в природе рано или поздно получают распространение биотипы патогена, способные поражать новые сорта. Достигнутые к настоящему времен» успехи в области патофизиологии позволяют считать, что выявление физиолого-биохимических механизмов устойчивости к патогену будет способствовать направленному изысканию эффективных средств защиты растений от ржавчины.

Одним из основных -путей реализации устойчивости пшеницы к ржавчине считают развитие защитной некротической реакции «сверхчувствительности»-, которая заключается в гибели группы растительных клеток, что затрудняет питание н развитие внедрившегося паразита (Stakman, 1915). Однако механизм указанного явления совершенно не изучен. В этой связи нельзя не обратить внимания на многочисленные сведения о накоплении в зараженных растительных тканях разнообразных фенольных соединений (Hare, 1966; Biehn et at., 1968; Иванова и сотр., 1965). Высокая физиологическая активность этих веществ позволяет предположить, что они участвуют в яроявлении устойчивости пшеницы к стеблевой ржавчине, в частности, в развитии реакции «сверхчувствительности».

Сведения об изменении фенольного обмена у растений пшеницы при заражении ржавчиной весьма немногочисленны и довольно противоречивы. Анализ литературных данных показывает, что отсутствие единой точки зрения на роль фенольных соединений в латогии'¡¿¿^¿^1 i.аВ.^ТТ%VЛ[сслеД°'

МОПиШ» Li., l. 'l t i»V. I 1

ватёлн определяли либо суммарное содержание всех полифенолов в здоровых и зараженных растениях (Kiraly and Farkas, 1962; Seevers and Daly, 1970), либо количество одного какого-то метаболита (El-Naghy, 1963 и др.). Кроме того, эти исследования проведены, как правило, на очень молодых растениях. В природе же реальной угрозе заражения ржавчнной подвергаются более взрослые растения, а с возрастом механизм ответных реакций может существенно изменяться (Чпг-рнн и сотр., 1969; Bateman et al., 1965).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение метаболизма фенол на рбо новых кислот у растений пшеницы при заражении стеблевой ржавчиной. Фенол-карбоновые кислоты представляют собой ключевые метаболиты фенольного обмена и являются предшественниками дело-го ряда ароматических соединений и лигнина (Занрометов, -1964, 197Ü; Тоуэрс,1968). Они обладают высокой физиологической активностью и участвуют в самых различных метаболических процессах, и есть основания думать, что они играют ■важную роль в формировании ^рсакции^верхчувствнтслыю-сти».

В задачи исследования входило:

1) изучение постинфекционных изменений основных фенол карбоновых кислот .пшеницы в начале развития болезни и в момент появления видимых симптомов заболевания;

2) определение активности ферментов, имеющих отношение к накоплению этих фенолкарбоиовых кислот;

3) получение сведений о фунгн- и цитотоксичностн феноль-ных соединений пшеницы, об их физиологических функциях.

Научная новизна, практическая ценность работы и пути реализации. Впервые проведено систематическое исследование обмена фенолкарбоиовых кислот у растений пшеницы при поражении стеблевой ржавчнной. Изучены самые ранние изменения содержания фенолкарбоиовых кислот при заражении, которые имеют непосредственное отношение к некробиозу. Обнаружено, что развитию защитных некрогенных реакций предшествует накопление в тканях устойчивых растений определенных фенолкарбоиовых кислот, обладающих высокой фун-гн- и цитотоксичностью. В отличие от известных работ о роли полифенолов в устойчивости растений пшеницы к инфекционным заболеваниям, наши исследования выполнены на взрослых растениях пшеницы, которые в природе подвергаются реальной угрозе заражения ржавчиной. Результаты экспериментов имеют значение для понимания механизмов защитных реакций растений и могут быть использованы при направленном синтезе новых протнворжавчннных фунгицидов.

Апробация. Материалы диссертации докладывались на И Всесоюзном симпозиуме по-фенольным соединениям (Алма-2

Ата, 1971) и на Ш Всесоюзном симпозиуме по фенольным соединениям (Тбилиси, 1976).

Объем работы. Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав экспериментальной части, заключения, списка цитируемой литературы; включает 12 рисунков и 21 таблицу в тексте. Список использованных литературных источников содержит 230 наименований, из них 131 — на иностранных языках.

Содержание работы ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В разделе I обзора приведены данные о широком распространении фенольных соединений в растительном мире и перечислены важнейшие функции этих соединений в процессах метаболизма. В разделе II раскрывается важная роль полифенолов в устойчивости растений к грибным, бактериальным и вирусным заболеваниям.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Глава!. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Исследования проводили на двух парах сортов: Капли и Эммер, относящихся к виду ТгШсипт dicoccum, Баллади 116 и Кубанка 3, принадлежащих к виду Triticum durum. Растения выращивали в теплице до фазы выхода в трубку и заражали свежесобранными уредоспорами 40-й расы Puccinia graminis Pers f. sp. tritici Eriks, et Herrn. Первый сорт каждой пары является устойчивым к этой расе ржавчины, второй — восприимчивым. При заражении сорта Баллади 116 отмечен тип реакции 0—0; Капли—0; —1, Эммер и Кубанка 3—3—4 по классификации Гоймана (Гойман Э., 1954). Таким образом, сорта Капли н Баллади 116 представляли несовместимую комбинацию с данным патогеном, сорта Эммер и Кубанка 3 — совместимую.

Образцы зараженных н контрольных (незараженных) растений отбирали в самом начале патогенеза (второй день после заражения) и в репродуктивную фазу развития гриба (пятый день). Целые листья замораживали жидким-азотом, растирали, лиофилизировали, запаивали в ампулах и сохраняли на холоду для проведения анализов.

Растворимые фенольные соединения экстрагировали горячим 80%-ным этанолом. Последний упаривали, водный остаток подкисляли до pH 2,0, и свободные фенолкарбоновые кислоты извлекали диэтиловым эфиром, Глюкозидносвязаниые фе-

нолкарбоновые кислоты определяли после двейадцатичасо-вого гидролиза водного остатка препаратом р-глюкозидазы (0,07'мг/мл) при 37° С и последующей экстракции диэтнловым эфиром. Растворимые этерифицнрованные формы фенолкар-боновых кислот определяли после пятичасового гидролиза (2 и. NaOH в атмосфере азота) водного элюата, оставшегося после обработки раствора р-глюкозндазой. Обесцвеченный растительный материал, оставшийся после извлечения растворимых полифенолов, инкубировали пять часов в атмосфере азота с 2 и, NaOH, и освободившиеся при гидролизе этанол-нерастворимые эфирносвязанные фенолкабоновые кислоты извлекали диэтнловым эфиром после подкисления смеси до рН 2,0, Разделение фенолкарбоновых кислот осуществляли двумерной хроматографией с использованием в первом направлении 1%-ной уксусной кислоты и во втором — органической фазы смеси толуол-уксусная кислота — вода (4:1:5). Хроматограммы обрабатывали слабым раствором соли прочного красного ГГ, фенолкарСюновыс кислоты элюировали из бумаги 0,05 н. 'NaOH в этаноле и использовали для количественного определения.

Содержание лигнина определяли двумя методами: классическим методом Класона (Пех и Трейсн, 1960) с поправкой на азот и -по методике, описанной Уайтхедом и сотр. (Whitehead et al„ 1964).

Определение гликозндазной активности проводили на препаратах белка, выделенного из здоровых и зараженных растений, с использованием в качестве 'субстратов соответствующих гликозидов л-нитрофенола (Jaynes et al., 1972).

Активность фенилаланин-лммиак лиазы определяли по методу Кукола и Кона (Koufcol and Conn, 1961).

Изучение способности растений пшеницы связывать фе-нольные соединения проводили на примере феруловой кислоты, которую вводили в растения в виде 2-10~3М раствора путем засасывания через срезы листьев. Об интенсивности связывания судили, сравнивая количество кислоты, оставшейся в свободном состоянии, с количеством, обнаруживаемым в гидролизуемых формах через 3 часа после окончания поглощения раствора.

Действие фенольиьгх соединений на прорастающие уредо-споры стеблевой ржавчины изучали в диапазоне концентраций от 10_г М до 2,5 • Ю-5 М, При изучении влияния различных фенол>ных соединений на токсичность феруловой кислоты последнюю использовали в концентрациях 2- Ю-3 М и 5 • lO-4 М. Другие фенольные соединения добавляли к феруловой кислоте в соотношениях 1:5; 1:2; 2:1; 5:1. Растворы фепольных соединений смешивали с агаром, наносили на предметные стекла и на них напылнвали уредосиоры. Стекла выдёржнва-4

ли 18 часов в темноте при 18—20° С. Подсчет проросших спор проводили в 10 полях зрения микроскопа.

О цитотоксических свойствах феиолкарбоновых кислот судили по распаду хлорофилла в отрезках листьев ■пшеницы, инкубируемых на растворах изучаемых соединений. Определение содержания хлорофилла проводили по методу, описанному Кулаевой (Кулаева, 1973). Кроме этого, цитотоксиче-ские свойства фенольных соединений оценивали по их влиянию на способность тканей листа поглощать из раствора краситель— кислый фуксин; краситель затем элюировали из тканей и колориметрировали при 545 нм.

Для изучения возможности повышения устойчивости растений пшеницы к ржавчине (путем увеличения уровня эндогенных полифенолов) зараженные растения восприимчивого сорта Кубанка 3 трехкратно обрабатывали растворами фенолкарбоновых кислот в концентрации Ю-3 М, На девятый день учитывали количество развившихся пустул на контрольных и обработанных растениях.

Результаты экспериментов подвергали вариационно-ста-тнстпческой обработке с использованием критерия Стьюден-та (Снедекор, 1961) при уровне вероятности Р = 0,95,

Глава II. ПОСТИНФЕКЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ФЕНОЛКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ

И ЛИГНИНА У РАСТЕНИИ ПШЕНИЦЫ ПРИ ЗАРАЖЕНИИ СТЕБЛЕВОЙ РЖАВЧИНОИ

Фенолкарбоновые кислоты (ФКК) растений пшеницы обнаруживаются как в свободном состоянии, так и в составе гликозидов и эфиров как растворимых в этаноле, так и нерастворимых. Суммарное количество всех форм ФКК в листьях пшеницы колебалось в пределах 2228—3259 мкг/г сухого вещества,'Содержание растворимых эфиров составило в среднем 49% от общего количества, нерастворимых — 39%, гликозидов— 9% и свободных ФКК— 3%. Во фракциях свободных, гликозидносвязанных, эфирносвязанных растворимых форм ФКК вами были идентифицированы феруловая, ванилиновая, сиреневая, п-кумаровая, п-оксибензойная кислоты, тогда как во фракции нерастворимых эфиров — только феруловая, ванилиновая и п-кумаровая. Такие кислоты, как феруловая и ванилиновая, имеются во всех фракциях ФКК, почти всегда количественно преобладают н, вероятно, могут считаться одними из основных компонентов фенольного комплекса растений пшеницы.

Заражение пшеницы стеблевой ржавчиной вызывает существенные измеиения в обмене ФКК. Данные таблицы 1

Изменение содержания свободных фенолкарбонових кислот в инфицированных листьях пшеницы на второй день после заражения

(% к контролю)

Фенолкарбоновые КИСЛОТЫ Несовместимая комбинация Совместимая комбинация

Ка пли Ба.плали 116 Эммер Кубанка 3

Феруловая...... 233* 171* 64* 85

Ванилиновая ..... 183* 125 76 10)

Сиреневая...... 126* 117 194* 85

п-Кумароная..... 169* 131* 127 100

п-ОксибешоАиая .... 133 120

* Различия достоверны при Р=0,95.

свидетельствуют о том, что устойчивые сорта характеризуются накоплением свободных феполкарбоновых кислот в отличие от восприимчивых сортов, которые не обладают этой способностью. У устойчивого сорта Капли, дающего типичную реакцию «сверхчувствительности», в начале развития некробиоза достоверно возросло содержание всех ФКК. Содержание наиболее токсичной для ■патогена феруловой кислоты в этом случае возрастает более чем в два раза. У сорта Баллади 116, реакция которого ближе к иммунной, также обнаружено увеличение всех фенол кар бонов ых кислот. Накапливаются ванилиновая и сиреневая кислоты, которые могут усиливать токсическое действие феруловой кислоты. У восприимчивых же сортов заражение ржавчиной, как правило, не сопровождалось накоплением свободных феполкарбоновых кислот. Более того, в тканях сортов Эммер и Кубанка содержание феруловой кислоты даже снижалось, количество других ФКК тоже уменьшалось или оставалось на уровне контроля. Отмеченные изменения сохранялись и на пятый день после заражения, однако они выражены не так отчетливо, и, по-видимому, менее важны с точки зрения выяснения факторов некробиоза.

Во фракции гликозидов заражение не вызвало существенных изменений, хотя определенная тенденция к снижению их уровня может быть отмечена к пятому дню после инокуляции, особенно у устойчивых сортов. Значительные изменения наблюдались во фракциях растворимых и нерастворимых эфи-ров. Как показывают данные таблицы 2, содержание этанол-растворимых эфиров ФКК резко уменьшилось уже на второй день после заражения. Это уменьшение особенно значительно у устойчивого сорта Капли, для которого характерна б

Изменение содержания этаиолрастворнмых эф про в ФКК при инфицировании листьев пшеницы (% к контролю)

Фе і і олка р бон овые кислоты Несовместимая комбинация Совместимая комбинация

Капли Баллади 116 Эммер Куба яка 3

дни после заражения .

2 5 2 5 2 5 2 i-

Феруловая ...... 37* 36* 91* 90* 68* 70* 99 98

Ванилиновая..... зо* 36* 64* 78* 37* 79 115 98

Сиреневая...... 10* 38* 79* 77* 36* 108 89 96

и-Кумаровая..... 28* 10* 102 87 33* 66* 69* 88

л-Оксибснзойлая . . . . 97 73* Ш 114

* Различия достоверны при Р=0,95,

обширная иекротизация в местах внедрения патогена. Снизилось содержание феруловон, ванилиновой, сиреневой кислот и у устойчивого сорта Баллад» 116. У восприимчивого сорта Эммер заражение также способствует уменьшению эфирно-связанных этаиолрастворнмых ФКК, однако эти изменения [¡ыражены менее отчетливо, У высоковосприимчнвого сорта Кубанка 3 количество растворимых эфиров практически пе изменяется под действием заражения. '

Достаточно четкие различия между устойчивыми и восприимчивыми сортами обнаруживаются во фракции нерастворимых эфиров, ассоциированных с материалом клеточных стенок (таблица 3). Устойчивые сорта реагируют на заражение резким снижением содержания эфнрносвязанной феруловой кислоты. Этот факт может свидетельствовать о том, что какие-то реакции метаболизма этой кислоты играют важную роль в процессе патогенеза. Количество ванилиновой и п-кумаровой кислот также обнаруживает тенденцию к уменьшению у устойчивых растений в начале развития болезни. В противоположность этому у восприимчивых растении инфекция, как правило, не вызывает снижения содержания нерастворимых форм ФКК, а в некоторых случаях можно даже наблюдать заметное увеличение их.

Данные о количественных изменениях различных форм ФКК свидетельствуют о том, что заражение по-разному влияет на фенольный обмен устойчивых и восприимчивых растений пшеницы. Так, устойчивым сортам свойственно значительное накопление свободных ФКК, которые обладают высо-

Изменение содержания эфирное вязанных нерастворимых ФКК при инфицировании листьев пшеницы (% к контролю)

Фе її ол к а р боно в ые кислоты Несовместимая комбинация Совместимая комбинация

Капли Баллади 11 б Эммер Кубанка 3

дни после заражения

2 5 2 5 2 5 2 5

Феруловая 36* 25"' 27* 36* 98 128* 80 152*

Ванилиновая 74* 115 85 103 167* 99 166* 127*

п-Кумаровая 83* ПЗ 75 101 І 83* 90 26* 124

* Различия с контролем достоверны при Р=0,95.

кой физиологической активностью (Бардинская и др., 1962; Кйс et al„ 1956), н довольно глубокие изменения во фракции связанных форм фенольных соединений. В противоположность этому у восприимчивых сортов некоторые изменения претерпевает лишь количество растворимых в этаноле форм ФКК. В то же время нерастворимые в этаноле ФКК не подвергаются заметным воздействиям.

Представлялось вероятным, что накопление свободных ФКК может происходить вследствие: а) повышения активности гидролитических ферментов, среди которых наиболее интересны гликозндазы, способные гидролизовать не только глико-эиды, но и некоторые эфиры (Тоуэрс, 1968); б) усиления биосинтеза ФКК de novo и в) подавления процессов связывания их в виде гликозидов, эфиров и лигнина {Тоуэрс, 1968). Результаты определения гликозидазной активности, представленные в таблице 4, показывают, что у иммунного сорта Балла-дн 116 активизируются как р-, так и а-гликозидазы; у устойчивого сорта Капли, образующего обширные некрозы, активизируются только р-гликозидазы. Гликозидазная активность восприимчивых растений, как правило, снижается или остается на уровне контроля.

Изучение активности фенил ал анин-аммиак лиазы (НФ 4.3.1.5) — (ФАЛ-лиазы), которая играет чрезвычайно важную роль в биосинтезе фенольных соединений, показало, что у устойчивого сорта заражение приводит к существенному увеличению активности этого фермента (рис. 1). У восприимчивого сорта наблюдали незначительное'повышение активности ФАЛ-лиазы или даже снижение ее активности по сравнению с контролем, особенно в начальной стадии развития инфекции.

іти Зим®

^—я.----

дни после жтт

Рис. І Акпмості фшлшдон - шш яшм ь тщтшш литих дошцм.

to

Ui Cö

і о» ta

Определение интенсивности связывания экзогенной феру-ловой кислоты показало, что в начале патогенеза в тканях не-зараженных листьев сорта Капли за 3 часа 98% этого соединения превращалось в связанные формы, тогда как в зараженных листьях — только 95%. У сорта Эммер интенсивность связывания при заражении возросла с 93 до 98%. Хотя эти различия невелики, они статистически достоверны и свидетельствуют об ослаблении процессов связывания фенолкарбо-новых кислот при заражении устойчивого сорта и усилении — у восприимчивого.

Определение содержания лигнина на 9-й день после заражения (рис, 2) показало снижение накопления лигнина, которое было сильнее выражено у устойчивых сортов (особенно у Капли) и слабее — у восприимчивых (особенно у Кубанки 3). Таким образом, постннфекционные изменения содержания эфиров ФКК и лигнина имеют однотипный характер. Полученные данные позволяют также заключить, что устойчивость пшеницы к стеблевой ржавчине не связана с лигннфи-кацией, которой 'приписывается создание механических барьеров на пути распространения паразита. Сравнение данных таблиц 1 и 4, относящихся к иммунному (Балладн 116) и

Таблица 4

Активность гликозидаз (мгк субстрата/м{Гбелка/час) в листьях Пшеницы (через два дня после заражения стеблевой ржавчмной)

Глнкозидазы Несовместимая комбинация Совместимая комбинация

Капли Балладн 116 Эммер Кубанка 3

здоров ые зараженные здоровые зараженные здоровые зараженные здоровые зараженные

Р-глюкоз ида за 338 389 75 )Е>9 508 387 595 496

а-глюкоз и да за 6 6 0 7 10 5 7 8

р-галактозидаза 165 183 46 130 273 226 101 102

а-галактозид аз а 89 85 39 99 51 37 46 31

устойчивому (Капли) сортам, позволяет предполагать, что в первом случае успех защитной реакции связан не столько с количеством высвободившихся ФКК, сколько с быстротой осуществления этого процесса, обусловленной резким активированием р- и а-гликозидаз. Таким образом, накопление свободных ФКК в листьях устойчивого сорта может быть связано с усилением гликозидазной активности тканей листа, активированием ФАЛ-лиазы и ослаблением процессов связывания свободных кислот.

э

Как указывалось выше, доля растворимых и нерастворимых эфиров ФКК составляет в сумме 88% всего количества ФКК пшеницы, тогда как на долю свободных приходится 3%. ' Очевидно, что постинфекционную убыль эфиров ФКК (табл. 2 и 3) никак нельзя объяснить только усилением их гидролиза, с которым частично может быть связано накопление свободных ФКК в листьях устойчивых растении (табл. 1). Возникает вопрос о возможных причинах столь резкой убыли эте-рифицированных ФКК, особенно заметной в листьях устойчивых растений. Одной из таких 'причин является, вероятно, интенсификация дыхания зараженных растений (особенно устойчивых) и связанная с этим большая потеря углерода в виде СОг. Изучение этого вопроса показало, что на 2:й день . после заражения у сортов Капли и Эммер выделение С02 листьями увеличилось на 54% и 45% соответственно. Резкое усиление потерь углерода вполне могло снизить объем биосинтеза вторичных соединений (в том числе лигннна) в связи с необходимостью поддержать на оптимальном уровне концентрации биологически более важных метаболитов.

Другой причиной убыли эфиров ФКК в листьях может быть перераспределение фенолкарбоновых кислот между надземными органами и корнями. Одним из подтверждений обоснованности этого предположения служит тот факт, что в корнях растений устойчивого сорта Капли в начале заболевания количество свободных ФКК при заражении возросло на 43%, связанных (растворимых и нерастворимых)—на 78% и общее количество — на 75%. У сорта Эммер заметно (на 58%) увеличилось только содержание первой фракции. Общее количество ФКК, в том числе связанных форм, возросло незначительно (на 10% и 7% соответственно). Таким образом, сопоставляя данные таблиц 2 и 3 с результатами определения ФКК в корнях, можно предположить, что накопление фенолкарбоновых кислот в этих органах в известной мере коррелирует с убылью связанных форм ФКК в листьях. Полученных данных недостаточно, чтобы датъ завершенную интерпретацию взаимосвязи фенольного обмена надземных органов и корневой системы. Возможно, что убыль эфиров ФКК в зараженных листьях связана с тем, что заражение способно вызвать изменения метаболизма в органах, отдерфных от места развития патогена (Рац|есЬ, 1974), и усиление биосинтеза ФКК в корнях ведет к «перехвату» каких-то предшественников, которые в норме направляются из корней в листья. Нельзя, по-видимому, исключить и возможность оттока непосредственно растворимых ФКК из листьев в корни. Проведенный нами эксперимент показал, что при погружении корней пшеницы в растворы 4-метнлумбеллиферо-]0

т.

w

gm

759

конртмр M

я<г* uf* w* mi* b'ti3 /гг

памшт

— фмомя -кислота-"

-----ii "шаровая кислота

'.........— бшиновая кислота

— n&cl

——т/1кж03а :

Puc. з Токсичность фенолклрбоно&ых кислот

№ КЛЕТОК МСТЕННй ПШЕЩЫ.

на н п-оксибензойной кислоты эти вещества накапливались в листьях и стеблях.

Таким образом, резкая убыль эфиров ФКК в зараженных листьях устойчивых сортов может быть связана, с одной стороны, с патологически возросшей интенсивностью дыхания и, с другой — с усилением биосинтеза ФКК в корнях.

Глава III. ИЗУЧЕНИЕ ФУНГИ- И ЦИТОТОКСИЧНОСТИ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИИ

Наибольшей токсичностью для прорастающих уредослор гриба обладают феруловая кислота и кониферилозый спирт, которые даже в концентрации 5* Ю-" М подавляли прорастание спор на 44% и 38% соответственно. Другие фенольные соединения, встречающиеся в растительной клетке, могут оказывать разнообразное действие на токсичность количественно преобладающей феруловой кислоты. Действительно, данные, представленные в таблице 5, позволяют отметить, что.

Таблица 5

Токсичность фенольных соединений и их смесей для прорастающих у ре д оспор стеблевой ржавчины пшеницы

Соединениє % подавления прорастакня уредослор под влиянием

веществ в концентрации 5 ■ КММ вещее ти (М) в смесіг с феруловой кислотой 5- Ю-"1 М

2,5 > І0-г (5:1) 10-' (2:1) 5- 10'* (1 : 1) 10-" (1:5)

Феруловая кислота . . . 44

Конифсрнловьій спирт 33 77* 74* 76* 50

Ваннлил ....... 0 100* 71* _ 67*

Ванилиновая кислота . . 0 95* 75* 55* 27*

Сиреневая кислота . . 0 60* 45 49 59

Протокатеховая кислота 0 — 19* 16* 13*

Кверцетин...... 50 29 15* 28 32

* Различил между данным вариантом и чистої! феруловой кислотой достоверны при Р = 0,95.

например, коннфериловый спирт проявил аддитивность по отношению к феруловой кислоте. При добавлении других соединений,'главным образом, имеющих в бензольном кольце 4-окси, 3-метокси или 4-окси, 3,5-ди-метокси групировкн (ванилиновая н сиреневая кислоты, ванилин) отмечается определенный синергизм с феруловой кислотой. В то же время ПОлифенолы с 3,4-диокси- группировками (протокатеховая кислота, кверцетин) проявили антагонизм. Таким образом,

П

характер токсического действия фенольного комплекса .весьма сложен: он определяется не только концентрацией наиболее токсичных веществ, но и их соотношением с веществами, способными усиливать или ослаблять их действие.

В связи с тем, что фенольные соединения, как выяснилось, обладают довольно высокой фунгитокснчпостью, представлялось важным изучение возможности повышения устойчивости растений пшеницы путем непосредственного введения в ткани листа отдельных фенолкарбоновых кислот и их смесей.

Приведенные в таблице 6 данные позволяют отметить, что обработка листьев восприимчивого сорта растворами ФКК приводит к снижению не только степени поражения, но и одновременному изменению типа поражения растений. Так, если в контрольном варианте тип 'поражения составил 3—4 балла, то в варианте с участием феруловой кислоты, и особенно ее смесей с ванилиновой и сиреневой кислотами, тип поражения приближался к 1. Данные таблицы 6 хорошо согласуются с представлением о том, что постинфекционное возрастание концентрации ФКК в листьях может быть одним из факторов, ответственных за несовместимость партнеров.

Фенольные соединения, накапливаясь в зоне внедрения патогена, могут, по-видимому, проявлять также и цитотокси-ческое действие. Поскольку первым очевидным симптомом реакции «сверхчувствительности» является распад хлорофил-

* Таблица 6

Изменение реакции растений пшеницы на заражение стеблевой ржавчиной под влиянием их обработки Ю-3 М растворами феиолкзрбоновных кислот

Интенсивность

Варианты опыта заражения Тип

число % к контролю реакции

пустул на лист *

Контроль (вода)....... 16 100 3—4

Феруловая кислота...... 10 63 1—2

Ванилиновая кислота .... 9 56 1—2

Сиреневая кислота ...... II 69 2

Протокатеховая кислота , . . 13 81 3

п-кумаровая кислота ..... . 13 81 2—3

п-оксибензойная кислота .... 1! 69 2—3

Феруловая+протокатеховая кисло-

ты ............ 13 81 .2

Феруловая+ ваиилинова ясирене- 43

вая кислоты ........ 7 1

Феруловая+ванили новая+- сирене- 56 1

ва я+протокатеховая кислоты 9

* Наименьшее существенное различие при Р=0,95 равно 3.

iâff

s

о 1— 80 -

^ 60

^__о о*-- 1 40

ш о» 20

0

ли до'* ">'s w3 »w"»

»-• Лол деіістши ферулово» кщштм.

*—- пои^сшен продуктаее"ошеіш.

Рис. Штті фершміі кислоти h продукта ft окисления

на содержание хлорофшімв отрезках л1ш& пшеницы.

ла в зоне инфекции и связанное с $тим образование хлоро-тичного пятна, можно было полагать, что изменение количества хлорофилла в отрезках листьев, инкубированных на растворах ФКК, служит мерой токсичности полнфенолов для растительных клеток. Проведенное нами изучение цитотоксич-ности фенолкарбоновых кислот показало, что феруловая и сиреневая кислоты в концентрациях 4-Ю"3 М и 6-10~3 М вызывали разрушение хлорофилла в отрезках, 'помещенных на растворы этих кислот, В других опытах о цитотоксическом действии ФКК судили по способности обработанных ими растительных тканей поглощать из раствора краситель — кислый фуксин. В качестве эталона токсичности был использован гербицид паракват с отчетливо выраженным некроген-ным действием по отношению к растительным тканям. Глюкоза и хлористый натрий были выбраны как заведомо нетоксичные вещества (в использованных нами концентрациях). Приведенные на рисунке 3 данные позволяют сделать вывод о том, что фенолкарбоновые кислоты проявили цитотокснче-ский эффект и в этом отношении они образовали следующий ряд: феруловая>п-кумаровая>ванилиновая.

Однако в растениях ¡n vivo фенольные соединения могут оказаться еще более токсичными. Известно, что под действием фенолокисляющих ферментов полифенолы переходят в хиноны (Стом, 1972, 1973), которые по токсичности значительно превосходят исходные фенольные соединения (Стом, 1970). Нами было изучено влияние продукта окисления фе-руловой кислоты (трансформация последней осуществлялась 'пероксидазой из хрена 30 мин. в присутствии НгОг) на отрез! ки листьев пшеницы. Данные, .представленные на рисунке 4, позволяют полагать, что продукт окисления феруловой кислоты обладал более высокой цитотоксичностью по сравнению ; с исходной формой этого соединения.

Таким образом, фенолкарбоновые кислоты, а также, ве-¡ роятно, и продукты их окисления, могут проявлять токсичность как для патогена, так и для самой растительной клетки.

Заключение

Нами установлено, что уже в самом начале развития возбудителя стеблевой ржавчины в тканях устойчивых растений t пшеницы возрастает активность глюкозидаз и фенилаланин-аммиак лиазы, интенсивность же связывания фенолкарбоновых кислот в виде растворимых, нерастворимых эфиров и лигнина, наоборот, снижается. Это приводит к накоплению в зараженных листьях свободных фенолкарбоновых кислот, среди которых преобладает феруловая кислота, отличающаяся заметной фунги- и цитотоксичностью.

t

!

Это накопление," конечно, происходит локально в местах контакта патогена с листьями растения, и это локальное повышение концентрации является, по всей вероятности, гораздо более значительным, чем то, которое мы обнаружили при , анализе листа в целом. Косвенным подтверждением того, что наблюдавшиеся нами изменения в фенольном комплексе листьев ассоциированы с зонами контактов, является тот факт, что развитию обширных некрозов на листьях сорта Капли предшествовало более сильное повышение концентрации свободных ФКК, чем в случае иммунного сорта Баллади 116 с его точечными некрозами.

При контакте с пероксидазной системой может иметь место образование окисленных продуктов, отличающихся более высокой фунги- и цитотоксичностью, чем исходные соединения. Такой контакт может осуществляться вследствие постинфекционных нарушений внутриклеточной компартменталнза-цин (Метлицкий, Озерцковская, 1968). Во всяком случае, несомненно, что при заражении устойчивых растений пшеницы стеблевой ржавчиной интенсивность пероксидазного окисления фенольных соединений резко возрастает (Чигрип и др., 1969).

Подтверждением наших предположений о защитных функциях фенолкарбоновых кислот являются также результаты экспериментов, в которых восприимчивые растения обрабатывали растворами этих соединений. Мы, естественно, далеки от того, чтобы связывать развитие совместимой или несовместимой реакции на заражение исключительно с особенностями изменения концентраций тех или иных фенолкарбоновых кислот. Тем не менее полученные в нашей работе данные свидетельствуют о том, что определенная связь между ранними постинокуляционными изменениями фенольного комплекса и характером реакций на заражение стеблевой-ржавчиной все же имеется.

Выводы

Результаты изучения особенностей фенольного метаболизма у растений пшеницы с различной устойчивостью к стеблевой ржавчине, проведенные в 1968—1973 гг., позволяют сделать следующие основные выводы.

1. Фенолкарбоновые кислоты листьев пшеницы присутствуют главным образом в виде этанолрастворимых и этанол-нерастворимых эфиров, а также в виде гликозидов и в свободном состоянии. Общее количество всех этих форм составляет 2,2—3,2 мг/г сухого вещества. Из этого количества на долю нерастворимых и растворимых эфиров, гликозидов и свободных кислот приходится в среднем 39%, 49%. 9% и 3% и

соответственно. В последних трех фракциях обнаружены феруловая, ванилиновая, сиреневая, п-кумаровая и п-оксибен-зойная кислоты, в этанолнерастворимой—феруловая, ванилиновая и п-кумаровая,

2. При заражении устойчивых растений стеблевой ржавчиной уже в начале патогенеза (2-й день после инокуляции) заметно возрастает активность гликозидаз и фенилаланин-аммиак лиазы при одновременном снижении способности тканей листа переводить свободные фенолкарбоновые кислоты в связанное состояние. Эти изменения приводят к резкому увеличению содержания свободных фенолкарбоновых кислот, в особенности феруловой кислоты, У восприимчивых растений подобных изменений не выявлено, некоторое возрастание содержания фенолкарбоновых кислот наблюдается к 5-му дню после заражения.

3. Заражение устойчивых растений сопровождается уменьшением содержания связанных фенолкарбоновых кислот н лигнина в листьях. С другой стороны, у восприимчивых растений снижается содержание лишь растворимых фенольных соединений, а количество нерастворимых эфиров фенолкарбоновых кислот даже несколько возрастает,

4. Инфицирование растений пшеницы уредоспорами стеблевой ржавчиЕШ сказывается также на фенольном обмене корней. При этом происходящие в корнях изменения противоположны тем, которые характерны для зараженных листьев: содержаниецсвободных фенолкарбоновых кислот и их нерастворимых эфиров здесь существенно возрастает. Указанные процессы более ярко выражены в устойчивых растениях, нежели в восприимчивых.

5. Установлена высокая токсичность феруловой кислоты для прорастающих уредоспор патогена. Ванилиновая и сиреневая кислоты, будучи нетоксичными для уредоспор, при совместном применении с феруловой кислотой достоверно усиливал]! токсическое действие последней. Феруловая кислота оказалась также наиболее токсичной для тканей листьев пшеницы, причем окисление ее в течение 30 мин. 'пероксндазой повышало цнтотокснчность (способ образования еще более токсичного продукта),

6. Обработка зараженных восприимчивых растений раствором феруловой кислоты и особенно ее смесью с ванилиновой и сиреневой не только достоверно снижала интенсивность заражения, но изменяла и тип реакции, приближая его к типу, характерному для устойчивых растений. Полученные данные позволяют считать, что локальное накопление фенолкарбоновых кислот в зоне развития патогена может быть одной из причин некротизации клеток н гибели патогена в тканях устойчивых растений.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Изменения фенольного обмена у яровой пшеницы при заражении стеблевой ржавчиной. Физиология растений, 1969 (16), 2, 330—335 (в соавторстве с В. В. Чигриным).

2. Токсичность фенольных соединений для прорастающих уредоспор стеблевой ржавчины пшеницы Puccinia graminis Pers f. sp. tritici Eriks, et Henn. Микология и фитопатология, 1969, 3 (3), 243—248 (в соавторстве с В. В. Чигриным и Л. М. Бессмельцевой).

3. Некоторые особенности фенольного обмена у сортов пшеницы с различной устойчивостью к стеблевой ржавчине. Тезисы Второго Всесоюзного симпозиума по фенольным соединениям. Алма-Ата, 1970, 106 (в соавторстве с В. В. Чигриным).

4. Фенолкарбоновые кислоты и лигнин в листьях устойчивых и восприимчивых сортов яровой пшеницы при заражении стеблевой ржавчиной. Физиология растеннй, 1973, 20, вьш, 5, 942—948 (в соавторстве с В. В, Чигриным, Н. М. За-прометовым).

5. Некоторые особенности фенольного обмена пшеницы и устойчивость к стеблевой ржавчине. Тезисы Третьего Всесоюзного симпозиума по фенольным соединениям. Тбилиси, 1976 (в соавторстве с В. В. Чигриным, М, Н. Запрометовым).

Л 77690 1/1V—77 г. Объем ] п. л. Заказ 745.

Тираж 120

Типография Московской с.-х. академии им. К- А. Тимирязева 125008, Москва А-8, Тимирязевская ул., 44