Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Сахароспирты (полиолы) как индикаторы характера взаимоотношений между возбудителями ржавчинных заболеваний и растениями пшеницы

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Сахароспирты (полиолы) как индикаторы характера взаимоотношений между возбудителями ржавчинных заболеваний и растениями пшеницы"

Й205 9 2

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК Всесоюзный научно-исследовательский институт фитопатологии

Стекольщиков Михаил Вячеславович

САХАРОСПИРТЫ (ПОЛИОЛЫ) КАК ИНДИКАТОРЫ ХАРАКТЕРА ВЗАИМООТНОШЕНИИ МЕЖДУ ВОЗБУДИТЕЛЯМИ РХАВЧИННЫХ ЗАБОЛЕВАНИИ И РАСТЕНИЯМИ ПШЕНИЦЫ

(06.01.II - защита растений от вредителей и болезней)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

УДК 632.093/097:612.015.32

Голицыно 1992

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте фитопатологш.

Научный руководитель - член-корреспондент ВАСХНИЛ, доктор биологических наук, профессор Д.И.Чкаников.

Официальные оппоненты: доктор биол. наук Ю.Н.Плотникова (ГБС РАН), доктор биол.наук Б.Н.Куликов (ВНИИФ).

Ведущая организация - Северо-Кавказский научно-исследовательский институт фитопатологии

при ВНИИ фитопатологии по адресу: 143050, Московская область, Одинцовский район, п/о Большие Вяземы, ВНИИФ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИФ.

Защита диссертации состоится

^ часов на заседании специализированного совета К 120.66.01

в

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

ifSSi;. '"т-'¿/г, '

' I

■ —•♦ г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Зерновая проблема, всегда бывшая для России актуальной, особенно обострилась за последние десятилетия (Народное хозяйство СССР в 1989 г., ■ 1990). Недобор продовольственного и фуражного зерна составляет десятки миллионов тонн ежегодно (Народное хозяйство СССР в 1989 г., 1990). Среди причин этого неблагополучия существенная роль принадлежит заболеваниям, в том числе и ржавчинным, многие из которых регулярно приобретают эпифитотийный характер (Степанов, 1961; Дорожкин и др., 1988).

Потери урожая, вызываемые стеблевой и бурой ржавчиной, могут быть предотвращены, например, применением системных фунгицидов (Брукс, 1975; Сийпейстейн, 1975; Политыко и др., (985; Справочник по пестицидам, 1985). Однако в нашей стране это мероприятие по многим причинам оказывается трудно осуществимым, не говоря уже о его нежелательности по соображениям охраны окружающей среды. Это вынуждает делать ставку на селекционно-генетические методы защиты посевов зерновых культур от ржавчинных заболеваний (Robinson, Chlarappa, 1977; Brodny et al., 1938). Во многих зерносеадих регионах мира именно такой подход позволяет надежно защищать посевы от ржавчины на протяжении десятилетия (Lulg et al., 1982; Singh MunBhi, Upadhyay, 1986).

Созданию устойчивых к болезням сортов уделяется сейчас все возрастающее внимание. Благодаря этому становится важным совершенствование методологии такой работы, одним из важнейших этапов которой является оценка уровня и характера устойчивости перспективных сортообразцов. На этом этапе возможно использование экспресс-методов, основанных, в частности, на биохимических различиях систем "хозяин-патоген" при разной степени совместимости партнеров.

Цель и задачи исследования.

Цель нашеП работы заключалась в изучении возможности разработки экспресс-метода оценки уровня и характера устойчивости растений пшеницы к возбудителям стеблевой и бурой ржавчины по содержанию специфических грибных углеводов в инфицированной растительной ткани.

Для этого было необходимо решить следующие задачи: '

1.Разработать экспрессный, высокочувствительный и достаточно специфичный метод количественного анализа углеводного состава здоровой и инфицированной ткани растений пшеницы и клеток ржавчинных грибов.

2.Провести сравнительное изучение углеводного состава ржавчинных грибов, а также здоровых и инфицированных этими грибами растений пшеницы, выявить закономерности накопления специфических грибных углеводов в инфицированной растительной ткани.

3.Определить характер взаимосвязи между уровнем и типом устойчивости растений пшеницы к возбудителям ржавчинных заболеваний и скоростью накопления в них специфических грибных углеводов.

4.Сравнить результаты воздействия ряда коммерческих фунгицидов на интенсивность развития ржавчинного заболевания и скорость накопления специфических грибных углеводов в обработанных растениях.

5.На основании полученных данных определить пригодность количественного анализа грибных углеводов в инфицированных растениях пшеницы для оценки уровня и типа их устойчивости к возбудителям ржавчинных заболеваний.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые проведен детальный качественный и количественный анализ углеводного состава уредоспор возбудителей стеблевой и бурой ржавчины пшениц и инфицированных ими растений. Показано, что по составу углеводов между растениями пшеницы и возбудителями ржавчинных заболеваний имеются не количественные, а качественные различия. Уредоспоры стеблевой и бурой ржавчины содержат большое количество арабита и маннита, а также трегалозу, которые совершенно отсутствуют в растениях пшеницы. Изучена динамика накопления специфических грибных углеводов в инфицированных ржавчинными грибами растениях пшеницы и показано, что темпы накопления поли-олов в листьях сортов пшеницы, различающихся по степени устойчивости к стеблевой или бурой ржавчине, зависели от степени совместимости партнеров. Это дало возможность предложить количественный анализ арабита и маннита в инфицированных листьях для определения уровня устойчивости сортов к ржавчине и оценки сравни-

тельной эффективности противоржавчинных фунгицидов.

Для проведения указанных исследований разработана га-зо-хроматографическая процедура определешш Сахаров, которая позволяет выявлять до 1 мкг углевода в образце. При этом возможно одновременное количественное определение растительных Сахаров (арабиноза, рамноза, фруктоза, галактоза, глюкоза, сахароза) и специфически грибных метаболитов (полиолы и трегалоза) как в инфицированных возбудителем ржавчинных заболеваний пшеницы растительных тканях, так и в уредоспорах ржавчинных грибов. Метод основан на двухстадийной дериватизацзш углеводов и ГКХ количественном анализе дериватов с применением многоступенчатой температурной программы нагрева колонки и пламенно-ионизационного детектора.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на научном семинаре "Использование современных методов исследований в биологии" в феврале 1988 г. в Ленинграде, на Всесоюзном совещании "Физиолого-биохимические основы иммунитета растешШ к грибным болезням для целей прикладной селекции" в апреле 1988 г. в Уфе и на втором съезде Всесоюзного общества физиологов растений в сентябре 1990 г. в Минске.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 сообщения.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного углеводному метаболизму биотрофных фитопатогенных грибов и методам анализа углеводного состава растительных и грибных клеток, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы. Материал диссертации изложен на 83 страницах машинописного текста и содержит 20 таб-лзщ и IЧ рисунков. Список литературы включает 103 наименования, в из них 86 работ зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили растения пшешщы сортов Маркиз (США), Тэтчер (США), Ли (США), Кения 58 (Кения), Мак Мурачи (США), Рэдман (США), Идайд 59 В (США), Эксчейндж (США), Ахилл (ФРГ), Партизанка (Югославия), Букет (Франция).

В качестве инфекционного материала использовали уредоспоры рас 15, 21, 117 возбудителя стеблевой ржавчины (Рисс1п1а

graminis Fers. f. sp. tritlci Eriks, a. Henn) и 52, 77, 105 возбудителя бурой ржавчины (Puccinia perslstens Plowr. í. sp. tritlci Eriks.).

Растения выращивали в условиях искусственного климата при стандартных условиях (освещенность - 25000 люкс, продолжительность дня - 16 часов, t дневная - 22°С, t ночная - 20°С, относительная влажность - 705) в течение 7 суток до фазы полного формирования первого листа. Затем их инокулировали суспензией, содержащей 500 мг/л уредоспор стеблевой или 200. мг/л бурой ржавчины в О.и-ном растворе Твин-20, помещали во влажную камеру и через 24 часа переносили обратно в климатическую камеру. На 7-12 сутки после инокуляции отделяли первые листья и использовали их для определения содержания полиолов.

Содержание арабита и маннита в инфицированных тканях определяли методом газо-жидкостной хроматографии с использованием пламенно-ионизационного детектора (Стекольщиков и др., 1991).

Определение спорогенности стеблевой и бурой ржавчины проводили на отрезках листьев, пользуясь специально разработанной процедурой культивирования (Johnson, Taylor, 1976).

Количественный учет спор проводили методом микроскопирова-ния. Статистическую обработку полученных данных проводили методом дисперсионного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Разработка газо-хроматографического метода количественного анализа углеводов из проростков пшеницы, инфицированных возбудителями стеблевой или бурой ржавчины.

. Для количественного анализа углеводов в растениях пшеницы, инфицированных возбудителями стеблевой или бурой ржавчины, необходимо было подобрать такой способ экстракции, который обеспечивал бы достаточно, полное их извлечение с минимальным количеством козкстрактивных веществ и надежную фиксации растительного материала.

Серией предварительных экспериментов было установлено, что наилучшие результаты могут быть достигнуты при использовании в качестве экстрагента кипящего 80 % водного этанола с последующей очисткой экстракта от примесей хроматографией на смешанной кати-оно-анионообменной смоле типа Amberlite ЫВ 1 фирмы Serva (ФРГ).

Оптимизация процедуры, заключающаяся в подборе размера колонки и режима ее загрузки и элюцин, привела к хорошей воспроизводимости результатов. Наряду с этим мы попытались проводить экстракцию углеводов из неразрушенных растительных тканей, что ускоряло подготовку образцов к анализу. Однако двухкратная экстракция листьев оказалась недостаточной для полного извлечения углеводов из образца. В связи с этим мы увеличили кратность этой операции до 4 - 5 раз, что дало положителыий эффект.

Необходимо было также подобрать такой метод анализа, который позволял бы количественно определять достаточно широкий набор растительных углеводов одновременно с основными растворимый! углеводами ржавчинных грибов - полиолами. Наиболее подходящ™ методом проведения такого анализа оказалась газо-жидкостная хроматография, позволяющая исследовать практически весь спектр углеводов в биологических объектах.

Так как растительные сахара и полиолы являются нелетучими соединениями, перед проведением газо-хроматографического разделения необходимо было модифицировать их в производные с достаточной летучестью. Это достигалось путем блокирования всех гид-роксильных групп триметилсилилышми остатками. Однако при таком способе дериватизации каждый аномер регистрировался в виде отдельного гожа, что при достаточно широком спектре углеводов в образце не позволяло получить их удовлетворительное хроматогра-фическое разделение. Поэтому мы использовали двухстадияную дери-ватизацию. Первоначально сахара превращали в оксины, что приводило к исчезновению аномерных форм, а затем их дериватизировали до триметилсилильных производных.

Подбор условий дериватизации и хроматографирования осуществляли на наборе стандартов, в который входили наиболее часто встречающиеся в растениях углеводы.

Описанный режим хроматографирования позволяет индивидуализировать большое число углеводов в одном образце (рис. 1). Единственное затруднение возникало при разделении пар Сахаров галактоза - манноза и манноза - глюкоза вследствие близких значений времени удерживания этих веществ; в отсутствии маннозы определение количества галактозы и глюкозы не вызывало затруднений. Полученные данные свидетельствуют о хорошей воспроизводи-

0 2 4 6 8 10 12 И 16 18 20

Времв удерживания. кинуты

Рис. I. Хроматограмма снеси водорастворимых углеводов:

I - арабит, 2 - арабиноза, 3 - рамноза, 4 - ман-нит, 5 - фруктоза, 6 - галактоза, 7 - глюкоза. -8 - инозит, 9 - фенил-р-П-глюкопиранозид (внутренний стандарт), 10 - сахароза, II - трегалоза.

мости предлагаемого метода: ошибка определения любого из испытанных углеводных компонентов не превышала 5Х. Выборочная проверка взаимосвязи между интенсивностью сигнала детектора и концентрацией некоторых углеводов, значительно различающихся по химической структуре, показала линейную зависимость между этими параметрами в широком диапазоне концентраций . Метод оказался достаточно чувствительным и позволял определять до 1 мкг углевода в исходном образце. Он оказался пригодным для количественного анализа углеводов в уредоспорах стеблевой и бурой ржавчины, а также в здоровых и инфицированных указанными возбудителями листьях пшеницы.

Углеводный состав грибных и растительных тканей.

Разработка эффективного газо-хроматографического метода определения углеводов дала возможность провести сравнительное изучение углеводного состава листьев пшеницы и уредоспор стеблевой и бурой ржавчины. Анализ продемонстрировал существование кардинальных различий между этими объектами. Если основными растворимыми углеводами листьев пшеницы были сахароза, глюкоза и фруктоза, то для углеводного комплекса уредоспор ржавчин характерно присутствие главным образом полиолов - арабита и маннита, >а также дисахарида трегалозы (рис. 2). Таким образом, между спорами

11

I__!_I ■ I_|__!_!___)__(____I_

0 2 4 0 а 10 12 И 1С 10 20

Оргмя удерясштния . минуты

Рис. 2. Газо-хроматографическое разделение углеводов уредоспор стеблевой ржавчины (раса 15): I - арабит, 4 - маннит, 8 - инозит (внутренний стандарт), II - трегалоза.

ржавчинных грибов и растениями пшеницы имеются не количественные, а качественные различия состава углеводов, которые могли использоваться при разработке способа обнаружения гриба в инфицированных листьях. Такого рода методы оказываются полезными для определения степени совместимости облигатно биотрофных патогенов с. растениями-хозяевами (Гринченко, Чкаников, 1989). Именно с этой позиции следовало убедиться в информативности газо-хрома-тографического анализа углеводов растений, инфицированных возбудителями стеблевой и бурой ржавчины.

Результаты изучения динамики накопления специфических грибных углеводов в инфицированных возбудителями стеблевой и бурой ржавчины растениях пшеницы (рис. 3.) показали, что на

ч 1

о

С

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Сут после инокуляции

б 7 в 9 10 11 12 13 " 15 Сут после ихпкуляцнк

Рис. 3. Динамика накопления арабита (-•-) и маннита (—о— > уредопустулами возбудителей стеблевой (А - сорт Маркиз, раса 21) и бурой (Б - сорт Тэтчер, раса 25) ржавчины пшеницы.

протяжении примерно 6-ти суток после инокуляции инфицированные растения по углеводному составу практически не отличались от здоровых, неинфицированных. Однако начиная с седьмых суток после инокуляции в инфицированных листьях уже обнаруживались детектируемые количества арабита и маннита, содержание которых впоследствии существенно возрастало.

Результаты этих исследований дали возможность полагать, что появление в инфицированных листьях полиолов связано с нарастанием здесь массы патогенного гриба. Однако ощутимые количества полиолов обнаруживались в листьях не ранее, чем через 7 суток после их инфицироватш, когда начинается Формирование спороген-ных тканей гриба (рис. 3). Это обстоятельство наводило на мысль, что полиолы присущи главным образом спорогенным тканям и спорам, а не вегетативному мицелию. Так или иначе, представлялось вероятным, что данные о содержании полиолов в инфицированных растениях могут дать представление о том, насколько благоприятны здесь условия для развития патогенного гриба, т.е. насколько совместимы изучаемые партнеры. Более того, количественный анализ полиолов мог бы дать представление и о спорообразупцей способности гриба, сведения о которой во многих случаях необходимы. Изучению именно этих возможностей были посвящены последующие разделы экспериментальной работы.

Возможность определения спорообразуюшей способности возбудителей стеблевой и бурой ржавчины по содержанию полиолов в инфицированных листьях шенищ.

Важность определения спорообразупцей способности фитопато-гешшх грибов хорошо известна фитопатологам и специалистам по фитоиммунитету, поскольку количество образующихся в инфицированных тканях спор чаще всего хорошо отражает степень совместимости патогена и растения-хозяина (Johnson, Taylor, 1976).' Однако обычно определение количества или массы сформировавшихся на инфицированном листе спор проводится с помощью весьма трудоемких процедур (Priestly, Doling, 1972), поэтому попытка использования для этих целей достаточно простого аналитического метода представлялась оправданной и целесообразной.

Вначале было установлено, что свежесобранные уредоспоры и стеблевой, и бурой ржавчины пшеницы характеризуются высоким со-

держанием арабита и маннита (табл. 1). При этом споры нескольких проанализированных физиологических рас одного и того же вида были достаточно близки между собой по содержанию полиолов. Существенными же были различия между уредоспорами стеблевой и бурой ржавчины, причем в последних концентрация арабита и маннита оказалась примерно вдвое более низкой.

Таблица I

Содержание арабита и маннита в свежесобранных уредо-спорах Р. ёгаш1п1Б ггШс! и Р. регвШепв

Возбудитель Раса Содержание Содержание

арабита, маннита,

| мкг/мг мкг/мг

21 78,1 89,2

Р. £гаш1п1в 1г1ис1 17 93,6 98,1

105 92,0 123,1

Среднее 87,916,5 103,5± 13,1

Р. регв1в1епв 52 40,6 59,3

77 46,2 41.2

Среднее 43,4±2,8 50,2±9,0

То обстоятельство, что принадлежность одного вида ржавчины к той или иной физиологической расе значительно не сказывается на содержании полиолов, позволяло рассчитывать на возможность использования указанного показателя для оценки спорообразущей способности гриба при взаимодействии его с разными сортами растения-хозяина. Однако следовало вначале установить, только ли споры накапливают полиолы или какая-то доля этих веществ все же присутствует и в тканях инфицированного листа.

- Параллельный анализ всего инфицированного листа и сформировавшихся здесь уредоспор позволил установить наличие очень важных различий между двумя изучавшимися видами паразитических грибов. Если споры стеблевой ржавчины целиком аккумулировали образовавшиеся в процессе патогенеза полиолы, то в зрелых уредоспо-

pax Сурой ржавчины содержалось только 28-2951 общего количества арабита и маннита, накопленного инфицированным листом (табл. 2). Ранее аналогичные данные были получены при изучении желтой ржавчины ячменя (RelBB et al., 1984). и этот факт приходится учитывать при переходе от результатов количественного анализа полио-лов в инфицированной ткани к данным о массе сформировавшихся уредоспор. Можно, в частности, пользоваться следующими простыми формулами:

X = А/0,6 = 1,7А или Х'= М/0,7 = 1,4М;

У = 29%(А/0,3) = А или У = 28%(М/0,3) = 0,9М где Х- тыс. спор на пустулу стеблевой ржавчины: У- тыс. спор на пустулу бурой ржавчины; А и М -содержание арабита или маннита, мкг на пустулу гриба.

Естественно, что содержание полиолов должно в этом случае определяться в момент полного созревания основной массы спор, т.е. на 14-18-е сут. после инокуляции.

Таблица 2

Содержание арабита и маннита в инфицированном листе (мкг но пустулу) и отделившихся уредоспорах P. graralnls tritici и P. persistans trltlcl

Объект | P.granlnis tritlcl анализа ¡(раса 21 на сорте Маркиз) P.perslctans trltlcl (раса 52 на сорте Тэтчер)

| Арабит Маннит Арабит Маннит

Инфицирован-| 38, 3 !ный лист 1 36,4 28,4 36,3

Отделившиеся1 42,4 споры I 49,5 8,1 10,2

Работоспособность предложенного способа определения массы уредоспор по результатам количественного анализа содержания полиолов в инфицированных листьях шйсници была проверена в экспериментах, включающих несколько сочетаний "сорт-раса патогена" с

различным уровнем совместимости партнеров. Результаты сравнивались с результатами традиционного микроскопического подсчета числа спор, сформировавшееся в каждом варианте. Установлено, что однократное количественное определение содержания полиолов в инфицированной ткани дает вполне адекватное представление о суммарной продуктивности пустул стеблевой и бурой ржавчины пшеницы на протяжении всего периода спорообразования (табл.3,4).

Таблица 3

Сравнительные данные о спорообразовании Р; егаш1п1Б I.БрДгШс1, получение микроскопическим и биохимическим методами, при различной совместимости патогена и хозяина

¡Сорт Раса Содержа- Содержа- Споруляция гриба

пшеницы пато- ние ара- ние ман- (тыс спор на пустулу)

гена бита , мкг нита.мкг

1

и тип на пус- на пус- Данные Рассчитан- Рассчи-

реак- тулу (А) тулу (М) микроско- ная по со- танная по

ции пического держанию содержанию

анализа арабита манкита

| (У) (х1=1,7А) (х2=1, 4М)

[Маркиз 15(4) 38,4 47,2 67,0 65,3 66,1

21 (4) 38,5 36,4 66,5 65,4 51,0

117(3) 43,4 39,5 64,7 73,8 55,3

Редман 15(3-4) 57,6 66,1 119,1 97,9 92,5

Прелюд 117(3) 54,3 63,8 73,4 92,3 89.3

Эксчейндж 21 (4) 51,0 55,8 98,5 87,6 78,1

117(3) 70,3 79,4 115,5 119,5 111.2

|капли 15(1) 2,1 1.7 0,0 2,9 2,4

ГУИ,У12 0,95 0,93

Полученные в экспериментах результаты дали возможность не только предложить простой аналитический метод определения спо-рообразущей способности возбудителей стеблевой и бурой ржавчины в инфицированных ими листьях пшеницы, но и послужили дополнительным основанием для изучения возможности использования данных

Таблица 4

Сравнительные данные о спорообразовании Р.регв1вгепв Г.БрЛгШс1, получение микроскопическим и биохимическим методами

Сорт Раса Содержа- Содержа- Споруляция гриба

пшегащы пато- ние ара- ние ман- (тыс спор на пустулу)

гена бита, мкг нита.мкг

и тип на пус- на пус- Данные Рассчитан- Рассчитан-

реак- тулу (А) тулу (М) микроско- ная по со- ная по со-

ции пического анализа (У) держанию арабита (У 1=А) держанию маюшта (У2=0.3М)

Тэтчер 25(4) 22,2 32,6 31 ,2 22,2 29,3 •

52(4) 27,6 35,0 32,1 27.6 32,2

105(3) 19,5 18, 1 21 ,3 19,5 16,3

Букет 77(4) 21,9 25,9 29,8 21,9 23,3

Ахилл 77(4) 22,3 25,3 25,1 22,3 22.8

гуу1,уу2 °'73 °-92

о содержании полиолов при характеристике степени совместимости указанных партнеров.

Изучение возможности использования данных о содержашт полиолов в проростках пшеници. инФнпиронпшшх возбудителями стсб-лепоП и ОуроП ржавчины, для определения степени совместимости партнеров.

Чтобы получить представление о возможности использования данных по накоплению полиолов в листьях пшеницы, инфицированных возбудителем ржавчинного заболевания, для оценки степени совместимости партнеров, следовало прежде всего подобрать ряд сор-

тов, уровень устойчивости которых к этому патогену точно известен. Именно такие материалы имелись в работе Созерна (Southern, 1978), который на протяжении двух лет в четырех точках штата Миннесота (США) изучал динамику развития стеблевой ржавчины на сортах, существенно более устойчивых, чем универсально восприимчивый сорт Маркиз. Рассчитанные им по результатам этих опытов усредненные величины ПКРБ (площади под кривой развития болезни) могли служить более или менее точно определенной мерой устойчивости сорта к заболевании. Это дало основание использовать изученные Созерном сорта пшеницы для определения темпов накопления полиолов в их проростках как возможного критерия оценки степени совместимости партнеров.

На протяжении нескольких суток после инокуляции полиолы в листьях пшеницы обнаружить не удалось, и только спустя 7 дней было зарегистрировано некоторое количество маннита (табл. 5 ), а еще через сутки - также и арабита у всех изучавшихся сортов (табл. 6). В последующие двое суток содержание полиолов постепенно возрастало. При этом устойчивые к стеблевой ржавчине сорта всегда отличались от универсально восприимчивого сорта Маркиз гораздо более низким содержанием сахароспиртов. Математический анализ полученных данных свидетельствовал о тесной корреляции между накоплением полиолов в инфицированных проростках и уровнем устойчивости к стеблевой ржавчине растений тех же сортов в полевых условиях. Важно, что с размерами площади под кривой развития болезни (ПКРБ) одинаково хорошо коррелировало содержание.и маннита, и арабита и суммарное содержание полиолов.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что содержание полиолов в листьях через 8-10 суток после их инфицирования способно служить адекватной характеристикой степени совместимости сорта пшеницы с возбудителем стеблевой ржавчины. При этом результаты лабораторного эксперимента с использованием молодых растений пшеницы дают возможность судить об отношении сорта к стеблевой ржавчине в полевых условиях при неоднократном реинфи-цировании посева. Вероятно, это особенно важно в тех случаях, когда выявляются сорта, обладающие частичной устойчивостью к заболеванию, поскольку по типу реакции на патоген они визуально не отличаются от восприимчивых. Для устойчивости такого типа харак-

Таблица 5

Накопление маннига в проростках сортов пшеницы, различающихся по степени устойчивости к возбудителю стеблевой ржавчины

Сорт Содержание матшта (мг/г) после

инокуляции через (сут.) X ) ПКРБ1

7 8 9 10 ( Y ) J

Маркиз 1,07 1,81 3,85 4,90 1056,0

Тэтчер 0,07 0,42 0,92 1,82 658,9

Ли 0,16 1,15 0,87 1,97 740,3

Кения 58 0,07 0,14 0,86 0,18 233,9

Мак Мурачи 0,05 0,17 0,24 0,17 286,2

Рэдман 0,26 0,47 1,03 2,00 617,8

Идайд 59 В 0,10 0,14 0,23 0,21 95,0

Эксчейндж 0,1 1 0,13 0,35 0,67 209,1

0,75 0,91 0,82 0,94

1-Ср. площадь под кривой развития болезни, рассчитанная на

основании 2-х летних полевых испытаний проведенных J.Southern в 4-х регионах штата Миннесота (Southern, 1978)

терны пониженная рецептивность и замедленное благодаря этому развитие заболевания, несмотря на формирование полноценных пустул.

Можно было думать, что определение темпов накопления полио-лов в инфищфованных проростках окажется пригодным и для выявления сортообразцов пшеницы, устойчивых к бурой ржавчине. Однако сложность здесь заключалась в отсутствии достаточно полных сведений об уровне устойчивости сортов к этому заболеватш в полевых условиях, аналогичных тем, которые были сообщены Созерном

применительно к стеблевой ржавчине. По этой причине при подборе сортов нам пришлось пользоваться в основном результатами качественной оценки уровня устойчивости к Сурой ржавчине. В качестве универсально восприимчивого использовали сорт Тэтчер (Holte, Statler, 1979); участвовавшие в эксперименте сорта Ахилл и Букет известны как • частично устойчивые с замедленным развитием бурой ржавчины (Beschreibende SortenllBte lur Getreide, Mals Ölfrüchte, Leguminosen (grosskornlng) und Hackfrüchte ausser Kartoffeln, 1985), а сорт Партизанка характеризуется достаточно высокой расоспецифической устойчивостью к этому заболеванию (Во-ронкова, 1980).

Таблица 6

Накопление арабита в проростках сортов пшеницы, различающихся по степени устойчивости к возбудители стебле-' 'вой ржавчины

Сорт пшеницы

Содержание арабита(мг/г)после инокуляции через(сут.) ( X )

8

9

10

ПКРБ

Маркиз Тэтчер Ли ^ Кения 58 Мак Мурачи Рэдман Идайд 59 В Эксчейндж

ГХУ

1,66 ¡0,34 0,23 0,00 0,00 0,50 0,06 |0,00

0.85

2,08 0,53 1,64 0,15 0,06 0,37 0,09 0,00

0,89

4,62 1,43 2,05 1,22 0,11 1,34 0,15 0,34

0,90

4,43 2,67 2,33 0,12 0,31 2,18 0,29 0,80

0,97

1-Ср. площадь под кривой развития болезни, рассчитанная на основании 2-х летних полевых испытаний проведенных J.Southern в 4-х регионах штата Миннесота (Southern, 1978)

Сравнительное изучение характера накопления полиолов в инфицированных возбудителем бурой растениях пшеницы указанных сортов показало, что наиболее энергично этот процесс протекал в

листьях воспрш!мчивого сорта Тэтчер и был гораздо менее интенсивным в листьях сортов, обладающих той или иной степенью устойчивости к патогену.

Полученные данные можно рассматривать как свидетельство того, что количественное определение полиолов в инфицированных проростках пшеницы может быть полезным также и при выявлении сортообразцов, устойчивых к бурой ржавчине.

Изучение возможности оценки эффективности противоржавчиншх фунгицидов по количеству полиолов в инфицированных растениях пшеницы

Количественное определение этих специфически "грибных" углеводов могло оказаться полезным методическим инструментом и при исследовании средств защиты растений от болезней, т.е. прежде всего фунгицидов. Дело в том, что обычно использующаяся в этих случаях -фитопатологами, иммунологами и токсикологами визуальная оценка степени поврежденности растений, весьма уместная при предварительном отборе эффективных препаратов, оказывается недостаточно "чувствительной" во многих других ситуациях. К ряду таких ситуаций нужно отнести, например, определение сравнительной Фунгитоксичности достаточно близких между собой веществ, вы-явлеше особенностей действия фунгитоксичных веществ при защитных и искореняющих обработках, длительность сохранения их биологической активности в растительных тканях и т.п.

Опираясь на полученные данные, мы предположили, что какую-то роль в этой работе мог бы сыграть и количественный анализ полиолов. Особую ценность этот метод мог бы уметь при отборе Фунгицидов, действие которых проявляется прежде всего в подавлении спорообразования, поскольку полиолы являются, ' видимо, конституентами преимущественно спор и спорогенных тканей (Иевз ег а1., 1984).

Проведешше исследовашш показали, что под влиянием байле-тона и тилта - эффективных противоржавчиншх фунгицидов содержание полиолов в инфицированных стеблевой ржавчиной расте!шях пшеницы заметно уменьшается в сравнении с необработанным контролем (табл.7). Степень влияния на содержание арабита и машшта прямо зависела от концентрации раствора фунгицида, используемого как для защитной, так и для искореняющей обработки.

Таблица 7

Влияние байлетона и тилта на содержание полиолов в растениях пшеницы сорта Маркиз, инфицированных стеблевой ржавчиной

Концентрация Содержание полиолов, мг/г под влиянием фунгици-

фунгицида, дов, через 9 сут. после инокуляции

% по д. в.

байлетон тилт

арабит маннит арабит маннит

Защитная обработка (за сутки до инокуляции)

0,02 0,05 0,04 0,09 0,09

0,004 0,44 0,37 0,02 0,04

0,0008 0,46 0,36 0,25 0,18

0,000)6 0,66 0,83 0,49 0,34

0,000032 0,76 0,59 0,51 0,34

0 2,47 2,02 2,47 2,02

Искореняющая обработка (через сутки после инокуляции)

0,02 0,02 0,05 0,08 0,07

0,004 0,01 0,04 0,01 0,01

0,0008 0,82 0,28 0,02 0,04

0,00016 1,81 1,30 0,05 0,06

0,000032 2,06 1,57 0,56 0,41

0 3,27 2,95 3,27 2,95

Количественный анализ "грибных" углеводов в инфицированных растениях способен дать и такую информации, которую невозможно получить, оперируя лишь визуальной оценкой площади пораженной поверхности листа. Так, визуальная оценка эффективности обработки пшеницы фунгицидами через сутки после инокуляции возбудителем стеблевой ржавчины позволила констатировать только слабо выра-

женное превосходство тилта над байлетоном (табл.8). Между тем тилт рекомендуется применять для обработки посевов в дозах,вдвое более низких, чем байлетон (Справочник по пестицидам, 1985), что может быть следствием по крайней мере вдвое более высокой фунги-токсичности тилта. Интересно, что именно такой уровень различий в эффективности этих двух фунгицидов удалось констатировать по результатам определения содержания арабита и маннита в инфицированных стеблевой ржавчиной листьях пшеницы (табл.8). Это дает основания полагать, что предлагаемое биохимическое тестирование может дать достаточно верную характеристику уровня фунгитоксич-ности изучаемых соединения.

Таблица 8

Сравнительная эффективность байлетона и тилта по отношению к стеблевой ржавчине при искореняющей обработке

(через сутки после инокуляцшО

Фунгицид Концентрация фунгицида, 7, по д. в. Уменьшение пло- г щади пораженной поверхности, X в сравнении с незащищенным контролем —...------- .. . Снижение содержа- В ния полиолов, X в сравнении с не- 1 защищенным контро-1 лем 1

арабит маннит |

байлетон 0,00016 0,000032 .-64,3 57,1 44,6 36,9 56,1 I 46,8 I

тилт 0,00016 0,000032 86,2 78,9 98,6 83,0 98,0 86,0 |

1 - Данные получены через 12 сут. после инокуляции

2 - Данные получены через 9 сут. после инокуляции

Таким образом, количественный анализ полиолов, дающий представление о развитии ржавчинных грибов в растительной ткани, может служить удобным методическим приемом при токсикологических исследованиях, поскольку он позволяет получить более полные, а иногда и более точные сведения об особенностях проявления фунт-токсичности изучаемых соединений.

ВЫВОДЫ

1. Разработана газо-хроматографическая процедура анализа Сахаров, которая позволяет определять до 1 мкг углевода в образце. При этом возможно одновременное количественное определение растительных Сахаров (арабиноза, рамноза, фруктоза, галактоза, глюкоза, сахароза) и специфически грибных метаболитов (полиолы и трегалоза) как в инфицированных возбудителем ржавчинных заболеваний пшеницы растительных тканях, так и в уредоспорах ржавчинных грибов. Метод основан на двухстадийной процедуре дериватиза-ции углеводов и ГЖХ количественном анализе дериватов с применением многоступенчатой температурной программы нагрева колонки и пламенно-ионизационного детектора.

2. Показано, что по составу углеводов между растениями пшеницы и возбудителями ржавчинных заболеваний имеются не количественные, а качественные различия. Уредоспоры стеблевой и бурой ржавчины содержат большое количество (до 100 мкг/мг) арабита и маннита, а также трегалозу, которые совершенно отсутствуют в растениях пшеницы.

3. В инфицированных стеблевой и бурой ржавчиной листьях восприимчивых растений пшеницы арабит и маннит обнаруживали только на 7-е сутки после инокуляции. Затем содержание полиолов постоянно возрастало и достигало максимума к началу споруляции.

4. Уровень содержания полиолов является признаком, свойственным виду возбудителя ржавчины и не зависит от принадлежности уредоспор гриба к той или иной физиологической расе. Это обстоятельство позволило предложить методику оценки спорули-рувдей способности стеблевой или бурой ржавчины в инфицированных листьях, основанную на количественном определении в них арабита и маннита.

5. Темпы накопления полиолов в листьях сортов пшеницы, различающихся по степени устойчивости к стеблевой или бурой ржавчине, зависели от степени совместимости партнеров. Это дало возможность предложить количественный анализ арабита и маннита в инфицированных листьях для определения уровня устойчивости сортов к ржавчине.

6. Количественный анализ полиолов в инфицированных листьях пшеницы оказался пригодным для определения сравнительной эффек-

тивности про тиворжавчинных фунгицидов и изучения особенностей прявления их активности при защитных и искореняющих обработках.

По материалам диссертации подготовлены методические рекомендации "Биохимическая оценка устойчивости пшеницы к стеблевой и бурой ржавчине", одобренные бюро отделения растениеводства и селекции BACXH1UI.

СПИСОК РАБОТ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Стекольщиков М.В., Артеменко E.H., Чкаников Д.И. Накопление полиолов в растениях пшеницы, инфицированных возбудителем стеблевой ржавчины// Тезисы докладов совещания "Физиолого-биохи-мические основы иммунитета растений к грибным болезням". - Уфа, 1988. - С. 89-90.

2. Стекольщиков М.В., Артеменко E.H., Умнов A.M. Газохрома-тографический метод определения углеводов в растительных тканях. В кп: "Современные методы исследований в растениеводстве" - Ленинград, 1989. - С. 33-35.

3. Стекольщиков М.В., Артеменко E.H., Чкаников Д.И. Роль сахароспиртов (полиолов) в патогенезе стеблевой ржавчины пшеницы // Тезисы докладов второго Всесоюзного общества физиологов растений. - Минск, 1990. - С. 87.

4. Стекольщиков М.В., Артеменко E.H., Чкаников Д.И. Возможность использования данных о содержании сахароспиртов (полиолов) при оценке степени устойчивости сортов пшеницы к стеблевой ржавчине // Физиология и биохимия культурных растений. - 1991. - Т. 23.N.I. - С. 75-79.

5. Чкаников Д.И.. Гринченко С.Г..Артеменко E.H.,Умнов A.M., Найденова В.Н., Микитюк Л.В., Стекольщиков М.В. и др. Биохимическая оценка степени частичной устойчивости пшеницы к стеблевой и бурой ржавчине // Методические рекомендации. - Москва, 1990. -24 С.