Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ФАКТОРЫ ПОВЫШАЮЩИЕ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ТРАНСПЛАНТАЦИИ РАННИХ ЭМБРИОНОВ ОВЕЦ

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "ФАКТОРЫ ПОВЫШАЮЩИЕ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ТРАНСПЛАНТАЦИИ РАННИХ ЭМБРИОНОВ ОВЕЦ"

А-МШ

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА

На правах рукописи

УДК 636.3:612.646.02

ДОЛГОШЕВ Александр Валентинович

ФАКТОРЫ ПОВЫШАЮЩИЕ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ТРАНСПЛАНТАЦИИ РАННИХ ЭМБРИОНОВ ОВЕЦ

03.00.13 — ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени -кандидата биологических наук

п. Дубровицы, Московская область 1990

Работа выполнена во Всесоюзном Ордена Трудового Красного Знаменн научно-исследовательском институте животноводства.

Научный руководитель — доктор биологических наук,

Е. Д. Башкеев

Официальные оппоненты — доктор биологических наук,

профессор Н. И. Сергеев кандидат биологических наук В. Я. Черных

Ведущее учреждение: Казахский научно-исследовательский технологический институт овцеводства.

Защита диссертации состоится 1990 г.

час на заседании специализированного Совета Д.020.16.02 при Всесоюзном Ордена Трудового Красного Знамени научно-нссле-до в ателье ком институте животноводства. ,

Адрес института: 1420)2, Московская область, Подольский р-он, пос. Дубровицы.

(с диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института)

Автореферат разослан »--1990 года.

I

I

н. И. ШМЫГНИ

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Трансплантация вибрионов органически входит в фундаментальные научные разработки. Получение эмбриональных клонов, реконструированных эмбрионов, химер или трансгенных животных возможно лишь в результате успешной трансплантации.

• Экспериментальная часть работы является составной частью

исследований отдела генетики ВШа по теме 22, 15.1.3.1.КЕ1 НТП, госрегистрацня И 01870025368 "Провести перенос генов у овец с целы) получения особей (трансгенных) с измененными качествами".

Ауггальндсуь тдцы. Несмотря на достигнутые успехи в гормональном вызывании суперовуляции, все же реакция яичника остается непредсказуемой. Неудовлетворительной остается также при-живляемость эмбрионов, особенно после целенаправленного вмешательства в их эмбриогенез.

Поэточу изучение факторов, способствующих увеличению количества ранних эмбрионов, повышению их щшшвляемости и в результате более эффективному использованию доноров и реципиентов является одной из актуальных задач при получении трансгенншс. овец.

Цель и задачи исследований. .Цель научно-исследовательской работы состояла в повышении эффективности использования доноров и реципиентов в трансплантации ранних эмбрионов овец с микро-инъецированными генами.

В задачи исследований входило;

- изучение влияния сезона года, дозы ГСЗЕК, возраста, породы и генотипа животных на результаты гормональной обработки;

- определение взаимосвязи гормонального статуса доноров , о результатам« вызывания суперовуляции;

- усовершенствование метода вызывания суперовуляции с использованием синтетического гонадотропного^ршщэинг-горьюна

.. ...... . ■■ ■■- . -1 I

...... ... ■ |

(ПЬЕТ, дцрягистрана);

- оценка условий повышения эффективности метода извлечения зародышей и его усовершенствование;

- изучение влияния некоторых факторов на результаты суетности реципиентов и приживляемости зародышей.

Научная цовкзна. Заключается в том,'что изучена впервые: эффективность использования в качестве доноров эмбрионов ярок раннего возраста (8 мес.); эффективность метода трансплантации эмбрионов у овец в анзстральный период; на многоплодша овцах породы финский ландрас влияние генотипических факторов многоплодия маток на результаты суперовуляции. Изучен гормональный статус в связи с гормональной обработкой и его влияние на результаты вызывания суперовуляции. Изготовлена и внедрена в практику канюля для хирургического извлечения ранних эмбрионов. Изучено влияние синхронности головых циклов доноров и реципиентов и одновременное использование доноров в качестве реципиентов на повышение суягности реципиентов и приживляеыости ранних эмбрионов овец.

Практически зн^чимост^. состоит:

- в усовершенствовании метода гормонального вызывания суперовуляции путем применения однократной инъекции синтетического Щ-ЕГ (дкригистрана), позволяющего увеличить более чем в 2 рада. выход ранних эмбрионов на одного донора;

- в усовершенствовании метода вымывания зародышей путем использования металлической канюли с валиком, обеспечивающей при хирургической извлечении повышение вымываемоети эмбрионов на 29,1%%

- в повышении эффективности метода трансплантации за счет сокращения числа животных, повышения суетности реципиентов и

приживляемости зародышей при использовании одновременно в качества реципиентов овец-доноров и межпородных пересадок.

Работы. Основные материалы диссертационной работа

доложены:

- на научно-методических конференциях аспирантов и молодых ученых ШХа (май 1988, 1989 г.г.);

- на научной конференции молодых ученых Всероссийского НИИ племенного дела (март 1989 г.);

- на ХШ областной научно-практической конференции фйбыыев-ского СХИ (июнь 1989 г,);

- на научной конференции отдела генетики сельскохозяйственных животных Ша (декабрь 1989 г.).

Объем гайот^. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, иллюстрирована 31 таблицей и 8 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследований» результатов-собственных исследований, обсуждения, выводов и практических предложений. Список использованной литературы включает 156 источников, в том числе 107 иностранных.

2. МАТЕРИАЛ И ШЩЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования по прилагаемой схеме проводили в совхозе "ВолгодоновскиЙ" Целиноградской области в анастрвльный и случной сезоны 1987 г. и в экспериментальном хозяйстве "Югеново-Чегода-ево" в случные сезоны 1987, 1988 г.г..

Исследования были проведены на овцах северо-казахского типа Советской мясо-шерстной породы, пород фшский ландрас я романовская. Всего в экспериментах использовали 178 голов овец.

В анэстралъный период для вызывания синхронной охоты и су~ перовуляцни всем жиэотньм внутримышечно, трехкратно, с интервалом 48 часов вводили 1^-ный масляный раствор прогестерона в до-

- 4 -СХЕМА ИССЛЕДОВАНИЙ

Доноры

Возраст Сезон Порода Доза ГСКК Схема обработки Генотип

К

ж

Ту

&

1

в

о

К

Зтепень синх-

юс-

ТИ1Ч.)

Реципиенты

Способ синхронизации

Ж А

3

м

Порода

А

з

е.

£

Породность пересадки

Чясло переса-жвнних зародыше:

Стация развития зародыше!

жж

По назначению

/V

зе 30 мг на одну иъекцню. Через 72 часа после последней инъекции прогестерона внутримышечно вводили сывороточный гонадотрошн по 1250 И.В. на одного донора.

В случные сезоны в начале у доноров и реципиентов устанавливали день наступления естественной охота (нулевой день астрального цикла), затем на 10-12-й дне полового цикла инъецировали гонедотрошш СЖК донорам 12б0 или 600 И.Е. и реципиентам 600 И.Е., а спустя 48 часов нростагладщш и донорам и реци-

пиентам по 250 мкг. В случной сезон 1988 года в дополнение к общей схеме, в день наступления охоты 12 животный внутримышечно вводили по 2,5 мл (100 мкг действующего вещества) гонадотроп-ного ршшзинг-гормона (ГН-РГ, диригистран).

Охоту выявляли йаранама-пройниками два раза в сутки: утром и вечером. Животных-доноров сокрывали баранами сразу после выявления охоты и'повторно через 12 и 24 часа.

Извлечение эмбрионов у доноров и их трансплантацию реципиентам Проводили хирургическим методом через 26-72 часа после покрытия доноров.

Для раскрытия механизма действия гормональной обработки доноров и реципиентов я выявления связи гормонального статуса с воспроизводством из яремной вены в зависимости от опыта брали кровь до гормональной обработки,в процессе и после обработки, при выявлении охоты и спустя 2 часа и исследовали радиомцуно-логическим методом на содержание ЛГ, прогестерона и эстрадиола.

По Зонитировочным дашш опытные матки породы финский ландрас были разделены на много- и мало плодных отдельно по двум критериям: многоплодие окота, из которого они происходят и их собственное многоплодие по данным последнего ягнения.

В ходе исследований учитывала: промежуток времени от конца обработки до начала проявления охоты, число овуляций, числю крупных неовулировавших фолликулов (к.н.ф.) и кист, число, стадия развития и качество вымытых зародышей у доноров.

7 доноров изучали результативность гормональной обработки в зависимости от возраста, породы, генотипа, сезона года, дозы ГСЖК и ГН-ЕГ (диригистрана). Бьши установлена коэффициенты корреляции между главньмк показателями суперовуляторной реакции и концентрациями эндогенных гормонов.

' Проанализированы результаты пересадки зародышей и влияние ряда факторов: степень синхронности эстральных циклов доноров и реципиентов, способа синхронизации, возраста животных, стадии развитая и числа пересаженных зародышей, породи реципиентов и породности пересадки на процент суягноств и процент приживляв-мости зародышей.

Результаты обработаны методами вариационной статистики с использованием критерия % Стьвдента, двухфакторного дисперсионного анализа и коэффициентов корреляции.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Влияние возраста животных и сезона размножения на эффективность вызывания синхронной охоты и полиовуляции

В совхозе "Волгодоновский" Целиноградской области в анэст-ральный период после завершения окота в марте-апреле 1987 года были сформированы три возрастные группы полутонкорунных мясо-шерстных овец-доноров; I - ярки в возрасте 12 месяцев, О- ярки в возрасте 24 месяца, оставшиеся яловыми от осенней случки 1986 г. и 10 - матки яловые 4-5 лет. Для стимуляции синхронной охоты и полиовуляции животных обработали прогестероном и гона-дотролином по вышеуказанной схеме.

Всего из 58 обработанных животных б течение 4-х дней после инъекции гонадотрошна проявили охоту 44 овцы или 75, Стабл, I).

Таблица I

Результаты гормональной обработки доноров разных возрастных групп в анэстральный период

Показатели Ярки 12 мес. Ярки 24 нес, Матки _4-5 .лет

Обработано овец 21 22 15

Проявили синхронную

охоту в течение „ . т . .

96 час,, % 66.7*10,3* 95,5±4,4 60,0±12,6х1

Оперировано овец 14 21 9

Из них, %:

с овуляциями 64,3*12,8 80,Э±8,6 88,9±10,5

с кистами и к.н.ф. 85,7±9,4 95,2*4,7 55,6*16,3* На одно оперированное

ЯЯВ0'11Юв Овуляций 1,0^0,Зв311 I,9tf0,37й 3,8*0,85

кист и к.я.ф. 5,2^0,96 7,5*1,04 4,6±1,83

х - Р<0,05: ** - 0,01

Больше било в охоте ярок в возрасте 24 месяца - 95, статистически достоверно меньше маток 4-5 лет и 12-месячных ярок, соответственно 60,С#, {Р<0,01> и 66,7^ (Р<0,05).

Из оперированных доноров лучшие результаты показали взрослые матки. Среди них больше животных,с полноценной охотой, меньше животных с кистами и к.н.ф. в сравнении с 24-месячннми ярками и разница статистически достоверна (Р^0,05), а число овуляций ка одно оперированное животное достоверно больше (Р<0,01), как по сравнению с 12-месячными, так и с 24-месячными ярками.

Возрастная реактивность животных на гормональную обработку изучалась и в случной период 1987 г. в экспериментальном

хозяйстве "Кленово-Чегодаево".

6 эксперименте в качестве доноров и реципиентов использовали II ярок 8-месячного возраста и 16 взрослых маток 3-5 лет. Ярки не уступали взрослым маткам по проценту прихода в охоту в течение трех дней после гормональной обработки, а по лриходу в охоту в первые 24 часа даже превосходили.

Из числа оперированных животных все 10 ярок имели овуляции, а из 15 взрослых маток только 9 £в($). Лишь две ярки (20$) имели в яичниках кисты и крупные неовулировавше фолликулы, а из матов - II (73,3$). Однако число овуляций на одно оперированное животное было больше у взрослых маток. Следовательно, использование в качестве доноров взрослых маток более эффективно, чей ярок.

В сдучной сезон, в сентябре месяце в совхозе "Волгодонов-ский" было обработано по вышеуказанной схеме 28 взрослых маток 4-5 лет.

Таблица 2

Результативность гормональной обработки взрослых овец (4-5 лет) в зависимости от сезона года

Показатели

Анзстральный период

Случной сезон

Обработано овец

15

бо.о^г.е** 9

88,9*10.5 55,6*16,3х

28 100,0*0 9

охоту в

Оперировано овец Из шас.,%1 с овуляциями

100,0*0 22,2*13,8

с кистами а к.н*ф. На одно оперированное животное: овуляций кист и к.н.ф.

3,8*0,85 •4,6*1,83

6,4*1,20 2,2*1,54

х - Р<0,05; ** - Р<0,01

В случной период все животные пришли в охоту в течение 4-х дней после гормональной обработки, а в анэс тральный - 60$; при этом из 9 оперированных в случной сезон see животные имели овуляции, тогда как в анэстральный - 8.

В случной период 6Шю значительно больше овуляций и меньше кист и к.н.ф. на I оперированное животное, хотя разница статистически недостоверна.

Таким образом, гормональная обработка в анэстральный период менее эффективна, чем в случной.

3.2. Влияние дозы ГСМ на реакцию яичников и вымываемость ранних эмбрионов

В случной сезон 1988 года в экспериментальном хозяйстве "Кленово-Чегодаево" гормональной обработке были подвергнуты овцы двух пород: романовские ярки в возрасте 12-13 месяцев и матки финский ландрас в возрасте 2-5 лет. Кивотные обрабатывались по следующей схеме: на 12-й день полового цикла внутримышечно "инъецировали гонадотропин СТО в дозах 1200 и 600 И.Е. к на 14-й день простагландин в дозе 250 мкг.

у взрослых маток порода финский ландрас лучшие результаты получены при дозе гонадотротша 1200 И.Е., чем при дозе 600 И.Е, Хотя степень вымывания зародышей была на 18,1% меньше, но за счет более высокой овуляции (17,0 овуляций на одного донора) выход на каждого донора на 3,0 зародыша больше.

Для романовских ярок доза гонадотротша СЯК 1200 И.Б. бала явно высокой по сравнению с дозой 600 И.Е. Об этом свидетельствует наличие большего числа животных (на 30,6$) с кистами и крупными неовулировавамми фолликулами, на 1,7 меньше овуляций на каждого донора, на 5,2% ниже степень вымывания зародышей. В конечном итоге на каждого донора зародышей получено на 1,1

меньше, чем с дозой 600 И.Е,

Однако при сравнении двух факторов: дозы СЖК (1200 и 600 И.Е,) и типа доноров {матки финский ландрас и романовские ярки) на результативные признаки статистически достоверным (Р<0,05) оказалось влияние индивидуальных особенностей овец-доноров на число овуляций -27,1$ и на число вымытых зародышей-29,0$. Влияние же дозы СЖК было статистически недостоверным (Р<0,05).

Рис. I. Зависимость числа овуляций от дозы СЖК на I кг живой массы

--матки финский ландрас

Своеобразным критерием оптимальности дозы может служить зависимость показателей реактивности яичников от дозы СЖК на I кг живой массы донора.

Эта зависимость для маток финский ландрас и романовских ярок изображена в виде линейного графика в системе прямоугольных координат (рис, I). Число овуляций для маток финский ландрас и доза СХК на I кг живой массы имеет положительную линейную зависимость. Для романовских ярок эта зависимость нелинейна: в начале до дозы 25,0 И.Е, на I кг живой массы наблздается не-

5* 101 15 20 Й 30*

И.Е.СЖК на I кг ж.м,

- романовские ярки

большой положительный подъем, затем резкий спад и дальнейший постепенный спуск. Этим и объясняется достаточно высокий и достоверный коэффициент корреляции С Ч = 0,55, Р<0,05) для маток финский лаяцрас и недостоверный, низкий для романовских ярок. Установлена также положительная связь дозы гонадотропина на I кг живой массы с числом кист и к.н.ф. (ч = 0,62, Р<0,01) и невысокая отрицательная, связь с процентом вцмываемости зародышей

3.3. Влияние генотипяческих факторов многоплодия на реактивность яичников при гормональной обработке

Установление генетической связи макну плодовитостью и чувствительностью яичников к гонадотропину СЕК приведено -на 23 взрослых матках породы финский ландрас.

Для определения реакции яичников на гормональную обработку все яивотнне бшш разделены на многоштодных и маяодлодша (табл. 3),

Таблица 3

Реакция яичников на гормональную обработку мало- и многоплодных животных по происхождению и собственной продуктивности

якогопяздие окота нэ иооственвов много-Показатели которого они происхо- плодие последнего

ДАТ_окотд

малоплодаые многоплод- малоялод- много-ные . вые плодные

_у =1.91_£=з,зз_ьд.е?

Число доноров II 12 9 12

Овуляций на X донора 10,27±1,97 9,83*2,73 10,56*2,50 9,0812,38

5ГГдоно^ОДШШЙ 7,32*1,99 8,22*2,95 6,43*3,91 В,32±2,27

В % от овуляций 71,6*8,7 83,8*11,6 60,8±9Д 91,6^5,6^

^ -Р<0,01

По чисду овуляций на I животное при гормональной обработке не обнаружено статистически достоверной разницы между группами мало- и мвогоплодвых маток, как по происхождению, тая и собственной продуктивности, хотя, в обоих случаях разница была в пользу малошюдных.

Однако средний процент вымываемости зародышей был выше в группах многоплодных, как по происхождению, так и по собственной продуктивности, причем в последнем случае этот показатель достоверно выше, чем у малсетодкых (Р<0,01). В итоге от многоплодных животных получено больше зародышей на I донора, яо разница статистически недостоверна.

Имеется разница в показателях между животными по дозе СЖК на I кг живой массы.

7 всех овцематок с увеличением дозы СХК на I кг живой массы увеличивалось число овуляций* Обращает на себя внимание более тесная связь этих показателей у многоплодных, чем у малоплодных по происхождению, соответственно Ч ~ 0,75, (Р<0,01) и х = 0,33.

Таким образом, можно резшировать, что у многоплодных овец несколько меньше овуляций на I животное, но за счет более высокого процента вшываеыости получено больше зародышей. Вое это и более высокий коэффициент корреляции мезду дозой СЖК на I кг живой массы и числом овуляций указывает на то, что для многоплодных овец используемая доза С1К <1200 И.Е.) недостаточна и ее можно повысить.

3.4. Проявление охоты в связи с концентрацией прогестерона и эстрадиола в крови при гормональной обработке в анэстральный период

Для выявления влияния инъецируемых гормонов в анэстральный

период на эндогенный уровень прогестерона и всзрацнола у овец были взяты образцы крови за 24 часа до обработки прогестероном (1-е взятие), через 48 часов после трехкратной инъекции прогестерона (2-е взятие) и через 24 часа после введения СЖК (3-е взятие).

Проведен анализ проявления охоты и зависимости от концентраций исследуемых эндогенных гормонов, который показал, что чем выше концентрация прогестерона в крови до его экзогенного введении (1-е взятие) и чем ниже через 48 часов (2-е взятие), а также через 24 часа после введения СЖК (3-е взятие), тем короче у животных период времени от введении CSK до начала проявления охоты (табл. 4).

Таблица 4

Проявление охоты в зависимости от концентрации в крови прогестерона и эстрадиола в анэстральннй период

Время прихода Прогестерон, нг/мл Зстрадиол, кг/ли

в охоту после л —---——

югьвкпи* СЖК 1-9 2-0 -з-е Е-9 2-е d-e инъркццц w_взятие взятие взятие взятие взятие взятие

Через 24 часа 3 3,78 4,82 3,12 119,17 104,17 116,67

Через 36 часов 7 2,41 5,29 4,17 90,00 94,17 100,71

Через 48 часов ' 8 2,49 4,61 3,75 107,29 102,50 108,06

Через 120 часов 5 2,62 5,39 4,99 92,50 96,00 99,38

Коэффициент корреляции мевду концентрацией прогестерона в крови через 24 часа после введения СЖК (3-е взятие) и временем прихода э охоту статистически достоверен (Р<0,05) и равен +0,47. И чем сильнее падение концентрации прогестерона относительно предшествующего уровня (2-е взятие), тем быстрее животные приходят в охоту. Так, яри приходе в охоту после инъекции (ЖК через 24 часа наблюдалось снижение концентрации на 35,3$, через 36 часов на 21,2$, через 48 часов на 18,6$, через 120 ча-

сов яа7,4#. Чей сильнее повышение уровни эсградкола относительно его значения при 2-м взятии, тем быстрее животные приходили в охоту: при приходе в охоту через 24 часа концентрация эсгра-диола повысилась на 12,0$, через 36 часов на 6,9?, через 48 часов на 5,4%, через 120 часов на 3,5$.

3.5. Реакция яичников в зависимости от концентраций прогестерона а астрадиола на 10-й, 12-й и 13-й день астрального цикла

В случной сезон 1987 года от 18 овец, подвергнутых лапа-ротоыии были исследованы образцы крови, взятые на следующие дня полового цикла: 10-й (перец введением СЖК), 12-й (через 48 часов после введения СЖК) и 13-Й (через 24 часа после инъекции простагландана). На 10-й день астрального цикла (до гормональной обработки) животные с большим процентом овулировавшях фолликулов отличались низкой концентрацией прогестерона и встравдола. Во с увеличением содержания этих гормонов увеличивалось число овуляций (для прогестерона коэффициент корреляции 0,54 статистически достоверен (Р<0,05). Это увеличение числа овуляций произошло за счет увеличения общего числа индуцированных к росту фолликулов.

На 12-й день эстрального цикла (через 48 часов после инъекции СИ) наблюдалось повышение концентрации прогестерона и эстрадиола, С увеличением концентрации прогестерона увеличивалось число овуляций ( t = 0,45) и уменьшалось число крупных неовуляровавщих фолликулов н кист. С увеличением концентрации астрадиола значительно увеличивалось число овуляций ( Ч =0,59, Р<0,05), а число крупных неовулировавтих фолликулов я кист увеличивалось незначительно.

На 13-й день полового цикла через 24 часа после инъекции

- 15 -

простагландина происходило падение концентрация прогестерона» ж чем больше оставалась концентрация, тем больше было число овуляций ( Ч а 0,42), а число крупных неовулировавших фолликулов и кист незначительно понижалось.

3.6. Изменение гормонального статуса, реакции яичников и вымываемости зародышей под действием ГЯ-ГГ'

Сравнение гормонального статуса при обнаружении охоты и спустя 2 часа у овец-доноров, содержащих наряду с овуляциями кисты и крупные неовулировавшие фолликулы, с животными, не содержащими таковых (табл.5), показало, что у животных без кист и крупных неовулировавших фолликулов отмечался более высокий подъем ЛГ через 2 часа после обнаружения охоты (242,9$ против 110,2$), в результате чего получено больше на каждого донора овуляций на 2,44 и. вымыла зародышей на 6,4 (Р<0,05).

Таблица 5

Реакция яичников и вымываемость зародышей в зависимости от" концентраций в крови ЛГ, прогестерона и эстраднола в период охоты

Группы ЛГ, нг/шг Прогестерон, Эстрадиол, На I донора

яивотннх _нг/мл нг/мл_

при спус- при спус- при спус- ову- заровняв- тя выяв- тя выяв- тя ля- дышей лении 2 ч. лешга 2 ч. лении 2 ч. ций _охоты__ЯШЫ_

С овуля- _

циями, но 8,29 28,43 2,32 2,42 70,31 67,75 8,44 7,401 без кист и к.н.ф. (п=аег

С овуляциями И 10,43 21,92 2,18 2,54 59,70 59,25 6,00 1,00 кистами

х - Р^0,05

-16 -

Исходя их этого в последующем опыте 12 донорам, обработанным гормонами, по общей схеме, при обнаружении охоты дополнительно внутримышечно ввели синтетический аналог гонадотропин-рилизинг-гормона (ГН-ЕГ, диригистран), способствующий высвобождению из аденогипо$йза ЛГ.

Обработка животных аналогом ГН-ЕГ "при выявлении охоты (табл, 6) привела через 2 часа »'повышению концентраций: в 5 раз ЛГ (Р< 0,001) и на 17,3$ прогестерона (Р<0,05); падению концентрации эстрадиола на 14,9? и уменьшению отношения эстра-диола к прогестерону; в результате уменьшилось число крупных неовулировавших фолликулов и кист, увеличились число овуляций, процент вымывания и в 2,5 раза число извлеченных зародышей, хотя из-за малой выборки и большой вариабельности эти показатели статистически недостоверны.

Таблица 6

Влияние введения ГН-ЕГ на концентрацию гормонов в крови и реакцию яичников

ЛГ, нг/мл Прогестерон, Эст^адиол, На I донора Группы _нг/мл нг/мл_

Еря ■ спус- при спус- при спус- ову- кист зарс£ Лммт М вшш- ТЯ 2 ВИЯВ- ТЯ 2 ЛЯЦИЙ И Д1ШЙЙ Агп^и 2 441041 лвнии часа лении часа к.н.ф.

ОХОТЫ ОХОТЫ

(&=12)Г 10,04 49.1бХХХ 2,48 2,91х 67,71 57,62 8,91 0,82 7,43 Без

-РГ 8,76 И,14 2,07 2,05 63,54 66,62 6,06 1,27 2,90 (п=г!4)

*-Р-£0,05; ша-Р< 0,001.

3.7» Влияние технических условий, числа овуляций, кист и крупных неовулировавинх фолликулов на число и степень вшиваемо ста ранних эмбрионов

Получение зародышей у животнцх-дояоров является одной из важнейших составных частей Общей технологии трансплантации эмбрионов.

По результатам наших экспериментов необходимо отметить заметное несоответствие между числом овулировавпшх фолликулов-372 и количеством извлеченных яйцеклеток - 201. Потери составит 4б#. По литературным данным даже при наиболее результативном извлечении эьйрионов их потери составляли околю 20%.

Анатомическое строение ьхода в яйцевод таково, что а точке фиксации канюли для промывания вследствии тонины и большой эластичности стенок образуется карман, в котором создается вмревое движение промывной дикости и задержание вибрионов.

С целью повышения выживаемости эмбрионов наш была изготовлена металлическая канкун (удостоверение ка рационализаторское предложение X 6/228 от 25,11.88 г.), представляющая собой трубочку с наружным диаметром 2 мм а внутренним каналом 1,2 ш, на конце которой имеется округлый валик с овальной поверхность» снаружи и воронкообразной изнутри* Ори введении инструмента в начало яйцевода точка фиксации его приходится строго по периметру валика. Карман не образуется и поэтому эмбрионы без задержки выносятся через канюлю.

Провалено сравнение вымываемоеги зародышей с применением предложенной нами кашали с валиком у 28 доноров я у 10 овец-доноров с традиционной канюлей без валика (табл.7).

В результате при извлечении зародышей с помощью усовершенствованной канюли вшываемостъ была почти на 30% выше

(В=0,05), чем у доноров с извлечением через традиционную стеклянную канюлю и выход зародышей на I донора составил соответственно 6,3 против 2,5 (Р<0,05).

Таблица 7

Эффективность извлечения зародышей у овец в зависимости от конструкции канюли

Показатели -КАНТОН-

без валика с валиком

Доноров с овуляциями 10 28

На I донора: овуляций 8,0±0,76 10,4*1,31

зародышей 2,5±0,87х б,3±Х,22

% вымывания 31,2*10,6х 60,3±9,2

а^ДН6ВШЫ- 30,0*4,5 10,745.8

1 ~Р<0,05

Установлено статистически достоверное снижение процента извлечения зародышей у доноров, в яичниках которых наряду с овуляциями имелись крупные неовулировавшие фолликулы и кисты (табл.8). От каждого донора без кист и к.н.ф. получено почти в три раза больше зародышей (Р<0,01). Причем, у таких доноров не было их одного случая с полностью невшытдаи зародышами, а с кистами и к.н.ф. - 40?,

Анализ вшивания зародышей отдельно из каждого яйцевода подтвердил негативное влияние кист и к.н.ф. независимо от того, в каком яичнике они находится: игсалатеральном или контрлатеральном яйцеводу, из которого производилось вымывание.

Коэффициенты корреляции меаду числом кист и к.н.ф. в яичниках донора и процентом вымывания зародышей составил -0,84

(Р< 0,001), между числом кист и к.н.ф. и числом вымытых зародышей -0,48 (Р<0,01), а между числом овуляций и числам извлеченных зародышей -»0,53 (Р< 0,001).

Таблица 8

Влияние крупных нейвулировавдах фолликулов и кист в яичниках на степень вымывания зародышей

Показатели Доноры с к.н.ф; Донорн без

показатели_и кистами к.н.ф. и кист

Доноров с овуляциями 15 23

На X донора:'

овуляций 8,2±0,7 Ю,8±1,6

зародышей 2,5±0,7ЗХ ?,2±1,4

$ вымывания от общего чяс— д^э 9х §§ Т^ХХ 9

ла овуляций * * * *

Случаи с полностью невымы- лни-о

тыми зародышами

Х-Р<0,05; ХХ-Р<0,01

3.8. Факторы, вдашцие на процент суягности реципиентов и ггриживдяемость ранних эмбрионов

В результате опыта 33 реципиентам было пересажено 183 за-

родыша с мнкроиньецированнши : генами. Всего объягнилось 13

реципиентов или 39,4$ и получен 21 ягненок, что составило

11,5$ от числа пересаженных зародышей. Сравнение результатов

пересадки зародышей реципиентам, начало циклов которых было

на I день раньше или позже, чем у доноров (п=12), с синхрон-

ными циклами доноров и реципиентов (п=21), показало статисти-

чески достоверное повышение процента суягности и приживаемости зародышей у последних, соответственно 16,6$ и 52,4$ (Р-С0.01) и 4,8$ и 14,9$ (Р<0,05) (табл. 9).

Из асинхронно пересаженных эмбрионов отставшие в возрасте во отношению к вкутриыаточной среде реципиента полностью по-

- 20 -

теряли способность приживляться, а у зародышей старшего возраста приживляемость равна 7,95?, при суягности реципиентов 25Ж

Таблица 9

Результаты ягнения реципиентов в зависимости от синхронности зстралышх циклов'с донорами

Эсгральные Рстптийитпв р Получено ягнят р

цшиш п объягнилось, п % от перв-

ое саженных

зародышей

Синхронные 21 52,4*10,9 18 14,943,3

Асинхронные

<0,01 <0,05

12 16,6*10,7 3 4,8*4,4

у реципиентов с гогмонально синхронизированными циклами по сравнение с естественно циклируищки не наблвдалось отрицательного воздействия обработки, а даже, наоборот, отмечено повышение процента суягности и процента приживляемоети зародышей.

Шесть реципиентов использовались в начале как доноры, т.е. их покрывали-баранами-производителями, извлекали зародыши и тут же пересаживали им другие эмбрионы от доноров другой породы, у таких реципиентов статистически достоверно (Р<*0,01) выше процент суягности по сравнению с только реципиентами, соответственно 83,и 29,и на З.^выше приживляемость зародышей (табл. 10).

Реципиенты с зародышами, пересаженными на 1-клеточной стадии развития имели наименьшие проценты (Р<(^001) суягности (9,1#) и цршшвляемости эмбрионов (1,85?), чем реципиенты с двух- и 4-8 клеточными зародышами (соответственно сущность

реципиентов составила 502 и 75,0Яи приживляемость зародышей

21,4* и 45,4$).

Таблица 10

Результаты ягнения реципиентов в зависимости от способа синхронизации циклов и использовании доноров в качестве реципиентов

Группы

реципиентов Всего п

Рецигрентор

вд (и)

Доду^'

:ено ягнят

от пере- {<(

и саженных __

С горданаль-

но-синхрони- 18 9 50,0±И,8 14 12,3*3,1

зировакной 1,43

охотой

Естественно к 4 ае,7*11,4 циркулирующие * '

7 10,1*3,6 6 14,3±5,4

Реципиенты ,

бывшие одно- 6 5 83,345,2 временно

донорами ^о,ОХ

27 8 29,6*8,9 15 10,6*3,5

0,46

0,62

С увелйиошем числа пересаженных микроиньецированных -зародышей с 2 до 3 дриживляедасть их несколько увеличивалась (с 25 до 29,2$). Пересадка ранних эмбрионов больше 1рех ла одного реципиента ведет к снижений их приживляемости (с 29,2$ при 3-х эмбрионах до 6,0$ при 8 и более эмбрионах) (?<£ 0,05).

Результаты межпородных пересадок (доноры романовские ярки-реципиенты матки финский ландрас и, .наоборот) были лучше, чем внутрипородные по проценту суягности реципиентов и еще более заметна эта разница по проценту приживляемости зародышей (табл. II).

Таблица II

Результаты ягнения реципиентов в зависимости от породных сочетаний пересазенжк зародышей

Группы сочетания Всего Объягнилось Подучено ягнят доноров и реципиентов рециш- п % и % от шрв_

саженных

_ЯЯЛП1ГН1Ий№

Межщные пересадки 13 6 <6,2*13.8 10 17(9±5,1 Внутрипородные 20 7 35,0*10,7 II 8,7*2,5

4. вывода

I. Эффективность гормональной обработки овец-доноров эмйрионов в значительной степени определяется сезоном года, возрастом н индивидуальными'особенностями животных. Результаты в случной сезон лучше, чем в анэстральный. Взрослые овцематки-по числу овуляций превосходят ярок в случной сезон на 34,4$, в анзстральный период в 2-3,6 раза (Р-^0,01), Доля влияния индивидуальных особенностей овец-доноров пород финский ландрас и романовская на вариабельность числа овуляций составила 27,1$н числа вымытых зародышей - 29,0$.

2* Дозу гонадотрошша (Ж овцам-донорам ранних эмбрионов необходимо вводить из расчета на I кг живой массы животных и с учетом генетического фактора многоплодия по происхождению и собственной продуктивности.

3. Динамика концентрации прогестерона и эстрациола в сыворотке крови овец-доноров является объективным 1фитерием функционального состояния их воспроизводительной системы. Чем больше концентрация прогестерона.на 10-й и эстрадаола на 12-й день полового цикла, тем больше число овуляций ( Ч =0,54 и 0,59, Р< 0,05).

4. Инъекция синтетического ГН-РГ (диригистрана) овцам-донорам в. день охоты способствует улучшению эндокринного баланса в организме, что ведет к повышению на I донора числа овуляций , вымытых зародышей и снижению числа кист и крупных неовули-ровавших фолликулов.

5. Степень вымываемости ранних эмбрионов отрицательно взаимосвязана с числом кист и крупных неовулировавших фолликулов

= -0,84, Р< 0,001), а число вшитых зародышей находится в прямой связи о числом овуляций ( i = 0,53, P-íO.OOI) и отрицательной с числом кист и крупных неовулировавших: фолликулов у доноров С t = -0,48, Р<0,01).

6. Использование для вымывания ранних эмбрионов канюли с валиком повышает на 29,1% вымываемость и в 2,5 раза (Р<0,05) выход зародышей на I донора.

7. Синхронность половых циклов доноров и реципиентов является основным фактором в повышении суягноеги реципиентов и прижв-ляемости ранних эмбрионов.

Ори синхронных циклах были выше: суяшость реципиентов на 35,0$ (Р<0,01) и приживляемостъ микрошъецированных эароды-шей на 10,1$ (Р<0,05), чем дри асинхронных (^24 ч.).

8. Реципиенты, бывшие одновременно донорами, превосходили остальных реципиентов по числу суягных животных на 53,75? (Р<г0,01) и приживляемости зародышей на 3,7%.

9. Приживляемо с ть одноклеточных зародышей и суягность реципиентов при их трансплантации значительно ниже, чем от пересадок зародышей 2-8 клеточной стации развития (Р<"0,001).

10. Доля суягности реципиентов и приживляемости ранних эмбрионов зависит от числа пересаженных зародышей. Наивысшая

сущность реципиентов (50,0$) установлена при трансплантации 2-х, а приживляемость (29,2?) при трансплантации 3-х зародышей.

II. Результаты межпородных- пересадок (доноры романовские ярки-реципиенты матки финский ландрас и, наоборот, были лучше, чем внутрипородннх пс> суягности реципиентов на II,и пргаивля-амости зародышей на 9,2$.

5. ЛРАКПШЖИЕ ЯШДСШЕНИЯ

1. Для повышения овуляций и числа вымытых зародышей дозу СЖК следует вводить из расчета 20-25 U.E. на I кг живой массы донора и дополнительно к общей схеме обработки инъецировать внутримышечно в день наступления охоты ГН-РГ (диригистран) в дозе 2,5 мг на животное.

2. Для хирургического вымывания ранних эмбрионов из яйцеводов предлагается удобная в использовании канюля с валиком, обеспечиващая повышение процента вымываемости зародышей.

3. Для повышения числа суягных реципиентов и приживляемости зародышей использовать одновременно доноров в качестве реципиентов, проводить межпородные пересадки эмбрионов и не более 2-3 на одного реципиента многоплодных пород овец.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Башкеев Е.Д., Хамицаев P.C., Мазепкин С.А. // Трансплантация эмбрионов у овец в астральный период /Долгошев A.B. - Билл, научн. работ ВИЕа. - Выпуск 87, - Дубровицы. - 1987. - С.53-55.

2. Башкеев Е.Д., Долгошев A.B., Куксова Р.И. Синхронизация охоты

и полиовуляция у овец при использовании гормональных препаратов // - Овцеводство. - 6, - 1988, - С,20-22.

3. Технология получения зигот у овец. / Башкеев Е.Д., Гольдман И.Л., Долгошев A.B., Семенова В.А,, .Хамицаев P.C. //-Зоотехния. - II. - 1989. - С. 56-57.

Подписано в печать 30/1-90 г. Л-47628 Зак. 24у Тир. 100 экз.

Объем 1 п. Л.

Типография ВНИИТЭМР, г. Щербинка