Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фармакотоксикологическая и антигельминтная оценка вигисола для диких животных

ВАК РФ 03.02.11, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Фармакотоксикологическая и антигельминтная оценка вигисола для диких животных"

005010334

На прашіх рукописи

ЕМЕЛЬЯНОВА НАДЕЖДА БОРИСОВНА

ФАРМАКОТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ И АНТИГЕЛЬМИНТНАЯ ОЦЕНКА ВИГИСОЛА ДЛЯ ДИКИХ ЖИВОТНЫХ

03.02.11 - паразитология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

п ОЕЗ 2012

Москва - 2012

005010334

Работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии имени К.И.Скрябина» (ВИГИС)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация: Пермская государственная сельскохозяйственная академия им. академика Д.Н.Прянишникова

Защита состоится «29» февраля 2012 года в 14.00 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.011.01 при ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И.Скрябина» (ВИГИС).

Адрес: 117218, г. Москва, ул. Б. Черемушкинская, 28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИГИС

Новик Тамара Самуиловна

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Малахова Екатерина Ивановна

кандидат биологических наук Напалкова Вера Владимировна

Ученый секретарь Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, доктор биологических наук, профессор

Бережко В.К.

Актуальность проблемы. Охрана диких животных и окружающей среды является актуальнейшей проблемой не только в России, но и во всем мире.

Наиболее эффективным методом снижения численности гельминтов является применение кормов, включающих антигельминтики. Терапия и профилактика гельминтозов позволяет не только освободить животных от паразитов, но и предохранить окружающую среду от заражения инвазионными элементами.

Применение лекарственных кормов является непростой задачей. Дикие животные часто отказываются от кормов, в которых содержатся вещества со специфическим вкусом и запахом. Кроме того, кормолекарственные смеси должны быть высокоэффективными, не токсичными, безопасными не только для животных и их потомства, но и для человека и окружающей среды.

Вред здоровью человека могут нанести и сами антигельминтики, накапливающиеся в продуктах животного происхождения. В связи с этим возникает еще одна проблема - это сроки выведения препаратов из организма животных.

В настоящее время практически отсутствуют лекарственные формы анти-гельминтиков, удобные для добровольного поедания дикими животными, которые соответствовали бы вышеперечисленным требованиям и были бы экономически выгодными.

В ГНУ ВИГИС РАСХН был разработан новый препарат - вигисол на основе фенбендазола. Препарат представляет собой белый порошок, без вкуса и запаха, что чрезвычайно важно для скармливания диким животным; он не растворим в воде. Вигисол предназначен для дегельминтизации кабанов в естественной среде обитания путем добровольного поедания.

Руководствуясь идеей о большой перспективности вигисола, необходимо было тщательно охарактеризовать препарат с точки зрения его антигельминтной эффективности, токсических свойств, остаточного содержания в мясе и субпродуктах от кабанов, обработанных препаратом.

Дизайн исследований был спланирован с учетом того, что препарат предназначается для диких животных, т.е. для применения в слабо контролируемых условиях, а также специфических свойств бензимидазолкарбаматов, к которым относится фенбендазол.

Цель н задачи исследований. В связи с вышеуказанным основной целью нашей работы было получение полноценной фармакотоксикологической характеристики нового отечественного препарата вигисол.

Для достижения поставленной цели намн был решен целый ряд подчиненных задач:

- установление параметров острой пероралыюй и накожной токсичности;

- определение раздражающего действия на кожу и слизистые глаза;

- изучение подострой токсичности вигисола;

- оценка кумулятивного действия;

- оценка влияния на эмбриональное развитие крыс;

- исследование антимитотического действия;

- определение сроков выведения фенбендазола у кабанов после дегельминтизации вигисолом;

- испытание вигисола при основных гельминтозах кабанов и титрация оп-тимальпой терапевтической дозы;

- комиссионное и производственное испытания вигисола при гельминтозах кабанов.

Научная новизна:

■ Дана полноценная фармакотоксикологическая характеристика нового, отечественного препарата - вигисола для лечения гельминтозов кабанов.

* В тщательно спланированных научных исследованиях показано, что вигисол является малотоксичным препаратом, к которому у крыс и мышей отсутствует видовая и половая чувствительность. Препарат не оказывает раздражающего действия на кожу. Вигисол не обладает специфическими эффектами (эмбриотоксическим, тератогенным, ан-тимитотическим действием).

■ Действующее вещество препарата - фенбендазол быстро выводится у кабанов после обработки вигисолом; через 7 суток фенбендазол и его основной метаболит сульфоксид фенбендазола (оксфеццазол) не обнаруживаются в тканях и органах животных.

■ По данным экспериментальных испытаний, комиссионного и производственного опытов экстенсэффективность препарата в дозе 20 мг/кг по фенбендазолу при аскаридозе, эзофагостомозе, метастронгилезе и макраканторинхозе кабанов находилась в пределах от 92,9 до 100%.

Практическая значимость работы. Материалы по фармакотоксикологи-ческой оценке вигисола использованы при подготовке проекта Инструкции по применению препарата и Технических условий на его получение.

Детальная информация о токсических свойствах, характере и особенностях противонаразитарного действия препарата, обоснование безопасных сроков использования мяса и органов кабанов после обработки препаратом делает реальным внедрение вигисола в ветеринарную практику для лечения гельминтозов диких животных.

Апробация работы. Полученные результаты исследований были доложены:

- на заседаниях Ученого совета ВИГИС (2006-2010);

- на научно-практических конференциях «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями животных» (г. Москва, 2008; 2010).

Личный вклад. .Представленная диссертационная работа является результатом 5-летних научных исследований автора. Исследования по оценке токсических свойств и антигельминтной эффективности вигисола проведены диссертантом самостоятельно под руководством доктора биологических наук, профессора Новик Т.С., которая оказывала научно-методическую помощь в проведении исследований, анализе и обобщении полученных результатов. Статьи, написанные в соавторстве, включают более 80% материалов исследований соискателя. Соавто-

ры не возражают в использовании результатов совместных исследований (справки предоставлены в диссертационный совет).

Основные положения, выносимые на защиту:

- фармакотоксикологическая оценка вигисола;

- определение сроков выведения фенбендазола и его метаболита у кабанов после дегельминтизации вигисолом;

- определение оптимальной терапевтической дозы препарата на кабанах;

- эффективность вигисола при гельминтозах кабанов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных статей, в которых изложены основные положения и выводы по работе, 3 из них в рекомендованном ВАК РФ издании.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах компьютерного текса, состоит из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований, включающего материалы и методы и результаты исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложение. В список литературы входят 88 отечественных и 94 иностранных источников. Работа иллюстрирована 22 таблицами, 28 рисунками.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Представлен анализ литературных данных по токсическим и антигельминт-ным свойствам препаратов, относящихся к группе бензимидазолкарбаматов, а также по зараженности гельминтами и лечению диких кабанов на охраняемых природных территориях.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

2.1.1. Токсикологическая характеристика вигисола

Исследования выполняли в полном соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005) и Правилами лабораторной практики в Российской Федерации.

Изучение острой пероральной токсичности вигисола проводили на 36 белых беспородных крысах и 60 беспородных мышах обоего пола массой 180-200 г и 18-20 г соответственно.

Вигисол вводили однократно с помощью желудочного зонда в дозах 1000; 3000 и 5000 мг/кг на 1% крахмальном геле с добавлением Твина-80. Препарат в последней дозе вводили равными порциями в два приема с интервалом не более 10 минут.

Острая накожная токсичность. Опыт проводили на 12 крысах-самцах массой 200-250 г.

За одни сутки до начала опыта у животных с участка площадью 5x5 см в области спины вогнутыми ножницами выстригали шерстный покров и наносили препарат в дозах 2500 и 5000 мг/кг на 1% крахмальном геле.

Раздражающее действие внгисопа на кожу и слизистые глаза. Раздражающее действие оценивали при нанесении препарата на неповрежденную кожу крыс в дозах 2500 и 5000 мг/кг. Первичную реакцию кожи оценивали сразу после нанесения, далее через 1; 2; 24; 48 и 72 часа. Наблюдали за возможным проявлением местных признаков воспаления: эритемы, отека и т.д.

Действие вигисола на слизистые глаза оценивали при постановке конъюнктивальной пробы на 5 клинически здоровых кроликах. 1 каплю суспензии препарата с помощью пипетки закапывали однократно в конъюнктивальный мешок левого глаза; в правый глаз вносили 1 каплю дистиллированной воды и он служил контролем.

Поведение животных, состояние глаз и реакцию слизистых оценивали визуально сразу после закапывания и через 15 мин; 1; 24; 48 и 72 часа.

Подострая токсичность. Настоящее исследование проводили на 24 беспородных крысах-самцах с исходной массой тела 100-120 г.

Животных разделили на 4 равноценные группы по 6 крыс в каждой.

Вйгисол вводили ежедневно перорально в течение двух месяцев с помощью внутрижелудочного зонда в дозах: 500; 250 и 100 мг/кг от LD50 (1/10; 1/20; 1/50 от максимально возможной для перорального введения дозы, установленной в остром опыте). Контрольные крысы получали 1% крахмальный гель.

В течение всего периода введения препарата наблюдали за общим состоянием и поведением животных, возможной гибелью, приемом корма и воды, видимыми физиологическими функциями и т.п. Ежедневно у крыс регистрировали массу тела.

В конце опыта через 1 сутки после последнего введения вигисола животных убивали декапитацией и отбирали пробы крови (с и без антикоагулянта) для определения гематологических и биохимических показателей. Определяли массу основных органов и рассчитывали массовые коэффициенты.

Проводили макро- и микроскопическое исследование органов (печени, легких, почек, сердца, селезенки), пробы которых отбирали у всех крыс каждой группы. Материал фиксировали в 10% формалине и заливали в парафин. Гистологические срезы окрашивали гематоксилин-эозином и исследовали микроскопом Prima star (Швейцария).

Кумулятивные свойства вигисола определяли двумя методами.

По методу Кагана Ю.С. и Станкевича В.В. животных разделяли на 2 группы по 10 крыс-самцов в каждой с исходной массой 140-160 г. Препарат вводили в течение 2 месяцев ежедневно перорально на 1% крахмальном геле в дозах 500 и 250 мг/кг (1/10 и 1/20 от максимально возможной для перорального введения дозы, установленной в остром опыте).

По методу Lim R.K. et al. (1961) была сформирована одна группа из 10 крыс-самцов с исходной массой тела 160-180 г. Вигисол вводили ежедневно в течение 24 суток; в первый день препарат ввели в дозе 500 мг/кг (1/10 от максимально возможной для перорального введения дозы, установленной в остром опыте), далее дозу увеличивали примерно в 1,5 раза через каждые четыре дня.

В обоих опытах основным критерием оценки результатов была гибель животных, однако, учитывали общее состояние и поведение крыс.

Эмбриотоксическое и тератогенное действие вигисола.

Данный фрагмент работы проводили на 36 крысах-самках массой 200-220 г и 6 крысах-самцах массой 230-250 г.

В зависимости от регистрации результатов введения испытуемого препарата в антенатальном или постиатальном периоде эксперименты условно разделились на два фрагмента.

В первом опыте антигельминтик вводили беременным самкам перорально в виде суспензии на 1% крахмальном геле с добавлением Твина-80 в трехкратной терапевтической дозе 60 мг/кг (терапевтическая доза составляет 20 мг/кг по действующему веществу (ДВ)) с 1 по 6; с 7 по14 и с 15 по 19 дни эмбриогенеза. Ви-гисол разводили в двойном объеме крахмального клейстера; животные получали препарат в два этапа с интервалом 15-20 минут. Крысы, которым вводили 1% крахмальный гель, служили контролем.

На 20-й день беременности опытных и контрольных крыс подвергали эвтаназии; после лапаротомии извлекали матку и зародышей из плодовместилищ; регистрировали количество желтых тел беременности в обоих яичниках, мест имплантации; число живых, мертвых, резорбированных плодов; эмбрионы внимательно осматривали на наличие внешних аномалий развития; определяли массу (г) и краниокаудальный размер (см) плодов; определяли массу (г) и диаметр плаценты (см); определяли общую эмбриональную смертность, пред- и поетимплан-тационную гибель; половину плодов фиксировали в жидкости Буэна и использовали для исследования плодов на наличие внутренних аномалий развития по методу Вильсона в модификации отдела эмбриологии НИИЭМ АМН СССР.

Во втором опыте опытным беременным крысам препарат вводили перорально в трехкратной терапевтической дозе 60 мг/кг по ДВ с 7 по 14 дни эмбриогенеза. Животные второй группы получали 1% крахмальный гель и служили контролем.

Вели наблюдение за течением беременности, родами и лактацией. За несколько дней до родов самок рассаживали в отдельные клетки по одной в каждую. Регистрировали дату родов и продолжительность беременности.

Оценивали развитие потомства в течение первых 30 суток жизни по ряду общепринятых в таких исследованиях интегральных и специфических показателей.

Ашпимитотическое действие вигисола. Опыт проводили на 12 белых крысах-самцах массой 180-200 г. Антигельминтик вводили однократно перорально в дозе 2500 мг/кг (‘Л от LD50, точнее от максимально возможной для перораль-ного введения дозы, т.е. 5000 мг/кг).

Через 3; 6 и 24 часа после введения вигисола животных подвергали эвтаназии декапитацией.

Препараты костного мозга из бедренной кости готовили по Ford С.Е., На-merton J.L. (1956).

От каждого животного было приготовлено по четыре препарата, на каждом из которых исследовали по 50 полей зрения под микроскопом Prima star (Швейца-

рия). Регистрировали все стадии митоза, определяли митотический индекс и выражали в процентах.

2.1.2. Определение сроков выведения фенбендазола и его метаболита у кабанов после дегельминтизации вигисолом

Определение остаточных количеств фенбендазола в тканях и органах кабанов проводили совместно с к.б.н. Русаковым С.В.

Исследования провели на 12 кабанах r возрасте 9-13 месяцев. Вигисол вводили кабанам с кормом (овсом), однократно перорально в дозе 20 мг/кг по ДВ (2 г/кг по препарату) или из расчета 100 г вигисола на 50 кг массы тела кабанов. По 3 кабана убивали через 1; 3; 5 и 7 суток после обработки. Для исследования на содержание фенбендазола и его метаболита — оксфендазола после убоя кабанов отбирали пробы крови, печени, почек, мышечной и жировой ткани (околопочечной), легких, селезенки и сердца. До исследования пробы органов и тканей хранили в холодильнике при температуре -20°С.

Определение фенбендазола и его метаболита - оксфендазола в органах и тканях кабанов проводили отработанным и адаптированным методом на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием.

Для проведения качественного и количественного анализа полученных экстрактов применяли процедуру градуировки хроматографических данных в компьютерной программе «Мультихром vs 1.52».

2.1.3. Испытания вигисола при гельминтозах кабанов

Настоящие исследования проводили в четырех последовательных опытах различного формата совместно с д.в.н., профессором Архиповым ИА.

Вигисол перемешивали с кормом (овсом) в соотношении 1:5, раскладывали на подкормочные площадки в дозе 20 мг/кг по фенбендазолу из расчета 100 г вигисола на 50 г массы тела кабанов путем добровольного поедания.

Во всех испытаниях эффективность вигисола определяли в опытах типа «критический тест» и «контрольный тест» по результатам копроовоскопии методом флотации с использованием счетной камеры ВИГИС согласно «Руководству, одобренному Всемирной ассоциацией за прогресс ветеринарной паразитологии» (1994). Полученные результаты обработали статистически с использованием компьютерной программы Microsoft Excel.

Испытание по определению эффективности и титрацию оптимальной терапевтической дозы вигисола проводили в январе-феврале 2007 г. в охотоведческом хозяйстве «Погорелки» Павловского района Нижегородской области на 221 кабанах на разных участках по 25-34 животных в каждом при смешанной инвазии, вызванной Ascaris suum, Metastrongylus spp., Oesophagostomum spp. и Macracanthorinchus hirudinaceus.

Кабаны участков 1; 2 и 3 получали вигисол в дозах 15; 20 и 25 мг/кг по фенбендазолу, который смешивали с овсом в соотношении 1:5 и раскладывали в кор-

мушки из расчета 100 г вигисола на 50 г массы тела кабанов путем добровольного поедания. -

Животные участка 4 получали базовый препарат - панакур в дозе 20 мг/кг по фенбендазолу.

Животные участка 5 препарат не получали и служили контролем.

Эффективность препарата определяли, как было описано в начале этого раздела. Во время проведения опытов учитывали поедаемость и переносимость препарата.

Комиссионное испытание вигисола при гельмиптозах кабанов. Комиссия в составе заместителя начальника Россельхознадзора по Нижегородской области, кандидата ветеринарных наук Н.И.Кошеварова, ветеринарного врача охотоведческого хозяйства «Комаровский» Нижегородской области К.КЛескова, заведующего лабораторией экспериментальной терапии ГНУ «Всероссийский институт гельминтологии им. К.И.Скрябина», доктора ветеринарных наук, профессора И.А.Архипова и научного сотрудника ВИГИС Н.Б.Емельяновой провела испытания вигисола при основных гельминтозах кабанов.

Испытание вигисола проводили в феврале-марте 2008 г. в охотоведческом хозяйстве «Комаровский» Павловского района Нижегородской области на 127 кабанах при смешанной инвазии, вызванной аскаридами, эзофагостомами, метас-тронгилами и макраканторинхусами.

Вигисол (лабораторный образец) задавали в дозе 20 мг/кг по ДВ на участке 1 с поголовьем 87 голов. Контролем служили 40 кабанов участка 2, получавшие корма без препарата.

Производственные испытания вигисола при гельминтозах кабанов. В лабораторных условиях было наработано 43 кг вигисола в форме белого порошка с содержанием 1 % фенбендазола. Производственные испытания вигисола проводили в охотоведческих хозяйствах «Погорелки» и «Комаровский» Нижегородской области, соответственно на 78 и 147 кабанах при смешанной инвазии, вызванной аскаридами, эзофагостомами, метастронгилами и макраканторинхусами, а также в охотхозяйстве «Большемурашкинский» этой же области на 136 кабанах, инвази-рованных аскаридами, эзофагостомами и метастронгилами.

Расчет эффективности препарата проводили аналогично тому, как описано выше.

2.1.4. Статистическая обработка

Статистическую обработку полученных данных проводили методом вариационной статистики с помощью простого сравнения средних по двухстороннему t-критерию Стьюдента (Плохинский Н.А., 1969). Различия определяли при 0,05 уровне значимости. Статистический анализ выполняли с помощью программы «Student-200» и Microsoft Excel.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Острая пероральная и накожная токсичность

Результаты перорального введения вигисола лабораторным животным обобщены в таблице 1.

Таблица 1

Результаты острого опыта при внутрижелудочном введении вигисола

Доза, мг/кг Количество животных (павших/выживших)

крысы мыши

самцы самки самцы самки

1000 0/6 0/6 0/10 0/10

3000 0/6 0/6 0/10 0/10

5000 0/6 0/6 0/10 0/10

Данные таблицы весьма наглядны и показательны.

Введение вигисола в трех тестированных дозах ни в одном случае не привело к гибели крыс и мышей. Кроме того, у животных обоих видов отсутствовали признаки интоксикации.

Между тем, самая верхняя доза, т.е. 5000 мг/кг, оказалась максимально возможной для внутрижелудочного введения крысам и мышам.

С учетом этого обстоятельства значение ЬО30 будет превышать 5000 мг/кг; согласно общепринятой гигиенической классификации ГОСТ 12.1.007-76 вигисол относится к 4 классу опасности.

Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод о том, что крысы и мыши не обладают видовой и половой чувствительностью к препарату.

С целью определения параметров острой накожной токсичности вигисол наносили в дозах 2500 и 5000 мг/кг. Гибель и признаки интоксикации у крыс отсутствовали.

Доза 5000 мг/кг была максимально возможной для нанесения на кожу. С учетом этого ограничивающего фактора значение ЬВ50 препарата будет составлять более 5000 мг/кг (4 класс опасности по ГОСТ 12.1.007-76).

3.2. Раздражающее действие на кожу и слизистые глаза

При аппликации вигисола на неповрежденную кожу крыс в дозах 2500 и 5000 мг/кг отсутствовало беспокойство и другие признаки, которые свидетельствовали бы о раздражающем действии препарата.

Данный вывод подкрепляется отсутствием эритемы, изъязвлений, отечности кожи (увеличения толщины кожной складки), повышенной местной температуры (0 баллов).

Реакция слизистых глаза у кроликов на внесение суспензии препарата была слабо выраженной (незначительное покраснение конъюнктивы - 1 балл), быстро

ю

проходила и, скорее всего, ее следует рассматривать в качестве адекватной на внесение чужеродного вещества.

3.3. Подострая токсичность вигисола

Несмотря на то, что вигисол будет применяться при одно-двукратном применении, в целях более развернутой характеристики препарата провели оценку его токсических свойств в условиях длительного подострого опыта.

Введение вигисола в трех испытанных дозах 500; 250 и 100 мг/кг (соответственно 1/10; 1/20 и 1/50 от 1Л)5о от максимально возможной для перорального введения дозы, установленной в остром опыте) не отразилось статистически значимым образом на промежуточных и конечных значениях привесов (в процентном выражении).

Во всех опытных группах не пала ни одна крыса. Отсутствовали какие-либо признаки интоксикации.

Массовые коэффициенты. Относительная масса органов является простым, но очень наглядным показателем токсического действия препаратов при их длительном введении. Результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2

Влияние вигисола на массовые коэффициенты органов крыс

________________________( п= 6, р < 0,05)_____________________________

Орган Дозы, мг/кг Контроль (1 % крахмальный гель)

500 250 100

сердце 3,31±0,12* 3,24±0,16 3,23±0,16 3,25±0,09

печень 27,61±0,78 27,53±1,03 27,10±0,81 28,01±1,33

легкие 5,91±0,29 6,26±0,54 6,26±0,27 5,14±0,51

селезенка 2,18±0,25 2,50±0,23 2,22±0,57 2,04±0,28

почки 6,68±0,17 6,85±0,18 6,68±0,14 6,63±0,29

* Во всех случаях р > 0,05

Как следует из представленных в таблице данных, вигисол ни в одном случае не привел к изменению относительной массы органов у крыс.

Гематологические показатели крови. Объективная оценка токсических свойств вигисола в формате настоящего опыта также включала определение показателей периферической крови крыс. Состояние крови является важным компонентом токсикологических исследований.

Результаты определения гематологических показателей обобщены в таблице 3.

Таблица З

Влияние вигисола на гематологические показатели крови крыс

__________________________(п - 6, р < 0,05) _________________________

Показатель Дозы, мг/кг Контроль (1% крахмальный гель)

500 250 100

Эритроциты, 1012/л 7,91±0,07* 7,84±0,15 7,86±0,12 7,67±0,24

Гематокрит, % 42,90±0,37 41,93±0,82 41,63±0,46 41,65±1,11

Средний объем эритроцитов, фл 54,22±0,49 53,43±0,33 53,67±0,36 54,05±0,87

Ширина распределения эритроцитов по объему (анизоциты), % 7,70±0,05 7,40±0,08* 7,58±0,04 7,87±0,11

Г емоглобин, г/л 164,33±0,84 161,67±3,13 160,67±1,82 157,00±3,96

Среднее содержание НЬ в эритроците, пг 20,78±0,20 20,62±0,09 20,88±0,43 20,40±0,39

Средняя концентрация НЬ в эритроците, г/л 383,50±1,87* 385,50±2,54* 383,33±0,92* 377,50±1,56

Тромбоциты, 109/л 941,00±25,37 1044,33±49,51 978,50±36,81 944,67±100,78

Тромбокрит, % 0,70±0,03 0,79±0,04 0,74±0,03 0,65±0,10

Средний объем тромбоцитов, фл 6,43±0,13 6,50±0,09 6,37±0,13 6,30±0,09

Ширина распределения тромбоцитов по объему, % 9,88±0,15 9,97±0,11 9,64±0,79 9,77±0,13

Лейкоциты, 109/л 11,62±0,65 13,22±1,12 10,95±0,79 12,58±0,69

Лейкограмма (%)

Лимфоциты 77,50±1,99 82,09±1,64 83,10±1,09 82,01±1,34

Моноциты, эози-нофилы 11,53±0,88 9,78±0,75 9,38±0,47 9,37±0,70

Г ранулоциты 10,97±1ДЗ 8,13±0,94 7,52±0,58 8,62±1,36

* Различие по данному показателю статистически достоверно между опытной и контрольной группами (р < 0,05)

Отметим наиболее важные установленные факты.

Обращает на себя внимание достоверное снижение показателя ширины распределения эритроцитов при введении в дозе 250 мг/кг и увеличение средней концентрации гемоглобина в эритроците, причем, последний показатель изменялся при введении препарата во всех трех дозах (таблица 3).

Приводим необходимые пояснения. В случае изменения ширины распределения эритроцитов: данный показатель изменялся только в средней дозе, составляющей 250 мг/кг; верхняя (это очень важно) и нижняя дозы не привели к подобному изменению. Иными словами, отсутствовала зависимость «доза-эффект», которая является непременной при значимых изменениях показателей.

В отношении достоверного изменения средней концентрации гемоглобина в эритроците. Несмотря на то, что данный показатель (во всех опытных группах) изменялся по сравнению с фактическим контролем, все значения находятся в пределах физиологической нормы для данного вида животных. Кстати, аналогичное примечание можно сделать и для ширины распределения эритроцитов.

Длительное введение вигисола не отразилось отрицательным образом, например, на таких жизненно важных показателях, как гематокрит, уровень гемоглобина, количество эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов и других.

Анализ определения гематологических показателей был бы не полным без констатации того факта, что у крыс, которым вигисол вводили во всех трех дозах отсутствовали изменения лейкоцитарной формулы (таблица 3).

Биохимические показатели крови. В таблице 4 приведены результаты определения биохимических показателей сыворотки крови после многократного введения вигисола.

Таблица 4

Влияние вигисола на биохимические показатели крови крыс

_________________________(п = 6, р < 0,05)____________________________

Показатель Дозы, мг/кг Контроль (1% крахмальный гель)

500 250 100

Общий белок, г/л 73,33±1,90* 65,50±2,21 69,17±0,95* 64,33±0,71

Альбумин, г/л 37,83±1,22* 29,33±1,2б 36,83±0,48* 33,00±1,29

Креатинин, мкмоль/л 58,00±1,67 49,50±1,02* 51,50±2,25 57,83±1,45

Мочевина, моль/л 7,77±0,29* 4,97±0,75 5,30±0,51 5,43±0,69

Глюкоза, моль/л 6,43±0,43 5,55±0,43 6,17±0,37 6,33±0,60

Билирубин, моль/л 0,76±0,09 0,53±0,12 0,95±0Д4 0,88±0,09

Алапинаминотранс-фераза (АЛТ), Ед/л 58,17±4,07 51,17±2,33 53,80±3,30 63,33±7,43

Аспартатаминотранс-фераза (ACT), Ед/л 169,88±7,36 182,45±9,99 175,89±8,17 190,03±10,24

Щелочная фосфатаза, Ед/л 264,17±23,37* 226,83±17,54 283,67±35,91 193,83±10,11

Амилаза, Ед/л 366,66±22,28 421,83±41,31 406,67±33,25 415,33±20,29

* Различие по данному показателю статистически достоверно между опытной и контрольной группами (р<0,05)

Как следует из полученных данных, при введении препарата в дозах 500 и 100 мг/кг имело место статистически достоверное изменение уровня общего белка и альбумина, что отсутствовало для средней дозы 250 мг/кг. Полагаем, что указанные изменения, во всяком случае, для дозы 100 мг/кг, носят случайный характер, а сами показатели находятся в пределах референс-значений для данного вида животных.

Кроме того, введение препарата в самой верхней дозе 500 мг/кг привело к повышению уровня мочевины и активности щелочной фосфатазы; средняя доза 250 мг/кг вызвала снижение содержания креатинина (таблица 4).

Остальные биохимические показатели не претерпели статистически значимых изменений.

Макро- и микроскопическое исследование органов. При макроскопическом и микроскопическом исследовании печени, легких, почек, сердца и селезенки после введения вигисола крысам в трех тестируемых дозах патологии не выявлено. Данное обстоятельство является еще одним важным доказательством низкой токсичности вигисола.

В итоге, несмотря на жесткие условия проведения настоящего опыта в отношении продолжительности введения, токсичной дозы установить не удалось. Дозы 500 и 250 мг/кг являются пороговыми, доза 100 мг/кг - недействующей.

3.4. Кумулятивные свойства вигисола

По методу Кагана Ю.С. и Станкевича В.В. при ведении вигисола в дозе 500 мг/кг суммарная доза составила 18500 мг/кг, в дозе 250 мг/кг суммарная доза составила 9250 мг/кг.

При использовании метода Lim R.K. et al. к 24 суткам введения суммарная доза составила 41563 мг/кг.

При оценке кумулятивных свойств вигисола двумя методами падеж животных отсутствовал, и признаков интоксикации не наблюдали, что позволяет сделать вывод об отсутствии функциональной и материальной кумуляции препарата.

3.5. Оценка влияния вигисола на эмбриональное развитие крыс

Как свидетельствуют многочисленные данные литературы, бензимидазол-карбаматы проявляют эмбриотоксическое и тератогенное действие на некоторых видах животных. По сути дела, результаты оценки влияния вигисола на эмбриональное развитие крыс были решающими в определении дальнейшей судьбы препарата. Дизайн исследования включал оценку влияния вигисола на пренатальное и постнаталыюе развитие крыс.

Оценка эмбриотоксического и тератогенного действия, регистрируемого в пренатальном периоде. При введении испытуемого препарата на 1-6; 7-14 и 15-19 дни эмбриогенеза у крыс-самок не отмечали признаков токсикоза, падежа, видимых нарушений беременности. При динамическом наблюдении за приростом массы тела у опытных самок не регистрировали снижения привесов по сравнению с контрольными животными.

Обратимся к таблице 5 и проведем анализ представленных данных.

14

Таблица 5

Влияние вигисола при многократном введении в различные сроки эмбриогенеза в трехкратной терапевтической дозе (60 мг/кг по ДВ) на пренатальное развитие крыс (п = 6; р < 0,05)

Показатели Дни беременности, в которые вводили препарат

1-6 7-14 15-19 Контроль (1% крахмальный гель)

Число самок 6 6 6 6

Среднее число плодов на одну самку 7,25±0,29* 10,20±0,32 6,00±0,32 9,00±0,31

Среднее число резорбций на одну самку 0,40±0,15 0,36±0,13 0,20±0,21 0,60±0,15

Предиплантационная гибель, % 6,18±1,02 6,06±0,90 5,95±0,89 5,88±1,33

Постиплантационная гибель, % 5,50±0,29 6,30±0,08 5,20±2,78 6,25±3,42

Общая эмбриональная смертность, % 11,52±3,38 12,06±2,31 10,15±2,78 11,76±3,56

Случаи полной внутриутробной гибели 0 0 0 0

Масса плода, г 2,50±0,19 2,89±0,08 2,78±0,10 2,71±0,12

Краниокаудальный размер плода, см 3,13±0,08 1=1,25 3,30±0,04 1=1,67 3,44±0,09 3,25±0,04

Масса плаценты, г 0,60±0,03 0,57±0,01 0,58±0,04 0,58±0,04

Диаметр плаценты, см 1,53±0,03 1,58±0,03 1,55±0,04 1,56±0,03

Число эмбрионов с аномалиями развития: - внешние аномалии; - внутренние аномалии 0 0 0 0 0 0 0 0

* Во всех случаях р > 0,05

Гибель эмбрионов у опытных крыс-самок во всех группах не отличалась от контрольных значений. Масса и размеры плодов от опытных самок также были сравнимы с контролем.

При тщательном осмотре эмбрионов не было обнаружено уродливых плодов, т.е. отсутствовали внешние уродства; результаты выполнения девяти сагиттальных срезов также свидетельствовали об отсутствии внутренних аномалий развития.

Суммируя полученные данные в целом, можно придти к очевидному выводу, что введение крысам препарата вигисол в различные сроки беременности, включая критические периоды, в трехкратной терапевтической дозе (60 мг/кг по ДВ) не оказывает эмбриотоксического и тератогенного действия.

Оценка эмбриотропного повреждающего действия, регистрируемого в постнатальном периоде. Приведенные в настоящем разделе данные считаем очень важными, поскольку отрицательное воздействие могло не проявиться в антенатальном периоде, но препарат мог оказать негативное влияние на постнаталь-ное развитие потомства.

В таблице 6 приведены итоги оценки постнатального развития потомства от крыс-самок, которым препарат вигисол вводили в трехкратной терапевтической дозе (60 мг/кг по ДВ).

Продолжительность беременности у опытных самок находилась на уровне контроля и физиологической нормы для данного вида животных. Течение родов было без особенностей. Судя по наличию молока в желудочке крысят, введение испытуемого препарата крысам-самкам не отразилось отрицательно на лактации и сосательном рефлексе у крысят.

При введении вигисола в дозе 60 мг/кг по ДВ на 7-14 дни беременности гибель крысят в первый месяц жизни отсутствовала.

Интегральные и специфические показатели постнатального развития крысят от опытных крыс-самок не отличались статистически значимым образом от контрольных значений (таблица 6).

Физическое развитие потомства протекало без каких-либо отклонений от нормы. Регистрируемые сроки проявления специфических показателей развития, таких как отлипание ушных раковин, появление первичного волосяного покрова, открытие глаз у крысят опытной группы находились в пределах контрольных и характерных для данного вида животных колебаний.

Формирование поведенческих реакций и рефлексов у крысят опытных групп было сравнимым с контролем и в сроки, характерные для данного вида животных.

Таблица б

Влияние вигисола при многократном введении в трехкратной терапевтической дозе (60 мг/кг по ДВ) на постна_________________талыюе развитие крыс (п = 6; р < 0,05) _____________

Показатели Опыт Контроль (1% крахмальный гель)

Количество родивших самок в группе 6 6

Продолжительность беременности, сутки 23,32±0,88 24,33±0,88

Среднее количество крысят на самку при рождении 10,34±0,48 9,34±0,28

Количество крысят п иомете 10,23±0,88 9,32±2,33

Количество мертвых крысят 0 0

Постнатальная гибель, %:

- в течение первых 7 суток 0 0

- в течение 30 суток 0 0

Краниокаудальный размер, см:

- при рождении 3,06±0,03* 3,33±0,04

- 3 сутки 3,59±0,03 3,60±0,04

Масса крысят, г:

- при рождении 2,59±0,04* 2,81±0,07

- 3 сутки 5,00±0,07 4,95±0,08

- 5 сутки 7,49±0,07 7,46±0,09

-13 сутки 15,25±0,31 15,51±0,32

- 30 сутки 85,50±1,23 84Д0±1,42

Отлипание ушных раковин, сутки 3,45±0,63 3,49±0,91

Появление шерстного покрова, сут- 5,00±0,62 5,72±0,32

ки

Открытие глаз, сутки 15,00±0,60 15,32±0,93

Самцы/самки примерно 1/1 примерно 1/1

* Различие по данному показателю статистически достоверно между опытной и кон-

трольной группами (р < 0,05)

Все крысята родились жизнеспособными. Краниокаудальный размер и масса крысят от опытных самок при рождении был меньше в сравнении с контрольными значениями (таблица 6). Однако необходимо отметить, что количество крысят в помете у опытных крыс было выше, чем в контроле, что привело к снижению указанных показателей; тем не менее, они находились в пределах физиологических колебаний.

Остальные тестированные показатели на протяжении всего периода наблюдений существенно не отличались от контрольных значений (таблица 6).

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о том, что введение крысам-самкам препарата не оказывает отрицательного влияния на постнатальное развитие крыс при введении в тестированной дозе.

Суммируя результаты настоящих исследований в целом, можно сделать очевидный вывод о том, что вигисол не обладает эмбриотоксическим и тератогенным действием.

3.6. Антимитотическос действие

В таблице 7 представлены результаты по оценке антимитотического действия вигисола.

Таблица 7

Оценка воздействия вигисола на митоз клеток костпого мозга крыс при введении в дозе 2500 мг/кг (п = 3; р < 0,05)

Показатели, % Период экспозиции (часы)

3 6 24 Контроль (1% крахмальный гель)

Профаза 12,53±1,98* 12,98±1,66 12,33±1,78 12,20±2,03

Метафаза 55,86±1,94 56,96±1,38 54,47±2,04 55,76±1,78

Анафаза 13,1Ш,67 13,86±1,21 13,54±1,53 12,90±1,74

Телофаза 17,20±0,93 17,69±0,86 17,89±1,10 17,12±0,69

Митотический индекс 0,62±0,32 0,97±0,40 1,00±0,41 0,52±0,29

* Во всех случаях р > 0,05

Митотический индекс в различные периоды экспозиции не претерпевал достоверных изменений; процентное число клеток, находящихся на различных стадиях митоза, также не подверглось статистически значимым изменениям.

На основании полученных результатов можно утверждать, что введение вигисола не оказывает влияния на клеточное деление в популяции клеток костного мозга крыс.

3.7. Определение сроков выведения фенбендазола и его метаболита у кабанов после дегельминтизации вигисолом

Фенбендазол обнаруживали в сыворотке крови (257,99±9,91 и 51,32±4,09 нг/г) и органах кабанов только на 1 и 3 сутки после введения вигисола. Наиболее высокая концентрация препарата была отмечена в печени (475,25±11,31 и 161,95±5,41 нг/г) и почках (396,37±10,10 и 122,92±3,83 нг/г).

В результате сульфоокисления в организме кабанов фенбендазол превращается в сульфоксид (оксфендазол). Продукт обнаруживался несколько дольше. Так, на 5 сутки его концентрация в печени, почках и мышцах составила соответственно 44,15±3,71; 35,25±4,5 и 18,33 нг/г. Однако на 7 сутки анализ оксфендазола во всех органах и тканях дал отрицательный результат.

Проведенные исследования дают основание рекомендовать использовать мясо и субпродукты от обработанных вигисолом кабанов в пищевых целях не ранее чем через 7 суток.

3.8. Антигельминтная эффективность и титрация терапевтической дозы вигисола при основных гельминтозах кабанов

В первом опыте оценили возможный спектр антигельминтного действия препарата в произвольной дозе, составляющей 20 мг/кг по ДВ.

Экстенсэффективность вигисола составила при метастронгилезе и макра-канторинхозе -100%, аскаридозе - 97,2% и эзофагостомозе - 92,9%.

Далее провели тнтрацию дозировок вигисола при основных гельминтозах кабанов. Полученные данные по антигельминтной эффективности вигисола в дозах 15; 20 и 25 мг/кг по ДВ представлены в таблице 8.

Вигисол в дозах 20 и 25 мг/кг по ДВ проявил высокую эффективность по сравнению с дозой 15 мг/кг и базовым препаратом панакур (22,2% содержанием фенбендазола) (таблица 8). Низкая эффективность панакура (15,6-17,3%) обусловлена плохой поедаемостью из-за специфического запаха.

Животные контрольного участка были инвазированы гельминтами в равной степени до и в конце опыта (р > 0,05).

Вигисол во всех тестированных дозах охотно поедался животными, хорошо переносился и не оказывал побочного действия.

Таким образом, при испытании вигисола в дозе 20 мг/кг по фенбендазолу препарат проявил 100% эффективность при метастронгилезе, 99,2% при аскаридозе и 98,4% при эзофагостомозе кабанов; доза была рекомендована в качестве оптимальной терапевтической дозы; дальнейшие испытания препарата проводили уже только с этой дозой.

3.9. Комиссионное испытание вигисола при основных гельминтозах кабанов

Зараженность кабанов опытного и контрольного участков охотхозяйства составила до обработки вигисолом аскаридами 78,1 и 75,0%, эзофагостомами 31,0 и 32,5%, метастронгилами 20,7 и 20,0% и макраканторинхусами 10,3 и 10,0% соответственно. Через 20 суток после применения препарата в дозе 20 мг/кг зараженность опытных и контрольных кабанов составила аскаридами 1,15 и 77,5%, эзофагостомами 1,15 и 32,5%, метастронгилами 0 и 20,0% и макраканторинхусами 0 и 10,0% соответственно.

Таким образом, экстенсэффективность вигисола в дозе 20 мг/кг по ДВ равнялась при метастронгилезе и макраканторинхозе 100%, аскаридозе 99,3% и эзофагостомозе 98,7%.

Полученные результаты свидетельствуют о высокой эффективности, хорошей переносимости и широком спектре действия препарата.

Таблица 8

Титрация терапевтической дозы вигисола при гельмшггозах кабанов

№ уча- стка Препарат Кол-во живот- ных Поедаемость Доза препарата по ДВ, мг/кг Эффективность, % Побочное действие

аскари- доз эзофаго- стомоз метастрон- гилез

1 Вигисол 28 полностью 15 96,7 95,2 99,4 нет

2 Вигисол 25 полностью 20 99,2 98,4 100 нет

3 Вигисол 30 полностью 25 100 100 100 нет

4 Базовый препарат -панакур* 26 низкая 20 17,3 16,8 15,6 нет

5 Контрольный участок (не леченные) 34 - - 0 0 0 -

* Действующее вещество фенбендазол

3.10. Производственные испытания вигисола при гельминтозах кабанов

По результатам конроовоскопических исследований зараженность кабанов в охотоведческих хозяйствах «Погорелки», «Комаровский» и «Боль-шемурашкинский» составила соответственно до обработки вигисолом аскаридами 85,9; 77,5 и 87,9%; эзофагостомами 33,3; 31,9 и 36,0%; мстаетропги-лами 19,2; 21,7 и 18,4% и макраканторинхусами 10,2; 10,2 и 0%.

Экстенсэффективность испытуемого препарата в трех указанных хозяйствах при аскаридозе равнялась 98,5; 100 и 99,2%; эзофагостомозе 96,2; 97,9 и 99,2%; метастронгилезе и макраканторинхозе 100% во всех случаях.

Отмечена хорошая поедаемость вигисола кабанами разных возрастных групп. Препарат не оказывал побочного действия на организм и поведение животных.

Вигисол является перспективным лекарственным средством лечения диких животных, так как он проявляет высокую антигельминтную эффективность (92,9-100%) и безопасен для кабанов в отличие от препаратов на основе нилверма (низкий химиотерапевтический индекс) и албендазола (обладает эмбриотронным действием). Важным преимуществом препарата является хорошая поедаемость кабанами.

Таким образом, суммируя результаты исследований в целом, можно придти к обоснованному заключению, что помимо высокой антигельминтной эффективности вигисол является малотоксичным препаратом для лабораторных животных, не проявляет специфических побочных эффектов, хорошо поедается и переносится кабанами и быстро выводится. К этому следует добавить простоту и экономичность его получения из доступных материалов, а также удобство и надежность в применении.

ВЫВОДЫ

1. LD5o вигисола при однократном пероральном введении крысам и

мышам (самцам и самкам) превышает 5000 мг/кг; согласно общепринятой гигиенической классификации (ГОСТ 12.1.007-76) препарат относится к 4 классу опасности. .

2. LD50 вигисола при нанесении на неповрежденную кожу крыс составляет более 5000 мг/кг (4 класс опасности согласно ГОСТ 12,1.007-76).

3. В дозах 2500 и 5000 мг/кг вигисол не оказывает раздражающего действия на кожу крыс. При постановке конъюнктивальной пробы препарат вызывает слабое кратковременное покраснение конъюнктивы глаз у кроликов (1 балл), полностью проходящее через 24 часа.

4. Оценена токсичность вигисола в условиях субхронического опыта при пероральном введении испытуемого препарата в течение 2 месяцев в дозах 500; 250 и 100 мг/кг (1/10; 1/20 и 1/50 от дозы 5000 мг/кг, представляющей собой максимально возможную для перорального введения, установленную в остром опыте). С учетом результатов определения динамики прироста массы тела, массовых коэффициентов органов, гематологических и биохими-

ческих показателей, а также макро- и микроскопического исследования тканей дозы 500 и 250 мг/кг являются пороговыми, а доза 100 мг/кг - недействующей.

5. Вигисол не обладает материальной и функциональной кумуляцией.

6. При внутрижелудочпом введении беременным крысам-самкам на 1-6; 7-14 и 15-19 дни беременности в трехкратной терапевтической дозе (60 мг/кг по ДВ) вигисол не оказывает отрицательного влияния на антенатальное и по-стнатальное развитие крыс.

7. Вигисол в дозе 2500 мг/кг не проявляет аитимитотического действия в популяции клеток костного мозга крыс.

8. Фенбендазол и его основной метаболит сульфоксид фенбендазола (оксфендазол) быстро выделяется из организма кабанов после обработки в терапевтической дозе (20 мг/кг по ДВ); оба продукта не обнаруживаются во всех анализированных тканях через 7 суток.

9. Оптимальная терапевтическая доза вигисола, примененного кабанам вольным скармливанием в смеси с кормом при наиболее распространенных гельминтозах, составляет 20 мг/кг по фенбендазолу; отмечена хорошая по-едаемосгь и переносимость препарата.

10. По данным экспериментальных испытаний, комиссионного и производственного опытов экстенсэффективность препарата в дозе 20 мг/кг по фенбендазолу при аскаридозе, эзофагостомозе, метастронгилезе и макракан-торинхозе кабанов находилась в пределах от 92,9 до 100%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Материалы по оценке токсических свойств, остаточного содержания и антигельминтной эффективности использованы при подготовке проекта Инструкции по применению вигисола для дегельминтизации кабанов и Технических условий на получение препарата, одобренных Ученым советом ВИГИС от 10.03.2010 г.

2. По результатам экспериментальных исследований, комиссионного и производственного опытов рекомендуем применять вигисол для лечения и профилактики основных гельминтозов диких кабанов.

3. Мясо и субпродукты от обработанных вигисолом кабанов можно использовать в пищевых целях не ранее чем через 7 суток.

4. Материалы диссертационной работы могут быть использованы для чтения лекций по дисциплине «Паразитология» в высших учебных заведениях, на курсах повышения квалификации ветеринарных специалистов, при подготовке соответствующих инструкций, приказов, нормативных документов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Емельянова Н.Б. Острая токсичность вигисола при введении в желудок и нанесении на кожу//Материалы докладов научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». - М. - 2007. - Вып. №8.-С. 126-127.

2. Емельянова Н.Б. Сроки выведения остаточных количеств фен-бендазола из организма кабанов после применения вигисола/Русаков С.В., Емельянова Н.Б., Архипов И.А.//Росснйскин паразитологический журнал. - 2009. - № 3. - С. 102-108.

3. Емельянова Н.Б. Производственные испытания вигисола при нематодозах кабанов//Архипов И.А., Емельянова Н.Б./УРоссийский паразитологический журнал. - 2009. - № 3. - С. 97-100.

4. Емельянова Н.Б. Оценка вигисола на кумулятивное и антимитоти-ческое действие//Материалы докладов научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». - М. - 2010. - Вып. № 11. -С. 169-170.

5. Емельянова Н.Б. Влияние вигисола на пре- и постнатальное развитие крыс//Материалы докладов научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». - М. - 2010. - Вып. № 11. - С. 165-169.

6. Емельянова Н.Б. Подострая токсичность вигисола//Материалы докладов научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». - М.-2010.-Вып. № 11.-С. 171-175.

7. Емельянова Н.Б. Фармакотоксикологическая оценка вигисо-ла//Российский паразитологический журнал. - 2011. - № 4. - С. 107-110.

Заказ № 6545 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Емельянова, Надежда Борисовна, Москва

61 12-3/481

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕЛЬМИНТОЛОГИИ ИМ. К.И. СКРЯБИНА (ВИГИС), РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ

На правах рукописи

ЕМЕЛЬЯНОВА НАДЕЖДА БОРИСОВНА

ФАРМАКОТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ И АНТИГЕЛЬМИНТНАЯ ОЦЕНКА ВИГИСОЛА ДЛЯ ДИКИХ ЖИВОТНЫХ

Специальность: 03.02Л1 - паразитология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Т.С. Новик

Москва - 2012

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................9

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.......................................................33

Материалы и методы..................................................................................33

2.1. Токсикологическая характеристика вигисола..................................33

2.2. Постановка опыта по определению остаточных количеств фенбендазола и его метаболита оксфендазола в тканях

и органах кабанов после дегельминтизации вигисолом..................45

2.3. Схемы опытов по оценке антигельминтной эффективности вигисола при основных гельминтозах кабанов................................46

2.4. Статистическая обработка..................................................................50

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ............................................................51

3.1. Острая пероральная токсичность.......................................................51

3.2. Острая токсичность при нанесении на кожу....................................52

3.3. Раздражающее действие на кожу и слизистые глаза.......................53

3.4. Подострая токсичность вигисола.......................................................55

3.5. Кумулятивные свойства вигисола......................................................79

3.6. Оценка влияния вигисола на эмбриональное развитие крыс..........79

3.7. Антимитотическое действие вигисола..............................................85

3.8. Определение сроков выведения фенбендазола

и его метаболита у кабанов после дегельминтизации вигисолом.............................................................................................86

3.9. Испытание вигисола при основных гельминтозах кабанов............99

3.10. Титрация терапевтической дозы вигисола

при гельминтозах кабанов..............................................................102

3.11. Комиссионное испытание вигисола при основных гельминтозах кабанов......................................................................104

3.12. Производственные испытания вигисола

при гельминтозах кабанов..............................................................106

4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ..............................109

5. ВЫВОДЫ........................................................................................................116

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ......................................................118

7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.................................119

ПРИЛОЖЕНИЕ................................................................................................137

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Охрана диких животных и окружающей среды является актуальнейшей проблемой не только в России, но и во всем мире.

Наиболее эффективным методом снижения численности гельминтов является применение кормов, включающих антигельминтики. Терапия и профилактика гельминтозов позволяет не только освободить животных от паразитов, но и предохранить окружающую среду от заражения инвазионными элементами.

Применение лекарственных кормов является непростой задачей. Дикие животные часто отказываются от кормов, в которых содержатся вещества со специфическим вкусом и запахом. Кроме того, кормолекарственные смеси должны быть высокоэффективными, не токсичными, безопасными не только для животных и их потомства, но и для человека и окружающей среды.

Вред здоровью человека могут нанести и сами антигельминтики, накапливающиеся в продуктах животного происхождения. В связи с этим возникает еще одна проблема - это сроки выведения препаратов из организма животных.

В настоящее время практически отсутствуют лекарственные формы ан-тигельминтиков, удобные для добровольного поедания дикими животными, которые соответствовали бы вышеперечисленным требованиям и были бы экономически выгодными.

В ГНУ ВИГИС РАСХН был разработан новый препарат - вигисол на основе фенбендазола. Препарат представляет собой белый порошок, без вкуса и запаха, что чрезвычайно важно для скармливания диким животным; он не растворим в воде. Вигисол предназначен для дегельминтизации кабанов в

естественной среде обитания путем добровольного поедания.

4

Руководствуясь идеей о большой перспективности вигисола, необходимо было тщательно охарактеризовать препарат с точки зрения его анти-гельминтной эффективности, токсических свойств, остаточного содержания в мясе и субпродуктах от кабанов, обработанных препаратом.

Дизайн исследований был спланирован с учетом того, что препарат предназначается для диких животных, т.е. для применения в слабо контролируемых условиях, а также специфических свойств бензимидазолкарбаматов, к которым относится фенбендазол.

Цель и задачи исследований. В связи с вышеуказанным основной целью нашей работы было получение полноценной фармакотоксикологической характеристики нового отечественного препарата вигисол.

Для достижения поставленной цели нами был решен целый ряд подчиненных задач:

• установление параметров острой пероральной и накожной токсичности;

• определение раздражающего действия на кожу и слизистые глаза;

• изучение подострой токсичности вигисола;

• оценка кумулятивного действия;

• оценка влияния на эмбриональное развитие крыс;

• исследование антимитотического действия;

• определение сроков выведения фенбендазола у кабанов после дегельминтизации вигисолом;

• испытание вигисола при основных гельминтозах кабанов и титра-ция оптимальной терапевтической дозы;

• комиссионное и производственное испытания вигисола при гельминтозах кабанов.

Научная новизна:

■ Дана полноценная фармакотоксикологическая характеристика нового, отечественного препарата - вигисола для лечения гельминтозов кабанов.

■ В тщательно спланированных научных исследованиях показано, что вигисол является малотоксичным препаратом, к которому у крыс и мышей отсутствует видовая и половая чувствительность. Препарат не оказывает раздражающего действия на кожу. Вигисол не обладает специфическими эффектами (эмбриотоксическим, тератогенным, антимитотическим действием).

■ Действующее вещество препарата - фенбендазол быстро выводится у кабанов после обработки вигисолом; через 7 суток фенбендазол и его основной метаболит сульфоксид фенбендазола (оксфендазол) не обнаруживаются в тканях и органах животных.

■ По данным экспериментальных испытаний, комиссионного и производственного опытов экстенсэффективность препарата в дозе 20 мг/кг по фенбендазолу при аскаридозе, эзофагостомозе, метастронгилезе и макракан-торинхозе кабанов находилась в пределах от 92,9 до 100%.

Практическая значимость работы. Материалы по фармакотокси-кологической оценке вигисола использованы при подготовке проекта Инструкции по применению препарата и Технических условий на его получение.

Детальная информация о токсических свойствах, характере и особенностях противопаразитарного действия препарата, обоснование безопасных сроков использования мяса и органов кабанов после обработки препаратом делает реальным внедрение вигисола в ветеринарную практику для лечения гельминтозов диких животных.

Апробация работы. Полученные результаты исследований были доложены:

• на заседаниях Ученого совета ВИГИС (2006-2010);

• на научно-практических конференциях «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями животных» (г. Москва, 2008; 2010).

Личный вклад. Представленная диссертационная работа является результатом 5-летних научных исследований автора. Исследования по оценке токсических свойств и антигельминтной эффективности вигисола проведены диссертантом самостоятельно под руководством доктора биологических наук, профессора Новик Т.С., которая оказывала научно-методическую помощь в проведении исследований, анализе и обобщении полученных результатов. Статьи, написанные в соавторстве, включают более 80% материалов исследований соискателя. Соавторы не возражают в использовании результатов совместных исследований (справки предоставлены в диссертационный совет).

Основные положения, выносимые на защиту:

• фармакотоксикологическая оценка вигисола;

• определение сроков выведения фенбендазола и его метаболита у кабанов после дегельминтизации вигисолом;

• определение оптимальной терапевтической дозы препарата на кабанах;

• эффективность вигисола при гельминтозах кабанов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных статей, в которых изложены основные положения и выводы по работе, 3 из них в рекомендованном ВАК РФ издании.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах компьютерного текса, состоит из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований, включающего материалы и методы и результаты исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложение. В список литературы входят 88 отечественных и 94 иностранных источников. Работа иллюстрирована 22 таблицами, 28 рисунками.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В рамках настоящего обзора мы попытались провести анализ доступной научной литературы, имеющей самое непосредственное отношение к целям и задачам наших собственных исследований. Такой круг вопросов включает краткую общую характеристику, токсические свойства и данные по про-тивопаразитарной эффективности бензимидазолкарбаматов, поскольку именно к ним относится фенбендазол — действующее вещество вигисола. Кроме того, нам представлялось важным привести данные по распространению гельминтозов среди диких животных на охраняемых природных территориях и мерам борьбы с ними.

Краткая общая характеристика препаратов, производных бензимидазолкарбаматов

К группе бензимидазолкарбаматов относится довольно большое количество препаратов, широко применяемых в ветеринарной медицине для лечения различных гельминтозов животных.

Производные этой группы ценятся за низкую токсичность и высокую эффективность против нематод; данные соединения менее эффективны против цестод и трематод, но при повторной схеме применения активно действуют на цестоды рода Taenia.

Действие бензимидазолкарбаматов на гельминты к настоящему времени досконально изучено, хотя, как и в каждой научной проблеме, и здесь остаются белые пятна. Исследования по механизму антигельминтного действия бензимидазолкарбаматов проводили Rew P.S. (1978), Prichard R.K. (1973), Romanowski R.K. et al. (1975) и другие.

Механизм антигельминтного действия данных соединений заключается в нарушении энергетических процессов гельминтов, в частности, с разобще-

нием цепочки окислительного фосфорилирования и воздействием на фума-ратредуктазу (Новик Т.С., Ястреб В.Б., 2000). Действуя, как ингибиторы полимеризации тубулина микроканальцев в клетках кишечника гельминтов и вызывая дезорганизацию большого количества скелетоформирующих клеток, бензимидазолы приводят к гибели нематод (Бене Ф., 1999).

Основные и широко применяемые в ветеринарии производные бензи-мидазолкарбатов и их структурные формулы представлены в таблице 1.

Таблица 1

Основные производные бензимидазолкарбаматов

Название соединения Структурная формула

Тиабендазол ОуН Н

БМК N №1-СО-ОСН3 н

Бенацил N г^чГ^ ИН-СО-ОСНз СО-СН2-ОС6Н5

Продолжение таблицы 1

Фенбендазол 0 N ^^^ ^^ ЫН-СО-ОСНз Н

Оксфендазол С о/ ) N ИН-СО-ОСНз н

Оксибендазол СН3-СН2-СН2-0 N ^^^^ ^^_ИН-СО-ОСНз н

Камбендазол (сн3),сн-о-со-м1 N - 01 1

Альбендазол СНз-СН2-СН2-8 N ^^^^ ^^_Ш-СО-ОСН3 н

Продолжение таблицы 1

Токсические свойства антигельминтиков, производных бензимидазолкарбаматов

Первым представителем этой группы является тиабендазол - 2(4-тиа-золил)беизимидазол. Впервые был синтезирован в США; и длительное время успешно применялся в медицине и ветеринарии в качестве антигельминтика широкого спектра действия.

В настоящее время тиабендазол выпускается разными странами и фирмами в разнообразных лекарственных формах и под разными торговыми названиями: анастронгил, бовизол, еквизол, фолдан, тиабензол, тибензол, тиа-бенда, триазокс и др.

В опытах по изучению эмбриотоксического и тератогенного действия на крысах ICK установлено, что тиабендазол в повышенных терапевтических дозах, а именно 700; 1300 и 2400 мг/кг, при введении с 7 по 14 дни эмбриогенеза вызывает аномалии в строении скелета плодов (Ogata А. et al., 1984).

LD50 тиабендазола при пероральном введении белым крысам составляет 3100 мг/кг, для белых мышей - 1300 мг/кг, для овец - 1200 мг/кг.

БМК - метил-1Ч-(2-бензимидазолил)карбамат. Выпускается под названиями: МБК, медамин, бовестин, БАС-3460, дерозол, карбендазим, Хое-

17411 и др. В основном этот препарат используется в растениеводстве в качестве системного фунгицида.

ЫЭ5о для белых мышей при пероральном введении составляет более 15000 мг/кг, при внутрибрюшинном более 10000 мг/кг. По данным Дороши-ной М.В. (1982) БМК обладает кумулятивными свойствами.

В ветеринарной медицине для дегельминтизации животных использовали БМК и его производное бенацил, синтезированное в СССР. Эти препараты обладают низкой токсичностью, высокой эффективностью против многих видов гельминтов, хорошей переносимостью в высоких дозах практически у всех видов животных.

Бенацил (метил-1 -феноксиацетил-2-метоксикарбонил-амино)бензими-дазол. БМК и бенацил использовали для лечения гельминтозных инвазий, однако, применение этих препаратов на репродуктивных овцах не рекомендовалось, поскольку эти соединения обладают выраженным эмбриотоксиче-ским и тератогенным действием для данного вида животных (Скира В.Н., 1986). Эмбриотоксический и тератогенный эффект БМК и бенацила отмечен у беспородных крыс и крыс линии Вистар в дозах 20-500 мг/кг с 7-15 дни эмбриогенеза (Штенберг А.И. и др., 1973; Рябова В.А., Лаптева Л.А., 1981; Рябова В.А., Веселова Т.П., 1984; МиНа М. й а1., 1982; ДапагёЬап А. е1 а1., 1984).

ЬБ5о бенацила при пероральном введении белым мышам составляет 9990 мг/кг, при внутрибрюшинном введении 1430 мг/кг (Дорошина М.В., 1982).

Позднее был синтезирован целый ряд замещенных в 5-ом положении различными заместителями бензимидазолкарбаматов; к данной подгруппе относится большинство современных высокоэффективных антигельминтных

средств, сведения по которым мы приводим ниже.

Анализ данных мы начинаем с фенбендазола, поскольку он представлял для нас наибольший интерес с учетом тематики наших собственных исследований.

Фенбендазол - 5-фенилтиобензимидазол-2-метилкарбамат - антигель-минтик, завоевавший огромную популярность во всем мире. Он не токсичен, обладает высокой эффективностью против большинства видов нематод, фас-циол, мониезий и других гельминтов.

Фенбендазол впервые был выпущен фирмой «Хехст» (Германия). Синонимы: панакур, сепкур, аксилур, ное-881 и др.

Фенбендазол не обладает кумулятивными, сенсибилизирующими свойствами, не раздражает кожу и слизистые. Отсутствует эмбриотоксический и тератогенный эффект у крыс, кроликов, овец, коров, лошадей (Becker W., 1975), свиней (Delatour P., Parish R., 1986). В литературе имеется единичное сообщение о проявлении эмбриотоксического действия у кроликов в дозе 63 мг/кг (Delatour P., Parish R., 1986).

Фенбендазол малотоксичен: LD50 при введении в желудок белым крысам и мышам составляет более 10000 мг/кг. Побочные явления встречаются нечасто и проявляются в виде судорог, гипотермии, диарее (Кузьмин A.A., 2004).

Интересный факт: в организме животных фенбендазол превращается в оксфендазол, который проявляет эмбриотоксический и тератогенный эффект.

Оксфендазол - метил[5-(фенилсульфанил)-1-Н-бензимидазол-2-ил] кар-бамат. Препарат был впервые синтезирован в Англии фирмой «Уэлком». Известен под названиями - синтекс, систамекс.

Оксфендазол, как и многие бензимидазолкарбаматы, проявляет эм-бриотоксическое и тератогенное действие. Этот эффект у крыс и овец препа-

рат проявил в дозах 10,5-21,0 мг/кг (Delatour P. et al., 1977, 1982; Delatour P., 1983). Однако, имеется противоречивое сообщение об отсутствии гибели и рождения ягнят с аномалиями развития при введении оксфендазола в трехкратной терапевтической дозе (Piercy D.W. et al., 1979). По данным этих же авторов оксфендазол не проявлял эмбриотропного эффекта у коров. Результаты исследований Morgana D.W.T. (1982) свидетельствуют об отсутствии эмбриотоксического и тератогенного действия у супоросных свиноматок.

Малотоксичный препарат - ЛД5о для белых крыс и мышей составляет 6400 мг/кг.

Оксибендазол - 5-пропоксибензимидазол-2-метилкарбамат. Антигель-минтик, обладающий высокой эффективностью против нематод пищеварительного тракта животных разных видов.

По данным Delatour P. et al. (1976) оксибендазол в высоких дозах проявляет эмбриотоксическое действие на крысах, но по результатам других ученых этот эффект не детектировали у мышей и крыс, а также у овец и коров, несмотря на то, что дозы препарата значительно превышали терапевтические (Theodorides V.J. et al, 1977, Anderson R.S., 1962; Coles G.C., 1986; La-cey E. et al., 1987; Mage С., 1985).

Как и многие другие производные бензимидазолкарбаматов, оксибенда