Фено-, генотипическая изменчивость бруцелл и разработка экспресс-метода оценки их иммуногенности

Панкова, Екатерина Витальевна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Фено-, генотипическая изменчивость бруцелл и разработка экспресс-метода оценки их иммуногенности
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Фено-, генотипическая изменчивость бруцелл и разработка экспресс-метода оценки их иммуногенности"

На правах пукопш:

005054361

Панкова Екатерина Витальевна

ФЕНО -, ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ БРУЦЕЛЛ И РАЗРАБОТКА ЭКСПРЕСС - МЕТОДА ОЦЕНКИ ИХ ИММУНОГЕННОСТИ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 1 НОЯ 2012

Казань - 2012

005054361

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»)

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, доцент

Плотникова Эдие Миначетдиновна

Официальные оппоненты: заведующая лабораторией иммунологии

ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», доктор биологических наук, профессор Хисматуллина Наиля Анваровна профессор кафедры эпизоотологии Казанской государственной академии ветеринарной медицины, доктор ветеринарных наук Харитонов Михаил Васильевич

Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллёза и туберкулёза животных» (г. Омск)

Защита состоится «13» ноября 2012 г. в И) часов на заседании диссертационного совета Д - 220.012.01 при ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (420075, г. Казань, Научный городок-2, ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»),

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г.Казань).

Автореферат разослан «10» октября 2012 г. и размещен на официальном сайте ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» www.vnivi.ru и на официальном сайте ВАК РФ www.vak2.ed.gov.ru.

Ученый секретарь /7

диссертационного совета

Степанов В.И.

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В результате экологического воздействия на возбудителя бруцеллеза антропогенных факторов (длительная персистенция в организме носителей, промежуточных хозяев, длительное хранение музейных культур, широкое применение антибиотиков и дезинфицирующих средств, массовая вакцинация животных), участились случаи появления измененных форм бруцелл, в частности R- и L-форм (Триленко П.А., 1976; Проворский C.B. с соавт., 1981; Хузин Д.А., 1990; Плотникова Э.М. с соавт., 1994).

Известно, что в процессе хранения музейных культур эпизоотических и вакцинных штаммов нередко происходят изменения как фенотипических, так и генетических характеристик, отражаясь на основных свойствах -вирулентности эпизоотических штаммов и иммуногенности вакцинных штаммов. Определение принадлежности таких атипичных культур к роду Brucella, а также их дифференциация от антиген - родственных гетерологических микроорганизмов, а также иммуногенности вакцинных штаммов по общепринятым методам весьма трудоемки, продолжительны и требуют значительных материальных затрат (Салмаков K.M. с соавт., 2008).

Успешное решение проблемы бруцеллеза возможно только при внедрении в широкую практику эффективной научно-обоснованной системы мероприятий с использованием наиболее совершенных средств и методов диагностики и специфической профилактики болезни, актуальность разработки которой возрастает в последнее время с учетом изменения форм ведения сельского хозяйства (Иванов A.B. с соавт., 2009).

Важное место в комплексе противобруцеллезных мероприятий занимает специфическая профилактика (Иванов A.B. с соавт., 2008; Иванов A.B. с соавт., 2012). В последние годы в нашей стране широко используется вакцина из слабоагглютиногенного штамма B.abortus 82. В ряде мест ее применение способствовало достижению определенных успехов в борьбе с бруцеллезом крупного рогатого скота (Салмаков K.M., 1980; Никифоров И.П.

с соавт., 1981; Исхаков 0.3. с соавт., 1981, 1986; Черкасов В.В., Ростов А.П., 1981; Косилов И.А. с соавт., 1986). Однако существенным недостатком этой вакцины является ее высокая реактогенность, обуславливающая большой процент абортов у стельных животных (Шумилов К.В. с соавт., 1983; Скляров О.Д., с соавт., 2004). Кроме того, при проведении противобруцеллезных мероприятий (иммунопрофилактика и антибиотикотерапия) в очагах инфекции с использованием указанной вакцины и антибиотиков резко снижается лечебно-профилактический эффект этих средств, что связано с губительным действием применяемых антибиотиков не только на возбудителя инфекции, но и на вакцинные штаммы бруцелл. Использование для этих целей пенициллинчувстви-тельного (В.abortus 82 Пч) и стрептомицинрезистентного (В.abortus 82 St) вариантов шт. 82, также малоэффективно, поскольку эти антибиотики при бруцеллезе малоэффективны и, во-вторых, они высокотоксичны (Кайтмазова Е.И., 1962).

Наиболее перспективным в этом направлении является использование антибиотиков широкого спектра действия, в частности ципролета, который является гораздо менее токсичным и обладает более широким терапевтическим действием (Плотникова Э.М. с соавт., 2009).

Учитывая, что оценка иммуногенности вакцинных штаммов бруцелл на сегодняшний день несовершенна, поскольку она предполагает обязательное последующее заражение иммунизированных животных вирулентным штаммом возбудителя бруцеллеза, диктуется необходимость проведения исследований в этом направлении (Григорьева Г.И. с соавт., 1998).

Из вышеуказанного следует, что разработка простых и надежных методов идентификации бруцелл (в т.ч. измененных форм) и определение иммуногенности вакцинных штаммов с использованием достижений современной биотехнологии (состава мембранных белков, гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК, а также по способности синтеза

медиаторов иммуногенеза-цитокинов), является актуальной задачей ветеринарной медицины.

Цель и задачи. Целью исследований явилось изучение влияния различных факторов на фено-, генотипические свойства бруцелл и разработка экспресс - метода оценки их иммуногенности.

Исходя из цели, на решение проблемы были поставлены следующие задачи:

- изучить культурально-морфологические и биохимические свойства музейных и эпизоотических штаммов бруцелл;

- изучить полипептидный состав экзобелков бруцелл;

- провести сравнительный анализ степени гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК музейных штаммов и изолятов, выделенных из организма животных-носителей возбудителя;

- разработать и апробировать способ оценки иммуногенности вакцинных штаммов бруцелл по их цитокининдуцирующей способности.

Научная новизна. Впервые изучены в сравнительном аспекте культурально - морфологические, биохимические, антигенные свойства, полипептидный состав и степень гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК 58 культур бруцелл производственных, музейных штаммов и изолятов, выделенных из организма носителей возбудителя животных.

Дана сравнительная оценка эффективности методов оценки фенотипических и генотипических характеристик различных штаммов бруцелл для их достоверной идентификации и дифференциации.

Установлена корреляция между иммуногенностью вакцинных штаммов и их способностью индуцировать синтез медиаторов иммуногенеза -цитокинов. Предложен способ использования цитокинового профиля сывороток привитых испытуемыми штаммами животных в качестве оценочного критерия иммуногенности потенциальных вакцинных препаратов.

Практическая значимость. На основании изучения фенотипических, генотипических и цитокининдуцирующих свойств различных штаммов бруцелл получен антибиотикорезистентный вариант - В.abortus 82Ц и предложен для дальнейшего изучения как перспективный штамм в качестве исходного для получения вакцины против бруцеллеза животных.

Предложен для практики способ экспресс - метода оценки иммуногенности вакцинных штаммов бруцелл путем определения цитокинового профиля сывороток крови животных, иммунизированных испытуемыми вакцинными препаратами.

Результаты исследований использованы при составлении «Методических рекомендаций по индикации и дифференциации отдельных видов бруцелл с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени», утв. директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» проф. Ивановым A.B. 11 октября 2011 г.; «Методических указаний по применению иммуноферментного анализа (ИФА) для серодиагностики бруцеллеза» и «Временной инструкции по изготовлению и контролю набора диагностических препаратов для дифференциальной диагностики бруцеллеза», утв. начальником Главного управления ветеринарии КМ РТ Камаловым Б.В. 26 июля 2011 г.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на научных сессиях Ученого совета ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по итогам НИР за 2008 - 2012 гг., на Международных научно-практических симпозиумах и конференциях (г. Саратов, 2011; г. Москва, 2012).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 научных работ, в том числе 3 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Основные положения, выносимые на защиту:

- фенотипические и генотипические характеристики штаммов бруцелл в зависимости от персистенции в различных условиях;

- разработка способа экспресс - метода оценки иммуногенности вакцинных штаммов бруцелл методом иммуноферментного анализа;

- результаты апробации эффективности способа оценки иммуногенности полученного штамма B.abortus 82Ц.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 198 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов исследований, выводов, практических предложений и приложений.

Материалы диссертации иллюстрированы 26 таблицами и 11 рисунками. Список литературы содержит 277 наименований работ, в том числе - 89 зарубежных авторов.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы и методы исследований

Работа выполнена в 2008-2012 гг. в лаборатории по хранению и изучению штаммов возбудителей особо опасных болезней (музей штаммов) ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» в соответствии с тематическим планом НИР (№ госрегистрации 01200202602).

В экспериментальных исследованиях использовали 58 штаммов бруцелл, в том числе 42 вирулентных: B.abortus, В.suis, B.melitensis и B.rangiferi, 6 вакцинных: В. abortus R-1096- (R-форма), 82- (SR-форма), 82Ц-(SR-форма), 82-Пч- (SR-форма), 19- (S -форма), Rev-1- (S-форма) и 10 эпизоотических штаммов вида B.rangiferi и B.suis, выделенных из организма диких оленей, волка, собак, горностая, дикого и клеточного песца, свиньи, а также 4 гетерологичные культуры: (Yersinia enterocolitica 0-9, Salmonella Dublin, Chlamydiales, Francisella tularensis), полученные из Щелковского биокомбината, музея штаммов ВГНКИ и музея штаммов лаборатории ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»; 12 видов антигенов бруцелл, 17 видов гипериммунных, антивидовых сывороток и антисывороток, диагностикумы собственного и производственного изготовления.

В экспериментальных исследованиях, производственных и комиссионных испытаниях были использованы: 320 белых мышей живой

массой 18-20 г, 180 морских свинок живой массой 400-450 г, 6 кроликов живой массой 2,0-3,5 кг.

В рутинных микробиологических и иммунологических исследованиях применяли различные стандартные растворы, питательные среды, метаболиты, биохимические реактивы, ферменты, стимуляторы иммуногенеза, красители.

Фенотипические свойства бруцелл изучали путем использования культурально-морфологических, серологических, бактериологических, иммунологических и других методов исследований по общепринятой схеме ФАО/ВОЗ.

Биохимические, тинкториальные и биологические свойства исследуемых культур определяли согласно общепринятым в микробиологии бруцеллеза методам (Студенцов К.П., 1975).

Культуры бруцелл выделяли из организма привитых, экспериментально и спонтанно зараженных животных бактериологическим методом. Выделенные культуры бруцелл идентифицировали, используя реакцию агглютинации на стекле с применением S- и R-сывороток. Учитывали индекс инфицированности (ИИ), индекс веса селезенки (ИВС) и процент иммунных животных.

Индекс веса селезенки (ИБС) определяли по формуле:

Вес селезенки (г) х 1000

ИВС— —-——

Вес морской свинки (г)

Интенсивность обсеменения организма морских свинок культурами бруцелл вычисляли по формуле:

ах 100

Х-- где

в х с

X - индекс инфицированности (ИИ) в %;

а - число органов и лимфатических узлов, из которых выделены культуры бруцелл;

в - число морских свинок в опыте;

с - число органов и лимфатических узлов, взятых для посева от каждого животного.

Определение вирулентных свойств культур проводили в опытах на 50 морских свинках и белых мышах в соответствии с «Методическими рекомендациями по определению вирулентности штаммов бруцелл на лабораторных животных» (1984). О степени вирулентности культур судили по количеству павших мышей в каждой группе путем определения летальной дозы, вызывающей гибель 50% животных в группе (LD50), вычисленной по методу Рида и Менча.

Изучали антигенные и иммуногенные свойства у штаммов-изолятов, выделенных из организма животных спонтанно зараженных возбудителем бруцеллеза, а также длительно хранившихся музейных культур. Антигены бруцелл выделяли непосредственно из микробной клетки путем физико-химического воздействия на клетку УФ - лучами, термо - водно - солевого, этанолового, фенолового, кислотного экстрагирования и ультразвукового дезинтегрирования, используя методы, предложенные Ременцовой М.М. с соавт. (1979); Фоминым A.M. (1984); Diaz R. е.а. (1968), Dubray G. (1983).

Липополисахаридный антиген из S- форм бруцелл (шт.19,99) выделяли по методу Stiller I.M., Nielsen К.Н. (1983), Nielsen К.Н. е.а. (1983) водно-фенольным методом с последующей обработкой 0,5 N NaOH (конечная концентрация 0,25N NaOH) при 56°С в некоторой модификации.

Качественный и количественный состав полисахаридов устанавливали с использованием антронового реактива и метода хроматографического анализа на бумаге в системе бутанол - уксусная кислота - вода.

Белок в антигенных препаратах определяли по методу Lowiy (1951), а в присутствии неионного детергента-тритона Х-100 - по методу Chi-Sun Wang, Smith R.L. (1975). Получение ЛПС и его концентрацию определяли по методу Weisbach A., Hurwitz J. (1984). Антигены внешней мембраны гладких (S-) и шероховатых (SR-) форм бруцелл получали путем действия на

микробные клетки неполным детергентом-тритоном Х-100 и хелати-рирующим агентом-ЭДТА (Deiterich D. е.а., 1977). Серологическую активность полученных антигенов тестировали в непрямом сэндвич -варианте ИФА с использованием иммуноферментных конъюгатов на основе соответствующих меченых пероксидазой антисывороток.

Полипептидный состав белков внешней мембраны бруцелл изучали электрофоретически по методу Laemmi U.K. (1969). Электрофорез белков проводили в 7,5% -ном полиакриламидном геле, денситометрировали на микрофотометре ИФО-451.

Для дифференциации штаммов бруцелл, выделенных от диких животных, а также длительно хранившихся в музее штаммов, проводили генодиагностические исследования с использованием метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). Выделение ДНК, подготовку проб и проведение реакции ПЦР-РВ осуществляли в соответствии с разработанными сотрудниками ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» «Методическими рекомендациями по индикации и дифференциации отдельных видов бруцелл с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени» (Казань, 2011). Для постановки ПЦР праймеры сконструировали в программе Vector NTT. При проведении реакции использовали Tag-полимеразу фирмы «Сиб Энзим» и олигонуклеотида фирмы «Синтол».

С целью изучения гуморального иммунитета в исследованиях применяли серологические реакции: роз - бенгал пробу (РБП) с роз - бенгал антигеном, агглютинации (РА), пассивной гемагтлютинации (РПГА), связывания комплемента (РСК) и иммуноферментный анализ (ИФА) с единым бруцеллезным и R-антигенами.

При изучении клеточного иммунитета использовали опсонофагоци-тарную реакцию (ОФР), которую ставили по методике Штритера В.А. (1939), вычисляли фагоцитарное число.

Иммуногенные свойства испытуемых культур изучали в соответствии с общепринятыми методами путем контрольного заражения иммунизирован-

ных животных вирулентным штаммом возбудителя бруцеллеза и определяя уровень защиты на фоне применения препарата с параллельными серологическими (титры специфических антител), бактериологическими (индикация возбудителя) и иммуноклеточными (опсонофагоцитарное число -ОФЧ) исследованиями. Для экспресс - метода оценки иммуногенности потенциальных вакцинных препаратов использовали in vitro и in vivo тест -систему-цитокининдуцирующую активность антигенов испытуемых культур. Уровень синтеза цитокинов определяли методом ИФА с использованием коммерческих наборов цитокинов и моноклональных антицитокиновых антител производства ТОО «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург).

Цифровой материал подвергали статистической обработке на персональном компьютере общепринятыми методами вариационной статистики (Плохинский H.A., 1978) с вычислением средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (±ш), среднеквадратического отклонения (ст) и коэффициента корреляции (г) с использованием программы Microsoft Excel.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 Фенотипические свойства различных штаммов бруцелл Учитывая, что в опытах нами были использованы штаммы бруцелл различного происхождения (выделенные от различных видов домашних и диких животных), находившихся под воздействием различных факторов (резкие перепады температур при лиофилизации и длительное хранение в условиях музея, персистенция в организме животных с различным уровнем антимикробной защиты), необходимо было выяснить, насколько влияют указанные факторы на бруцелл в процессе взаимодействия экосистемы «микроб + фактор воздействия».

С учетом изложенного, на 1-м этапе работы, в соответствии с 1-й задачей, проводили изучение культурально-морфологических, тинкториаль-ных, биохимических и антигенных свойств 58 штаммов различных видов бруцелл - В.abortus, B.melitensis, В.suis и B.rangiferi.

В опытах были использованы 3 группы штаммов: 1) вакцинные, длительно хранившиеся в лиофилизированном виде в условиях музея; 2) вирулентные, длительно хранившиеся в условиях музея в лиофилизированном виде и 3) эпизоотические штаммы, хранившиеся в условиях музея в лиофилизированном виде, выделенные из организма домашних и диких животных.

Результаты изучения фенотипических свойств штаммов бруцелл 1-й и 2-й групп показали, что лиофилизация культур и длительное (более 5 лет) хранение их при температуре 6±2°С не оказывало существенного влияния на культурально-морфологические, антигенные и вирулентные свойства микробов.

Однако они претерпевали некоторые изменения фенотипических свойств, которые выражались в способности продукции Н25, фагочувствительности, изменении метаболизма тионина, акрифлавина, фуксина, антибиотикочувствительности, агглютинабельности, термоагглютинации. Указанные изменения культурально-биохимических свойств были временными - при последующих пассажах через организм животных они приобретали типичные для этих культур исходные свойства. Исключение составил шт. В.те1кепз1з 356, он в процессе хранения трансформировался из 5- в 11-форму, сохранившую стабильность и после пассажа на морских свинках - реверсии в Б-форму не последовало. Степень диссоциации при этом составляла 1,8 %.

Одновременно следует отметить, что ряд культур, при применении общепринятых методов идентификации, вследствие изменения фенотипических свойств, имели отклонения от видовых признаков, а по некоторым (антигенности) - имели схожие с гетерологичными культурами (У.егиегосоШса, Б.сЗиЫт) свойства, что представляло определенные трудности при их идентификации.

При параллельном изучении фенотипических свойств 3-й группы эпизоотических штаммов бруцелл, выделенных из организма домашних

(свиньи, собаки) и диких (олени, песцы, зайцы, волки) животных установлено, что по ряду признаков они имели некоторые отклонения от типичных для этого вида бруцелл. В первую очередь эти изменения касались трансформации культур из S- в RS- и R-формы. Так, B.rangiferi В-307, B.rangiferi П-278 и B.rangiferi П-271, выделенные от волка, дикого песца и клеточного песца, находились в RS-форме, a B.rangiferi С-227 и B.rangiferi 226 - в R-форме, у которых этот признак при пассировании через организм морских свинок сохранялся.

RS- и R-трансформация культур сопровождалась с одновременным изменением биологических свойств, в частности, вирулентности: R-трансформанты оказались авирулентными, а RS-трансформанты слабовирулентными. B.rangiferi шт. 0-172, выделенный от дикого оленя и B.rangiferi шт. С-227, выделенный от собаки, не лизировались фагом «Тб». Указанные признаки трансформации оказались стабильными - при последующих пассажах через организм морских свинок реверсии культур к исходным признакам не наблюдалось. При этом степень диссоциации культур составляла 30%.

Таким образом, персистенция возбудителя в организме диких (волки, песцы) и домашних (собаки) животных сопровождалась значительными изменениями фенотипических свойств, что создавало определенные трудности при их идентификации.

3.2 Изучение белкового состава клеточной мембраны бруцелл

Учитывая сведения о возможности идентификации сальмонелл и микобактерий по белковому спектру (Алимов A.M., Коксин В.П., 1997), для идентификации бруцелл нами был использован метод диск-электрофореза лизатов микробов в полиакриламидном геле.

Результаты проведенных исследований показали, что основное количество полипептидов лизата клеток бруцелл распределялось в пределах молекулярных масс от 12,3 до 80 кД, где выявлялось до 24 фракций при градиенте концентрации ПААГ 12,5-20%.

При этом каждый вид бруцелл обладал определенным набором характерных фракций. Характерными для всех видов бруцелл являлось достаточно широкое расположение интенсивно окрашенных фракций по всей длине геля. По характеру расположения крупных и средних белковых фракций отмечалось сходство бруцелл видов abortus-melitensis и suis-canis. Однако имелись видовые и даже штаммовые отличия белковых фракций бруцелл. Так, например, для вида B.abortus отмечалась характерная фракция полипептидов с М.м. около 32 кД. Кроме того, у штамма B.abortus 54 имелись в спектре белков еще две мажорные фракции с М.м. 64 кД и 36 кД.

Результаты изучения белкового спектра бруцелл различного происхождения показали межвидовую и внутривидовую общность и отличия. Так полипептид с молекулярной массой 37-40 кД, выявляемый у штаммов B.abortus и B.melitensis, отсутствовал у других видов бруцелл. В отличие от вида B.abortus, у эпизоотических штаммов В.suis и B.rangiferi, независимо от объекта выделения (олень, заяц, песец, волк), были выявлены характерные для данных видов две низкомолекулярные пептидные фракции с М.м. 25-30 кД.

Таким образом, установлено, что белковый спектр экзопродуктов бруцелл имел уникальный характер. Вместе с тем можно выделить и общие для всех видов признаки по наличию крупных фракций. На наш взгляд, сравнительное изучение электрофоретических характеристик экзобелков бруцелл может быть использовано при штаммовой дифференциации этих бактерий.

Однако в условиях воздействия на бруцеллы экологических факторов (дезинфицирующих средств, антибиотиков, высоких и низких температур и т.д.) происходят значительные изменения таксономических признаков возбудителя, что создает трудности при его идентификации. Поэтому использование общепринятых методов идентификации бруцелл в таких случаях нередко приводит к ошибочным результатам.

3.3 Изучение степени гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК у различных видов и штаммов бруцелл

Как показали проведенные ранее исследования, наиболее достоверным методом ускоренной идентификации микроорганизмов бруцелл является определение степени гомологии нуклеотидных последовательностей их ДНК.

В связи с этим проводили генетическую идентификацию тест-штаммов в реакции ДНК-ДНК гибридизации с целью подтверждения или исключения их принадлежности к роду Brucella.

При этом нами были подвергнуты анализу 30 культур, из которых 14 -вирулентных, 10 - эпизоотических (выделенных из органов диких и домашних животных в основном - вида B.suis, B.rangiferi) и 6 - вакцинных штаммов, хранившихся в лаборатории музей штаммов в течение 5 и более лет.

Для определения степени гомологии нуклеотидных последовательностей вышеуказанных штаммов бруцелл различного происхождения, использовали метод полимеразной цепной реакции в реальном времени -ПЦР-РВ.

Молекулярно-генетические исследования проводили в 2 этапа: выделение ДНК и постановка ПЦР-РВ.

Для постановки полимеразной цепной реакции, сконструировали праймеры в программе Vector NTI, используя Taq-полимеразу фирмы «СибЭнзим» и олигонуклеотиды фирмы «Синтол».

Результаты ПЦР-РВ анализа различных видов бруцелл с использованием 3 вариантов ПЦР (ПЦР-1, мультиплекс ПЦР-2 и ПЦР-3) и 6 видов праймеров (PI (bsp31), Р2 (IS711), РЗ (IS711), Р4 (R0952), Р5 (BMEU 0635-0636) и Р6 (А0504) показали, что все виды бруцелл проявляли положительную реакцию с указанными праймерами, т.е. все они принадлежали роду Brucella, однако при этом каждый вид имел свои особенности. Так, B.abortus вступал в ПЦР с праймерами Р1 и Р2; B.melitensis - PI и РЗ; B.suis - PI и Р4; B.ovis - PI и Р6; B.canis - PI, Р4 и Р5.

Для подтверждения достоверности реакции «гнездового» варианта ПЦР, параллельно проводили идентификацию изучаемых культур по их характеру флуоресценции в зависимости от номера цикла. Установлено, что использованные штаммы бруцелл имеют существенные отличия по характеру флуоресценции в зависимости от цикла амплификации и каждому виду бруцелл свойственна своя специфика флуоресценции.

Таким образом, в результате проведенных в первой серии опытов по идентификации различных видов музейных штаммов бруцелл с использованием 6 различных праймеров установлено, что все они имели идентичные для рода Brucella ДНК, которая выявлена у всех бруцелл при использовании праймера PI (bsp31) в варианте ПЦР 1.

Полученные в 1-й серии опытов положительные результаты по генотипической идентификации вирулентных и вакцинных штаммов бруцелл послужили основанием для продолжения опытов по ПЦР идентификации эпизоотических штаммов - изолятов бруцелл, выделенных из организма сельскохозяйственных (свиньи) и диких (олени, песцы, волки, зайцы) животных, обитающих на Крайнем Севере, Калининградской области РФ, Польше и Казахстане.

Поскольку выделенные из организма диких животных варианты бруцелл (B.rangiferi и В.suis) по фенотипическим свойствам имели значительные отличия от референтного штамма В.suis 1330, сочли необходимым провести определение степени гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК эпизоотических штаммов, выделенных из органов и тканей диких животных-носителей бруцелл. Результаты молекулярно-генетических исследований в ПЦР-РВ показали, что степень гомологии нуклеотидных последовательностей их ДНК, независимо от показателя вирулентности или степени диссоциации, была практически однозначной в пределах 85,0-100%.

Эпизоотические штаммы В.suis 117, В.suis 1005 (биотип 3) и B.suis 164, независимо от источника выделения, различия регионов и степени

диссоциации (S-, SR-формы), имели высокую степень гомологии с ДНК референтного штамма B.suis 1330 (84,3-100,0). Эти данные свидетельствуют о тесном генетическом родстве бруцелл и, что их SR-диссоциация не приводит к значительным перестройкам в нуклеотидной последовательности их ДНК, независимо от показателя вирулентности или степени диссоциации, подтверждающим или исключающим принадлежность микроорганизмов к роду Brucella, в то же время ДНК фенотипически сходных микроорганизмов (Y.enterocolitica) и общие нуклеотидные последовательности ДНК микроорганизмов рода Brucella практически отсутствуют - степень их гомологии составляла всего 0,1-0,5%.

Аналогичную степень гомологии с ДНК референтного штамма имели штаммы бруцелл-изолятов, выделенных из организма диких северных оленей, (степень гомологии 100,0%), волка (91,3%), собак (89,7% и 93,5%), горностая (96,1%), дикого песца (90,3%), клеточного песца (88,9%).

Таким образом, полученные данные подтверждают, что характерной особенностью микроорганизмов рода Brucella является высокая гомологичность их ДНК и отсутствие гомологии с представителями других родов. При этом изменчивость бруцелл (диссоциация, трансформация и т.п.) не ведет к заметной дивергенции их генома. Следовательно, метод ДНК-ДНК гибридизации не только дополняет общепринятую систему тестов идентификации бруцелл, но и во многих случаях является единственным достоверным показателем принадлежности штаммов к роду Brucella.

3.4 Изучение влияния различных факторов на иммуногенную активность вакцинных штаммов бруцелл

Как было показано выше, под воздействием экологических факторов (резкие перепады температур, персистенция в организме с различным уровнем антимикробной защиты), возбудитель бруцеллеза претерпевал ряд фенотипических и генотипических изменений. При этом наиболее высоким бактериоизменяющим свойством обладают такие факторы как бактериофаги

и антибиотики, что послужило основанием для получения из вирулентного штамма высокоиммуногенного мутанта В. abortus 82 (Салмаков K.M. 1980).

Однако, несмотря на высокую иммуногенную активность шт. 82, при проведении противобруцеллезных мероприятий в очагах с использованием указанной вакцины для специфической профилактики и антибиотикотерапии приводит к существенному снижению эффективности иммунопрофилак-тического препарата, что связано с губительным действием антибиотиков как на вирулентные, так и вакцинные штаммы бруцелл.

Известно, что для лечения бруцеллеза широко применяют пенициллин, стрептомицин, левомицетин и другие антибиотики. Однако высокая токсичность указанных антибиотиков, особенно стрептомицина, препятствуют широкому применению указанных препаратов при проведении противобруцеллезных мероприятий.

Учитывая широкий спектр антибиотического (грамположительные и грамотрицательные бактерии) и терапевтического действия, включая заболевания опорно-двигательного аппарата и мочеполовых органов нового антибиотика - ципролета, для получения антибиотикоустойчивого мутанта вакцинного штамма бруцелл в качестве индуктора использовали указанный антибиотик из класса фторхинолонов.

Путем выращивания исходного штамма 82 В. abortus на средах с возрастающими концентрациями (5, 10, 20 мг/л) ципролета, на 50-м пассаже нами был получен антибиотикорезистентный вариант В.abortus 82 Ц, который сохранял стабильность приобретенного свойства при 50-кратных пассажах на питательных средах и 10-кратном пассаже через организм морских свинок.

Установлено, что 10-кратное пассирование ципролетрезистентного мутанта через организм морских свинок не оказывало влияния на иммунобиологические свойства - культура, независимо от кратности пассажа, сохраняла исходные свойства, положительно реагируя с R-, S-сыворотками в РСК и ИФА тест-системах, равномерно распределяясь

(обсеменяя) по органам и тканям (от 35 до 70% в зависимости от органа) при индексе высеваемости селезенки (ИБС) от 1,2 до 2,5 в зависимости от кратности пассажа.

Сохранение одного из основных свойств - антигенности, у полученного антибиотикорезистентного мутанта В.abortus 82 Ц, послужило основанием для оценки его иммуногенности.

Результаты опытов, проведенных на 30 морских свинках, иммунизированных используемым штаммом с последующим заражением вирулентной культурой В.abortus 54 показали, что наиболее выраженный защитный эффект отмечен в опытах с вакциной из антибиотикорезистентного варианта В.abortus 82 Ц. Это подтверждается не только количеством устойчивых к заражению животных, но и выраженностью иммунологических реакций.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что антибиотикорезистентный вариант вакцинного штамма B.abortus 82 Ц обладает более выраженной иммуногенной активностью по сравнению с исходным штаммом и может быть использован в дальнейшем при изготовлении препаратов для экстренной профилактики бруцеллеза.

3.5 Разработка экспресс - метода оценки иммуногенности вакцинных штаммов бруцелл

Учитывая, что оценка иммуногенности вакцинных штаммов на сегодняшний день несовершенна, поскольку она предполагает обязательное последующее заражение иммунизированных животных вирулентным штаммом возбудителя инфекции, на завершающем этапе работы проводили исследования по разработке экспресс - метода оценки иммуногенности потенциальных вакцинных штаммов.

При разработке способа в качестве рабочей гипотезы мы использовали известный в области вакцинологии принцип - инкубирование лимфоцитов в присутствии антигенов противочумных и противохолерных вакцинных штаммов и по уровню индуцированного ими синтеза цитокинов

(интерферона, интерлейкина (ИЛ-1(3) и фактора некроза опухолей (ФНО-а) в ИФА) и определение иммуногенности вакцин.

Используя названный принцип, путем культивирования лимфоцитов в присутствии используемых антигенов тест-штаммов в in vitro тест-системе, тестировали супернатанты культуральной жидкости на наличие иммунорегуляторных цитокинов (фактора некроза опухолей, интерлейкина-1 и колониестимулирующего фактора) в ИФА с моноклональными антицитокиновыми антителами, производства ООО «Цитокин». По соотношению указанных цитокинов определяли иммуногенность изучаемых штаммов бруцелл.

Результаты исследований показали, что по способности индуцировать синтез иммунорегулирующих цитокинов (ФНО-а, ИЛ-10, КСФ) в модельной in vitro тест-системе испытанные антигены из штаммов бруцелл образуют следующий убывающий ряд: АГ из шт. 82 Ц>АГ из шт. 82 Пч >АГ из шт. 82 >АГ из шт. 19 >АГ из шт. R-1096.

Для проверки эффективности оценки иммуногенности различных вакцинных штаммов бруцелл и установления корреляции между цитокининдуцирующей активностью штаммов и их иммуногенностью, опыты проводили на морских свинках живой массой 400-450 г. Животные были разделены на 6 групп по 10 особей в каждой и были подвергнуты иммунизации испытуемыми штаммами бруцелл. Животным 1-й группы однократно подкожно вводили вакцину из шт. 19 в дозе 0,46x109 КОЕ в объеме 1 см3 в область паха; 2-й группы - в аналогичных условиях и дозе -вакцину из штамма 82; 3-й - вакцину из штамма 82 Пч; 4-й - вакцину из шт. 82Ц; 5-й - вакцину из шт. R-1096; животных 6-й группы заражали вирулентным штаммом возбудителя бруцеллеза B.abortus 54М ВГНКИ (контроль заражения).

Результаты опытов показали, что при использовании вакцины из шт. 19 (1-ая группа), iut.R-1096 (5-ая группа) заразилось по 6 животных, что составляет 40% защиты. В отличие от них, в группах 2, 3, 4,

иммунизированных вакцинными штаммами 82, 82Пч и 82Ц, процент защиты составил 80%, 80% и 90% соответственно. При этом установлено, что максимальный процент защиты животных после иммунизации коррелировал с уровнем цитокинов при их соотношениях 1,25 (ФИО- а): 2-2,50 (ИЛ-1р): 33,70 (КСФ). Любые нарушения этих соотношений как в сторону увеличения или уменьшения, ведут к снижению иммуногенности противобруцеллезных вакцинных штаммов.

При повторении аналогичных опытов на других видах лабораторных животных (белые мыши, белые крысы и кролики) были получены совпадающие данные.

Таким образом, в результате проведенных исследований нами разработан метод определения гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК бруцелл различного происхождения, получен антибиоти-корезистентный вариант В.abortus 82Ц и разработан способ экспресс - метод оценки иммуногенности вакцинных штаммов бруцелл.

4 ВЫВОДЫ

1. Культурально-морфологические и биохимические свойства 58 вирулентных, вакцинных и эпизоотических штаммов бруцелл, находящихся длительное время (более 5 лет) в лиофилизированном состоянии (в запаянных под вакуумом стеклянных ампулах) при температуре +2 - + 4°С существенным изменениям не подверглись. Степень диссоциации культур (переход из S- в R-форму) составила 1,8%.

2. Подтверждено, что хранение исследованных культур микроорганизмов в лиофилизированном состоянии является оптимальным для создания и поддержания коллекции полевых, вакцинных, селекционированных и производственных штаммов.

3. Персистенция возбудителя бруцеллеза в организме различных по чувствительности к данной инфекции домашних и диких животных (свиньи, олени, волки, зайцы, песцы, горностаи) приводит к существенным изменениям фенотипических свойств культур (степень диссоциации

фенотипических признаков - 30%), что затрудняет идентификацию штаммов - изолятов.

4. Установлено, что из использованных методов идентификации (фенотипические, анализ белковых спектров мембран, генотипизация) различных по происхождению бруцелл наиболее объективным критерием оценки принадлежности их к роду Brucella является степень гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК.

5. Показаны значительные изменения фенотипических признаков у полевых штаммов-изолятов, выделенных в различных климатогеографичес-ких зонах РФ (Крайний Север, Калининградская обл.), Казахстане и Польше, степень гомологии нуклеотидных последователь-ностей бруцелл вида B.suis и B.rangiferi находилась на высоком уровне - 84,3-100%. При этом не установлено заметной дивергенции генома бруцелл при S-SR-R-диссоциации в процессе персистенции возбудителя в макроорганизме с различным уровнем антимикробной защиты.

6. Методом культивирования исходного штамма B.abortus 82 на среде с последовательно возрастающими концентрациями (1, 2, 3, 5, 10 мг/мл) антибиотика нового поколения - ципролета, получен антибиотикорезистенг-ный вариант - B.abortus 82 Ц, обладающий менее агглютиногенными, но более выраженными иммуногенными свойствами, который может быть использован в качестве вакцинного.

7. Разработан экспресс-метод оценки иммуногенности противо-бруцеллезных вакцин по цитокининдуцирующей активности антигенов в in vitro тест-системе. Установлено, что объективным критерием оценки иммуногенности испытуемых потенциальных вакцинных препаратов является антигениндуцированный синтез иммунорегуляторных цитокинов классов ФНО-а, ИЛ-1р и КСФ при оптимальном соотношении их концентраций 1-1,25:2-2,25:3-3,70 соответственно.

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Полученные результаты исследований позволяют рекомендовать применение экспресс-метода оценки иммуногенности противобруцеллезных вакцин по критерию цитокининдуцирующей активности антигенов в in vitro тест-системе методом иммуноферментного определения концентрации иммунорегуляторных цитокинов ФНО-а, ИЛ-ip и КСФ, оптимальное соотношение которых для иммунногенных штаммов составляет 1-1,25:22,25:3-3,70 соответственно.

На основании полученных данных разработаны «Методические рекомендации по индикации и дифференциации отдельных видов бруцелл с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени», утвержденные директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» 11 октября 2011 г. 6 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Плотникова, Э.М. Разработка тест-системы на основе био- и нанотехнологий при бруцеллезе/ Э.М. Плотникова, Е.В. Панкова// Матер. Междунар. научно-практич. конф. - «От теории - к практике: вопросы современной ветеринарии, биотехнологии и медицины». - Саратов. - 2011. -С.221-225.

2. Панкова, Е.В. Использование моноклональных антител для дифференциации различных штаммов бруцелл/ Е.В. Панкова, Э.М. Плотникова// Междунар. научно-практич. конф. «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (www.mosbiotechworld.ruf) - М.: ЗАО «Экспо биохим-технологии» РХТУ им. Менделеева. - М., - 2012. - С.322-323.

3. Панкова, Е.В. Обеспечение сохранности антигенных и генетических свойств штаммов возбудителей бруцеллеза/ Е.В. Панкова// Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - Казань. - 2012. - Т.209. - С.257-261.

4. Панкова, Е.В. Фенотипический контроль стабильности при хранении музейных и производственных штаммов возбудителей бруцеллёза/ Е.В. Панкова // Ветеринарный врач. - Казань. - 2012. - С.23-24.

5. Иванов, A.B. Степень гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК бруцелл/ A.B. Иванов, Е.В. Панкова, P.M. Ахмадеев, Э.М. Плотникова// Достижения науки и техники АПК. - М. - 2012. С.83-84.

Подписано в печать 09.10.2012 г. Заказ № 108 Формат 60x84/16. Гарншура Times New Roman Усл. печ. л. 1,5. Бумага офсетная. Тираж 80 экз. Отпечатано с оригинал-макета в типографии ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» 420075, г. Казань-75, Научный городок-2

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Панкова, Екатерина Витальевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Краткие сведения о биологических свойствах и таксономии бруцелл.

1.2 Характеристика основных свойств бруцелл.

1.2.1 Морфология, биохимия, патогенные свойства и изменчивость бруцелл.

1.2.2 Антигенная структура бруцелл.

1.2.3 Методы генодиагностики и геноидентификации возбудителей бруцеллеза.

1.2.4 Уровень цитокинеза как показатель иммуномодулирующего действия антигенных веществ.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Материалы и методы исследований.

2.1.1 Материалы.

2.1.2 Методы.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1 Фенотипические свойства различных штаммов бруцелл.

3.1.1 Изучение токсинообразования у бруцелл.

3.2 Изучение белкового состава клеточной мембраны бруцелл.

3.3 Получение антигенных компонентов бруцелл и их серолого-биохимическая характеристика.

3.4 Изучение степени гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК различных штаммов бруцелл.

3.5 Изучение влияния различных факторов на иммуногенную активность вакцинных штаммов бруцелл.

3.5.1 Индукция антибиотикорезистентности у вакцинного штамма В. abortus 82 и получение его измененного варианта В. abortus 82 Ц.

3.6 Разработка экспресс - метода оценки иммуногенности вакцинных штаммов бруцелл.

3.6.1 Моделирование in vitro тест-системы для экспресс - метода оценки цитокининдуцирующей способности бруцеллезных антигенов.

3.6.2 Оценка иммуногенности вакцинных штаммов бруцелл на животных.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ВЫВОДЫ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Фено-, генотипическая изменчивость бруцелл и разработка экспресс-метода оценки их иммуногенности"

Известно, что в процессе хранения музейных культур эпизоотических и вакцинных штаммов нередко происходят изменения как фенотипических, так и генетических характеристик, отражаясь на их основных свойствах -вирулентности эпизоотических штаммов и иммуногенности вакцинных штаммов. Определение принадлежности таких атипичных культур к роду Brucella, а также их дифференциация от антиген - родственных гетерологических микроорганизмов, а также иммуногенности вакцинных штаммов по общепринятым методам весьма трудоемки, продолжительны и требуют значительных материальных затрат (Салмаков K.M. с соавт., 2008).

Успешное решение проблемы бруцеллеза возможно только при внедрении в широкую практику эффективной научно - обоснованной системы мероприятий с использованием наиболее совершенных средств и методов диагностики и специфической профилактики болезни, актуальность разработки которой возрастает в последнее время с учетом изменения форм ведения сельского хозяйства (Иванов A.B. и др., 2009).

Исхаков 0.3. с соавт., 1981, 1986; Черкасов В.В., Ростов А.П., 1981; Косилов И.А. с соавт., 1986). Однако существенным недостатком этой вакцины является ее высокая реактогенность, обуславливающая большой процент абортов у стельных животных (Шумилов К.В. с соавт., 1983; Скляров О.Д., с соавт., 2004). Кроме того, при проведении противобруцеллезных мероприятий (иммунопрофилактика и антибиотикотерапия) в очагах инфекции с использованием указанной вакцины и антибиотиков резко снижается лечебно-профилактический эффект этих средств, что связано с губительным действием применяемых антибиотиков как на возбудителя инфекции, так и на вакцинные штаммы бруцелл. Использование для этих целей пенициллинчувствительного (В.abortus 82 Пч) и стрептомицинрезистентного (В.abortus 82 Sr) вариантов шт. 82, также малоэффективно, поскольку эти антибиотики при бруцеллезе малоэффективны и, во-вторых, они высокотоксичны (Кайтмазова Е.И., 1962).

Учитывая, что оценка иммуногенности вакцинных штаммов бруцелл на сегодняшний день несовершенна, поскольку она предполагает обязательное последующие заражение иммунизированных животных вирулентным штаммом возбудителя бруцеллеза, диктуется необходимость проведения исследований в этом направлении (Григорьева Г.И. с соавт., 1998).

Исходя из цели, на решение проблемы были поставлены следующие задачи:

- изучить культурально-морфологические и биохимические свойства музейных и эпизоотических штаммов бруцелл;

- изучить полипептидный состав экзобелков бруцелл; провести сравнительный анализ степени гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК музейных штаммов и изолятов, выделенных из организма животных-носителей возбудителя;

Научная новизна. Впервые изучены в сравнительном аспекте культурально-морфологические, биохимические, антигенные свойства, полипептидный состав и степень гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК 58 культур бруцелл производственных, музейных штаммов и изолятов, выделенных из организма носителей возбудителя бруцеллеза животных.

Дана сравнительная оценка эффективности методов оценки феноти-пических и генотипических характеристик различных штаммов бруцелл для их идентификации и дифференциации.

Установлена корреляция между иммуногенностыо вакцинных штаммов и их способностью индуцировать синтез медиаторов иммуногенеза - цитокинов. Предложен способ использования цитокинового профиля сывороток привитых испытуемыми штаммами бруцелл животных в качестве оценочного критерия иммуногенности потенциальных вакцинных препаратов.

Практическая значимость. На основании изучения фенотипических, генотипических и цитокининдуцирующих свойств различных штаммов бруцелл получен антибиотикорезистентный вариант - В.аЬогШБ 82 Ц и предложен для дальнейшего изучения как перспективный штамм в качестве исходного для получения вакцины против бруцеллеза животных.

Предложен для практики способ экспресс - метода оценки иммуноген-ности вакцинных штаммов бруцелл путем определения цитокинового профиля сывороток крови животных, иммунизированных испытуемыми вакцинными препаратами.

Основные положения, выносимые на защиту:

- разработка экспресс - метода оценки иммуногенности вакцинных штаммов бруцелл методом иммуноферментного анализа;

- результаты апробации эффективности способа оценки иммуногенности полученного штамма В.abortus 82Ц.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 198 страницах компьютерного текста и состоит из общей характиристики работы, обзора литературы, собственных исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических предложений и приложений.

Материалы диссертации иллюстрированы 26 таблицами и 11 рисунками. Список литературы содержит 277 наименований работ, в том числе 89 зарубежных авторов.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Панкова, Екатерина Витальевна

выводы

5. Показаны значительные изменения фенотипических признаков у полевых штаммов-изолятов, выделенных в различных климатогеографичес-ких зонах РФ (Крайний Север, Калининградская обл.), Казахстане и Польше, степень гомологии нуклеотидных последователь-ностей бруцелл вида В.suis и B.rangiferi находилась на высоком уровне - 84,3-100%. При этом не установлено заметной дивергенции генома бруцелл при S-SR-R-диссоциации в процессе персистенции возбудителя в макроорганизме с различным уровнем антимикробной защиты.

6. Методом культивирования исходного штамма В.abortus 82 на среде с последовательно возрастающими концентрациями (1, 2, 3, 5, 10 и 20 мг/мл) антибиотика нового поколения - ципролета, получен антибиотикорезистент-ный вариант - В.abortus 82 Ц, обладающий менее агглютиногенными, но более выраженными иммуногенными свойствами, который может быть использован в качестве вакцинного.

7. Разработан экспресс-метод оценки иммуногенности противо-бруцеллезных вакцин по цитокининдуцирующей активности антигенов в in vitro тест-системе, что является объективным критерием оценки иммуногенности испытуемых потенциальных вакцинных препаратов является антигениндуцированный синтез иммунорегуляторных цитокинов классов ФНО-а, ИЛ-1(3 и КСФ при оптимальном соотношении их концентраций 1-1,25:2-2,25:3-3,70 соответственно.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Полученные результаты исследований позволяют рекомендовать применение экспресс - метода оценки иммуногенности противобруцеллезных вакцин по критерию цитокининдуцирующей активности антигенов in vitro тест-системе методом иммуноферментного определения концентрации иммунорегуляторных цитокинов ФНО-а, ИЛ-1(3 и КСФ, оптимальное соотношение которых для иммунногенных штаммов составляет 1-1,25:22,25:3-3,70 соответственно.

На основании полученных данных разработаны «Методические рекомендации по индикации и дифференциации отдельных видов бруцелл с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени» утвержденные директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» 11 октября 2011 г.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Панкова, Екатерина Витальевна, Казань

1. Абдуллин, Х.Х. Диагностическая ценность серологических исследований при бруцеллезе/Х.Х. Абдуллин//Уч. зап. Казанского вет. ин-та. 1962. -Т.89.-С.31.

2. Абдуллин, Х.Х. Серологическая диагностика бруцеллеза и пути повышения ее эффективности/ Х.Х. Абдуллин// Научные труды Каз. НИВИ.-1980.-С. 16-20.

3. Авакумов, М.Е. Восстановление и усиление вирулентных свойств штаммов Brucella методом интрацеребральных заражений / М.Е.Авакумов //Труды Московской вет. Академии. 1950. - В.7. - С.119.

4. Али-Кука Изучение изменчивости бруцелл при пассаже их через организм нетипипового хозяина/ Али-Кука// Сб. рефератов ВИЭВ. 1960. -В.1.-С.28.

5. Алимов, A.M. Разработка и внедрение биотехнологических методов и средств диагностики, специфической профилактики бруцеллеза, листериоза и сибирской язвы сельскохозяйственных животных: Автореф. дисс. . докт. вет. наук. Казань. - 1993. - 38 с.

6. Алимов, A.M. Оценка методом иммунопереноса серологической активности белков бруцелл abortus/ A.M. Алимов// Межвузовский сб. научных трудов. Казань. - 1994. - С.18-21.

7. Анина-Радченко, Н.Д. Материалы по бактериологии и патогенезу бруцеллеза/ Н.Д. Анина-Радченко: Автореф. дисс. . докт. мед. наук. -Одесса. 1954.-24с.

8. Анина-Радченко, Н.Д. Фактор распространения и гиалуронидаза при бруцеллезе/Н.Д. Анина-Радченко//ЖМЭИ. 1956. - №10. - С.9-14.

9. Антонов, B.K. К вопросу изменчивости бруцелл и перспективы получения вакцинных штаммов/ В.К. Антонов// Труды Института краевой патологии АН Казахск. ССР. 1988. - Т.6 (14). - В.1. - С.З.

10. Архангельский, Д.С Известия АН Казахск. ССР. Серия физиол. и мед. / Д.С.Архангельский. 1956. - В.7. - С. 14.

11. Асланян, Р.Г. К географии бруцеллеза: Автореф. дисс. канд. мед. наук. -М. 1967.-24с.

12. Ахмадеев, P.M. Возможность дифференциации некоторых штаммов Brucella abortus с использованием универсального праймера/ Ахмадеев P.M. // Вет. врач. 2003. - № 3. - С. 58-60.

13. Баева, A.A. Иммуногенные свойства клеточных компонентов бруцелл / A.A. Баева, И.Ф. Таран// ЖМЭИ. 1975. - Т.8. - С.71-76.

14. Базиков, И.А. Ультраструктура L-форм бруцелл и культур-реверсантов / И.А. Базиков, А.И. Бондаренко// ЖМЭИ. 1991. - №1. - С. 17-20.

15. Балахонов, C.B. Оптимизация детекции бруцелл с помощью полимеразной цепной реакции/ C.B. Балахонов, М.Ю. Шестопалов, А.И. Калиновский// Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. М. -1996.- №4.- С.33-35.

16. Беклемишев, Н.Д. Хронический бруцеллез/ Н.Д. Беклемишев. Алма-Ата. - 1957,-ЗОс.

17. Белозерова, Г.А. Получение и испытание новой вакцины из штамма В. abortus 82-ПЧ / Г.А. Белозерова // Автореферат дисс. . докт. вет. наук. -Казань. 1993. -38 с.

18. Вагина, JI.A. Стабильность свойств B.rangiferi В. 209/ JI.A Вагина, В.И. Никулина, A.C. Гоппе// Диагностика, профилактика и терапия болезней животных на крайнем Севере: Сб. науч. трудов. Новосибирск. - 1983. - С.З-8.

19. Васильева, Г.И. Кооперативное взаимодействие моно- и полинук-леарных фагоцитов, опосредованное моно и нейтрофилокинами/ Г.И. Васильева, И.А. Иванова, С.Ю. Тюкавкина// Иммунология. 2007. - №5. -С.11-17.

20. Вафаупов, А.Х. Изучение содержания свободных аминокислот в бруцеллезах шт. В. Bovis-19 и Невский 12, B.melitensis/ А.Х. Вафаупов// Тр. Уз. ВНИВИ.- 1979.- 29.42.- С.48-50.

21. Вершилова, П.А. Активная иммунизация против бруцеллеза/ П.А. Вершилова: Автореф. докт. дисс.- М. 1949. - С. 11-12.

22. Вершилова, П.А. Изучение диагностической ценности реакции пассивной гемагглютинации при бруцеллезе/ П.А. Вершилова, М.М. Чернышева, И.И. Дубровская// Советская медицина. 1961. - № 1.- С. 128-134.

23. Вершилова, П.А. Диагностическая оценка реакции непрямой гемагглютинации при бруцеллезе/ П.А. Вершилова, М.И. Чернышева, А.Г. Асланян// Бюлл. Всесоюзн. ин-та экспер. вет. М. - 1971. - № 10. - С. 18-21.

24. Вершилова, П.А. Бруцеллез/ П.А. Вершилова. М.: Медицина. - 1972.

25. Вольпе, И.М. Патогенные микроорганизмы/ И.М. Вольпе, Т.И. Чернова, Е.П. Столбикова, Е.М. Никитин. Под ред. В.П. Миронова. - М.: Изд. МГУ. -1967.-С.107-108.

26. Высоцкий, В.В. Ультраструктура бруцелл/ В.В. Высоцкий, Д.С. Курдиина, H.H. Островская//Микроб. 1967. - №3. - С. 19.

27. Вышелесский, С.Н. Частная эпизоотология/ С.Н. Вышелесский / Бруцеллез. М.: Сельхозгиз. - 1948. - 325 с.

28. Вышелесский, С.Н. Научная оценка современных мер борьбы с бруцеллезом сельскохозяйственных животных/ С.Н. Вышелесский // Бруцеллез сельскохозяйственных животных. М. - 1955. - С.5-17.

29. Гамалея, Н.Ф. Инфекция и иммунитет/ Н.Ф. Гамалея. M.-JI. -1921.

30. Глонти, Т.М. Аллергическое состояние овец, привитых разными вакцинами против бруцеллеза/ Т.М. Глонти// Тр. ВГНКИ. 1973. - №19. -С.84-89.

31. Горелов, В.И. Определение генетической связи между видами и биоварами бруцелл и методом генной инженерии/ В.И. Горелов, Ю.К. Кулаков, А.Г. Скавронская. М. - 1989. - С.56.

32. Григорьева, Г.И. Антигенная структура бруцелл/// Успехи современной биологии. 1991. - №111. - В.6. - С.890-904.

33. Григорьева, Г.И. Бруцеллы и бруцеллез: микробиология, иммунология, биотехнология/ Г.И. Григорьева, В.В. Сочнев, Н.П. Бацанов, Н.В. Филиппов.- Под общей ред. Засл. Деятеля науки РФ В.В. Сочнева. Н. Новгород. - 1998.- 246с.

34. Грякова, H.A. Патоморфологическая характеристика органов морских свинок, зараженных аглютинабельными и инагглютинабельными культурами

35. B.melitensis/ H.A. Грякова, H.H. Островская// Микроб. 1964. - № 6. - С. 111.

36. Давыдов, Н.И. К изучению бруцеллеза у северных оленей// Ветеринария.- 1961.-№5.-С 48-54.

37. Дегтяренко, В.И. О сходстве аминокислотного состава аллергенов из бруцелл и микобактерий/ В.И. Дегтяренко, Г.Г. Новицкая// Аллергия и реактивность организма. Матер. 1-ой Всесоюзной конф. - М., Львов. - 1969.1. C.24-32.

38. Демченко, A.B. Сравнительная оценка методов оздоровления хозяйств от бруцеллеза крупного рогатого скота в различной эпизоотической обстановке/А.В. Демченко// Тезисы докладов научн. конф. Одесского СХИ. Одесса. 1970. - С. 144.

39. Демьянов, A.B. Диагностическая ценность исследования уровней цитокинов в клинической практике/ A.B. Демьянов, АЛО. Котов, A.C. Симбирцев// Цитокины и воспаление. 2003.-№3.-С20-35.

40. Домарадский, И.В. Некоторые данные по проблеме "химической" вакцины против чумы/ И.В. Домарадский, А.П. Калмыкова, В.А. Кротова и др.// Доклады Иркутского противочумного института. Хабаровск. - 1962. -Вып. 3. -С.18-25.

41. Драновская, Е.А. Иммунологическая активность физико-химические свойства компонентов клеточной стенки бруцелл и Yersinia enterocolitica 0-9 / Е.А. Драновская, М.М. Желудков, Т.А. Толмачева и др.// Ветеринария. -1975. -№ 11. С.34-37.

42. Драновская, Е.А. Таксономия возбуждения бруцеллеза / Е.А.Драновская// Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организации медицинской помощи больным: Тезисы докл. Всесоюзн. конф. -Новосибирск. 14-25 октября. - 1989. - С.53-55.

43. Драновская, И.И. Состав специфических полисахаридов одного варианта бруцелл типа abortus/ И.И. Драновская, Е.А. Драновская //Биохимия. 1966. -В. XXXII. - №1. - С.31.

44. Дрожевкина, М.С. Результаты изучения лизогении у бруцелл/ М.С. Дрожевкина// Диагностика особо опасных инфекций. Ростов-на Дону. -1967.-В.1.-С.8.

45. Дрожевкина М.С. Попытка использования бактериофага для определения вида бруцелл, выделенных от оленей/ М.С. Дрожевкина // Диагностика особо опасных инфекций. Изд-во Ростов, ун-та. - 1968. -C.I55-160.

46. Дубровская, И.И. Изменение химического состава бруцелл под влиянием фага/ И.И. Дубровская, H.H. Островская, А.И. Глубонина // Биохимия. 1958. - В.23. - №4. - С.523-526.

47. Дубровская, И.И. Изменение антигенных комплексов бруцелл под влиянием фага/ И.И. Дубровская, H.H. Островская// Биохимия. 1961. -Т.26. - С.290-293.

48. Дубровская, И.И. Наследственно закрепленные изменения в составе варианта бруцелл со стойко ослабленной вирулентностью/ И.Н. Дубровская //Вопросы мед. химии. 1967. - В.13. -№ 2. - С.168.

49. Дубровская, И.И. Химический состав и токсические свойства антигена полученного из бруцелл водно-эфирной экстракцией/ И.И. Дубровская, Д.С. Курдина//Вопросы медицинской химии. 1968. - В. 14. - № 6. - С.560-563.

50. Дубровская, И.И. О наличии некоторых корреляции между составом специфических полисахаридов и вирулентными свойствами бруцелл/ И.И. Дубровская// Вакцины и сыворотки. Материалы по производству. М. - 1970. -В.12.-С.73-77.

51. Езепчук, Ю.В. Патогенность как функция биомолекул/ Ю.В. Езепчук. -М. 1985. - 240с.

52. Ершов, Ф.И. Циклоферон: Итоги и перспективы клинического применения/ Ф.И. Ершов и др. СПБ.- 2000.-125с.

53. Жованик, П.Н. Колебание титра агглютининов у бруцеллезных коров / П.Н. Жованик, В.Г. Петренко, A.M. Говоров// Советская ветеринария. -1938. № 4, 5. - С.27.

54. Жованик, П.Н. Активная профилактическая иммунизация животных против бруцеллеза/П.Н. Жованик: Дисс.д-ра вет. наук.- Харьков. -1969.

55. Жованик, П.Н. Изучение иммунитета против бруцеллеза без поствакцинальной серопозитивности/ П.Н. Жованик, Н.И. Ерж// Иммунитет с.-х. животных.- М. 1973. - 135с.

56. Журина, Е.В. Препараты интерферона в комплексном лечении больных бруцеллезом/ Е.В. Журина: Авт. дисс. канд. мед. наук. Алматы. - 1993. -23 с.

57. Здродовский, П.Ф. К характеристике мальтийской лихорадки у коз при спонтанной инфекции/ П.Ф. Здродовский// Тр. Азерб. инст. микробиол. и гигиены. 1926. -Т. 3. -С.101-102.

58. Здродовский, П.Ф. Бруцеллез/ П.Ф. Здродовский. М.: Медицина. -1953. - С.242.

59. Зенкова, Н.Ф. Характеристика штаммов бруцелл, полученных от больных при лечении антибиотиками/ Н.Ф. Зенкова, Е.А. Шнырова// Труды ин-та краевой патологии АН Казах. ССР. -1962. Т. 12. - 194 с.

60. Зенкова, Н.Ф. Микробиология и лабораторная диагностика бруцеллеза / Н.Ф. Зенкова, Ю.М. Леванов// Труды Каз. НИИ эпид., микроб, и инфекц. болезней. 1975. -С.9, 7-23.

61. Иванов, A.B. Изыскание и результаты применения новых препаратов для специфической профилактики бруцеллёза крупного рогатого скота/ A.B. Иванов, K.M. Салмаков, A.M. Фомин, Э.М. Плотникова// Ветеринарный врач. 2006. - № 1.-С. 14-18.

62. Иванов, A.B. Радиоэкотоксикологическая микробиология/ A.B. Иванов, Р.Н. Низамов, Э.М. Плотникова и др. М.: Колос. - 2009.- 680 с.

63. Иванов, A.B. Способ оценки иммуногенности противобруцеллезных вакцинных штаммов/ A.B. Иванов, K.M. Салмаков, Э.М. Плотникова, Р.Н. Низамов: Патент на изобретение № 2419096 от 20 мая 2011 г.

64. Иванов, A.B. Биологическая безопасность: молекулярно-клеточные аспекты диагностики зооантропонозов/ A.B. Иванов, Э.М. Плотникова, Р.Н. Низамов, A.A. Иванов, P.P. Гайзатуллин. М.: Планида. - 2012. - 784 с.

65. Иванов, М.М. Получение и испытание вакцинного штамма бруцелл вида B.melitensis 89/23/М.М. Иванов, J1.B. Кириллов// Бюлл. ВИЭВ.- 1971. -№ 10.- С.23.

66. Иванов, М.М. Сравнительная оценка применения бруцеллезных вакцин / М.М. Иванов, Р.В. Складчикова// Ветеринария. 1970. - № 4. - С.53.

67. Инструкция по медицинскому применению препарата «Ципролет».

68. Исхаков 0.3., Карпенко И.Г., Кузьмин Г.Г. Итоги применения ротивобруцеллезной вакцины из штамма 82 в хозяйствах РФ// Научные труды КВИ. Казань. - 1980. - Т. 135. - С. 34-44.

69. Кайтмазова, Е.И. Изучение лечебного действия сочетаний из антибиотиков при экспериментальной бруцеллезной инфекции/ Е.И. Кайтмазова// Антибиотики. 1962. - № 4. - С.324.

70. Кайтмазова, Е.И. Характеристика культур B.ovis/ Е.И. Кайтмазова, Д.С. Кудрина, Е.А. Драновская, H.A. Гренова, Ю.Г. Сахновский// Ветеринария. -1971. №10. - С.44.

71. Кетлинский, С.А. Цитокины мононуклеарных фагоцитов в регуляции воспаления и иммунитета/ С.А. Кетлинский, Н.М. Калинина// Иммунология.- 1998. №3. - С.30-44.

72. Кетлинский, С.А. Цитокины/ С.А. Кетлинский, A.C. Симбирцев. М.: Фолиант. - 2008. - 552 с.

73. Кирис, Н.Д. Сравнительное изучение бруцеллезных антигенов методом преципитации в агаре/ Н.Д. Кирис// ЖМЭИ. 1963. - № 9. - С. 130.

74. Киселев, П.Н. Токсикология инфекционных процессов/ П.Н. Киселев. -Л.: Медицина. 1971. - 359с.

75. Клочков, A.A. Получение слабовирулентного штамма бруцелл воздействием ультрафиолетовых лучей/А.А. Клочков// Ветеринария. 1964. -№ 2. - С.31.

76. Кнорринг, Г.Ю. Цитокиновая сеть как мишень системной энзимо-терапии/ Г.Ю. Кнорринг// Цитокины и воспаление. 2005. - Т.4. - №4.-С.45-49.

77. Козловский, E.H. О каталазной активности у бруцелл/ E.H. Козловский. -Сб. тр. Харьковск. вет. ин-та. 1952. - T.XXI. - С.202-210.

78. Коновалов, А.И. О вакцинации коров и нетелей против бруцеллеза на благополучных фермах и особенности штаммов бруцелл, выделенных от привитых животных/А.И. Коновалов, А.Г. Власов// Ветеринария. 1961. -№11.- С.49.

79. Королев, П.А. О каталазной активности у бруцелл/ П.А. Королев // Советское здравоохранение Туркмении. 1938. - №1-2. - С.55-57.

80. Корунов, В.П. Аминокислотный обмен у бруцелл/ В.П. Кору нов// Уч. записки КГВИ. Казань. - 1974. - Т. 115.-С.183-190.

81. Косилов, И.А. Изменчивость бруцелл и ее значение в проблеме бруцеллеза с.-х. животных// Сб. научн. работ. Омск. - 1974. - Вып.21. - С.30-34.

82. Косилов, И.А. Изменчивость бруцелл и ее значение в проблеме бруцеллеза сельскохозяйственных животных: Автореф. дисс. . д-ра. вет. наук. Фрунзе. - 1975.- 40 с.

83. Косилов, И.А. Противоэпизоотическая эффективность вакцины из штамма 82 в общем комплексе противобруцеллезных мероприятий/ И.А. Косилов, С.К. Димов, А.Г. Падалица//РЖВ. 1986. - №5. - С.27.

84. Косилов, И.А. Бруцеллез с.-х. животных/ И.А. Косилов. Новосибирск. -1992.-259 с.

85. Косилов, И.А. Бруцеллез с.-х. животных/ И.А. Косилов, П.К. Аракелян, С.К. Дымов, А.Г. Хлыстунов. Новосибирск. - 1999. - 334 с.

86. Крашенникова, JI.A. Свойства культур бруцелл вакцинного штамма 82, пассированных через организм белых мышей/ JI.A Крашенникова// Научные труды КГВИ им. Н.Э.Баумана. Казань. -1980. - Т.135.-С.21-22.

87. Кулаков, Ю.К. Генетическая характеристика изолятов Brucella melitensis из Монголии, России и Азербайджана/ Ю.К. Кулаков, J. Erdenebaator, М.М. Желудков, Э.И. Коренберг// Молекуляр. генетика, микробиология и вирусология. 2011. - № 2. - С.8-12.

88. Кулаков, Ю.К. Молекулярно-генетическое типирование бруцелл, циркулирующих в некоторых областях Монголии/ Ю.К. Кулаков, J. Erdenebaator, Л.Е. Цирельсон и др.// ЖМЭИ. 2010. - №3. - С. 17-22.

89. Курманова, Г.М. Бруцеллез. Клинические аспекты/ Г.М. Курманова, Дуйсенова А.К. Алматы: Кггап. - 2002. - 352 с.

90. Курманова, Г.М. Оценка иммунного статуса и дифференциальная коррекция при бруцеллезе/ Г.М. Курманова и др.// Методические рекомендации. Алматы. - 2002. - 30 с.

91. Курманова, К.Б. Значение биоваров Br.melitensis в клинико-иммунологических проявлениях бруцелл/ К.Б. Курманова, Т.А. Грушина, М.М. Ременцова// ЖМЭИ. 1991. - №4. - С.76-77.

92. Курманова, К.Б. Значение биоваров B.melitensis в клипико-иммунологических проявлениях бруцелл/ К.Б. Курманова, Т.А. Грушина, М.М. Ременцова//ЖМЭИ. 1996. - № 4. - С.76-77.

93. Леванова, Г.Ф. Основные принципы геностиматики и приложении к решению практических задач таксономии бактерий/ Г.Ф. Леванова, И.Н. Блохина.-М. 1987.-24 с.

94. Леванова, Г.Ф. Геносистематика бактерий и ее прикладное значение / Г.Ф. Леванова, И.Н. Блохина // Успехи микробиологии. 1990. - Т.24. - С.З-25.

95. Логинов, Ф.С. Характеристика культур бруцелл, выделенных от коров, привитых вакциной из штаммов B.abortus/ Ф.С. Логинов// Сб. науч. работ Сиб. НИВИ. 1961. - В.9. - С.17.

96. Лямкин, Г.И. Таксономическое положение в экологии возбудителя бруцеллеза, выделенного от мышевидных грызунов в районах Северных предгорий Большого Кавказа/ Г.И. Лямкин, И.С. Тюменцева, E.H. Афанасьева// ЖМЭИ.- 1983. № 6. - С.30-33.

97. Лященко, В.А. Механизмы активации иммунокомпетентных клеток / В.А. Лященко, В.А. Дроженников, И.М. Молотковская. М.: Медицина. -1988.-238с.

98. Маликова, М.В. Активность каталазы у бруцелл/ М.В. Маликова //ЖМЭИ. 1960. -№.11. - С.93-99.

99. Маликова, М.В. Материалы о ферментном спектре бруцелл: Авторефер. дисс. . канд. мед. наук. Одесса. - 1969. - 22с.

100. Малышева, Л.А. Система протиэпизоотических мероприятий при бруцеллезе крупного рогатого скота в зоне интенсивного ведения животноводства: Автореф. дисс. . докт. вет. наук. 1995. - 36с.

101. Мамацашвили, Э.Г. Факторы распространения у бруцелл/ Э.Г. Мамацашвили// ЖМЭИ. 1960. - №2. - С.88-91.

102. Медуницын, Н.В. Приобретенный иммунитет при инфекциях/ Н.В. Медуницын// Иммунология инфекционного процесса. Руководство для врачей. Под ред. В.И. Покровского и др. М. - 1994. - С.122-148.

103. Мельниченко, А.Н. Нуклеотидный состав и степень подобия нуклеотидных последовательностей ДНК у бруцелл разных видов/ А.Н. Мельниченко// Бюллетень ВИЭВ. 1983. - Вып.51. - С.53-56.

104. Мельниченко В.И. Антигенные и вирулентные свойства вакцинных штаммов бруцелл в эксперименте на морских свинках// «Пути ликвид, инфекц. и инваз. болезней с.-х. животных». Сиб. отд. ВАСХНИЛ. -Новосибирск. - 1987. - С. 22-23.

105. Мельниченко, В.И. Идентификация Л-форм бруцелл реакцией ДНК-ДНК гибридизации/ В.И. Мельниченко, С.К. Артюшин, Б.А. Фомин и др. // Бюлл. ВИЭВ. 1987 (1988). - Вып.64. - С.75-78.

106. Меринов, С.П. Иммуноферментный метод обнаружения антигенов бруцелл и антител к ним/ С.П. Меринов, Г.Ю. Загоскина// Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций. Тезисы докладов Всесоюзной конференции. Иркутск. - 1984. - 4.2. - С.П 1-113.

107. Миротворский, К.А. Способ приготовления антигена при бруцеллезе / К.А. Миротворский// Сов. здравоохранение Туркмении. 1940. - № 6. - С.44.

108. Муромцев, С.Н. Бруцеллез сельскохозяйственных животных/ С.Н. Муромцев. М.: Сельхозгиз. - 1955. - С. 17-19.

109. Муромцев, С.Н. Материалы по испытанию полужидкой формолвакцины против бруцеллеза/ С.Н. Муромцев// Ветеринария. -1944. № 2-3. - С.8.

110. Невский, И.Н. Иммунобиологическая характеристика штамма бруцелл / И.Н. Невский// Сб. науч. тр. Узбек, академии с./х. наук. 1959. - В. 13. -С.140-142.

111. Никифоров, И.П. Реактогенность и эпизоотическая безопасность противобруцеллезной вакцины из штамма 82/ И.П. Никифоров и др.// Диагн. и профилакт. инфекц. болезней животных. Сб. научных трудов СибНИВИ. -Омск. - 1980.

112. Обухов, И.Л. Лабораторная диагностика инфекционных болезней методом ДНК-амплификации при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР)/ И.Л. Обухов, К.Н. Груздев// Тр. ВГНКИ вет. препаратов. М. - 1995. -Т.57. - С.36-45.

113. Орлов, Е.С. Течение вакцинного и инфекционного процесса в организме животных, иммунизированных бруцеллезными вакцинами/ Е.С. Орлов, A.A. Клочков// Труды ВИЭВ.-1962. -№13. с.8.

114. Орлов, Е.С. Сравнительное изучение вирулентных и иммуногепных свойств шести вакцинных штаммов бруцелл/ Е.С. Орлов// Бюлл. ВИЭВ. -1971. -В.10. -С.-160.

115. Орлов, Е.С. Усовершенствование средств и методов диагностики и специфической профилактики бруцеллеза/Е.С. Орлов// Труды ВИЭВ. 1976. - №44.- С.40-50.

116. Островская, H.H. Изменчивость бруцелл под влиянием вирулентного фага/ H.H. Островская, Э.Н. Князева// Изменчивость микроорганизмов. М. -1957. - №2.-С. 117.

117. Островская, H.H. Феномен бактериофагии у бруцелл и изменчивость бруцелл под влиянием вирулентного бактериофага. / H.H. Островская //Гиг. эпидемиолог, микробиол. и иммунолог. Прага. - 1961. - № 5. - с.280.

118. Островская, H.H. Морфология бруцелл/ H.H. Островская// Бруцеллез. -М.-1972.-С.43-104.

119. Ощепов, В.Г. R-, L- формы бруцелл и значение их в эпизоотологии и диагностике бруцеллеза животных: Автореф. дисс. докт. вет. наук. JI. -1991. -35с.

120. Первушин, Б.П. О методах лабораторной диагностики бруцеллеза у человека/ Б.П. Первушин// Бруцеллез. Труды экспедиции ВИЭМ. - М. -1937.-С.80.

121. Петров, Р.В. Иммунология/Р.В. Петров. М.: Медицина. - 1987. - С.414.

122. Пинигин, А.Ф. К таксомическому положению бруцелл, выделенных от северных оленей/ А.Ф. Пинигин, О.С. Петухова, С.П. Меринов и др. // ЖМЭИ. 1986. - № 6. - С.98-101.

123. Плотников, К.Н. Бруцелловыделение и бациллоносительство у бруцеллезного крупного рогатого скота в стадии выздоровления и характеристика выделенных диссоциантов бруцелл/ К.Н. Плотников //Ветеринария. 1948. -№11. - с.19.

124. Плотникова, Э.М. Применение иммуноферментного анализа при ранней диагностике бруцеллеза/ Э.М. Плотникова, K.M. Салмаков// Мат. Докл. научно-произ. конф. по пробл. вет. и жив-ва. Казань. - 1994. - С.44.

125. Погорелов, H.A. Итоги изучения инагглютинабельных форм бруцелл / H.A. Погорелов, И.Ф. Таран// Зоонозы. Ставрополь. - 1966. - 126 с.

126. Попхадзе, М.З. Изменчивость В. melitensis на искусственной питательной среде. Живые вакцины/М.З. Попхадзе, Т.Г. Абушидзе// Сб. трудов межинститут, науч. конф. -1956. Т.П. - С.307.

127. Пяткин, К.Д. Микробиология/К.Д. Пяткин. М. - 1971. - 350 с.

128. Рево, М.В. Ветеринарная микробиология/ Рево М.В., Жукова М.Д. М. -1958. -456с.

129. Резников, Б.Ф. Диссоциация бруцелл и строение клеток/ Б.Ф. Резников // Наука производству.- Алма-Ата. - 1983. - С.63-67.

130. Ройт, А. Иммунология/ А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл. М.: Мир. -2000. - С.20-160.

131. Рягузов, B.C. Изучение на овцах иммуногенности жидкой и сухой вакцины из штамма В. abortus 21/ В.С.Рягузов, П.М. Потатуркин// Сборник научных трудов Донского СХИ. 1976. - Вып.2. - С. 105-109.

132. Салмаков, K.M. Живая вакцина против бруцеллеза из штамма 82 / Ветеринария. 1975. - №7. - С.43-45.

133. Салмаков, K.M. Живая вакцина из штамма В. abortus 82 и её эффективность в профилактике и ликвидации бруцеллёза/ K.M. Салмаков, Ю.Ш. Абузаров, Б.А. Киршин// Науч. труды Казанского гос. вет. ин-та. -1980. Т.135. - С.27-34.

134. Салмаков, K.M. Получение гибридом, индуцирующих моноклональные антитела к возбудителю бруцеллеза крупного рогатого скота/ K.M. Салмаков, Н.Я. Зуева, Т.М. Арсентьева// Тез. секц. сообщ. 1 Всесоюз. иммунол. съезда. -Сочи. 1989.-Т.1.-С.171.

135. Сергеенко, Ф.Э. Бактериофаг до культур бруцелл/ Ф.Э. Сергеенко, В.М. Шультц, A.JI. Натович// Микробиологической журнал. 1940. - Т.7. - №1-2. -С.175-179.

136. Симбирцев, A.C. Цитокины новая система защитных реакций организма/ A.C. Симбирцев// Цитокины и воспаление. - 2002. - №3. - С.9-17.

137. Скляров, О.Д. Экспресс-диагностика бруцеллеза методом ГТЦР/ О.Д. Скляров, С.Б. Яцышина, К.В. Шумилов и др.// Ветеринария. 2004. - № 9. -С. 18-22.

138. Скляров, О.Д. Диагностика бруцеллеза методом полимеразной цепной фракции/ О.Д. Скляров, М.Б. Брюсова, И.Л. Обухов и др.// Тез. докл. Вс. конф. «Лекарств, средства для животных и корма». М. - 2005. - С.33-35.

139. Скляров, О.Д. Результаты сравнительного изучения методов диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота/ О.Д. Скляров// Сб.науч.тр. ВГНКИ. М. -2005. - С.150-182.

140. Скляров, О.Д. Исключение заболевания крупного рогатого скота бруцеллезом с использованием современных диагностических методов/ О.Д. Скляров, Л.П. Мельниченко, В.В. Терещенко и др.// Ветеринарный врач. -2010. №1. - С.31-34.

141. Смирнов, С.М. Бруцеллез как социально гигиеническая инфекция / С.М. Смирнов/ ЖМЭИ. -1960. -№12. С. 14.

142. Солнцева, О.С. Роль цитокинов в осуществлении атопических процессов клеток иммунной системы у лиц, подвергшихся воздействию ионизирующей радиации/ О.С. Солнцева// Иммунология. М. - 2000. - №3. - С.22-24.

143. Студенцов, К.П. Бруцеллез животных. / К.П. Студенцов Алма-Ата: Кайнар.-1979 -236 с.

144. Таран, И.Ф. Сравнительное изучение напряжённости иммунитета против бруцеллёза в зависимости от дозы, метода, сроков введения живой вакцины в опытах на морских свинках/ И.Ф. Таран, Ю.М. Ёлкин, Н.В. Васильев // ЖМЭИ. -1961. № 8. - С.96-100.

145. Таран, И.Ф. Видовая приуроченность бруцелл к животным как таксономический признак/ И.Ф. Таран, М.П. Козлов// ЖМЭИ. 1972. - №9. -С. 110-115.

146. Таран, И.Ф. Видовая приуроченность бруцелл к животным как таксономический признак/ И.Ф. Таран, М.П. Козлов// ЖМЭИ. 1976. - № 8. -С.100-105.

147. Таран, И.Ф. Бруцеллез (микробиология, иммунология, эпидемиология, профилактика)/ И.Ф. Таран, Г.И. Лямкин Ставрополь. - 1996. - 176 с.

148. Тен, В.Б. Диагностика бруцеллеза у верблюдов/ В.Б. Тен, Р.Д. Сейдахметова// Достижения науки и техники. АПК. 1993. - № 1. - С.31.

149. Терентьев, Н.Ф. Сборник аннотаций и перечень работ по общей и коммунальной гигиене/Н.Ф. Терентьев. М. - 1940. - С. 109.

150. Тимаков, В.Д. Бруцеллез как социально-гигиеническая инфекция/ В.Д. Тимаков// ЖМЭИ. М. - 1960. - № 10. - С.З.

151. Титов, В.Н. Роль макрофагов в становлении воспаления, действие интерлейкина 1, интерлейкина 6 и активность гипоталамогипофизарной системы/ В.Н. Титов// Клиническая лабораторная диагностика. 2003. - № 12. -С.3-10.

152. Триленко, H.A. Значение измененных штаммов бруцелл, утративших свойства вызывать образование антител, для профилактики бруцеллеза у животных / H.A. Триленко// Докл. Сов. ученых к XVII Международ, вет. конгрессу. М. - 1963. - С.96-98.

153. Триленко, H.A. Бруцеллез сельскохозяйственных животных/ H.A. Триленко. Л.: Колос. - 1976. - 280с.

154. Тульчинская, В.М. Реакция пассивной гемагглютинации у иммунизированных и больных бруцеллезом животных/ В.М. Тульчинская, Н.И. Ищенко// Труды Моск. вет. академии. 1960. - В.31. - С.62.

155. Туманский, В.М. Оценка реакции и реакции связывании комплемента при диагностике бруцеллеза овец/ В.М. Туманский// ЖМЭИ. 1958. - № 6. -С.З.

156. Уралова, B.C. К вопросу изменчивости бруцелл типа melitensis/ B.C. Уралова// Труды Ростовского научно- исследовательского противочумного института. 1955. - №17. - С.58-75.

157. Фишбейн, В.Я. Получение авирулентной бруцеллезной культуры и изучение ее культурально биохимических свойств/ В.Я. Фишбейн// Вестник с.-х. науки. - Ветеринария. - 1940. - №1. - С.9.

158. Фомин, A.M. Схема идентификации вакцинного штамма 82 от культур полевых штаммов бруцелл/ A.M. Фомин, К.А. Хамзин// Акт. вопросы эпизоотол. Казань. - 1983. - С.71.

159. Фомин, A.M. Абортогенные и антигенные свойства антибиоти-корезистентных вариантов штамма В. abortus 82/ A.M. Фомин, K.M. Салмаков, Г.М. Сафина, Г.М. Галимова, P.A. Крючков// Ветеринарный врач. -2006. -№ 1.-С. 18-20.

160. Хазипов, Н.З. Фагоцитарная реакция макрофагов морских свинок, иммунизированных против бруцеллеза/ Н.З. Хазипов, Н.М. Василевский, О.П. Ионова, В.А. Шошокин//Ветеринария. 1984. - №12. - С. 27-30.

161. Хузин, Д.А. Роль L-форм иммунитете при бруцеллезе: Автореф. дисс. . канд. вет. наук. Казань. - 1988. - 24с.

162. Хузин, Д.А. JI-трансформация бруцелл вакцинных штаммов 19 и 82 в организме морских свинок. Разработка эффективных методов диагностики особо опасных инфекционных болезней животных. Межвузовский сборник научных трудов. - Казань. - 1990. - С.41-45

163. Цуверкалов, H.A. Какой комплекс диагностических приемов необходим для борьбы с бруцеллезной инфекцией/ H.A. Цуверкалов, В.М. Красов // Бруцеллез с.-х. животных. М.: Сельскохозяйс. - 1971. - С.34-37.

164. Цыбин, Б.П. Итоги изучения диагностических качеств бруцеллезного и туляремийного антигенных эритроцитарных диагностикумов/ Б.П. Цыбин, И.Ф. Таран, А.И. Тинкер/ЖМЭИ. 1975. - №9. - С. 83 - 87.

165. Цыбин, Б.П. Итого изучения диагностических качеств бруцеллезного и туляремийного эритроцитарный диагностикумов/ Б.П. Цыбин, И.Ф. Таран, A.I. Tinker// ЖМЭИ. 1976. - №9. - С.83-88.

166. Черкасов, В.В. Опыт оздоровления хозяйств от бруцеллеза с применением живой вакцины из штамма 82/ В.В. Черкасов, А.П. Ростов //Научные труды КВИ. 1980. - Т.135. - С. 80-82.

167. Чернышева, М.И. Пигментообразование у бруцеллезных культур/ М.И. Чернышева// Ветеринария. 1950. - №9. - С.52.

168. Шанина, Л.Н. Аутоиммунные реакции при чумном и холерном вакцинальном и инфекционном процессах, методы их коррекции. Автореф. диссдокт. мед. наук. - Саратов. - 1983. - 40с.

169. Штритер, В.А. Бактериологическая картина бруцеллеза у морских свинок и белых мышей при подкожном заражении/ В.А. Штритер// Архив биолог, наук. 1939. - Т.53. - №81. - С.64.

170. Шумилов К.В., Кальянов А.Н., Ромахов В.А. Результаты изучения вакцинного штамма B.abortus 104-М// Труды ВИЭВ. 1984. - №8. - С.27 - 28.

171. Шумилов, К.В. Идентификация бактерий рода бруцелла методом полимеразной цепной реакции/ К.В. Шумилов, О.Д. Скляров, И.Л. Обухов,

172. К.Н. Груздев, Г.А. Шипулин, 0.10. Шипулина// Ветеринария. 1996. -№12.-С. 19-23.

173. Юсковец, М.К. Бруцеллез сельскохозяйственных животных/ М.К. Юсковец М.: Сельхозгиз. - 1952. - 319с.

174. Юсковец, М.К. Данные по испытанию вакцины против бруцеллеза из штамма В.abortus 68/ М.К. Юсковец, А.И. Комсова// Труды ГНКИ вет. препаратов. 1955. - С.84-93.

175. Aldret- Servent, A. DNA polumorpnism in strains of the genus Brucella/ A. Aldret- Servent, G. Bourg, M. Ramus// Water Res 1989. - V. 170. - № 10 - P. 4603- 4607.

176. Anderson, B. ELISA for bovine brucellosis usinog a monoclonal antibody. Specific for field strains of B. abortus/ B. Anderson, M. Gorrell, G. Milliken// 3 entern, Symposium on Brucellosis. Algria Develor. boil.- Standart. - 1983. -V.56.-P.491-492.

177. Baily G.G. //J. Trap. Med. Hyg. - 1995.

178. Bazan, J.F. Structural design and molecular evolution of u cytokine receptor superfamily/ J.F. Bazan// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1990. - V.87. - P.6934-6938.

179. Beutler, B. Cachectin and tumour factor as two sides of the same biological coin/ B. Beutler, A. Cerami// Nature. 1986. - V.320. - P.584-588.

180. Brinley-Morgan, W.J. Род. Brucella Meyer et Shaw 1920, 173/ W.J. Brinley-Morgan, N.B. McCullough// Краткий определитель бактерий Берги. М.: Мир. - 1980. - С.135-137.

181. Brun М. Homogeneite electrophoretique de I'urease chez 3 especes de Brucella/ M. Brun, S. Descous// 3rd Inter. Symp. on Brucellosis. Algiers, Algeria.,1983. Develop, biol Standard. - 1984. - V.56. - P.l 13-121.

182. Bundle, D.R. Serological confirmation of Brucella abortus and Versenia enterocolitica 0:9 Q- antigens bu monoclonal antibodies/ D.R. Bundle, M. Ginney, M. Perry// Infec. And Immun.-1984.-V.46.-№ 2.-P.383-393.

183. Bundle, D.R. Structure an serology of Brucella abortus O-antigen / D.R. Bundle, M Perry/Biochem. Soc. Trans. 1995. - V.13.-№6.-P.980-982.

184. Burnet, E. Sur le paramelitennis et emplade termes /paramelitennis /, paratyphigue, eth. dans la nomonchature des bacteries/ E. Burnet// C.R.Soc. Biol.-1925. V.93. - P.340.

185. Caroff, M. Antigenic S-type lypopolysacchande of Brucella abortus 1119-3 / M.Caroff, D.R. Bundle, M.B. Perry, J.W. Cherwonogrodzky// Infect. Immun.1984. V.46. - P.384-388.

186. Cohen, M.C. Cytokine function. A Study in biologic diversity/ M.C. Cohen, S. Cohen// Am. J. Clin Pathol. 1996. - V.105. - P.589-598.

187. Corbel, M.J. Brucella prages: advances in the drelopmem of A reliable prage typing system for smooth ahd njn- smooth Brucella isolates / M.J. Corbel //2rd Forum in Mrctcuer Microbiol. 1987.- V.138.-№1. - P.70-75.

188. Corbel, M.J. Genus Brucella Meyer and Shaw 1920,173 / M.J Corbel, W.J. Brinley-Morgan// Bergey,s manual oi systematic bacteriology/ Eds. N.R.Krieg, J.G.Holl. Ballimore: Willams Co. - 1984. - V.l. - P.377-388.

189. Deley, J. Ribo Somal ribonucleic acid cistron similarities and CDC group Vd /J.Deley, W.Mannheim, P.Segers//Int J Syst Bacteriol. 1988. - V.37. - P.35-39.

190. Diaz, R. Antigenie relationship of Brucella ovis and Brucella melitensis / R.Diaz, L. Jones, I. Wilson//J. Bacteriol. 1968. - V.93. - P. 1262-1268.

191. Diaz, R. Immunoelectrohoretig analysis et Brucella suis/ R. Diaz, A. Chordi // Experienta. 1966. - V.22. - P.8-13.

192. Douglas, J.I. Porins of Brucella species/ J.I. Douglas e.a. // Infect. Immun. -1984.-№44.-P. 16-21.

193. Dubrau, G. Structure et consutituents des Brucella. Charctersation des Fractions et proprieles biologigues/ G. Dubrau, M. Plommet// Internat. Symp. on Brucellosis (II), Rabat, 1975. Develop. Biol. Stand. - 1976. - V.31. - P.68-91.

194. Dubray, G. Isolation of three Brucella abortus cell-wall antigens protective in murine experimental Brucellosis/ G. Dubrau e.a.// Ann. Rech. Vet. 1980. - №11. - P.367-373.

195. Evans, A. Further subies en. the bacterium aborus and related bacteria. ll.A. Comparison of bacterium abortus with bacterium bronchiserticus and with the organsm with cousend Malta fever/ A. Evans// Inf. Dis.-1918. -V.22. № 6. -P.321-233.

196. Fayazi, Z. Development of a Brucella suis specific hybridisation probe and PCR which distinguishes B.suis from Brucella abortus/ Z. Fayazi, A. Ghadersohi, R.G. Hirst// Veter. Microbiol. 2002. - V.84. - iss.3. - P.253-261.

197. Fekete, D.//J. Appl. Bakteriol. 1990.

198. Foster, I.W. Immunological role of Brucella abortus cell walls/ I.W. Foster, E. Ribi// J. Bacteriol. 1962. - V.84. - № 2. - P.258.

199. Freeman, B.A. Host- parasite relation ships in Brucellosis. I. Infecion of normal guinta peg macrophages in tissue culture/ B.A. Freeman, L.R. Vana// J. Infect. Dis. 1958. - V.102. - № 3. - P.258-268.

200. Glenchur, H. Significance of the blocking antibody in experimental bcellosis / H. Glenchur, H.H. Zinneman, W.H.// J. Immunol. 1961. - V.86. - P.421.

201. Guarino, A. Detection of Brucella species in buffalo whole blood by genespecific PCR/ A. Guarino, L. Serpe, G. Fusco et 2X.II Veter. Ree. 2000. -V.147. - №22. - P.634-636.

202. Halton, B. Recovery of I-roras from Tissue culture cells infectiol with Brucella abortus/B. Halton, B. Sulkin// J. Bact. -1966. -V.91.-№l.-P.285.

203. Hemmen, F. Cloning and serological evaluation of the 17- Kilodalton antigen that it encodes/ F. Hemmen, V. Weynanth, T. Scares e.a.// Clin. Diagn. Lab. Immunal. 1995. - V.2. - № 3. - P.2663-267.

204. Herdberg, M. Immunisation against brucella infection. 1. Isolation and characterzition of a atreptomycin dependent mutant/ M.Herdberg, S.S. Elberg // J.Bacteriol.-1953. -V.1962. - № 5. - P.585-586.

205. Herzberg, M. Immunisation against brucella infection. 2. Effectiveness of a streptomycin dependent strain of Brucella melitensis/ M.Herzberg, S.S. Elberg, K.P. Meyer// Bacteriol. -1953.- № 5.-P.600.

206. Huddelson, J.F. A. studi of the opsone cytorhagie power of the biood and allergie skin reaction in Brucella intection and immunity in man/ J.F. Huddelson,

207. H.W. Ichansion// Amer. J. Publ. Health. 1933. - P.917-922.

208. Huddelson, J.F. Catalase activity of the species of Brucela as a criterion of virulence in studies in Brucellosis/ J.F. Huddelson, W.H. Stahl// Mich, Agric. Exp. Stn. Tech. Bull. 1943. - P.57-62.

209. Hurvell, B. Differertiation of antibodies adoinst Brucella abortus and Jersinia enterocolitica by ELISA/ B.Hurvell, A.A. Lindberg, H.E. Carlsson// Contoibutions to Microb and Immunol. 1979. - V.5. - P.73-79.

210. Jahans, K. The characterization of Brucella strains isolated from marine mammals/ K. Jahans, G. Foster, E. Broughton// Vet. Microbiol. 1997. - V.57. -№4. - P.373-382.

211. Jones, L. Factors influencing biometrie potency as says of brucella allergens in guinea pigs/ L. Jones, P. Berman, R. Dias// Brit. J. Exp. Path. 1973. - V.54. -P.308-379.

212. Abt. -Orig.,175.-1959.-P.81.

213. Kasai, T. Antiinflammatorycytokine levels in patients with septic shock/ T. Kasai, J. Carlet, T. Takakuwa et al.// Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 1997. - V.98. - P.3404-3407.

214. Koylass, M.S. Comparative performance of SNP typing and "Bruce-ladder" in the discrimination of Brucella suis and Brucella canis/ M.S. Koylass, A.C. King, J. Edwards-Smallbone et al.// Veterinary Microbiology. 2010. - V.142. - № 3/4. -P.450-454.

215. Kreutzer, D.L. Chemical characterization and biological properties of lipopolysaccharides isolated from smooth and rough strains of Brucella abortus /D.L. Kreutzer, C.S. Buller e.a.//Infect. Immun. 1979. - №23. - P.811-816.

216. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the heard of bacteriophage T4/ U.K. Laemmli//Nature. 1970. - V.227. - P.680-685.

217. Leal-Klevezas, D.S. Use of polymerase chain reaction to detect Brucella abortus biovar 1 in infected goats/ D.S. Leal-Klevezas, J.P. Martinez-Soriano, I.O. Martinez-Vazquez et al.// Veter.Microbiol. 2000. - V.75. - №1. - P.91-97.

218. Lowry, O.H. Protein measurement with the Folin phehd reagend/ O.H. Lowry, G.I. Roserrou et al.//1. Boil. Chem. 1951. - V. 19. - P.265-275.

219. Lugtenberg, R. Structure and tunction of membrane proteins/ R. Lugtenberg // Enterrobact. Surtace Antigens: Meht. Mol.Characterist. Amasterdam. - 1985. -P.3-16.

220. Marcenson, J. Immunogenitig activety of Brucella cell Wall/ J. Marcenson, D. Sulitreamu// Brit. J. Expti. Pathol. 1962. - V.43. - №1. - P.67.

221. Marx, A. Immunochenical studies in Brucella abortus lipopoly sassarides/ A. Marx, J. Jonescu, A. Pop// Zbl. Bact., I.Abt. orig. 1983. - V.253. - P.544-553.

222. Meyer, M.E. Inter- and inter-strains variants in genus Brucella //3 rd inter. Symp. on Brucellosis , Algiers, Algeria, 1983/ M.E. Meyer// Develop.boil. Standard. 1984. - V.56. - P.79-83.

223. Milles, A. The properties of antigenic preparations from Brucella melitensis.J. Chemical prysiecal propererties of bacterial frandionas/ A. Milles, N. Pirie// Brit.I. exp.path. 1939. - V.20. - P.83.

224. Millis, K. Primer-Directed Euzymatic Amppplication of DNA with a Thermostable DNA Polymerase/ K. Millis// Science. 1983. - V.239. - P.487-491.

225. Moreira-Jacob M. Studies on methods and techniques (or the classification of the bacterial genus Brucella// Internal. Symp. on Brucellosis, Tunis, Tunisic, 1968: In Symp. Seres immunobiol. Standard. Karger, Basel, Suisse. - 1968. - P. 167180.

226. Moreno, E. Brucella lipooplysaharide and polysaccharide/ E. Moreno, D.M. Borowiak, H. Mayer// 2rd Forum in Microbiology Brucella and brucellosis: Ann.Inst. Pasteur Microbiol. 1987. - V.138. - №1. - P.102-105.

227. Moreno, E. Immunochemical characterization of rough Brucella lipopolysaccharides / E. Moreno, L. Jones, D.I. Berman// Infect, and Immunal.1984. Y.43. - №3. - P.779-782.

228. Morison, S.L. Properties of the outer membrane of Brucella/ S.L. Morison, C. Gamero, R. Diaz// 2 rd Forum in Microbiology Brucella and brucellosis. Ann. Inst. Pasteur Microbil. 1987. - V.138. - №1. - P.89-97.

229. Nielsen, K.H. Agglutination of Brucella abortus cells by sera from cattle experimentally infected with Escherichia coli / K.H. Nielsen e.a.// Vet. Med. Microbiol. 1980. - V.5. - №2. - P.123-134.

230. O'Hora, M.J. Restri ction endonuclease analysis of Brucella ovis and other Brucella species/ M.J. O'Hora, D.M. Collins, G.W. Delisie// Vet. Microbiol.1985. P.425-428.

231. Obradovich, J.E. Effect of recombinant canine granulocyte colony stimulating factor on peripheral blood neu-tropbil counts in normal cats/ J.E. Obradovich, G.K. Ogilvie, S. Stadler-Morris et al.// J. Vet. Intern. Med. 1993. - V.7. - P.65-67.

232. Olitzki, A. The use of stereptomycinrosistand and nonresistant strains of the determination of the immuis ing offect of living /B.abortus/ vaccines in wethe mill /A. Olitzki, D. Sulitzcani// J.Infect. Dis. 1959. - V.94. - P.213.

233. Olitzki, A. Defferenees berween antigenic Specifity of nonsoluble partig and solubie exstacts pristacts prepared from Brucella by desintergration/ A. Olitzki //Proc. Soc.exp. Biol. 1960. - V.101. - P.388.

234. Parker, D.C. T cell-dependent B cell activation/ D.C. Parker// Annu. Rev. Immunol. 1993. -V.ll. -P.331-360.

235. Parnas, I. Brucella suis und die Brucellapphagen/ I.Parnas, K. Burdzy //Arch. Hyg. Uhd Bacterid. 1964. - V.147. - №1. - P.66.

236. Paul, W.E. Lymphocyte regponse and Cytokinie/ W.E. Paul, R.A. Seder/ Cell. 1994.-V.76. -P.241-251.

237. Perry, M.B. Structyre of the phenol- phase soluble lipopolysaccharde of Escherichia coli 0:157:H7/ M.B. Perry, L. Mac Lean, D.W. Grittlah// Canad J.Biochem.Cell.Biol. 1985. - V.64. - P.21-28.

238. Prohazka, L. Versuche zur Herctellung von Brucella suis stamen mit herabgesreten virulens/ L. Prohazka// Acta veteran. Acad seien. Hung. 1999. -V.9. - №1. - P.67.

239. Reid, M.T. A quentitative enzyne linked immunosorbent assay for noneunce venom- spicitik immunoglobulin G/ M.T. Reid, K.J. Wasicni e.a.// J.of allergy and clin immunol. 1982. - V.70. - №3. - P.191-198.

240. Renoux, G.A. Sur Pexi Pexistence probarle d nowveaux antigens des Brucella, avec un nourean sheme propose pour representer la repartition des antigens/ G.A. Renoux, M.C. Hoffman// Ann Inst. Pasteur. 1955. - V.88. - №4. -P.52-53.

241. Renoux, G. Spontaneous lusis and phage carrier Staste in brucella cultures/ G. Renoux, M. Plammet, A. Philippon// J. Bach. 1963. - V.86. - №1. - P.642.

242. Rubins, I. Infect, and Immun./ I. Rubins, C. Pomeroy// Infect, and Immun. -1997. V.65. - №7. - P.2975-2977.

243. Rylatt, D. Competitive enzyme immunoassay for the detection of bovine antibodies to Brucella abortus using monoclonal antibodies/ D.Rylatt, D. Wyatt, P.A. Bundesen// Vet. Immunol. Immunopathol. 1985. - V.8. - №3. - P.261-271.

244. Salmacov, K.M. Comparative studu of the immunobiological properties of life brucellosis vaccines/ K.M. Salmacov, A.M. Fomin, E.M. Plotnicova, A.V. Ivanov e.a.// Vaccine. V.28. - S.5. - 2010. - P.35-40: www, elsevier. com/locate/vaccine.

245. Santos, J.M. Outer membrane proteins from rough strains of four Brucella species/ J.M. Santos e.a.// Infect. Immun. 1984. - V.46. - P. 188-194.

246. Simmons, G.G. Epididymiti in rams. Preliminary studies on the occurence and pathogenicity of a Brucella- like organism/ G.G. Simmons, V.T. Hall //Austral.Vet. 1953. - V.29. - №2. - P.33-40.

247. Simon, E.M. Patogenity and immunogenity of streptomicin dependent mutant of Brucella/ E.M. Simon, D.T. Berman// J. Bacteriol. 1982. - V.83. - №6. -P. 1347.

248. Smith, L.D. Pathogenesis of Brucella/L.D. Smith, T.A. Ficht// Crit. Rov. in Microbiology. 1990. - V. 17. - №3. - P.209-230.

249. Stoenner, H.G. Apreliminary report on a Brucella isolation from the desert weod rat neotoma lepida Thomas/ H.G. Stoenner, D.B. Laskman // Am.Vet.Med.Assoo. 1957. - №38. - P.28-32.

250. Tabatabai, L.B. Lspecitic Enzyme-Linked immunosorbent Assay for Delection of Bowine Antibody to Brucella abortus/ L.B. Tabatabai, B. Deyoe // Clin Microbiol. 1984. - V.20. - №2. - P.209-213.

251. Traum, T. Infect abortus investigations in piqs/ T. Traum// Ann. Rep. Dep.Agr. 1914. -P.415-440.

252. Verger, J.M. Brucella a monospecitig genus as shown by decxyribonucleic acid hybridization/ J.M. Verger, F. Grimont, P.A. Griment// Int. J. Syst. Bacter. -1985. V.36. - №3. - P.292-296.

253. Vergeth, J.M. In Disscussion // 2 rd Forium in Microbiology Brucella and brucellosis/ J.M. Vergeth //Ann. Inst Pasteur Microbiol. 1987. - V.138. - №1. -P.131-132.

254. Verstreate, D.R. Outer membrane proteins of Brucella abortus: isolation and characterization/ D.R. Verstreate, M.T. Creasy, N.T. Caveney// Infect. Immun. -1982. V.35. - P.979-984.

255. Weemen, B.K. W.H. Immunoassay using antigen enzyme conjugate/ B.K. Weemen, A.H. Schnurs// TEES letters. - 1971. - V. 15. - P.232-236.

256. Wilson, G.S. The serological differentiation of smooth strains of the Brucella graup / G.S. Wilson and A.A. Milles// Brit. J. Exper. Path. 1932. - V.26. - P. 13.

257. Wilson, J.B. Biochemical properties of virulent and avirulent strains of Brucella Ann. Acad, sei/ J.B. Wilson, B. Dasinger 1960. - V.88. - №5. - P.l 15.

258. Winter A.J. Outer membrane proteins of Brucella // Ann. Inst. Paster. 1987. -V.138. -P.87-90.

259. Wolff, H.C. A new antigen of Brucella abortus/ H.C. Wolff, J.E. Dinger //J. Path. a. Bact. 1951. - V.63. - P. 163-165.277. www.the-icsp.org/subcoms/Brucella/html, 2010.

Информация о работе

Панкова, Екатерина Витальевна
кандидата биологических наук
Казань, 2012
ВАК 06.02.02

Диссертация

Фено-, генотипическая изменчивость бруцелл и разработка экспресс-метода оценки их иммуногенности - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы