Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Фармакокоррекция иммуносупрессии при Т-2 токсикозе животных

ВАК РФ 06.02.03, Звероводство и охотоведение

Автореферат диссертации по теме "Фармакокоррекция иммуносупрессии при Т-2 токсикозе животных"

ии5049787

На правше рукописи

м

ВАЛИЕВ АЛМАЗ РАФАИЛЬЕВИЧ

ФАРМАКОКОРЕКЦИЯ ИММУНОСУПРЕССИИ ПРИ Т-2 ТОКСИКОЗЕ ЖИВОТНЫХ

06.02.03 — ветеринарная фармакология с токсикологией

- АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кадидата биологических наук

ддфЕВМ«

Казань-2013

005049787

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», Казань).

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Тремасов Михаил Яковлевич

Официальные оппоненты: Великанов Валериан Иванович

зав. кафедрой анатомии, фармакологии с токсикологией Нижегородской

государственной сельскохозяйственной академии

доктор биологических наук, профессор,

Усенко Виктор Иванович

зав. кафедрой фармакологии Казанской

государственной академии ветеринарной

медицины им. Н.Э. Баумана

доктор биологических наук, профессор,

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский

институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии РАСХН (г. Москва)

Защита состоится « Z& » года в 10°° часов на

заседании диссертационного совета Д-220.012.01 при ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (420075, Казань, Научный городок-2, ФГБУ «ФЦГРБ-ВНИВИ»).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГЪУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (Казань). . ,

Автореферат разослан « »^¿' ¿^А^ 2013 г. и размещен на официальном сайте ФГБУ «ФЦТРБ-ВНЙВИ» www.vnivi.ru и на официальном сайте ВАК РФ www.vak2.ed.gov.ru.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук, л

старший научный сотрудник c^V&rrrrrn^^- Степанов В.И.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Из природных экотоксикантов - загрязнителей сельскохозяйственного сырья и продуктов питания, наибольшую опасность для здоровья населения и животных представляют микроскопические грибы и их токсины - микотоксины (Смирнов А.М., Кононенко Г.П., Таланов Г.А. и др., 1999; Кузнецов А.Ф., 2001). Микотоксины загрязняют продукты питания и корма на всех этапах их производства, транспортировки, хранении, переработки и реализации (Иванов A.B.; Тремасов МЛ.; Папуниди К.Х., 2008,2010).

Микотоксины отличаются высокой токсичностью, а многие из них — иммуносупрессивными, мутагенными, тератогенными и канцерогенными свойствами (Тутельян В.А. с соавт., 1985; 2009). Исследования отечественных и зарубежных ученых показывают, что животноводство,несет серьезные экономические потери от снижения продуктивности и воспроизводства сельскохозяйственных животных, возникающих при микотоксикозах (Антипов В.А. и др., 2007; Дорожкин В.И., Иванов В.Г., 2007; Fink -Gremmels., 2006; Trevor К., 2006).

У исследователей особый интерес вызывает иммунодепрессивные свойства микотоксинов (Рухляда В.В. и др. 2009, Niyo К. et al., 1988, Vidal D., 1990). Некоторые исследователи иммуносупрессию, вызванную микоток-синами, выделяют в отдельную форму течения микотоксикоза. Одним из наиболее токсичных микотоксинов является : Т-2 токсин. Показано, что органами-мишенями Т-2 токсина являются костный мозг, селезенка, вилочковая железа, лимфоидная ткань, а у птиц еще и фабрициева сумка (Красников Г.А. и др., 1992; McDonald Е., 1987). При этом регистрируют подавление иммунной системы, задержку роста и снижение продуктивности животных и птицы, нарушение функции воспроизводства (Котик А.Н.,1999; Тремасов МЛ, 2004; Труфанов О.В., 2009). Снижая резистентность организма, они могут способствовать развитию инфекционных и незаразных болезней.

Вышеизложенное обуславливает актуальность проблемы иммуносупрессии, индуцированной микотоксинами, поиск и внедрение эффективных лечебных и профилактических средств, способствующих иимунокоррекции при микотоксикозах животных.

Цель и задачи исследований. Целью исследований явился поиск эффективных иммуномодуляторов для фармакокоррекции иммуносупрессии, вызванной микотоксином Т-2, оценка их эффективности при отравлении животных этим микотоксином.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие

задачи:

1. Определить уровень загрязнённости кормов Т-2 токсином и НТ-2 токсином;

2. Провести скрининг эффективных иммуномодуляторов при воздействии Т-2 токсина на организм животных;

3. Изучить эффективность применения иммуномодулятора тималина в отдельности и в комплексе с сорбентом при воздействии Т-2 токсина на лабораторных и сельскохозяйственных животных, учитывая изменение иммунологических, клинических, гематологических, биохимических и патоморфологических показателей;

4. Провести производственные испытания отобранных средств.

Научная новизна. В результате мониторинга впервые установлено,

что корма в РФ, контаминированные Т-2 токсином, до 40-50% случаев одновременно загрязнены НТ-2 токсином.

Впервые показано лечебно-профилактическое действие препарата тималин в отдельности и в сочетании с энтеросорбентом «Фитосорб» при Т-2 токсикозе животных. Установлено коррегирующее действие отобранных средств на иммунологические, биохимические и гематологические показатели животных. Определены их оптимальные дозы и схемы применения.

Практическая ценность работы. В качестве средств профилактики и лечения Т-2 токсикоза животных и профилактики иммуносупрессии, вызванной Т-2 токсином, рекомендуется применять препарат тималин в дозе 0,1 — 0,2 мг/кг массы тела, ежедневно курсом 5 сут с одновременным включением в рацион органического энтеросорбента «Фитосорб» в количестве 0,5% от массы рациона.

Результаты исследований вошли в «Методические рекомендации по применению энтеросорбентов при отравлении животных» (2010) и «Методическое пособие: диагностика, профилактика и лечение сочетанных отравлений животных вторичными метаболитами микроскопических грибов рода Fusarium», утвержденных Отделением ветеринарной медицины РАСХН (2012).

Апробация материалов диссертации. Основные материалы диссертационной работы доложены и одобрены на научных сессиях ФГЪУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по итогам НИР за 2008-2012 гг., ежегодных республиканских, межрегиональных, международных научно — практических конференциях и симпозиумах (Казань 2008, 2009, 2010, 2011, 2012; Самара 2009; Ульяновск, 2010; Харьков, 2010; Новосибирск 2010; Краснодар, 2011, 2012; Москва 2009,2010,2012).

Публикации. По результатам выполненных исследований опубликовано 14 научных работ, в том числе 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Основные положения диссертации, выдвигаемые на защиту:

• Результаты скрининга средств - иммуностимуляторов при Т-2 токсикозе;

• Иммуносупрессивное действие Т-2 токсина на лабораторных и сельскохозяйственных животных;

• . Эффективность применения иммуномодулятора в отдельности и в сочетании с сорбентом при Т-2 токсикозе.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 162 страницах компьютерного текста и включают: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, практические рекомендации, список литературы. Работа содержит 32 таблицы. Список литературы включает 236 источников, в том числе 54 - иностранных.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в 2008-2012 г.г. в отделе токсикологии ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань) и является частью комплексных исследований, проводимых по заданию: «Токсикологическая безопасность» (№ гос. регистрации 01200202603).

Эксперименты проведены на лабораторных и сельскохозяйственных животных: нелинейных белых крысах (210), овцах породы «Прекос» (15 гол) и пороеятах-отьёмышах крупной белой породы (12 гол). Перед постановкой опытов животных выдерживали на 2-х недельном карантине, кормление проводили согласно нормам, принятым в зоотехнии. Подопытных и контрольных животных распределяли в группы по принципу аналогов. В течение всего опыта они находились в одинаковых условиях содержания и кормления. Производственные опыты проведены в сельскохозяйственном предприятии Буинского района РТ на поросятах (60 гол).

Для экспериментальных исследований использовали кристаллические Т-2 токсин и НТ-2 токсин, полученные в лаборатории микотоксинов и ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (Семёнов Э.И., Валиев АР.) не отличающиеся по физико-химическим параметрам и токсическим свойствам от существующих стандартных образцов. В качестве продуцента Т-2 токсина использовали гриб Ризалит Брогой1сЫо1(1е8 пггамм 2М15, любезно предоставленный д.б.н. А.Н.Котиком. Токсин животным вводили внутрижелудочно в виде 5% водно-спиртового раствора с помощью атравматичного зонда, либо включением в корм животных. Контрольные животные получали эквивалентные количества раствора без содержания Т-2 токсина.

В качестве потенциальных лечебно-профилактических средств использовали препараты: левамизол, ксимедон, димефосфон, тималин и энтеросорбент «Фитосорб», разработанный ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» совместно с Казанским государственным технологическим университетом и производимый ООО «Маркорм».

В ходе экспериментов изучали клиническое состояние животных, потребление корма, гематологические, биохимические и иммунологические показатели, изменение массы тела, регистрировали продолжительность жизни, патологоанатомическую картину. У опытных и контрольных животных взятие крови осуществляли: у белых крыс путем декапитации, у овец - из яремной вены, у поросят - из хвостовой вены. _

Гематологические исследования — количество эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина, моноцитов, лимфоцитов, тромбоцитов определяли

с помощью гематологического анализатора «Mythic 18» и общепринятыми методами (Кондрахин И.П., 2.004).

Содержание общего белка, билирубина, • глюкозы,. активности ферментов аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, щелочной фосфатазы в сыворотки крови животных проводили с помощью биохимического анализатора «Microlab 300». Фракции белка -нефелометрическим методом.

Животных в ходе опыта вакцинировали вакциной против эшерихиоза животных, изготовленной в ФГБУ «ФЩТБ-ВНИВИ» и любезно предоставленной зав. лабораторией болезней молодняка, к.в.н. Спиридоновым Г.Н. Титры антител определяли в реакции агглютинации сыворотки крови.

Лизоцимную активность сыворотки крови определяли по Маркову ЮМ., в модификации отдела зоогигиены Украинского научно - исследовательского института экспериментальной ветеринарии (Марков Ю.М. и др., 1979). Определение фагоцитарной активности нейтрофилов проводили по Гостеву (Гостев B.C. и др., 1979).

Содержание Т- и В-лимфоцитов в периферической крови определяли с помощью метода спонтанного розеткообразования с эритроцитами козла Е-РОК (Кондрахин, И.П 1985).

О степени интенсивности процесса перекисного окисления липидов (ПОЛ) судили по накоплению вторичных продуктов ПОЛ - малонового диальдегида (МДА) в реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой по методике Гончаренко М.С., Латиновой A.M. (1985).

Материал для патологоанатомических исследований фиксировали в 5%-ном нейтральном формалине, этанол-формалине (9:1), в буферном растворе 10%-го формалина, рН-8,0. После обезвоживания, уплотнения взятого материала и приготовления блоков изготавливали гистологические срезы толщиной 8 мкм. Окрашенные гематоксилин-эозином, ШИФФ-реактивом, по Вейгерту, Браше, гистологические препараты изучали в светооптическом микроскопе (OLIMPUS СХ31), оценивая изменения структуры органов и тканей, а также параметры морфометрии, накладывая окуляр-насадку (МОВ-1-15*) и окуляр сетку.

. Содержание Т-2 токсина и НТ-2 токсина в образцах кормов определяли методом — биоавтографии, согласно методическим указаниям (Антонов Б.И., 1991). Биоавтографическое проявление хроматограммы осуществляли с использованием тест-культуры Candida pseudotropicalis, шт.44 пк, с подтверждением результатов с помощью методов ТСХ и ГЖХ.

При выполнении отдельных этапов работы принимали участие с.н.с. к.б.н. Семёнов Э.И., с.н.с. к.м.н. Губеева Е.Г., за что выражаем им искреннюю благодарность.

Обработку цифрового материала проводили методом вариационной статистики с применением критерия достоверности по Стъюденту на

персональном компьютере с использованием программного пакета Microsoft Excel.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 Микотоксикологический анализ кормов

Всего за период 2008-2011 г.г. происследовано 2756 образцов кормов. Результаты анализа кормов на содержание Т-2 токсина и НТ-2 токсина в Республике Татарстан, а также ряда других регионов РФ показывают, что содержание Т-2 токсина в кормах для животных в 2008 г. регистрировалось в 13,8% образцов (рис 1). Максимальное содержание микотоксина наблюдалось в грубых кормах (солома) - 615 мкг/кг. Высоким содержанием отличались также овес (240 мкг/кг) и жмых подсолнечный (254 мкг/кг). Превышение ПДК составило 30,4% от числа положительных проб. НТ-2 токсин был обнаружен в 5,5% образцов, концентрация варьировала от 37 до 415 mkf/кг.

Рис. 1. - Контаминированность кормов Т-2 и НТ-2 токсинами.

В 2009 г. Т-2 токсин выявлялся в 12,8% образцов кормов. Максимальные концентрации токсина (до 150 мкг/кг) выявлялись в образцах кукурузы, ржи и зернофураже. Превышение допустимых норм микотоксина составило 43,5% от числа положительных проб. НТ-2 токсин обнаруживался в 5,0% проб.

В 2010 г. Т-2 токсин был обнаружен в 12,2% образцов, из них 36,3% превышай ПДК. Максимальное содержание Т-2 токсина не превышало 197 мкг/кг. Микотоксин НТ-2 выявлялся в 5,2% образцов. Максимальные концентрации токсина были в зернофураже и отрубях (до 403 мкг/кг), в полнорационных комбикормах его содержание не превышало 217 мкг/кг.

7

В 2011 г. по содержанию Т-2 токсина 10,8% проб оказались положительными, из них 46,2% превышали ПДК. Обнаруживался НТ-2 токсин в 4,1% случаев.

Были проанализированы корма из хозяйств, в которых регистрировали заболевания животных и одновременно были обнаружены фузариотоксины, в 100% случаев обнаруживался Т-2 токсин, из них 70% превышали ПДК, в 60% случаев обнаруживались и другие микотоксины (ДОН, зеараленон и др. токсины)., Установленные дозы и клиника заболеваний в этих случаях позволяли отнести влияние Т-2 токсина как основное в этиологии отравления и с возможным синергизмом между токсинами. НТ-2 токсин обнаруживался в 80% случаев, при этом тяжесть течения отравления животных усиливалась. В 70% случаев совместного обнаружения Т-2 токсина и НТ-2 токсина, содержание НТ-2 токсина было вьлре, чем Т-2 токсина и, наоборот, при высоком содержании микотоксина Т-2, содержание НТ-2 токсина было значительно ниже (на пределе метода обнаружения). Эти данные подтверждают необходимость при диагностике отравлений животных и санитарной оценке кормов наряду с Т-2 токсином определять его высокотоксичный метаболит НТ-2 токсин.

3.2 Скрининг средств — потенциальных иммуномодуляторов при Т-2 токсикозе

Опыты проведены на 60 половозрелых самцах.' нелинейных белых крыс массой 160-180 г., разделённых на 3 групп по 12 особей в каждой. Животным первой группы внутрижелудочно вводили ТЙ токсин в^виде 5% водно-спиртового раствора в дозе 1/5 ЛД.0 (0,64 мг/кг массы тела), ежедневно. Крысам второй группы внутрижелудочно вводили ежедневно Т-2 токсин в виде 5% водно-спиртового раствора в дозе 1/5 ЛД50 и иммуностимулятор левамизол в дозе 4 мг/кг массы в течение 3 дней, после 4-х дневного перерыва, вновь вводили в течение 3 дней. Животным третьей группы - ежедневно внутрижелудочно Т-2 токсин (1/5 ЛД50) и ксимедон в дозе 75 мг/кг массы ежедневно. Четвертой группе крыс ежедневно вводили внутрижелудочно Т-2 токсин (1/5 ЛД50) и димефосфон в дозе 90 мг/кг массы. Животным пятой группы ежедневно внутрижелудочно вводили Т-2 токсин (1/5 ЛД50) и тималин внутримышечно в дозе 0,2 мг/кг массы в течение первых 5 суток. Длительность опыта составила 15 суток. Кроме того, всех животных вакцинировали вакциной против эшерихиоза внутримышечно в дозе 0,5 мл/гол, двукратно на 1-е и 7-е сут опыта.

У животных во всех группах регистрировалось уменьшение количества эритроцитов, лейкоцитов и гемоглобина. Так, в первой группе животных на фоне введения токсина без применения иммуностимуляторов относительно фона, количество эритроцитов к концу опыта уменьшалось на 24,3% (р < 0,001); лейкоцитов - на 26,4% (р < 0,001); гемоглобина на 11,6%.

Во второй группе животных, с применением левамизола на 15 сут уменьшение эритроцитов, лейкоцитов и гемоглобина было менее

выраженным и составило - 19,9 (р < 0,05); 21,4 (р < 0,001) и 9,4% соответственно, относительно фоновых величин. В третьей группе животных на 15 сут с применением ксимедона содержание эритроцитов, лейкоцитов и гемоглобина изменялось на 18,7 (р < 0,05); 22,6 (р < 0,001) и 10,1% соответственно; в четвёртой группе, с применением димефосфона — на 15,4; 16,3 (р < 0,01) и 8,7%; в пятой группе, с применением тималина — на 16,4; 15,2 (р < 0,05) и 9,2% соответственно.

Фагоцитарная активность у крыс в первой группе к 7 сут опыта увеличивалась на 4,5%, а к 15 сут уменьшалась на 14,2% (р < 0,001). Во второй группе фагоцитарная активность крови к 15 сут снижалась на 11,8% (р < 0,01), в третьей - на 9,2% (р < 0,05), в четвёртой - на 6,2%, в пятой - на 7,6% (р < 0,05). Фагоцитарная ёмкость в первой группе животных снижалась к 15 сут на 32,6% (р < 0,01), во второй группе животных - на 25,4% (р < 0,05), в третьей - на 22,6% (р < 0,01), в четвёртой - на 14,9%, в пятой - на 22,6%.

Содержание Т - и В - лимфоцитов в крови всех групп животных снижалось. В первой группе содержание Т - и В - лимфоцитов уменьшилось на 16,2 (р < 0,001) и 11,0% (р < 0,01) соответственно, во второй группе животных (введение Т-2 токсина и левамизола) понижение было менее значительным и составило 12,7 (р < 0,001) и 8,9% (р < 0,05) соответственно. Показатели третьей группы животных (введение Т-2 токсина и ксимедона) характеризовались также незначительным снижением Т - и В - клеток и составили на 15 сут 11,8 (р < 0,001) и 8,3% соответственно. В четвертой группе опытных животных (введение Т-2 токсина и димефосфона) снижение Т - и В - лимфоцитов составило 9,5 (р < 0,001) и 6,1% соответственно. В пятой группе (введение Т-2 токсина и тималина) - было минимальным - 8,1 (р < 0,01) и 6,3% соответственно.

Максимальные титры антител наблюдались в третьей (введение Т-2 токсина и ксимедона) и пятой (введение Т-2 токсина и тималина) группах опытных животных. У животных первой группы (введение Т-2 токсина) отмечался наименьший показатель титра — 1:40.

Таким образом, иммуностимуляторы ксимедон, димефосфон и тималин показали защитный эффект. Однако, с учетом показателя титра антител, тималин оказался более эффективным, его и отобрали для дальнейших исследований.

3.3 Применение тималина при подостром и хроническом Т-2 токсикозе белых крыс

Для определения оптимальной дозы тималина при подостром отравлении токсином проведены опыта на 60 белых нелинейных крысах с массой тела. 125-130 г, разделённых на 5 групп по 12 особей в каждой. Животные первой группы служили биологическим контролем. Крысам второй группы вводили Т-2 токсин в виде 5% водно-спиртового раствора внутрижелудочно, в дозе 1/5 ЛДя) ежедневно. Животным третьей группы - Т-2 токсин (1/5 ЛД50) и тималин внутримышечно в дозе 0,1 мг/кг массы

ежедневно в течение 5 суток. Четвертой группе крыс вводили Т-2 токсин (1/5 ЛД30) и тималин внутримышечно в дозе 0,2 мг/кг массы. Животным пятой группы - Т-2 токсин (1/5 ЛД50) и внутримышечно тималин в дозе 0,3 мг/кг массы в течение 5 суток. Длительность опыта составила 15 суток. Кроме того, всех животных вакцинировали вакциной против эшерихиоза животных, внутримышечно в дозе 0,5 мл/гол двукратно на 1-е и 7-е сут опыта.

У животных во всех опытных группах регистрировали уменьшение количества эритроцитов, лейкоцитов и гемоглобина. Так, во второй группе снижение уровня эритроцитов, лейкоцитов и гемоглобина на 15 сут составило - 17,6 (р < 0,001); 26,8 (р < 0,05) и 8,5% (р < 0,05) соответственно. В третьей и четвёртой группах уменьшение показателей . было менее выражено. Уровень общего белка к 15 сут значительно понижался. Во второй, третьей, четвертой и пятой группах содержание общего белка снижалось на 14,6; 12,7; 12,2 и 11,8% соответственно по сравнению с контролем, наблюдалось снижение содержания у — глобулинов.

. Снижение количества Т - и В - клеток у животных отмечалось во всех опытных группах. Так, во второй группе уменьшение было максимальным и к 15 сут составило 17,4 (р < 0,001) и 12,7% (р < 0,01) соответственно. В последующих группах снижение было менее значительным. Так, в третьей группе количество Т — клеток понизилось на 13,4% (р < 0,001), В - клеток — на 9,7% (р < 0,05), в четвертой группе - на 9,2 (р < 0,01) и на 7,6% соответственно. Пятая группа отличилась минимальным снижением количества Т - и В лимфоцитов - на 7,2 (р < 0,05) и 7,0% соответственно.

Результаты исследований показали, что при подостром Т-2 токсикозе максимальное содержание антител в сыворотке (титр) наблюдалось в четвёртой и пятой группах, и было на уровне группы биологического контроля (1:160), для второй группы (введение Т-2 токсина) был характерен наименьший показатель титра - 1:40.

Таким образом, применение тималина при подостром Т-2 токсикозе оказывало защитное действие на организм животных. Учитывая соотношение «доза-эффект» препарата, оптимальной и экономически целесообразной при подостром отравлении является доза 0,2 мг/кг массы тела.

В последующем, для определения оптимальной дозы тималина при хроническом отравлении токсином провели опыты на 90 белых крысах, разделённых на 5 групп по 18 особей в каждой. Животные первой группы служили биологическим контролем. Крысам второй группы вводили Т-2 токсин в виде 5% спиртового раствора внутрижелудочно, в дозе 1/10 ЛД50. Животным третьей группы - Т-2 токсин (1/10 ЛД50) и тималин внутримышечно в дозе 0,05 мг/кг массы в первые 5 сут опыта и с 20 по 25 сут опыта. Четвертой группе крыс вводили Т-2 токсин (1/10 ЛДзо) и тималин в дозе 0,1 мг/кг массы по аналогичной схеме. Животным пятой группы - Т-2 токсин (1/10 ЛДзо) и тималин в дозе 0,2 мг/кг массы по аналогичной схеме. Длительность опыта составила 30 суток. Кроме того, всех животных

вакцинировали вакциной против эшерихиоза животных, внутримышечно в дозе 0,5 мл/гол двукратно на 7 и 14 сут опыта.

Результаты измерения массы тела животных при использовании иммуномодулятора тималина на фоне хронического Т-2 токсикоза показывают, что во второй группе животных (затравка Т-2 токсином) наблюдалось снижение прироста массы тела за весь период опыта (30 сут) и к концу опыта масса тела животных была на 27,5% (р < 0,001) меньше, относительно данных группы биологического контроля. Более выраженное увеличение массы животных, относительно группы контроля Т-2 токсина оказалось в группах, где применялся тималин в дозах 0,1 и 0,2 мг/кг.

.У животных второй группы (введение Т-2 токсина) отмечается значительное снижение в крови количества эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина к 30 сут на 25,9% (р < 0,001), 33,8% (р < 0,001) и 17,3% (р < 0,001) соответственно. В третьей группе снижение показателей было на 21,7% (р < 0,01), 24,6% (р < 0,01) и 14,3% (р < 0,001), в четвёртой группе - на 19,3% (р < 0,001), 16,8% и 11,6% (р < 0,01), в пятой - на 17,5% (р < 0,01), 15,7% и 10,5% (р < 0,01) соответственно.

Происходило также изменение биохимических показателей. Активность щелочной фосфатазы во второй группе понижалась к 30 сут на 18,8% (р < 0,001). В третьей, четвёртой и пятой группах животных к 30 сут отмечалось снижение данного показателя на 15,7% (р < 0,001), 10,2 % (р < 0,01) и 9,2% (р < 0,05) соответственно.

К 30 сут исследований отмечалось повышение аланинаминотранс-феразы и аспартатаминотрансферазы во всех группах животных: во второй группе на 7,1% (р < 0,001), третьей - на 6,3 (р < 0,001); четвертой - на 5,1 (р < 0,01); пятой - на 4,6% (р < 0,001).

Максимальное снижение общего белка и количества глюкозы было во второй группе, которым задавали лишь Т-2 токсин - на 23,0 (р < 0,01) и 49,1% (р < 0,001) соответственно. В то же время в третьей группе показатели уменьшились на 20,2% (р < 0,01) и 31,7% (р < 0,001), в четвертой - на 18,9 (р < 0,05) и 34,7% (р < 0,001), в пятой - лишь 17,3% (р < 0,05) и 17,6% (р < 0,01) соответственно.

Показатели неспецифической резистентности организма понижались. Снижение фагоцитарной ёмкости наименьшим было в пятой группе - на 22,2% (р < 0,05), а максимальным во второй группе - на 48,0% (р < 0,001). Содержание Т- и В - лимфоцитов снижалось во второй группе на 21,3 (р < 0,001) и 16,7% (р < 0,01). Наименьшее понижение было отмечено в пятой группе - на 12,3 (р < 0,001) и 9,3% (р < 0,01) соответственно.

Максимальное содержание антител в сыворотке (титр) наблюдалось в первой (1:160), в четвёртой (1:80) и пятой (1:160) группах.

В гистологических препаратах внутренних органов белых крыс, получавших затравку Т-2 токсином, обнаруживались очаги некроза эпителия извитых канальцев почек; межуточные инфильтраты полиморфными клетками в сердце с серозным отеком, некрозы клеток и периваскулярная

лимфоцитарная инфильтрация в печени; десквамация, лимфоцитарная инфильтрация слизистого слоя тонкого кишечника, реактивные изменения селезенки.

При затравке Т-2-токсином и лечении тималином изменения были, но менее выраженными: проявились мелкоочаговой гадропической дистрофией почек, некрозом единичных клеток паренхимы печени, гиперсекрецией редких клеток слизистой тонкого кишечника. Признаки активации иммунной системы выразились в формировании лимфоидных фолликул с многочисленными лимфоцитами и их фрагментами.

Таким образом, применение тималина при хроническом Т-2 токсикозе, смоделированном на белых крысах, оказывало защитное действие на организм животных, что выражалось в положительной динамике гематологических, биохимических, иммунологических и гистологических показателей. Оптимальной и экономически целесообразной при хроническом отравлении Т-2 токсином является доза иммуномодулятора 0,1 мг/кг массы тела.

3.4 Применение иммуномодулятора тималина и энтеросорбента «Фитосорб» при Т-2 токсикозе овец

Следующим этапом исследований явилось проведение опытов на сельскохозяйственных животных (овцы).

Для этого были сформированы 5 групп овец по 3 животных в каждой. Первая группа служила биологическим контролем, животные получали обычный рацион, вторая группа получала ежедневно Т-2 токсин в дозе 1/10 ЛДго- Третья группа получала микотоксин в дозе 1/10 ЛД50 и «Фитосорб» в количестве 0,5% от массы рациона. Четвёртая группа животных получала токсин в дозе 1/10 ДЦм и тималин в дозе 0,1 мг/кг массы тела в первые 5 сут и с 20 по 25 сут опыта. Животные пятой группы получали с рационом Т-2 токсин в дозе 1/10 ДД50 в сочетании с тималином в дозе 0,1 мг/кг массы тела и сорбентом «Фитосорб» в количестве 0,5% от массы рациона в первые 5 сут, а также с 20 по 25 сут опыта. Длительность эксперимента составила 30 суток.

Результаты исследований показали, что первые признаки изменения клинического состояния животных второй группы наступали на 12 сут эксперимента и характеризовались снижением аппетита, угнетением, саливацией, диареей, тремором отдельных мышц конечностей, некротическим поражением слизистой ротовой полости. У овец третьей группы клинические признаки отравления проявлялись к 17 сут опыта и характеризовались снижением аппетита, .угнетением.

Наблюдалось понижение фагоцитарной активности к 30 сут исследований на 25,4 (р<0,001) и 11,4% (р<0,01) во второй и третьей группах; в четвертой и пятой группах уменьшение фагоцитарной активности составило 16,3 и 6,2% (р<0,01) соответственно. Фагоцитарное число снизилось во второй группе на 32,6% (р<0,01); в третьей, четвертой и пятой группах оно составило 17,1 (р<0,05), 24,0 (р<0,05) и 10,2% соответственно.

Активность лизоцима во второй группе снизилась на 27,9% (р<0,001), в третьей -на 39,0% (р<0,01), в четвертой- на 36,2% (р<0,01) и в пятой группе -на 43,0%.

Таким образом, применение иммуномодулятора и сорбента оказывает положительное влияние при Т-2 микотоксикозе. При этом наблюдаемое снижение гематологических и иммунологических показателей были менее значительными, чем в контрольной 1руппе, которой задавали только микотоксин. Совместное использование иммуномодулятора и сорбента более эффективно, чем их раздельное применение.

3.5 Применение иммуномодулятора и энтеросорбента при хроническом Т-2 токсикозе поросят

Данные, полученные на лабораторных животных, явились основанием для проведения опытов на поросятах-отъёмышах. Для этого были сформированы 4 группы животных по 3 поросёнка в каждой. Первая группа поросят получала с рационом Т-2 токсин в дозе 2 ПДК (200 мкг/кг корма, группа контроля на токсичность). Животным второй группы задавали с рационом микотоксин 2 ПДК и вводили тималин внутримышечно в дозе 0,1 мг/кг массы тела с 1 по 5 сут и с 20 по 25 сут. опыта. Третья группа животных служила биологическим контролем, четвёртая группа животных получала с рационом токсин в дозе 2 ПДК в сочетании с тималином внутримышечно в дозе 0,1 мг/кг массы тела с 5 по 10 сут и с 20 по 25 сут и «Фитосорбом» в количестве 0,5% от рациона. Длительность эксперимента составила 30 суток.

У животных наблюдали колебание гематологических показателей. Так, к 10 сут эксперимента в первой группе животных, получавших с кормом микотоксин, отмечали увеличение количества лейкоцитов относительно показателей группы биологического контроля, к концу эксперимента увеличение составило в первой группе 21,8%, в четвёртой - 3,4%, во второй группе количество лейкоцитов значительно повысилось - на 22,2%. На наш взгляд, это связано с несколькими факторами: воздействие микотоксинов (в начате интоксикации закономерно увеличение форменных элементов), признаки диареи животных (фактор сгущения крови) и инфекционной нагрузки, которую мы подтвердили в течение опыта. Увеличение количества гранулоцитов, вероятно, связано с аллергизирующим действием микотоксинов, а также реакцией организма на бактериальные токсины. У животных в группе, профилакгаруемых препаратами, эти изменения были менее выражены.

Содержание эритроцитов, гемоглобина и тромбоцитов в первой группе было выше на 20,6; 7,6 и 16,5% соответственно, при этом во второй и четвёртой группах колебания были статистически недостоверными.

Наблюдали незначительное колебание содержания общего белка, вписывающееся в статистическую погрешность. Более выраженное уменьшение на 30 сут было во второй группе - на 13,1% (р < 0,01). В третьей

группе статистическое значимое уменьшение было только к концу опыта -на 10,3% (р < 0,01). Аналогичная закономерность отмечалась и в концентрации глюкозы - более выраженное уменьшение было на 30 сут во второй группе - на 56,8% (р < 0,001). Содержание билирубина значительно возрастало во второй группе - на 408% (р < 0,001), в третьей - на 192% (р < 0,001), что свидетельствует о токсической нагрузке на печень и о защитном действии препаратов.

Активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови в четвёртой группе животных незначительно отличалась от показателей группы биологического контроля. В четвертой группе колебания были менее выражены, относительно группы токсического контроля. Следует отметить значительные колебания в сторону увеличения активности AJIT к 10 и 20 сут - на 39,4 и 76% (р < 0,05) соответственно относительно биологического контроля и к 30 сут - на 41% (р < 0,05), происходило снижение коэффициента Ритиса до 0,95, при 1,31 в контроле. Это свидетельствует о нарушениях, происходящих в печени животных первой группы.

У поросят наблюдали увеличение содержания малонового диальдегида во второй группе на 67,4% (р < 0,001), в третьей — на 33,3% (р < 0,01) и четвёртой - на 14,8% (р < 0,05).

Результаты исследования крови на содержание иммунных клеток Т- и B-лимфоцитов свидетельствуют, что в четвёртой группе у поросят не выявляли статистически значимого уменьшения Т- и В- лимфоцитов, во второй группе значительное 10,2% (р < 0,05) уменьшение Т-лимфоцитов было только к концу опыта, наиболее выраженное уменьшение Т-лимфоцитов наблюдали в первой группе - на 31,3 % (р<0,01).

При наблюдении за животными в течение опыта следует отметить следующие моменты. В первой половине опыта (первые 2 недели) общее состояние всех групп было удовлетворительное, животные первой группы, которые получали чистый корм, были активны и хорошо его поедали.

Животные второй группы, которые получали токсичный корм, потребляли его меньше, чем животные других групп, через 6-8 сут наблюдался частичный отказ от корма. В последующие дни животные потребляли корм в меньших количествах. Поросята были менее активны по сравнению с контрольными. Это особенно проявилось во второй половине опыта - животные были вялыми, собирались в кучу, поджимали живот, наблюдалось расстройство желудочно-кишечного тракта. К 21-23 сут ухудшилось общее самочувствие, наблюдалось повышение температуры, 1 поросёнок пал. При бактериологическом исследовании каловых масс были выявлены возбудители инфекционных заболеваний: Clostridium и Escherichia. В других группах подобной картины не наблюдали.

Наибольшие среднесуточные привесы были в группе биологического контроля — 244 г, в четвёртой группе — 231 г (-5%), наименьший привес был в первой группе - 148,Зг, (-39%), во второй группе - 194,0 г (-20,5%). Конверсия корма также отличалась по группам: от 3,55 в третьей группе до

5,07 в первой. Сохранность во всех группах, за исключением первой, была на уровне 100%, в группе контроля на токсичность — 66,6% (табл.).

Таблица — Продуктивность и сохранность опытных поросят.

Показатель Группа животных

1 2 3 4

Масса тела на начало опыта, кг 14,9 14,65 15,2 14,86

±0,22 ±0,22 ±0,21 ±0,23

Масса тела на конец опыта, кг 22,22 19,1 21,02 21,79

±0,36 ±0,64* ±0,40 ±0,37

Прирост массы тела за 30 сут, кг 7,32 4,45 5,82 6,93

Среднесуточный привес, г 244,0 148,3 194,0 231,0

Израсходовано корма на 1 гол за 30 сут, кг 26,0 22,6 26,6 26,8

Конверсия корма 3,55 5,07 4,06 3,86

Сохранность животность, % 100 66,6 100 100

* - Р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001

При гистологическом исследовании выявлено, что поедание корма, контаминированного микотоксинами, приводит к патологическим изменениям в ряде органов. В печени развивалась белковая дистрофия с очаговыми некрозами, достигающими 1/3 клеток дольки. В печени также проявлялась реакция Купферовских клеток, которые несколько увеличивались, деформировались, расширялось пространство под Купферовской клеткой (пространство Диссе). В почках развивалась белковая дистрофия, сопровождающаяся десквамацией эпителиальных клеток в просветы канальцев, очаговым некрозом эпителия канальцев. В легких отмечался очаговый серозный отёк межальвеолярных перегородок. В селезенке происходило обеднение белой пульпы. В стенке 12-перстной кишки наблюдалось усиление полиморфноклеточной инфильтрации с выходом многочисленных лимфоцитов из лимфатических фолликул кишки, появлялись очаговые некрозы слизистой. В стенке желудка определялась инфильтрация лимфоидными клетками, очаговые некрозы слизистой.

Все вышеописанные изменения не были выявлены у животного, получавшего наряду с токсинами тималин (за исключением гистоструктуры печени, где наблюдалось определенное набухание купферовских клеток). При даче с кормом препарата тималин и «Фитосорб» каких-либо изменений структуры изученных органов и желез не происходило.

Полученные данные свидетельствуют о негативном воздействии микотоксинов на иммунологические, гематологичские и биохимические параметры поросят. У животных, защищенных тималином и энтеросорбентом, прирост массы тела и сохранность были ёолее выражены, что характеризует защитное действие тималина и «Фитосорба».

3.6 Производственные испытания иммуномодулятора и энтеросорбента в условиях свиноводческого хозяйства

Изучение профилактической эффективности тималина и энтеросорбента «Фитосорб» провели на базе СХП «Дружба» Буинского района Республики Татарстан, где при микотоксикологических исследованиях кормов были обнаружены фузариотоксины на уровне или ниже ПДК.

Для проведения анализов было сформировано 3 группы поросят живой массой 26-30 кг по 20 животных в группе. Первая группа животных служила контролем и получала токсичный корм, вторая группа животных помимо корма получала тималин внутримышечно в дозе 0,1 мг/кг с 1 по 5 и с 20 по 25 сут опьгта; третья группа животных помимо корма получала также тималин внутримышечно в дозе 0,1 мг/кг с 1 по 5 и с 20 по 25 сут опыта и энтеросорбеггг «Фитосорб» из расчета 0,5% от рациона. Продолжительность эксперимента составила 30 дней.

Установлено, что введение в рацион энтеросорбента и применение препарта тималин оказало положительное влияние на динамику живой массы животных опытных групп. Так, к концу эксперимента среднесуточный прирост живой массы животных второй и третьей опытных групп составил -463,3 и 506,6 г соответственно, против 426,6 г в контрольной группе.

Включение энтеросорбента в рацион не сказывалось на степени поедаемости корма. У поросят ни в контрольной, ни в опытных группах не наблюдали выраженных признаков токсикоза. Однако животные контрольной группы были более подвержены расстройствам желудочно-кишечного тракта.

Полученные данные подтверждают благоприятное влияние энтеросорбента «Фитосорб» и тималина на клинико-гематологические, биохимические показатели, живую массу и сохранность свиней.

4. ВЫВОДЫ

1. При анализе кормов, поступивших из различных регионов РФ, установлено: до 13,8% образцов содержали Т-2 токсин в концентрации от 9,0 до 615 мкг/кг корма, из числа положительных проб превышение ПДК составляло до 46,2%, что обуславливает риск возникновения Т-2 токсикоза животных. НТ-2 токсин обнаруживался, до 5,5% образцов кормов в концентрации от 27 до 415 мкг/кг корма. В хозяйствах с повышенной заболеваемостью и падежом животных содержание в кормах Т-2 токсина в 70% случаях было выше ПДК, при этом в 80% случаев одновременно обнаруживался НТ-2 токсин.

2. Выявлено выраженное иммуносупрессивное действие Т-2 токсина. Так, внутрижелудочное введение микотоксина в дозах 1/5 ЛД50-1/Ю ЛД50 в течение 15 - 30 сут животным (белые крысы, овцы) вызывало уменьшение. содержания Т - и В - лимфоцитов на 21,3% и 16,7% соответственно, фагоцитарной активности - на 24,6%, антителообразования

(при вакцинации противоэшерихиозной вакциной) - в 2 раза.

, 3. Установлено, что у поросят Т-2 токсин в дозе 200 мкг/кг корма в течение 30 сут вызывает уменьшение содержания Т- и В- лимфоцитов на 38,3% и 14,7% соответственно, а также изменения гематологических (снижение лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов), биохимических показателей (снижение общего белка и глюкозы, увеличение билирубина, аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрнасферазы, малонового диальдегида). Привесы животных были снижены на 39%, регистрировали возникновение инфекции (колибактериоз и клостридиоз) и падёж 1/3 опытных животных. В печени и почках развивалась белковая дистрофия с "очаговыми некрозами. В легких очаговый серозный отёк межальвеолярных перегородок. В селезенке происходило обеднение белой пульпы. В стенке желудка и кишечника наблюдалось усиление полиморфноклеточной инфильтрации с выходом многочисленных лимфоцитов, очаговые некрозы слизистой.

4. Для лечения и профилактики иммуносупрессии Т-2 токсикоза рекомендуется применять препарат тималин. Применение данного препарата внутримышечно в дозе 0,1-0,2 мг/кг массы тела благоприятно влияет на физиологическое состояние животных при подостром и хроническом Т-2 токсикозе (белые крысы, овцы), что проявляется положительным влиянием на гематологические (увеличение уровня эритроцитов на 11,3%, лейкоцитов - на 27,5%, гемоглобина - на 8,2%), биохимические и иммунологические показатели (повышение фагоцитарной активности на 14,2%, Т-лимфоцитов — на 11 ¡5%, В-лимфоцитов - на 9,0%, титр антител - в 2 раза).

5. Внутримышечное введение поросятам тималина в дозе 0,1 мг/кг раздельно или в сочетании с включением в рацион энгеросорбента «Фитосорб» (0,5% от массы корма) профилактирует токсическое и иммуносупрессивное действие Т-2 токсина. При этом наблюдается нормализация гематологических, биохимических, иммунологических параметров, показателей, неспецифической резистентности животных, гисто-структуры внутренних органов. Повышается сохранность и привесы поросят, снижается коэффициент конверсии корма.

6. Эффективность применения тималина раздельно и совместно с сорбентом «Фитосорб» при микотоксикозах подтверждена в производственных условиях на свиньях. Применение препаратов способствовало стабилизации количества лейкоцитов, эритроцитов, гемоглобина и общего белка, уменьшению случаев возникновения диареи поросят, увеличению сохранности животных, повышению среднесуточного прироста живой массы на 8,6 и 18,8% соответственно.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. При санитарной оценке кормов и диагностике отравлений животных рекомендуется наряду с Т-2 токсином определять его высокотоксичный метаболит НТ-2 токсин.

2. В качестве средств профилактики и лечения подострого Т-2 токсикоза животных рекомендуется применять препарат тималин в дозе 2 мг/кг массы тела курсом 5 сут, а в рацион включать органический Энтеросорбент - «Фитосорб» в количестве 0,5% от массы рациона.

3. Полученные данные использованы при составлении «Методических рекомендаций по применению энтеросорбентов при отравлении животных», утвержденных Отделением ветеринарной медицины РАСХН (2010) и «Методического пособия: диагностика, профилактика и лечение сочетанных отравлений животных вторичными метаболитами микроскопических грибов рода Ршапшп», утвержденных Отделением ветеринарной медицины РАСХН (2012).

4. Основные положения диссертационной работы рекомендуется использовать на курсах по повышению квалификации и при подготовке зооветеринарных специалистов в учебном процессе.

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Валиев А.Р., Хусаинов И.Т. Оценка токсичности кормов в Поволжском регионе / А.Р. Валиев, И.Т. Хусаинов. // Матер, научно-практ. конф. молодых ученых и специалистов «Достижение молодых ученых - в производство», посвящ. 100-летию со дня рождения проф. Х.Х.Абдуллина. 25-26 июня 2008. Казань, 2008.- С. 122-123.

2. Валиев А.Р., Семёнов Э.И., Тремасов М.Я. Изучение влияния иммуностимуляторов на течение смешанного Т-2 - афлатоксикоза животных /Э.И. Семёнов, М.Я. Тремасов, А.Р. Валиев. // Иммунопатология, Аллергология, Инфектология. Микотоксикология. 2009.-№ 2. С. 35-36.*

3. Валиев А.Р., Семёнов Э.И., Тремасов М.Я. Применение иммуностимуляторов при микотоксикозах / А.Р. Валиев, Э.И. Семёнов, МЛ. Тремасов. // Современные проблемы ветеринарной фармакологии и токсикологии. 2009. Матер, второго съезда ветеринарных фармакологов и токсикологов России. Казань, 9-12 июня 2009 года. - Казань, 2009. - С. 400 -402.

4. Валиев А.Р., Семёнов Э.И., Тремасов МЛ Влияние тималина на показатели иммунитета при Т-2 токсикозе / А.Р. Валиев, Э.И. Семёнов, М.Я. Тремасов. // Иммунопатология, Аллергология, Инфектология. Микотоксикология. 20Ю.-№1,-С. 186-188.*

5. Валиев А.Р., Семёнов Э.И. Валиуллин Л.Р., и др. Поиск иммуномодуляторов в качестве средств профилактики микотоксикозов / А.Р. Валиев, Э.И. Семёнов, Валиуллин Л.Р., В.И. Степанов, М.Я. Тремасов // Междунар. научно-практ. конф. «Современные системы безопасности и

биозащиты в ветеринарной медицине» Межведомственный тематический научный сборник «Ветеринарная медицина» Харьков, Украина, 2010. - С. 216-217.*

6. Валиев А.Р., Валиуллин JI.P., Семёнов Э.И., Тремасов МЛ. Влияние сочетанного поступления микотоксинов на факторы неспецифической резистентности организма / А.Р. Валиев, J1.P. Валиуллин, Э.И. Семенов, МЛ. Тремасов // Матер, междунар. научно-практ. конф., посвящ. 50-летию ФЦТРБ. Биотехнология: токсикологическая, радиационная и биологическая безопасность 8-10 декабря 2010. ФГУ «ФЦТРБ - ВНИВИ». Казань, 2010. - С. 20-24.

7. Валиев А.Р., Валиуллин Л.Р., Семёнов Э.И., Гумеров В.Г., Тремасов МЛ.. Некоторые аспекты, влияющие на иммунный статус и сохранность молодняка крупного рогатого скота / А.Р. Валиев, Л.Р. Валиуллин, Э.И. Семенов, В.Г. Гумеров, МЛ. Тремасов // Актуальные вопросы ветеринарной медицины Сибири. Матер, междунар. научно-практ. конф., посвящ. 70-летию со дня основания ГНУ ИЭВС и Дальнего Востока и 100-летию академика A.A. Свиридова. Новосибирская область, р.п. Краснообск, 28-29 октября 2010 г. Краснообск 2010.- С. 243-246.

8. Валиуллин Л.Р., Валиев А.Р., Семёнов Э.И. и др. Сочетанные фузариотоксикозы свиней / Л.Р. Валиуллин, А.Р. Валиев, Э.И. Семёнов, МЛ. Тремасов // Матер, междунар. научно-практ. конф. «Современные проблемы интенсификации производства свинины в странах СНГ», посвященной 75-летнему юбилею заслуженного деятеля науки РФ, проф. В.Е. Улитько, 7-10 июля 2010 г.- Ульяновск, 2010. - С. 232-235.

9. Валиев А.Р., Семёнов Э.И., Валиуллин Л.Р., Тремасов МЛ. Фармакокоррекция неспецифической резистентности животных при хроническом Т-2 токсикозе. // Матер, междунар. научно-практ. конф. «Актуальные проблемы современной ветеринарии», посвящ. 65-летию ветеринарной науки Кубани. Часть 2. Краснодар.-2011. - С. 314-316.

10. Валиев А.Р., Спиридонов Г.Н., Семёнов Э.И., Махмутов А.Ф., Влияние Т-2 токсина на антителообразование на фоне применения тималина. // Матер, междунар. научно-практ. конф. «Актуальные проблемы современной ветеринарии», посвящ. 65-летию ветеринарной науки Кубани. Часть 2. Краснодар.-2011. - С. 329-332.

11. Семёнов Э.И., Валиев А.Р., Ахметов Ф.Г. Иммуносупрессия в патогенезе Т-2 микотоксикоза и её фармакокоррекция / Э.И.Семёнов, А.Р.Валиев, Ф.Г. Ахметов / Ветеринарный врач.-2011.-№2. С. 4-6*

12. Валиев А.Р., Семёнов Э.И., Тремасов М.Я. Применение иммуномодулятора и сорбента фитосорб для профилактики Т-2 микотоксикоза / Актуальные вопросы ветеринарной фармакологии и фармации. Матер, межрегион, научно-практ. конф. Краснодар.-2012. - С.132-135.

13. Валиуллин Л.Р., Валиев А.Р., Семёнов Э.И., Тремасов МЛ. Применение адсорбентов при сочетанных микотоксикозах свиней /

Актуальные вопросы ветеринарной фармакологии и фармации. Матер, межрегион, научно-практ. конф. Краснодар.-2012. - С. 135-137.

14. Валиев А.Р., Семёнов Э.И. Оценка загрязнения Т-2 токсином и НТ-2 токсином кормов урожая 2011г. в Поволжье. / Современная микология в России. Матер. 3-го съезда микологов России. М.; -2012. С. 435.

*Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ

Подписано к печати 18.01/3. Формат 60x84/16

Заказ¿V Тираж/Щкз. Усл. печ.л. YO

Бумага офсетная Печать RISO

Центр информационных технологий КГАВМ 420029, Казань, Сибирский трахт, 35

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Валиев, Алмаз Рафаильевич, Казань

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧЕРЕЖДЕНИЕ «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЙ, РАДИАЦИОННОЙ И БИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ»

На правах рукописи

В АЛИЕВ АЛМАЗ РАФАИЛЬЕВИЧ

ФАРМАКОКОРРЕКЦИЯ ИММУНОСУПРЕССИИ ПРИ Т-2 ТОКСИКОЗЕ ЖИВОТНЫХ

06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: засл. деятель науки РТ, доктор биологических наук, профессор М.Я. Тремасов

Казань - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ 6

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10

2.1 Фузариотоксины в продовольственных и кормовых культурах 10

2.2 Иммунотоксичность в патогенезе токсического действия микотоксинов 17

2.3 Потенциальные иммуномодуляторы при Т-2 токсикозе 22

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 36

4 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 40

4.1 Микотоксикологический анализ кормов 40

4.2 Скрининг средств - потенциальных иммуномодуляторов

при Т-2 токсикозе 51

4.3 Применение тималина при подостром Т-2 токсикозе белых крыс. 57

4.3.1 Динамика прироста массы тела белых крыс на фоне применения тималина при подостром Т-2 токсикозе. 58

4.3.2 Гематологические показатели белых крыс на фоне применения тималина при подостром Т-2 токсикозе 59

4.3.3 Содержание общего белка и его фракций в сыворотке крови белых крыс на фоне применения тималина при подостром

Т-2 токсикозе. 61

4.3.4 Неспецифическая резистентность белых крыс на фоне применения тималина при подостром Т-2 токсикозе. 63

4.3.5 Содержание Т - и В - лимфоцитов белых крыс на фоне применения тималина при подостром Т-2 токсикозе 64

4.3.6 Содержание антител в реакции агглютинации сыворотки крыс на фоне применения тималина при подостром Т-2 токсикозе 65

4.4 Применение тималина при хроническом Т-2 токсикозе белых крыс. 66

4.4.1 Динамика прироста массы тела белых крыс на фоне применения тималина при хроническом Т-2 токсикозе 67

4.4.2 Гематологические показатели белых крыс на фоне применения тималина при хроническом Т-2 токсикозе 68

4.4.3 Биохимические показатели сыворотки крови белых крыс на фоне применения тималина при хроническом Т-2 токсикозе 69

4.4.4 Неспецифическая резистентность белых крыс на фоне применения тималина при хроническом Т-2 токсикозе 73

4.4.5 Содержание Т - и В - лимфоцитов белых крыс на фоне применения тималина при хроническом Т-2 токсикозе 74

4.4.6 Содержание антител в реакции агглютинации сыворотки крыс на фоне применения тималина при хроническом Т-2 токсикозе 75

4.4.7 Патоморфологические изменения в органах и тканях белых крыс на фоне применения тималина при хроническом Т-2 токсикозе 76

4.5 Применение иммуномодулятора тималин и энтеросорбента «Фитосорб» при Т-2 токсикозе овец 85

4.6 Применение иммуномодулятора и энтеросорбента

при хроническом Т-2 токсикозе поросят 88

4.6.1 Гематологические показатели поросят на фоне применения тималина и «Фитосорба» при хроническом Т-2 токсикозе 88

4.6.2 Биохимические показатели сыворотки крови поросят на фоне применения тималина и «Фитосорба» при хроническом Т-2 токсикозе 94

4.6.3 Содержание МДА в крови поросят на фоне применения тималина и «Фитосорба» при хроническом Т-2 токсикозе 96

4.6.4 Содержание Т- и В- лимфоцитов в крови поросят на фоне применения тималина и «Фитосорба» при хроническом Т-2 токсикозе 97

4.6.5 Влияние тималина и «Фитосорба» на росто-весовые показатели и общее состояние животных 98

4.6.6 Влияние тималина и «Фитосорба» на гистоструктуру органов при хроническом Т-2 токсикозе 100

4.7 Производственные испытания применения

иммуномодулятора и энтеросорбента в условиях

свиноводческого хозяйства 105

5 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 107

6 ВЫВОДЫ 125

7 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 127

8 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 128

9 ПРИЛОЖЕНИЕ 158

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АЛТ - аланинаминотрансфераза

ACT - аспартатаминотрансфераза

АТФ - аденозинтрифосфорная кислота

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДОН - дезоксиниваленол

ЛД50 - среднесмертельная доза

МДА - малоновый диальдегид

ПВК - пировиноградная кислота

ПДК - предельно допустимая концентрация

ПОЛ - перекисное окисление липидов

РНК - рибонуклеиновая кислота

тРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

ТБК - тиобарбитуровая кислота

ТСХ — тонкослойная хроматография

ТТМТ — трихотеценовый микотоксин

ФА - фагоцитарная активность

ФИ - фагоцитарный индекс

ФЧ - фагоцитарное число

ЩФ - щелочная фосфатаза

БВМД - белково-витаминно-минеральная добавка ИФА - иммуно-ферментный анализ

ФАО (FAO) - организация по продовольственной безопасности при ООН

РМЭ - Республика Марий Эл

РТ - Республика Татарстан

ЕС - Европейский Союз

IL - шифр цитокинов воспаления

IgA, IgG - иммуноглобулин А и G

1 ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Из природных экотоксикантов - загрязнителей сельскохозяйственного сырья и продуктов питания, наибольшую опасность для здоровья населения и животных представляют микроскопические грибы и их токсины - микотоксины (Смирнов A.M., Кононенко Г.П., Таланов Г.А. и др., 1999; Кузнецов А.Ф., 2001). Микотоксины загрязняют продукты питания и корма на всех этапах их производства, транспортировки, хранения, переработки и реализации (Иванов A.B., Тремасов М.Я., Папуниди К.Х., 2008; 2010).

Микотоксины отличаются высокой токсичностью, а многие из них -иммуносупрессивными, мутагенными, тератогенными и канцерогенными свойствами (Тутельян В.А. с соавт., 1985; 2009). Исследования отечественных и зарубежных ученых показывают, что животноводство несет серьезные экономические потери от снижения продуктивности и воспроизводства сельскохозяйственных животных, возникающих при микотоксикозах (Антипов В.А. и др., 2007; Дорожкин В.И., Иванов В.Г., 2007; Fink - Gremmels., 2006; Trevor К., 2006).

У исследователей особый интерес вызывает иммунодепрессивные свойства микотоксинов (Рухляда В.В. и др. 2009). Иммуносупресивное действие микотоксинов проявляется уменьшением хемотаксиса и фагоцитоза различных нейтрофилов и макрофагов (Buening G. et.al., 1982; Gerberic G. et al., 1984; Niyo К. et al., 1988; Vidal D., 1990). Некоторые исследователи, иммуносупрессию, вызванную микотоксинами, выделяют в отдельную форму течения микотоксикоза. Одним из наиболее токсичных микотоксинов является Т-2 токсин. Многочисленными исследованиями показано, что органами-мишенями Т-2 токсина являются костный мозг, селезенка, вилочковая железа, лимфоидная ткань, а у птиц еще и фабрициева сумка (Красников Г.А. и др., 1992; McDonald Е., 1987). При этом регистрируют подавление иммунной системы, задержку роста и снижение продуктивности животных и птицы, нарушение функции воспроизводства (Котик А.П.,1999; Тремасов М.Я., 2004;

Труфанов О.В., 2009). Снижая резистентность организма, они могут способствовать развитию инфекционных и незаразных заболеваний.

Все это указывает на актуальность проблемы иммуносупрессии, индуцированной микотоксинами, поиск и внедрение эффективных лечебных и профилактических средств, способствующих иммунокоррекции при микотоксикозах животных.

Цель и задачи исследований. Целью исследований явился поиск эффективных иммуномодуляторов для фармакокоррекции иммуносупрессии, вызванной микотоксином Т-2, оценка их эффективности при отравлении животных этим микотоксином.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

1. Определить уровень загрязнённости кормов Т-2 токсином и его токсичным метаболитом НТ-2 токсином.

2. Провести скрининг эффективных иммуномодуляторов при воздействии Т-2 токсина на организм животных.

3. Изучить эффективность применения иммуномодулятора тималина в отдельности и в комплексе с сорбентом при воздействии Т-2 токсина на лабораторных и сельскохозяйственных животных, учитывая изменение иммунологических, клинических, гематологических, биохимических и патоморфологических показателей.

4. Провести производственные испытания отобранных средств.

Научная новизна. В результате мониторинга впервые установлено, что

корма в РФ, контаминированные Т-2 токсином, в 40-50% случаев одновременно загрязнены НТ-2 токсином.

Впервые установлено усиление негативного влияния Т-2 и НТ-2 токсина на иммунологические, гематологические, биохимические показатели животных, содержание антител и гистоструктуру органов.

Впервые показано лечебно-профилактическое действие препарата тималин в отдельности и в сочетании с энтеросорбентом «Фитосорб» при Т-2 токсикозе животных. Установлено коррегирующее действие отобранных средств на иммунологические, биохимические и гематологические показатели животных. Определены их оптимальные дозы и схемы применения.

Практическая ценность работы. В качестве средств профилактики и лечения Т-2 токсикоза животных и профилактики иммуносупрессии вызванной Т-2 токсином рекомендуется применять препарат тималин в дозе ОД - 0,2 мг/кг массы тела ежедневно в течение 5 суток, а в рацион включать органический энтеросорбент на основе пищевых волокон - «Фитосорб» в количестве 0,5% от массы рациона.

Результаты исследований использованы при составлении «Методических рекомендаций по применению энтеросорбентов при отравлении животных» (М., 2010), «Методического пособия: диагностика, профилактика и лечение сочетанных отравлений животных вторичными метаболитами микроскопических грибов рода Fusarium», утвержденных Отделением ветеринарной медицины РАСХН (М., 2012).

Апробация материалов диссертации. Основные материалы диссертационной работы доложены, обсуждены и одобрены на научных сессиях ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по итогам НИР за 2008-2012 гг., ежегодных республиканских, межрегиональных, международных научно - практических конференциях и симпозиумах. (Казань, 2008, 2009, 2010, 2011, 2012; Самара, 2009; Ульяновск, 2010, Харьков, 2010, Новосибирск, 2010; Краснодар, 2011, 2012; Москва, 2009, 2010, 2012).

Публикации. По результатам выполненных исследований опубликовано 14 научных работ, в том числе 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Основные положения диссертации, выдвигаемые на защиту: • Результаты скрининга средств - иммуностимуляторов при Т-2 токсикозе

• Иммуносупрессивное действие Т-2 токсина на лабораторных и сельскохозяйственных животных.

• Эффективность применения иммуномодулятора в отдельности и в сочетании с сорбентом при Т-2 токсикозе.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 162 страницах компьютерного текста и включают: список сокращений, введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, практические рекомендации, список литературы. Работа иллюстрирована 32 таблицами и 18 рисунками. Список литературы включает 236 источник, в том числе 54 иностранный.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Фузариотоксины в кормовых и продовольственных культурах

Проблема микотоксинов известна с глубокой древности. Письменные упоминания о микотоксинах содержатся в литературе раннего Буддизма, трактатах древнего Египта, Греции, Рима.

Значительное разнообразие объектов заражения, способность токсигенных грибов поражать посевы сельскохозяйственных культур на больших площадях и продукцию в послеуборочный период являются причиной угрожающих масштабов их распространения (Львова Л.С. и др., 2004; Аргунов М.Н., Бузлама B.C. и др., 2007).

По оценке ФАО, за последние годы потери мирового сельского хозяйства от поражения токсигенными грибами зерновых культур и накопления опасных микотоксинов увеличилось с 2-х до 16 млрд. долларов в год. Микотоксины стали основными загрязнителями зерна и продуктов его переработки (Кононенко Г.П. и др., 2005; Львова Л.С. и др., 2005; ПоповаК.В, 2011).

По данным фитосанитарного мониторинга за 1998-2002 гг. в России комплексом токсигенных грибов заражено более 60% исследованных товарных партий злаковых культур, поступивших в реализацию или заложенных на хранение. Около 10% из них содержали микотоксины. В значительной степени токсигенными грибами заражено семенное зерно, комбикорма, фуражное зерно (Монастырский O.A., 2001; Артюх В.П. и др., 2003; Оншценко Г.Г. и др., 2010).

По данным Всемирной организации здравоохранения, около 25% мировых поставок зерна загрязнены микотоксинами. В результате многолетнего мониторинга товарных партий семенного, пищевого и фуражного зерна установлено, что 60% из них были поражены, а 12 % содержали фузариотоксины в регистрируемых количествах (Монастырский O.A. и др., 2007). Расширение масштабов экспорта и импорта зерна между странами, наблюдаемое изменение климата в мире, систематическое применение фунгицидов, пестицидов, протравителей семян, приводят к увеличению образования микотоксинов в сотни раз (Монастырский O.A., 2001; 2008) и

повышению возможности одновременной контаминации корма различными микотоксинами (Jouany J-P., 2001; Diaz G., 1994). Причем концентрация каждого токсина в отдельности может быть ниже установленной ПДК, что затрудняет постановку диагноза, повышает тяжесть заболевания и обуславливает высокий экономический ущерб (Котик А.Н. и др., 1997; Левченко В.Ю., Антипов В.А., 2005; Тремасов М.Я., 2002; 2005).

В настоящее время известно более 300 микотоксинов, продуцентами которых являются грибы (Рыбальченко О.В., 2007; Hussein Н.М., 2003). Многие виды грибов рода Fusarium, поражающие зерновые культуры, являются продуцентами фузариотоксинов: дезоксиниваленола (DON), ниваленола (NIV), зеараленона (ZEN), Т-2 токсина, фумонизинов и др. Гриб Claviceps purpurea — возбудитель спорыньи злаков, продуцирует эрготоксины (Левитин M. М., 2009; Шефард Г.С.,2011).

Одним из экологических факторов, снижающих качество овощей, фруктов, ягод и других пищевых продуктов растительного происхождения, являются микромицеты, развивающиеся на них в условиях выращивания, уборки, хранения и реализации (Кравченко Л.В. и др., 2005). Уже в самом начале развития микромицетов на продуктах растительного происхождения изменяется их вкус, запах, внешний вид, наносится большой экономический ущерб (Лугаускас А., 2005). Пищевые продукты, пораженные микромицетами, могут быть причиной токсикозной диспепсии с различными исходами и других болезней человека (Рухляда В.В. и др., 2002; Стакенене Ю., 2002).

Грибы рода Fusarium являются наиболее значимыми в глобальном масштабе, чаще всего преобладают в зерне до сбора урожая и могут продуцировать различные микотоксины, наиболее важными из которых являются трихотецены, фумонизины, зеараленон, монилиформин и фузаривая кислота (D'Mello J.P.F., et al., 1997; Иващенко В.Г. и др., 2000; Левитин М.М., 2011). Популяция грибов рода Fusarium в сельскохозяйственных почвах может быть очень высокой и включать как сапрофиты, расщепляющие остатки

растений, так и патогены, которые могут быть причиной различных болезней растений (CAST, 2003; Линченко С.Н. и др., 2004).

Основным продуцентом Т-2 токсина является Fusarium sporotrichioides., который широко распространен в природе, особенно в средней полосе Российской Федерации, где наиболее благоприятные климато-географические условия для его развития. В годы эпифитотии фузариоза колоса в основных зерносеющих регионах России (Северный Кавказ, Центрально-Черноземный район) поражение колоса штаммами - суперпродуцентами достигает 100% (в среднем - около 65%) (Монастырский О.А. и др., 2001).

Fusarium sporotrichioides отнесён к числу доминантных видов Fusarium в Дальневосточном регионе, Центральной России и Западной Сибири. По данным Г.П. Кононенко и Н.А. Буркина, в 1995 - 2001 годах в Уральском и Западно-Сибирском регионах контаминированность Т-2 токсином составила 36,6 и 37,7%, в Дальневосточном - 23,6%, до 22% случаев встречалась сверхнормативная контаминация (Кононенко Г.П. и др., 2003).

Зинатуллинным Р.Р. (2000), Тремасовым МЛ., Сергейчевым А.И. и др. (2003) показано, что в Республике Татарстан все корма контаминированы микроскопическими грибами, потенциальными продуцентами высокотоксичных микотоксинов. Так например, во всех исследованных районах Республики Татарстан, условно подразделенных на 5 крупных регионов - восточный, западный, северный, южный и центральный, выделялись грибы Aspergillus flavus, значительная часть из них оказалась токсичной. Наибольший процент токсичных штаммов грибов (более 40% из всех выделенных) приходилось на долю Fusarium sporotrichiodes.

Имеются данные о высокой частоте (до 40-50%) случаев обнаружения Т-2 токсина в отдельные годы в зерне пшеницы, ячменя и овса в ряде Европейских стран - Польше, Финляндии и др. (Ryu J. et al., 1987).

Анализ импортируемой сельскохозяйственной продукции, проведенный в ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» с 1985 по 2005 гг., показал, что из 1610 исследованных образцов в 14% случаев в кормах и их ингредиентах выявлялся

Т-2 токсин в концентрациях - 0,05-3,1 мг/кг, в том числе в импортируемой продукции наибольшее количество которого было обнаружено в тапиоке, доставленной в 1985 г. в Одессу из Таиланда - 0,81 мг/кг корма (Тремасов М.Я., 2005).

В скандинавских странах среднее ежедневное общее потребление Т-2 и НТ-2 токсинов из зерновых продуктов составляет 0,13 мкг/кг (Eriksen G., 2003), в Европе - 0,017 мкг/кг (Canady R.A., Coker R.D., Egan S.K. JECFA, 2001).

Был исследован видовой состав комплекса фузариев - контаминантов в пробах, поступивших из 20-ти территорий Уральского, Западно-Сибирского, ВосточноСибирского и Дальневосточного регионов, на токсич