Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Факторы персистенции микрофлоры репродуктивного тракта у мужчин в норме и при патологии

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Факторы персистенции микрофлоры репродуктивного тракта у мужчин в норме и при патологии"

од

На правах рукописи

ИВАНОВ Юрий Борисович

ФАКТОРЫ ПЕРСИСТЕНЦИИ МИКРОФЛОРЫ РЕПРОДУКТИВНОГО ТРАКТА МУЖЧИН В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Оренбург -1998

Работа выполнена в Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской Академии наук.

Научный руководитель член-корреспондент РАН, Заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор Бухарин О.В.

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор Волков А.Н.

кандидат медицинских наук Шеенков Н.В.

Ведущая организация

Челябинская государственная медицинская академия

Защита состоится «_» _ 1998 г. в_часов

на заседании диссертационного совета К 084.51.02 Оренбургской государственной медицинской академии по адресу: 460014 г. Оренбург, ул. Советская, б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Оренбургской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан «_»_ 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук, доцент

Семченко Ю.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Известна важная роль нормальной микрофлоры репродуктивной системы в создании устойчивости к колонизации экониши патогенными и условно-патогенными микроорганизмами, формировании иммунного гомеостаза и др. В последние годы у 30-40% мужчин наблюдаются хронические неспецифические воспалительные заболевания гениталий (Тикгинский O.JI. и др., 1985; Юнда И.Ф., 1990; и др.); в 30-50% случаев причиной бесплодных браков является мужское бесплодие, развивающееся вследствие воздействия на мужские гениталии различных факторов (Исраилов С.Р., 1982; Пшеничникова Т.Я., 1990; и др.).

В отечественной и зарубежной литературе нет твердых взглядов на причины и патогенез мужского бесплодия (Пепперелла Р.Дж., 1983; Пшеничникова Т.Я., 1990 и др.). Мнения исследователей по этому поводу отличаются большим разнообразием. Одним из факторов нарушения фер-тильности и развития патоспермии является инфицирование внутренних гениталий различными микроорганизмами (Исраилов С.Р., 1982; Кейт Л.Г. и др., 1988; и др.). Показано снижение оплодотворяющей способности сперматозоидов под действием внутриклеточно паразитирующих возбудителей - хламидий, уреаплазм - и их метаболитов (Кейт Л.Г. и др., 1988; Wolff Н. et al., 1991; и др.). В то же время вопрос о роли условно-патогенных бактерий в патофизиологических механизмах развития бесплодия остается открытым. С одной стороны, данные микроорганизмы являются представителями нормальной микрофлоры репродуктивной системы (Magnanelli S. et al., 1990), и, препятствуя заселению патогенов, обеспечивают колонизационную резистентность экониши (Ильин И.PL, 1983). С другой стороны, приобретая агрессивные потенции, они могут явиться этиологическим фактором воспалительного процесса в гениталиях (Corradi G. et al, 1992).

В такой ситуации дифференцировка этиологически значимых микроорганизмов от представителей нормофлоры или контаминантов, очевидно, должна основываться на выявлении у бактериальных культур определенных качественных характеристик, ассоциирующих их с патогенными штаммами микроорганизмов. Ранее была показана связь между уровнем лизоцима эякулята, способностью бактерий к его инактивации и развитием патоспермии (Кузьмин М.Д., 1993). Однако открытым остается вопрос о роли факторов персистенции микроорганизмов в формировании дисбиотических состояний урогенитального тракта мужчин, развитии и хронизацни воспалительных заболеваний гениталий.

Элиминация возбудителей воспалительных процессов в гениталиях и восстановление нормальной микрофлоры репродуктивной системы сопровождается восстановлением репродуктивной функции (Кейт Л.Г. и др., 1988).

В этой связи представляется актуальным изучение видового состава и биологических свойств микрофлоры репродуктивного тракта мужчин в норме и в условиях сниженной колонизационной резистентности. Кроме того, определенный интерес представляют вопросы регуляции микробного биоценоза репродуктивной системы, что позволит повысить эффективность коррекции дисбиотических состояний урогенитального тракта мужчин.

Цель работы: Определение видового состава и биологической роли факторов персистенции микрофлоры репродуктивной системы мужчин в норме и при различных дисбиотических состояниях, а также регулирующего влияния различных факторов на персистентные характеристики бактерий in vitro.

Для достижения данной цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Определить видовой состав микрофлоры уретры и эякулята здоровых мужчин, больных хроническим негонококковым уретритом и хроническим простатитом, осложненным бесплодием.

2. Изучить частоту встречаемости и степень выраженности адгезивной способности, антилизоцимной (АЛА) и антикомплементарной (АКА) активности микроорганизмов, выделенных у мужчин обследуемых групп.

3. Оценить влияние физических (радиоволновая гипертермия) и химических (гормоны) факторов на биологические свойства микроорганизмов.

Научная новизна Впервые изучен комплекс биологических характеристик (адгезивная способность, АЛА, АКА) как группы патогенетически значимых свойств микроорганизмов, обеспечивающих фенотипиче-скую адекватность определенных видов и штаммов бактерий специфическим условиям урогенитального тракта. Выявлены различия в видовой структуре микроорганизмов, изолированных от здоровых мужчин и больных воспалительными заболеваниями урогенитальной системы: у больных хроническим негонококковым уретритом и хроническим простатитом, осложненным бесплодием, наблюдалось уменьшение содержания в микробиоценозе лактобактерий и коринебактерий и появление в спектре изолированной микрофлоры энтерококков и энтеробактерий. Установлена роль отдельных качественных характеристик бактерий в развитии дисбиотических состояний мужской репродуктивной системы: увеличение в биотопах репродуктивной системы доли штаммов бактерий с набором персистент-ных характеристик и обнаруженные высокие (по сравнению со штаммами микроорганизмов, выделенными о здоровых мужчин) значения АЛА и АКА у условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при воспали-

тельных заболеваниях гениталий, подтверждают их этиологическую роль в развитии орогенитального дисбиоза и мужского бесплодия.

Выявлено снижение персистентных свойств стафилококков и энте-робактерий под влиянием радиоволновой гипертермии, что послужило теоретической предпосылкой для разработки «Способа лечения мужского бесплодия» путем воздействия на персистентные характеристики микрофлоры эякулята физическими факторами - радиоволновой гипертермией (положительное решение ВНИИГПЭ о выдаче патента РФ по заявке на изобретение №96101283/14(001504) от 15.09.97).

Установлено ингабирующее влияние препаратов тестостерона на АКА и АЛА условно-патогенных микроорганизмов. Выявлены различия в изменении ростовых характеристик бактериальной популяции при культивировании с метилтестостероном: гормон оказывал биостимулирующий эффект на развитие популяции стафилококков и стабилизирующий - на популяцию эшерихий.

Практическая ценность. Полученные в работе данные расширяют теоретические представления о роли отдельных биологических свойств бактерий в формировании микробных биоценозов репродуктивной системы человека и развитии дисбиотических состояний биотопов репродуктивного тракта мужчин.

Практическое значение исследования заключается в возможности использования факторов персистенции микрофлоры в качестве маркеров дисбиотического процесса, в частности при проведении скрининговых исследований для выявления лиц группы риска.

Разработанный способ лечения мужского бесплодия апробирован и внедрен в работу Оренбургского Центра планирования семьи и репродукции и урологического отделения Оренбургской областной клинической больницы.

Предложенные приемы могут быть использованы в работах микроэкологического профиля и при решении медицинских задач.

Положения, выносимые на защиту:

1. Изменение персистентного потенциала микрофлоры репродуктивной системы мужчин отражает микроэкологические нарушения в биотопах репродуктивного тракта.

2. Модификация биологических свойств условно-патогенных микроорганизмов под влиянием физических (радиоволновая гипертермия) и химических (гормоны) факторов определяет возможность регуляторного воздействия в системе «паразит-хозяин».

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на I Международном научном конгрессе студентов, аспирантов и моло-

дых ученых «Молодежь и наука: третье тысячелетие» ("YSTM'96"), Москва, 1996; Российской научной конференции «Персистенция микроорганизмов», Оренбург, 1997; юбилейной научно-практической конференции Оренбургской областной клинической больницы (к 125-летию больницы), Оренбург, 1997.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, получено положительное решение ВНИИГПЭ по заявке на изобретение № 96101283/14(001504).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы и указатель литературы, включающий 91 отечественный и 75 зарубежных источников. Иллюстрации представлены 6 таблицами и 29 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования: При проведении исследований было изучено 452 штамма микроорганизмов, выделенных от 12 здоровых фертильных мужчин, 22 больных хроническим негонококковым уретритом и 60 мужчин репродуктивного возраста, состоящих в бесплодном браке 1 год и более. Выделение штаммов бактерий осуществляли на плотных питательных средах - 5% кровяном агаре, 20% сывороточном агаре, среде Эндо, MRS-arape. Идентификацию выделенных штаммов микроорганизмов проводили общепринятыми методами на основании морфологических, тинкториальных, культуралыгых, биохимических и антигенных свойств. Биохимический профиль выделенных микроорганизмов оценивали с помощью коммерческих тест-систем фирмы LACHEMA (Чехия). Адгезивную способность бактерий изучали по методу В.И.Брилис с соавт. (1986), факторы персистенцш (АЛА, АКА) микроорганизмов изучались по методикам, О.В.Бухарина с соавт. (1984, 1992, 1997). Ростовые характеристики бактериальных популяций изучали в соответствии с рекомендациями Г.Шпегеля (1987).

Радиоволновое гипертермальное воздействие на микроорганизмы проводили на аппарате "Thermex-2" (Direx Systems Ltd, Израиль) при температуре +44°-+48°С с экспозицией 60,120 и 180 минут.

Изучение влияние препаратов тестостерона на персистентные и ростовые характеристики микроорганизмов проводили при культивировании бактерий в жидкой среде, содержащей препарат гормона в концентрации 100 нМ/мл.

Для характеристики гетерогенности популяций, оценки внутри-штаммового разнообразия использовали индексы разнообразия и выров-ненности Симпсона (Бигон М. и др., 1989).

Полученные результаты обработаны с использованием статистических методов (Ашмарин И.П., Воробьев А. А., 1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При изучении микрофлоры уретры здоровых мужчин было установлено, что в переднем отделе уретры здоровых мужчин с различной частотой встречались грамположительные микроорганизмы различных таксонов, которые в 66,7% случаев были представлены коагулазоотрицательны-ми стафилококками и негемолитическими стрептококками, у 58,3% обследуемых выделялись лакгобактерии, а коринеформные микроорганизмы - у всех обследованных лиц. В среднем из переднего отдела уретры от одного человека было выделено 5,7±0,9 видов микроорганизмов. Микробная об-семененность уретры здоровых мужчин была довольно высокой и колебалась для отдельных видов микроорганизмов от 3,0 до 6,0 ^ КОЕ/мл. Большинство (83,4%) штаммов стафилококков имели средние и высокие значения индекса адгезии (>2,5 б акт./эр.). Все коринебактерии являлись средне-адгезивными, а стрептококки - неадгезивными или низкоадгезивными. Отсутствие персистентных признаков наблюдалось у 33,3% штаммов стафилококков и стрептококков и 20% коринебактерии (рисунок 1). Средние значения АЛА составили 0,5±0,4 мкг/мл и 0,5±0,4 мкг/мл для стрептококков и стафилококков соответственно, у коринебактерии антилизоцимный признак не регистрировался. Большинство штаммов бактерий обладали низкой (менее 5 анти-СН50) активностью, а средние значения АКА у штаммов микроорганизмов, выделенных из уретры здоровых мужчин составили 1,56±1,05; 3,47±2,03 и 3,56=2,2 анти-СНзо для стафилококков, стрептококков и коринебактерии соответственно.

В микробиоценозе уретры больных НГУ установлены существенные изменения видового состава уретральной микрофлоры и частоты выделения отдельных ее представителей: коринебактерии выделялись лишь в 54,6% случаев, стрептококки - в 9% случаев, отсутствовали лакгобактерии, было отмечено появление микрококков (27,2% случаев), энтерококков (18,1% случаев) и энтеробактерий (18,1% случаев). Среднее количество видов микроорганизмов в одном биоценозе составляло 2,3±0,7 (р<0,05 по сравнению с микробиоценозом уретры здоровых мужчин). В большинстве случаев ПМО не достигал диагностически значимого уровня (5,0 КОЕ/мл), позволяющего дифференцировать этиологический агент от са-профитов или контаминантов: средние значения составляли для стафилококков и коринебактерии 4,5±1,3 ^ КОЕ/мл; 3,5±0,6; 3,7±0,5 и 3,0±0,5 1« КОЕ/мл для энтеробактерий, энтерококков и стрептококков соответственно. подавляющее число штаммов независимо от видовой принадлежности

□ стафилококки В коринебактерии

□ микрококки Шэнтерококки вв энтеробактерии а стрептококки

Рис.1. Доля штаммов микроорганизмов с различным набором персистент-ных характеристик, выделенных из уретры здоровых мужчин (А) и больных НГУ (Б). По оси ординат: % штаммов.

являлись средне- и высокоадгезивными. Средний уровень АЛА составил 3,3±0,7 мкг/мл (р<0,05, по сравнению с АЛА стафилококков, выделенных из уретры здоровых мужчин) и 3,5±0,9 мкг/мл для стафилококков и микрококков соответственно. Большинство штаммов коринебактерий обладали низкими значениями АЛА (0-1 мкг/мл), а средние значения АЛА равнялись 1,2±1,2 мкг/мл. Энтеробактерии инактивировали лизоцим в концентрации 1-2 мкг/мл, при среднем значении признака 1,5=0,5 мкг/мл. АКА встречалась у 80% штаммов стафилококков при средней выраженности признака 7,3=1,4 анти-СН50 (р<0,05). АКА регистрировалась у всех выделенных энтерококков и равнялась 7,2±2,9 анти-СНзо. Все штаммы энтеробактерии имели 16,7±0,5 анти-СН50. Микрококки обладали АКА 7,4±3,2 анти-СНго. Способностью к деградации белков системы комплемента обладали 75% выделенных коринебактерий при этом у большинства штаммов регистрировались средние и высокие значения АКА, а средний уровень выраженности антикомплементарной активности составил 7,3±2,7 анти-СНзо (р>0,05).

Полученные результаты о доминировании грампозитивной флоры в уретре здоровых мужчин подтверждают данные других исследователей (Шмидт У. и др., 1988; Кишаг В. е1 а1., 1995; и др.), а изменения в микробиоценозе уретры, связанные с уменьшением видового богатства, появлением в структуре изолятов грамотрицательной энтеробактериальной флоры и повышением вирулентного и персистентного потенциала бактерий-симбионтов, свидетельствуют о микроэкологических нарушениях в уретральном биоценозе при данной патологии, что позволяет рассматривать хронический неспецифический негонококковый уретрит как проявление урогенитального дисбиоза.

В сперме здоровых мужчин микроорганизмы в 66,7% случаев были представлены микрококками, у 33,3% обследованных лиц были выделены стрептококки, коагулазоотрицательные стафилококки и коринебактерии были изолированы из эякулята всех мужчин обследуемой группы, лакто-бактерии выделялись у 58,3% здоровых фертильных мужчин. Среднее количество видов микроорганизмов, выделенных от одного обследуемого составило 4,7±1,3. ПМО составил для стафилококков 3,3±0,7; для стрептококков - 3,7±0,1; для коринебактерий - 4,1±0,7 и для лактобактерий 3,3±0,5 ^ КОЕ/мл. Средние значения индекса адгезии составили 2,1±0,7; 2,0±0,2; 2,8±0,3 и 2,1 ±0,2 бакт./эр. для стафилококков, стрептококков, коринебактерий и микрококков соответственно. Отсутствие персистентных признаков наблюдалось у 16,7% коринебактерий и 100% стрептококков. Одним персистентным признаком - АКА - обладали 75% штаммов стафилококков; 50% коринебактерий и микрококков (рисунок 2). Наличие комплекса персистентных признаков было зарегистрировано у 25% стафилококков, 33,3% коринебактерий и 50% микрококков. Средние значения АЛА

□ стафилококки Ш коринебактерии

□ микрококки в стрептококки

и энтерококки ^ энтеробактерии

Рисунок 2. Доля штаммов микроорганизмов с различным набором перси-стентных признаков, выделенных из эякулята здоровых мужчин (А) и больных бесплодием (Б). По оси ординат: % штаммов.

выделенных микроорганизмов составили 0,7±0,5; 0,6±0,3 и 0,8±0,5 мкг/мл для стафилококков, микрококков и коринебактерий соответственно. Абсолютные значения АКА изолятов не превышали 10 анти-СН5о, при этом большинство штаммов обладало низкой (менее 5 анти-СН5о) активностью, а средние значения антикомплементарного признака у микроорганизмов, выделенных из эякулята здоровых мужчин составили 3,6±2,7; 2,5±1,2 и 4,3±2,1 анти-СН5о для стафилококков, микрококков и коршгебактерий/со-ответственно.

При бактериологическом исследовании эякулята больных бесплодием коринебактерии были выделены лишь у 43,3% обследованных мужчин, лактобактерии - у 33,3%, микрококки и стрептококки выделялись в 23,3 и 20% случаев соответственно, наблюдалось появление фекальной флоры, представленной энтерококками (40% случаев) и энтеробактериями (36,7% случаев). Среднее количество видов микроорганизмов, выделенных от одного больного, составило 3,2±2,1. При оценке степени бактериоспермии было установлено, что, в большинстве случаев интенсивность бактериоспермии не достигала диагностически значимого уровня (4,5 КОЕ/мл), а средние значения ПМО составили для стафилококков 3,4±0,б ^ КОЕ/мл, для энтеробакгерий - 4,2±0,8 и 3,9±1,2 ^ КОЕ/мл для коринебактерий. Индекс адгезии составил для стафилококков 5,8±0,8 (р<0,05 по сравнению со стафилококками, выделенными из эякулята здоровых мужчин), для коринебактерий - 5,3±0,8 бакт./эр. (р<0,05, по сравнению с коринебактериями, выделенными из эякулята здоровых мужчин), микрококки являлись сред-неадгезивными - 3,5±0,3 (р<0,05), 50% выделенных стрептококков были высокоадгезивными (Иадг 3,8±0,5 бакт./эр, р<0,05, по сравнению со стрептококками, выделенными из эякулята здоровых мужчин). Средние значения индекса адгезии для энтерококков и энтеробактерий составили 4,5±1,1 и 5,3±0,8 бакт./эр. соответственно. Средине значения АЛА составили для стафилококков и энтеробактерий 2,7±0,8 и 3,5±0,9 мкг/мл соответственно. Микрококки и коринебактерии инактивировшш лизоцим в концентрациях 1,3±0,7 и 0,8=0,9 мкг/мл соответственно, а стрептококки и энтерококки - в концентрациях 1,3±0,6 (р<0,05, по сравнению со стрептококками, выделенными из эякулята здоровых мужчин) и 2,1±0,9 мкг/мл.

АКА обладали 76,4=3,8% выделенных стафилококков при среднем уровне признака 7,8±1,2 анти-СНзо (р>0,05). Экзометаболиты энтеробактерий ингибировали активность комплемента в пределах 16,8±2,1 анти-СН5о. Антикомплементарная активность коринебактерий регистрировалась у 75±6,8% штаммов при средних значениях 4,4±3,6 анти-СНзо. Средние значения АКА у стрептококков составляли 3,7±2,5 анти-СН5о (р<0,05, по сравнению со стрептококками, выделенными из эякулята здоровых мужчин), а у микрококков и энтерококков - 11,6±3,3 (р<0,05) и 4,3±2,9 анти-СНзо соответственно.

Наблюдаемые изменения видового состава микрофлоры спермы больных бесплодием, характеризующиеся появлением в структуре изоля-тов грамотрицательной энтеробактериальной флоры, подтверждаются данными М.Д.Кузьмина (1993), S.Magnanelli (1990) и позволяют сделать вывод о том, что коагулазоотрицательные стафилококки, стрептококки, ко-ринебактерии и лактобакгерии являются представителями нормальной микрофлоры репродуктивной системы мужчин.

Высокая адгезивная активность микрофлоры эякулята больных бесплодием, вероятно, способствует связыванию бактериями фибронекти-на семенной плазмы и сперматозоидов, снижая подвижность и оплодотворяющую способность последних (Glander HJ. et al., 1990).

Широкая распространенность и выраженность персистентных признаков обеспечивает микроорганизмам возможность длительного переживания в организме хозяина (Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., 1996). В то же время персистенция бактерий, способных инакгивировать лизощш формирует дефицит лизоцима в сперме, что отражается на подвижности сперматозоидов (Кузьмин М.Д.,1993). С другой стороны, лизоцимдефицитное состояние эякулята, возможно, уменьшает вероятность прохождения сперматозоидов через цервикальную слизь (Кейт Л.Г. и др., 1988).

Повышение персистентного потенциала симбионтной микрофлоры, вероятно, может быть связано с передачей генетического материала от патогенов представителям нормальной микрофлоры (Бондаренко В.М., 1994), что вполне объяснимо с учетом плазмидного характера детерминации АЛА (Бондаренко В.М., Яблочков А.Л., 1987), и, возможно, АКА, учитывая протеазный механизм антикомплементарного действия (Bhakdi S. et al., 1985). С другой стороны, повышение доли штаммов с высокими перси-стентными характеристиками в сперме больных бесплодием может быть связано с усилением продукции местных антимикробных факторов при воспалительном процессе в гениталиях (Теплова С.Н. и др., 1997).

Было изучено влияние радиоволновой гипертермии на персистент-ные характеристики условно-патогенных микроорганизмов. В результате проведенных экспериментов установлено, что под воздействием радиоволновой гипертермии наблюдается снижение АЛА и АКА микроорганизмов (таблица 1).

Поскольку ранее было показано ингибирующее влияние на факторы персистенции субоптимальных температур (Гриценко В.А., 1989), логично предположить, что в условиях температурного стресса микроорганизмы максимально ограничивают свою метаболическую активность вплоть до образования некультивируемых форм (Романова Ю.М. и др., 1997).

Таблица 1.

Влияние радиоволновой гипертермии на персистентные характеристики S.epidermidis и E.coli (п=20, М±ш).

Экспозиция S.epidermidis E.coli

АЛА, мкг/мл АКА, антиСНэд АЛА, мкг/мл АКА, антиСН?о

контроль 3,9±0,7 5,6±2,1 4,7+0,5 10,7+4,8

60 минут 2,7±0,5 3,9±3,5 3,2+1,7 5,3±0,9

120 минут 1,3±0,7 0,9±0,7 1.2±0,7 2,5±1,1

180 минут 0,8±0,7 1,02+0,9 0,9±0,8 2,46±0,9

Установлено, что метилтестостерон оказывает ингибирующее влияние на факторы персистенции S.haemolyticus и E.coli - антилизоцимную и антикомплементарную активности (таблица 2). Снижение степени выраженности указанных признаков под действием гормона сопровождается изменением структуры популяции бактерий по изученным свойствам, что проявляется изменением индексов разнообразия и выровненности Снмпсона бактериальной популяции по АЛА и АКА.

Таблица 2.

Влияние метилтестостерона на персистентные характеристики популяций S.haemolyticus и E.coli (п=20).

Показатель S.haemolyticus E.coli

Контроль опыт контроль опыт

АЛА, мкг/мл • OD (M±m) 0,922+0,235 0,217±0,087* 0,191±0,01 0,045±0,01*

Н 4,05 1,76 2,78 1,9

Е 0,21 0,09 0,56 0,38

АКА, антиСН5о (М+т) 13,59±0,83 1,98±0,58* 10,56±1,37 2,08±0,79*

Н 2,46 2,67 3,3 1,9

Е 0,49 0,53 0.67 0,38

Условные обозначения: Н- индекс разнообразия Симпсона; Е - индекс выровненности Симпсона; * - р<0,001.

\ 0,3 -

0,25 -

1 ^

, ¡5 0,2 -

о

а. 1 Л 0,15

1 н о

о 1 а. 0,1 -

1 о

0,05

2 3 4 5 6 7 время, ч

Рисунок 3. Влияние метилтестостерона на скорость роста популяции Б.Ьаето^юиз (А) и Е.соК (Б) (п=20).

Условные обозначения: светлые столбики -контроль; темные столбики - опыт.

При этом зарегистрирован неоднозначный характер изменений внут-рипопуляционной структуры бактерий по АЛА и АКА под действием ме-тилтестостерона: уменьшение индексов разнообразия и выровненности Симпсона популяции E.coli по АЛА и АКА, тогда как в популяции S.haemolyticus аналогичные изменения наблюдались по антилизоцимному признаку, а по АКА в популяционной структуре у S.haemolyticus было отмечено усиление процессов диссоциации, что сопровождалось повышением индексов разнообразия и выровненности Симпсона.

Метилтестостерон оказывал выраженное модифицирующее действие на процессы развития бактериальных популяций S.haemolyticus и E.coli, проявляющееся в изменении удельной скорости роста бактериальных клеток (рисунок 3), при этом в отношении S.haemolyticus наблюдался значительный биостимулирующий эффект, тогда как при культивировании E.coli в среде с гормоном, несмотря на высокие значения константы экспоненциального роста, отмечалась более ранняя стабилизация скорости роста и уменьшение продолжительности фазы логарифмического роста.

Снижение персистентных характеристик микроорганизмов при культивировании с препаратами тестостерона, вероятно, является одним из механизмов нормализации микробиоценоза репродуктивного тракта мужчин, наблюдаемой при проведении гормонотерапии, поскольку ранее было показано бактерицидное действие тестостерона и его метаболитов в отношении клинических изолятов Pseudomonas aeruginosa (Mosier S. et al., 1991).

Полученные данные о снижении персистентных свойств микроорганизмов под влиянием радиоволновой гипертермии in vitro послужили основанием для изучения эффективности применения радиволновой гипертермии при лечении мужского бесплодия. Предложенный способ лечения мужского бесплодия был испытан в Оренбургском Центре планирования семьи и репродукции. У 20 пациентов с диагнозом «бесплодие, астенозо-оспермия» было было проведено лабораторное и бактериологическое исследование эякулята до и после лечения. В результате лечения установлено снижение интенсивности бактериоспермии, изменения в видовой структуре микрофлоры эякулята (уменьшение доли энтеробактерий), снижение АЛА микрофлоры эякулята. Указанные изменения в эякуляте сопровождались повышением процента активно подвижных сперматозоидов, уменьшением количества патологических форм сперматозоидов. Вероятно, вследствие снижения бактериальной обсемененности спермы происходит уменьшение токсического влияния бактерий и их метаболитов на фертиль-ные характеристики спермы, что проявляется увеличением активно подвижных форм сперматозоидов (Кейт Л.Г. и др., 1988, Eggert-Kruse W., 1988; и др.).

Данные об антиперсистентном действии препаратов тестостерона in vitro были использованы для клинических наблюдений по применению ме-тилтестостерона с целью коррекции урогенитального дисбиоза. После про-

веденного лечения у больных наблюдались изменения видовой структуры микрофлоры эякулята у больных хроническим простатитом, проявляющиеся в элиминации патогенных бактерий (S.aureus), уменьшении доли энтеробактерий и снижен™ персистентных характеристик условно-патогенных микроорганизмов.

Возможно указанные изменения в микробиоценозе репродуктивной системы мужчин связаны со способностью тестостерона и его метаболитов повышать активность местных факторов защиты и лизосомальных бактерицидных белков (Сергеев П.В., 1984; Stern J.E. et al., 1992).

Оценивая фактический материал в целом, следует выделить три главных момента:

Во-первых, микрофлора биотопов урогенитального тракта здоровых мужчин представлена микроорганизмами грампозитивной группы, при этом факторы персистенщш широко распространены у различных представителей микрофлоры репродуктивной тракта мужчин, а частота встречаемости и степень выраженности персистентных свойств тесно связаны с характером микроэкологических нарушений.

Во-вторых, бактерии подчиняются регуляторным влияниям различных биологически активных веществ, в частности, гормонов, что проявляется в модификации биологических свойств бактерий и может быть использовано с целью изучения механизмов формирования микробиоценозов репродуктивной системы.

В-гретьих, снижение персистентных свойств условно-патогенных микроорганизмов под влиянием различных факторов (радиоволиовая гипертермия, гормоны) может быть использовано при разработке методов коррекции дисбиотических процессов урогенитального тракта и связанных с ними инфертильных состояний у мужчин.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что микрофлора биотопов урогенитального тракта здоровых мужчин характеризовалась выделением грампозитивных микроорганизмов с низким вирулентным и лерсистентным потенциалом.

2. Уменьшение видового богатства в микробиоценозе уретры свидетельствует о формировании урогенитального дисбиоза у больных хроническим негонококковым уретритом.

3. Увеличение в биотопах репродуктивной системы доли штаммов бактерий с набором персистентных характеристик и обнаруженные высокие значения АЛА и АКА у условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при воспалительных заболеваниях гениталий отражают микроэкологические нарушения в биотопах урогенитального тракта.

4. Антиперсистентное действие препарата тестостерона на микроорганизмы является одним из механизмов, способствующим нормализации микробиоценоза репродуктивной системы мужчин при гормонотерапии.

5. Метилтестостерон оказывал выраженное модифицирующее действие на процессы развития бактериальных популяций S.haemolyticus и E.coli, проявляющееся в изменении удельной скорости роста. В отношении S.haemolyticus наблюдался значительный биостимулирующий эффект, тогда как при культивировании E.coli в среде с гормоном, несмотря на высокие значения константы экспоненциатьного роста, отмечалась более ранняя стабилизация скорости роста и уменьшение продолжительности фазы логарифмического роста.

6. Установлено ингибируюгцее влияние радиоволновой гипертермии на персистентные свойства микроорганизмов, что положено в основу разработанного способа лечения мужского бесплодия.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Динамика видового состава и антилизоцимной активности микрофлоры эякулята под воздействием локальной гипертермии.// Журн. мик-робиол., .эпидемиол., иммунобиол.- 1996. - №3. - С.86-88 (соавт. М.Д.Кузьмин).

2. Роль факторов персистенции Staphylococcus epidermidis в инфекционном процессе.// Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол.- 1997. -№4. -С.81-84 (соавт. О.Л.Чернова, С.Б.Матюшина, И.В.Райцелис).

3. Влияние препаратов стероидных гормонов на персистентные и ростовые характеристики стафилококков.// Журн. микробиол., эпидемиол.. иммунобиол.- 1997. - №4. - С.92-95 (соавт. С.В.Черкасов, М.Д.Кузьмин, О. Д .Константинова).

4. Фотометрическое определение антилизоцимной активности микроорганизмов.// Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол.- 1997. - №4,-С. 117-120 (соавт. О.В.Бухарин, А.В.Валышев, Н.Н.Елагина, С.В.Черкасов).

5. Трансуретральная радиоволновая гипертермия в лечении хронического бактериального простатита.// Тез. докл. Юбилейной научно-практической конф. Оренбургской областной клинической больницы.-Оренбург, 1997. - С. 119-120 (соавт. М.Д.Кузьмин, В.Н.Мананникова).

6. Роль персистирующей микрофлоры в формирован™ патоспер-мии.// Урология и нефрология.- 1998,- №2.- С.48-50 (соавт. М.Д.Кузьмин, Е.А.Михайлова, О.В.Бухарин).

7. Способ лечения мужского бесплодия. Положительное решение ВНИИГПЭ по заявке на изобретение №96101283/14(001504) от 15.09.97. (соавт. О.В.Бухарин, М.Д.Кузьмин).