Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Факторы, контролирующие чувствительность эритроцитов к осмотическим и температурным воздействиям

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Факторы, контролирующие чувствительность эритроцитов к осмотическим и температурным воздействиям"

На правах рукопису

ФЕДОСОВА Світлана’ Миколаївна

ФАКТОРИ, ЩО КОНТРОЛЮЮТЬ ЧУТЛИВІСТЬ ЕРИТРОЦИТІВ ДО ОСМОТИЧНОГО ТА ТЕМПЕРАТУРНОГО ВПЛИВІВ

ОЗ.О0Л З — Фізіологія людини га твари»

АВТОРЕФЕРАТ .

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Харків — 199-1

Дисертація е рукопис

(Робота виконана на кафедрі фізіології Харківського державного університету

людини та тварин

Науковий керівник Офіційні опоненти

доктор біологічних наук, професор Бондаренко Валерій Антонович

доктор біологічних наук, професор

Панченко Ніна Іванівна (Харківський інститут удосконалення лікарів)

доктор біологічних наук, професор

Луговий Володимир Йосипович (Інститут проблем кріобіології та кріомедицини АН України, м. Харків)

Провідна установа

Захист відбудеться 15-

Ха-рківсь-кий медичний інститут /Д » СІЧНЯ__________________________ 1995 р.

годині на засіданні спеціалізованої Вченої -ради К 053.06.07 Харківського державного університету (310077, м. Харків, пл. Свободи, 4, аудиторія 3-15)

З дисертацією можна ознайомитися в Центральній науковій бібліотеці Харківського держуніверситету.

Автореферат розісланий листопада.

1994 р.

Учений секретар спеціалізованої Вченої ради, кандидат біологічних наук

А. В. Некрасова

' АКТУАЛЬНІСТЬ ПРОБЛЕМИ. Сучасний етап розвитку біологічної науки та медицини характеризується підвищеним інтересом до дослідження загальних закономірностей пошкодження клітин в екстремальних умовах з метою пошуку засобів підвищення їх стійкості до дії несприятливих факторів.

Механізми, що визначають спрямованість відповідної реакції клітини за зміни умов середовища, ще й досі не визначені. Однак, виходячи з того, що початковий структурно-функціональний .стан клітини в цілому і, зокрема, її плазматичної мембрани (ПМ), визначають характер адаптаційних та деструктивних змін, що розвиваються в ній при дії несприятливих факторів [Бондаренко В. А. и соавт., 1992; Рамазанов В. В., 1994J, формується специфічний підхід до направленої регуляції стійкості клітин. Цей підхід базується на тому, що при перенесенні клітин в специфічні вихідні умови, значно відмінні від фізіологічної норми, можна індукувати в них комплекс змін, які приводять до збільшення стійкості клітин при послідуючій дії пошкоджуючих факторів [Бондаренко В. А. и соавт., 1992]. Забезпечення таких вихідних умов передбачає модифікацію стану клітини не тільки за допомогою хімічних агентів, фармакологічних препаратів, але й за допомогою добору певного сполучення таких параметрів середовища, як температура та осмолярність.

Важлива роль початкового структу-рно-функціонального стану клітини і, зокрелМа, її ПМ, як первинної ланки пошкодження, найбільш чітко просліджується при дії на неї холодового (ХШ) та гіперосмотичного шоку (ГШ) [Белоус А. М. и соавт., 1985] — процесів, які є елемеитами більш загального механізму пошкодження клітини в процесі консервування органів та тканин методом охолодження або заморожування [Lovelock G. Е., 1954; Meryman Н. Т., 1971], Враховуючи це, складний характер залежності між початковим станом клітини, модифікуючим впливом на нього осмотичних та температурних умов середовища, з одного боку, та чутливістю клітин до наступної дії X та ГШ, з другого, -можна розглядати як тест, що не тільки дозволяє виявити різницю в реакційній здібності клітин, що знаходяться в різних структурно-функціональних станах, але й дає можливість цілеспрямованій регуляції вихідиого стану клітини з метою підвищення її стійкості до послідугочої дії X та ГШ.

МЕТА ТА ЗАВДАННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ. У зв’язку з цим, метою даної роботи було дослідження спрямованості та глибини модифікації структурно-функціонального стану еритроцитів в процесі їх селективної дегідратації в гіперосмотичних розчинах NaCl та сахарози і вивчення взаємозв’язку між вихідним станом клі* тини та її чутливістю до дії X та ГШ.

У відповідності з поставленою ціллю були передбачені слідуючі експериментальні завдання: .

■!.. Дослідити особливості осмотичної та температурної чутливості еритроцитів щурів різного віку (І, 3, 6, 12, 24 міс.).

2. Дослідити спрямованість і глибину модифікації структурно' функціонального стану еритроцитів людини та щурів по мірі

збільшення тонічності електролітного та нее лектр о літного середовища інкубації, включаючи оцінку зміни об’єму і форми клітин, внутріклітинного pH, бар’єрної функції мембрани та стійкості ■цитоскелету (ЦС) до механічної дії.

3. Прослідкувати особливості .розвитку сенсибілізованого стану еритроцитів людини та щурів до дії X та ГШ після передінкуба-ції клітин в гіперосмотичних розчинах NaCl та сахарози при 37 ° і 0 °С.

4. Вивчити вплив додаткової температурної (+49 4- -j-50°C) та хімічної (за допомогою SITS, діпіридамолу та лідокаїну) модифікації структурно-функціонального стану еритроцитів людини та щурів на чутливість .цих клітин до дії X та ГШ.

НАУКОВА НОВИЗНА. Вперше виявлено, що механізми, які лежать в основі реакційної здібності клітини, можуть контролюватися такими факторами середовища, як температура та осмо-лярність, але глибина їх проявления в значній мірі детермінована віком організму. Зміни структурно-функціонального стану еритроцитів, що відбуваються в різних фазах життєвого циклу організму, виявляються в зміні чутливості цих клітин до механічного, температурного та осмотичного впливів. При цьому, зміни . різних параметрів структурно-функціонального стану еритроцитів в процесі розвитку та старіння організму не носять прямоліній-. ного характеру та не відбуваються односпрямовано.

Механізм сенсибілізації еритроцитів людини та щурі® до дії X та ГШ пов’язаний зі змінами, що відбуваються в комплексі ЦС—ПМ. Однак, в еритроцитах щурів, поряд із структурним механізмом контролю реакційної здібності клітин суттєвий вклад в -механізм сенсибілізації вносять інші механізми, які можуть бути зв’язані з метаболічним статусом клітини, стано'.ч ліпідів бішару, та з функціонуванням систем транспорту іонів, що регулюють об’єм клітини.

Вперше показано, що додаткова модифікація стацу еритроцитів за допомогою препаратів, які змінюють структурно-функціональний стан капнофоріну та характер його взаємодії з ферментами гліколізу (ФГК, ГАФДГ), білками ЦС (білками смуг 2.1 та 4.1) та ліпідами бішару, суттєво змінює чутливість еритроцитів людини та щурів до дії X та ГШ. При цьому, сам модифікуючий вплив SITS, діпіридамолу та лідокаїну на чутливість '■еритроцитів людини та щурів до дії X та ГШ має ряд відмінних особливостей,

л

ТЕОРЕТИЧНЕ ТА ПРАКТИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ РОБОТИ. Результати роботи не тільки розширюють уявлення про існуючі в клітинах власні механізми регуляції їх чутливості до дії несприятливих факторів середовища, але й важливі для більш глибокого розуміння механізмів, що обумовлюють розвиток X та ГШ. Одержані дані дають підхід до розуміння механізмів дії на рівні клітини ряду фармакологічних препаратів (діпіридамолу, лідо-каїну), що надає можливість для більш адекватного їх використання у медичній практиці.

Одержані в роботі результати дозволяють обгрунтувати нозі підходи для розробки методів низькотемпературного консервування еритроцитів з урахуванням впливу температури, іонної сили, осмолярно'сті середовища консервування. Одержані дані також можуть бути використані і для розробки нових підходів у вивченні еритроцитів як показника вікових змін в організмі людини в нормі та при патологічних станах.

ОСНОВНІ ПОЛОЖЕННЯ, ЩО ВИНОСЯТЬСЯ НА ЗАХИСТ:

1. Конкретний характер розвитку сенсибілізованого стану ери-

троцитів до дії X та ГШ обумовлений видовою належністю клітин, а глибина його проявлення — особливостями структурно-функціонального стану клітини, які детерміновані віком організ-. му. ;

2. Вплив осмотичних та температурних факторів середовища пе-редінкубації на чутливість еритроцитів до дії X та ГШ може здійснюватись через -модифікацію структурно-функціонального стану капнофоріну-білка смуги 3, який контролює, не тільки транспорт аніонів та води, але й характер асоціації ЦС з ПМ.

3. Модуляція структурних взаємодій капнофоріну з ферментами гліколізу (ФГК, ГАФДГ), білками ЦС (білками смуг 2.1 та 4.1) та ліпідами бішару є фактором, здатним здійснювати координацію існуючих в клітині функціональних, структурних та метаболічних механізмів регуляції реакційної здібності клітини.

АПРОБАЦІЯ РОБОТИ. Матеріали дисертації доповідались на конференції молодих вчених біологічного факультету, НДІ біології ХДУ (Харків, 1994); республіканській науково-практичній конференції «Сучасні проблеми фармації» (Харків, 1994).

ПУБЛІКАЦІЇ. По матеріалам дисертації опубліковано 5 робіт: 2 депоновані статті, 3 роботи в тезах.

СТРУКТУРА ТА ОБСЯГ ДИСЕРТАЦІЇ. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів, трьох глав опису результатів власних досліджень та їх обговорення, висновків, списку літератури, який включає 178 робіт зарубіжних та 90 робіт вітчизняних авторів, додатку. Робота викладена на 150 сторінках машинописного тексту, утримує 49 малюнків, 4 схеми та 15 таблиць.

У роботі були використані еритроцити 1, 3, б, 12 та 24 місячних самців — щурів лінії Вістар та еритроцити донорської крові II — групи чоловіків 34—39 років.

'Різні .початкові стани клітин формувались за допомогою дегідратації в процесі 10-хвилинної інкубації еритроцитів в гіпер-осмотичних розчинах NaCl та сахарози. Для характеристики вихідного стану клітин реєструвався їх об’єм методом спектроскопії імпульсів опору на приладі типу Coulter-Counter [Heinbush P. et al., 1985]. Аналіз зміни форми еритроцитів проводився на мікроскопі ВІОЛАМ. Залишковий вміст іонів К+ в еритроцитах визначався за допомогою калій-селективного мембранного електроду [Macey R. І., 1978]. Вимірювання внутріклітинного pH проводилось по загальноприйнятому методу [Roos А., 1981]. Досліджувалась стійкість ЦС еритроцитів до механічного впливу згідно Leibo S. P., 1976.

Для модифікації структурно-функціонального стану капнофо-ріну еритроцити оброблялись SITS (0,01 мМ), діпіридамолом (0,05 мМ) та лідокаїном (10 мМ). Температурна денатурація анкіріну здійснювалась при +49 °С [Лапшина Е. А., Завод-ник И. Б., 1993].

іГіперосмотичний шок еритроцитів здійснювався переносом аліквот клітинних суспензій, проінкубованих на протязі 10 хвилин П’ри 37 ° та 0 °С в досліджуваних розчинах NaCl і сахарози, в 2,00 та 4,00 М розчини NaCl [Поздняков В. В., 1989].

Холодовий шок еритроцитів був змодельований на основі загальноприйнятої методики [Green F. A., Jung С. Y., 1977].

Статистичну обробку експериментальних даних проводили по методу Ст’юдента-Фішера.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

ВІКОВІ ОСОБЛИВОСТІ ОСМОТИЧНОЇ ТА ТЕМПЕРАТУРНОЇ ЧУТЛИВОСТІ ЕРИТРОЦИТІВ. З урахуванням того, що структурно-функціональний стан клітин, з одного боку, визначає характер адаптаційних і деструктивних змін, що розвиваються ■в них при дії пошкоджуючих факторів, а, з другого боку, є відображенням процесів, що відбуваються на рівні цілісного організму [Лопухин Ю. М. и соавт., 1993], можна припустити, що чутливість еритроцитів до дії несприятливих факторів, у тому числі, температурних і осмотичних, може бути детермінована віком організму.

Виявлено, що передіикубація еритроцитів щурів різного віку в гіперосмотичних розчинах NaCl та сахарози за різних температурних режимів дає можливість виявити вікові відмінності структурно-функціонального стану клітин, які в фізіологічних умовах

являються прихованими, латентними. При цьому, зміни струк-. турно-функціональаого -стану еритроцитів, які відбуваються на різних етапах життєвого циклу організму, проявляються не тільки в зміні бар’єрної функції ПМ клітин, але й в змі«і їх чутливості до механічних, ’осм-отичних та температурних впливів (Мал. 1). Спрямованість проявлення цих змін в онтогенезі різна і залежить від тонічності, складу та температури середовища перед інкубації (Мал. 1). Однак, вікові відмінності реєструючих параметрів найбільш виражені після передінкубації клітин в умовах, максимально сенсибілізуючих еритроцити до дії X та ГШ, тобто після передін'кубадії клітин в 0,55—0,75; 1,05—1,50 М розчинах КаСІ або в 0,60—0,90 М розчинах сах'а-рози. Незважаючи на те, що зміни параметрів еритроцитів 1- та 24-місячних щурів, з одного боку, та еритроцитів З- і 12-місячних тварин, з другого, відбуваються односпрямова-но по відношенню до показників еритроцитів 6-місячннх щурів, ці зміни мають різний зміст і генез.

Одержані дані вказують на існування в клітині власних -механізмів контролю її реакційної здібності. Глибина проявлен-ня цих механізмів зумовлена особливостями структурно-функціонального стану клітини, які детерміновані віком організму.

ДЕГІДРАТАЦІЯ ЯК ФАКТОР, ЩО КОНТРОЛЮЄ ЧУТЛИВІСТЬ ЕРИТРОЦИТІВ ДО ЗМІНИ ТЕМПЕРАТУРНИХ ТА ОСМОТИЧНИХ УМОВ СЕРЕДОВИЩА. Модифікація структурно-функціонального стану еритроцитів в процесі осмотичної дегідратації супроводжується реорганізацією білків ЦС та компонентів ПМ, зміною характеру і тривкості взаємодії білкової решітки з ПМ. При цьому, в однакових осмотичних та температурних умовах передінкубації формуються різні вихїдні стани еритроцитів людини та щурів. Це -виявляється в різній, по мірі збільшення тонічності електролітного .середовища, спрямованості трансформації клітинної форми, що охоплює, у випадку еритроцитів людини, перехід дискоцит-ехіноцит-'плоскі гіпертонічні -клітини, а у випадку еритроцитів щурів — дискоцит-акантоцнт-тороцит. Виявлені закономірності спостерігаються в критичній області осмоляр-ності, при переході через яку, еритроцити людини та щурів не тільки досягають мінімального об’єму, але й гублять здатність до неідеальної осмотичної поведінки.

В процесі інкубації клітин в досліджуваних розчинах КаСІ бар’єрні властивості мембран еритроцитів людини та щурів, стійкість ЦС цих клітин до механічної дії, змінюються по-різному. При цьому, відмінною особливістю еритроцитів щурів являється «е тільки висока чутливість до- механічної дії, але й високий рівень звільнення іонів К+ із клітин в процесі їх інкубації в 0,55— 0,75 М розчинах ^С1, який корелює з закисленням внутрішнього середовища клітини.

Виходячи з того, що найбільш ранніми, неспецифічними ознаками метастабільного -стану клітини є високий рівень звільнення

із клітин іонів к+ і закислення внутріклітинного pH [Бондаренко В. А., 1988; Браун А. Д., 1987; Roos А., 1981], можна чекати, що передінкубація еритроцитів людини в 0,85—3,00 М розчинах NaCl буде сенсибілізувати клітини до наступної зміни осмотичних та температурних умов середовища. У випадку еритроцитів щурів, поряд з цим критичним інтервалом вірогідно існування другого концентраційного інтервалу — 0,55—0,75 моль/л NaCl, передінкубація в межах якого також може чинити сенсибілізуючий вплив. Одержані дані показали, що еритроцити людини та щурів виявляються сенсибілізованими до охолодження після передінкубації в передбачених умовах (Мал. 2).

Чутливість еритроцитів людини та щурів до дії ГШ також значно змінюється в залежності від тонічності середовища передінкубації (Мал. 3). При цьому, відмінною рисою еритроцитів щурів е більш висока, в порівнянні з еритроцитами людини, чутливість до переносу в 2,00 М розчини NaCl. Якщо, у випадку еритроцитів людини, по мірі збільшення тонічності середовища" передінкубації відмічається кореляція в зміні чутливості клітин до механічного впливу та до дії ГШ, то еритроцити щурів виявляються максимально сенсибілізованими до дії ГШ в умовах, передінкубація в яких призводить не тільки до максимальної механічної чутливості, але н різкому збільшенню рівня вивільнення іонів К+.

Виявилось, що проявлення клітинних механізмів контролю реакційної здібності залежить не тільки віїд осмолярності середовища, але й від його температури. Так, передінкубація еритроцитів людини та щурів в гіперосмотичних розчинах NaCl при 0°С, в порівнянні з 37 °С, призводить не тільки до зменшення рівня звільнення із клітин іонів К+, зменшенню механічної чутливості клітин, але й до збільшення їх стійкості до наступних змін умов середовища. Таким чином, втикає можливість цілеспрямованої модифікації вихідного стану клітини за допомогою добору певного сполучення таких параметрів середовища, як температура та осмолярність.

(Механізм сенсибілізації клітин до дії Г та ХШ має складну основу та може бути пов’язаний з одночасною дією таких факторів, як зміна об’єму та форми клітини, перерозподіл іонів, зміна внутріклітинного pH та інш.

ОСОБЛИВОСТІ РОЗВИТКУ СЕНСИБІЛІЗОВАНОГО СТАНУ ЕРИТРОЦИТІВ В ПРОЦЕСІ IX СЕЛЕКТИВНОЇ ДЕГІДРАТАЦІЇ В РОЗЧИНАХ НЕЕЛЕКТРОЛІТІВ. Незважаючи на існування в клітинах трьох типів механізмів регуляції їх реакційної здібності: функціонального, структурного та метаболічного

[Александров А. А., 1989; Бужурина И. М. и соавт., 1986; Хочач-ка П., Самеро Дж., 1977] провідна роль відводиться [Браун А. Д. и соавг., 1987] структурному механізму, тобто стану комплексу ЦС—!ПМ.

ЬІК'МІС. і З в /2 14

0.65 иоль/л тЛ

Ьікміс. і з е п м . і,05 моль/* г*иЛ

. . 5 в п гч м *,и> мвль/я*ЛгСк

II

1,10 /чвлл/л Ца££

ЬИі,/Че. і з 6 а 29

4 З Є 12 24 сахаїроьи О, ЇО мало/л

% * н

90 » 90

чь ?*•

ЗО $3

*? Ю

& €0

да § Я

4а 40

зо 10

20 М

ю Ю

0 V': а

і 3 £ 12 2Г

і з є яг*

Концентрація

Мал.І. А - Рівень звільнення іонів К+ з еритроцитів щурів різно-

до механічно-

го віку;

ИВІС1

В - чутливість еритроцитів щурів різного віку

го впливу; •

С - чутливість цих клітин до дії холодового шоку;

Д - чутливість еритроцитів щурів різного віку до дії гіпер-осмотачного таку (2,00 Ш

після ІО-хвшшнноі інкубації клітин в розчинах і^аСІ (і) та

сахарози (II) при 37°С.

№

80

60

§ 40

І

и 20

О

Концентрація иксе , Моль/л

сахарози, Иоль/л .

Иал.2. Чутливість еритроцитів людини (•—•) та щурів (*--*) до дії ХШ після ІО-хвилшної Інкубації клітин при 37°С в гіпертонічних розчинах Мі се (і) та сахарози (II).

Концентрація г/аСІ , Моль/л

80 0°С '* У\ ®Ч7?Ч..

60 ! А 1 / ' |і /А

40 т і Vі* • !:\/ V»'* п[\\

20 аЧ '! /•' /т

0 і-Х/ '*-* а о о » п-< І

0.19 0£0 0,90 0,90 1.20 ЦЯ Ч£0 0.10 ЦЮ ОО

Концентрація сахарози , Моль/л

Мах. 3.

Чутливість еритроцитів люда-ни (»-*) та щурів (•"•) до дії Ш при перш ОСІ КЛІТИН в 2,00 М (1,2) та 4,00 М (3,4) розчини г/а.С£ після 10 - хвилинної їх інкубації при 0° та 37°С в гі-перосмотичних розчинах гіаСІ та сахарози.

Якщо припустити, що визначаючим фактором в механізмі регуляції чутливості клітин до дії X та ГШ лежать процеси, пов’язані зі зміною стану комплексу ЦС—ПМ, то виявлені в умовах дегідратації еритроцитів в гіперосмотичних розчинах ЛаСІ закономірності повинні зберегтися і в розчинах сахарози.

Виявилось, що за умови збільшення осмолярності «еелектро-літного середовища зберігаються специфічні спрямованості трансформації форми еритроцитів людини та щурів, які спостерігаються по мірі збільшення осмолярності електролітного середовища. Однак, перехід від однієї клітинної форми до іншої спостерігається при значеннях осмолярності неелектроліітного середовища в 2 рази менших в порівнянні зі значеннями осмолярності електролітного середовища.

Характерною особливістю розвитку ХШ еритроцитів в розчинах сахарози є не тільки збільшення чутливості клітин до охолодження, але й зміщення критичної області осмолярності в бік менших значень (Мал. 2). Однак, незалежно від складу середовища, еритроцити людини і щурів виявляються сенсибілізованими до дії ХШ в умовах, передінкубація в яких призводить до максимального зменшення об’єму клітин, збільшенню рівня втрати іонів к+ та збільшенню механічної чутливості клітин. Відсутність фіксованої межі осмолярності, яка сенсибілізує клітини до охолодження, може свідчити про те, що розвиток ХШ визначається величиною осмотичного градієнту на мембрані. В розчинах сахарози досягнення цього критичного негативного гідростатичного тиску на мембрані відбувається при більш низьких значеннях осмолярності, в порівнянні з електролітним середовищем, в силу не тільки більш високого рівня звільнення іонів к+, але й в силу виходу з клітин аніонів хлору.

Передінкубація еритроцитів в розчинах сахарози призводить до зменшення їх ізоосмотичної чуттєвості до переносу в 4,00 М розчин N30 (Мал. 3).

Одержані дані свідчать про те, що початкові стани сенсибілізації еритроцитів до охолодження та дії ГШ можуть бути пов’язані зі зміною структури білків ЦС, які протидіють стискуванню. На відміну від ГШ, появлення у еритроцитів чутливості до охо-‘ лоджеиня є наслідком глибоких внутріклітинних змін, які можуть бути пов’язані і з порушенням іонного гомеостазу клітини. Однак, конкретний характер розвитку сенсибілізованого стану еритроци-. тів до дії X та ГШ обумовлений видовою належністю клітин.

ВПЛИВ МОДИФІКАЦІЇ СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНОГО СТАНУ КАПНОФОРІНУ НА ХОЛОДОВУ ТА ОСМОТИЧНУ ЧУТЛИВІСТЬ ЕРИТРОЦИТІВ ЛЮДИНИ ТА ЩУРІВ. Холодова та осмотична чутливість еритроцитів може контролюватися, принаймні, двома групами процесів: 1. Процесами, які зв’язані зі зміною характеру взаємодії білків ЦС між собою та компонентами ПМ на етапі передшкубації: 2. Процесами, які зв’язані зі

9а

змінами, що розвиваються в клітині безпосередньо при переносі її в нові температурні або осмотичні умови, коли відбувається зрив вихідної метастабільності клітини. Ця група процесів може відігравати важливу роль в умовах, коли руйнування клітин при зміні умов середовища <не зв’язана з їх вихідною метастабіль-містю, наприклад, при переносі клітин в 4,00 М розчин NaCl із середовищ з осмолярністю, близькою до фізіологічної [Рамазанов В. В., 1994]. В цьому випадку, зміни асоціації компонентів ЦС з ПМ можуть бути пов’язані з фазою швидкої зміни об’єму клітин під час переходу в нові осмотичні умови. При' цьому, амплітуда «об’ємного здвигу» мінімальна при величинах осмолярності 400—500 та 800—900 мОсмоль для розчинів сахарози та NaCl, відповідно, коли завершується об’ємна, але «є розвивається структурна дегідратація клітини, яка індукує її вихідну метастабіль-ність. В цьому випадку, виникає динамічно стійкий стан клітин, зв’язаний з осмотично індукованим включенням «'структурного механізму», в основі якого може лежати порушення взаємодій спек-тріну з ліпідним біша-ром мембрани, опосередкованих анкіріном, або білком смуги 4.1.

Таким чином, різниця між X та ГШ полягає в природі процесів, що модифікують стан еритроцитів в перехідній фазі. Якщо перехідна фаза у випадку ГШ — миттєве стиснення еритроцитів в умовах ізотермії, то перехідна фаза ХНІ — термотропні структурні перебудови, які відбуваються в комплексі ЦС—ПМ.

Оскільки провідна .роль в контролі стану білків ЦС та характеру їх взаємодій з компонентами ПМ належить капнофорІяу [Каззенов А. М. и со авт., 1987, 1991], який контролює також аніонний та водний транспорт, треба чекати, що зміни структурно-функціонального стану цього білка можуть суттєво змінити чутливість клітин до температурних та осмотичних впливів.

Обробка еритроцитів людини інгібітором аніонного транспорту — S1TS призводить до зменшення чутливості клітин до дії ХШ не тільки в розчинах сахаїрози, але н в гіперосмотичних розчинах NaCl. Під впливом SITS зменшується чутливість еритроцитів людини до переносу в 2,00 М .розчин NaCl, але зростає їх ізоосмотична чутливість до переносу в 4,00 М розчин NaCl. Інгібіругочий вплив SITS на розвиток ХШ еритроцитів в розчинах NaCl та сахаїрози; різноснрямована його дія на чутливість клітин до дії ГШ в залежності від осмолярності середовища пе-;реді«кубації указує на те, що процеси, які пов’язані з перерозподілом між клітиною та середовищем аніонів хлору та катіонів калію, не являються головними факторами, що контролюють зміну осмотичної та температурної чутливості еритроцитів. Таким чином, модифікуючий вплив SITS на чутливість еритроцитів до дії X та ГШ може бути пов’язаний з його впливом на структуру комплексу ЦС—ЛМ, оскільки лід час взаємодії SITS з капнофо-ріном, змінюється характер взаємодії аніонного переносника

з ліпідами бішару, зростає чисельність зв’язків білка-3 з ГАФДҐ та з спектрін-актиновим комплексом, посередником в яких є ан-кі’рін [Hsu L., 1983; Cl'ague М. J. et al,, 1989].

Додаткова модифікація структурно-функціонального стану еритроцитів людини діпіридамолом, котрий як і SITS, збільшує кількість зв’язків у ланцюзі спектрін—анкірін—капнофорін, підвищує спорідненість капнофоріну до ГАФДГ та збільшує рівень внутріклітинного ДФГ [Eaton J. N. et al., 1980; Lowe A. G., et al., 3983], справляє менш виражений, в порівнянні з SITS, інгібіру-ючий ефект на розвиток ХШ, але більш виражений сенсибілізуючий вплив на ізоосмотичну чутливість клітин до переносу в 2,00 М та 4,00 М розчини NaCl.

Таким чином, регуляція реакційної здібності еритроцитів людини осмотичними та температурними факторами середовища передінкубації може бути пов’язана і з метаболічним контролем стану комплексу ЦС—ПМ, що відбувається на рівні структурних взаємодій капнофаріну з ферментами гліколізу (ГАФДГ, ФГК). і

Обробка еритроцитів людини лідокаїном, що підвищує текучість ліпідного бішару, послабляє зв’язки у ланцюзі спектрін— анкірін—капнофорін, та заважає безпосереднім контактам спектрін у з фосфоліпіДами бішару [Nishiguchi Е. et al., 1993; Fuller G. M. et al., 1994], призводить до зменшення чутливості клітин до дії X та ГШ. При цьому, інгібіруюча дія лідокаїну на холодову чутливість еритроцитів виражена менш, чим SITS, та подібна впливу діпіридамолу, тобто відбувається зміщення критичної області осмолярності, при переході через яку клітини ви-яляються сенсибілізованими до охолодження, в бік більших величин. Однак, «а відміну від SITS та діпіридамолу, які справляють інгібіруючий вилив на зміни об’єму еритроцитів та збільшують ізоосмотичну чутливість клітин до дії ГШ (4,00 М NaCl), під виливом лідокаїну еритроцити втрачають не тільки здатність до неідеальної осмотичної поведінки, але ії високу ізоосмотичну чутливість до переносу в 4,00 М розчин NaCl.

Температурна модифікація (+49°С) стану еритроцитів людини, яка супроводжується денатурацією анкіріну [Лапшина Е. А., Заводник И. Б., 1993] також призводить до зменшення ізоосмотичної чутливості клітин до дії ГШ, втрати неідеальної осмотичної поведінки, але не справляє суттєвого впливу на чутливість еритроцитів ^до охолодження. Подібний вплив температурна інкубація при -j-49°C справляє і на чутливість еритроцитів щурів до дії X та ГШ. Таким чином, порушення опосередкованих анкіріном взаємодій спектрін-актинової сітки з капнофо-ріном не справляє суттєвого впливу на чутливість клітин до охолодження, але відіграє важливу роль в «осмотично індукованому механізмі» збільшення стійкості клітин до дії ГШ (4,00 М) по

мірі збільшення тонічності середовища передінкубації до 0,35— 0,45 та 0,40—0,50 Моль/л NaCl та сахарози, відповідно.

Вплив же SITS, діпіридамолу та лідокаїну на осмотичну та температурну чутливість еритроцитів щурів має ряд особливостей. На відміну від еритроцитів людини, більш виражений модифікуючий вплив на чутливість клітин до дії X та ГШ справляє не SITS, а діпіридамол та лідокаїн. При цьому, характер зміни осмотичної та температурної чутливості клітин як модифікованих, так і нативних, корелює «е тільки зі зміною їх механічної чутливості, але і з характером зміни проникності мембрани для іонів К+ та зміною внутріклітинного pH. Таким чином, на відміну від еритроцитів людини, структурні механізми контролю реакційної здатності еритроцитів щурів більш тісно пов’язані з метаболічним статусом клітини, станом ліпідів бішару, а також з функціонуванням систем транспорту іонів, які регулюють об’єм клітини.

В основі механізму сенсибілізації еритроцитів людини та щурів лежить єдиний механізм, пов’язаний зі станом комплексу ЦС—'ПМ. На рівні структурних взаємодій капнофоріну з ферментами гліколізу (ГАФДГ, ФГК), білками ЦС (білками смуг 2.1 та 4.1) і ліпідами бішару може здійснюватися координація існуючих в клітині власних структурних, функціональних та метаболічних механізмів контролю її реакційної здібності.

висновки

її. Характер реакції еритроцитів «а зміну осмотичних та температурних умов середовища вказує «а існування в цих клітинах специфічних та неспецифічних механізмів, які контролюють спрямованість та глибину розвитку їх відповідних реакцій на дію зовнішніх факторів.

2. Механізми, що забезпечують реакції клітин на зміну зовнішніх умов, контролюються такими факторами середовища як температура та осмолярність, однак їх проявлення залежить від структурно-функціонального стану клітини та, в значній мірі, детерміновано віком організму.

3. Зміни структурно-функціонального стану еритроцитів, що відбуваються на різних етапах життєвого циклу організму, виявляються в зміні чутливості цих клітин до механічних, осмотичних та температурних впливів.

4. Для зміни різних параметрів структурно-функціонального стану еритроцитів в процесі розвитку та старіння організму експериментальних тварин відмічається відсутність не тільки прямолінійного характеру, але й односпрямованості. Незважаючи на те, що відмічається кореляція в зміні параметрів еритроцитів 1- та 24-місячшіх щурів по відношенню до показників еритроцитів

8-місячних тварин, з одного боку, і еритроцитів 3- та 12-місяч-них щурів, з другого, ці зміни мають різний зміст та гєнез.

б. Структурною основою механізму, який контролює в умовах дегідратації чутливість еритроцитів до дії X та ГШ є зміна характеру асоціації білків ЦС між собою та компонентами ПМ.

6. Аналіз впливу температурних та осмотичних умов середовища на стан комплексу ЦС—ТІМ, вказує на втягненая в процес зміни структурно-функціонального стану ‘капнофоріну, який контролює аніонний та водний транспорт, а також стан комплексу ЦС—ПМ.

7. Модуляція структурних взаємодій капнофоріну з ферментами гліколізу (ГАФДГ, ФГК), ліпідами бішару та білками ЦС (білками смуг 2.1 та 4.1) є фактором, що здатний здійснювати координацію структурного, функціонального та метаболічного механізмів регуляції реакції еритроцитів на осмотичні та температурні дії.

8. Виявлені відмінності в механічній, осмотичній та температурній чутливості нативни.х та модифікованих SITS, діпіридамо-лом та лідокаїном еритроцитів людини та щурів можуть бути обумовлені не тільки видовими особливостями оранізації комплексу ЦС—іПМ, механізмів активації транспорту іонів при зміні об’єму клітини, але й особливостями інтеграції процесів, які формують загальний механізм контролю іонного гомеостазу еритроцитів людини та щурів.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ПО ТЕМІ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Федосова С. Н. Модифицирующее действие курантила на развитие холодового и гиперосмогического шока эритроцитов в растворах электролитов// ВИНИТИ. Депонированные научные работы. — 1994. — № 94-УК-94.

2. Федоссва С. //. Модифицирующее влияние курантила на температурную, осмотическую и механическую чувствительность эритроцитов в растворах неэлектролитов//ВИНИТИ. Депонированные научные работы. — 1994, — № 90-УК-94.

3. Федосова С. //., Божок Г. А. «Печать» возраста организма на осмотическом поведении эритроцитов//Биологическне механизмы старения. Симпозиум. Тез. докл. — Харьков, 1994. — С. 153.

4. Федосова С. М., Кудокоцева О. В. Курантил як модифікатор температурної та осмотичної чутливості еритроцитів людини в розчинах неелектро-літів//В зб.: Сучасні проблеми фармації. Тез. доп. респ. наук, практ. конф. — Харків. 1994. — С. 15.

5. Федосова С. Н. Модифицирующее влияние лидокаина на температурную, осмотическую и механическую чувствительность эритроцитов человека и крысы// Тез. докл. науч. конф. мол. уч. биол. ф-та и НИИ биол. ХГУ. — Харьков. — 1994. — С. 43.

Федосова Светлана Николаевна. Факторы, контролирующие чувствительность эритроцитов к осмотическим и температурным воздействиям.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13 — Физиолошя человека и животных. Харьковский государственный университет, Харьков, 1994.

Исследовалось влияние температурных и осмотических условий среды предияку-бащии, фармакологических препаратов, возраста организма- на чувствительность эритроцитов человека и крысы к действию холодового* и гиперосмотическото шока. Установлено, что механизмы, лежащие в основе реакционной способности клетки, контролируются такими факторами среды как температура и осмолярноеть, однако проявление этих механизмов детерминировано возрастом организма и зависит от исходного состояния клетки. Делается вывод о том, что на уровне структурные взаимодействий капнофор-ина с ферментами гликолиза (ГАФДГ, ФГК), белками цитоскелета (белками полос 2.1 и 4.1) и липидами бислоя может осуществляться координация существующих в клетке 'собственных структурных, функциональных и метаболических механизмов контроля ее реакционной способности. Выявленные различия в осмотической, механической и температурной чувствительности нативных и модифицированных SITS, дипиридамолом и лидокаином эритроцитов человека и крысы могут быть обусловлены не только видовыми различиями структурной организации комплекса цитоскелет—мембрана, особенностями механизмов активации транспорта ионов при изменении объема- клетки, но и особенностями самих механизмов контроля ионного гомеостаза эритроцитов человека- и крысы.

.1,

Fedosova Svetlana Nicolajevna. The factors that control the sensitivity of erythrocytes to osmotic and temperature influences.

The thesis on competition for scientific degree of candidate of biological science on speciality 03.00.13 — Human and animal physiology. Kharcov State University, Kharcov, 1994.

-The influence temperature and osmotic -condition of preincubation, pharmacologic preparation and age of organism on sensitivity of human and rat erythrocytes to action of cold and osmotic shock have been studed.

It has been shown that mechanisms underlaying the cell reactivity may be controlled by such parameters of mediun as temperature and osmolarity, none the less display of these mechanisms was determined by age of organism and depended on initial state of cell. It has been concluded that structural, functional and metabolic mechanisms of regulation of cell reactivity may be co-ordinated by the structural interections of capnophorine with

glycolytic enzymes (PGK, GAPDN), cytoskelelon proteins {protein band 4.1 and ankyrin) and lipid bylayer. The revealed distinction of temperature and osmotic sensitivity of native and mo-dificated by SITS, di'pyridamol and lidocain human and rat erythrocytes may be determined not only by structural differences of cytoskeleton — membrane -complex; activation mechanism peculia-rites of the ion transport in the process of cell volume change, but also by control mechanism peculiarites of the ione homeostasis of human and rat erythrocytes.

КЛЮЧОВІ СЛОВА: еритроцит, плазматична мембрана (ПМ), цитоскелет (ЦС), капнофорін, аякірін, гліцероальдепд-3-фосфат-дегідрогеназа (ГАФДГ), фосфогліцераткіназа (ФГК), 2,3-дифос-фогліцерат (ДФГ), холодовий шок (ХШ), гіперосмогичний шок (ГШ), діліридамол, лідокаїн, 4-ацетамідо-4’-ізотіоцианостильбеп-2,2-дисульфонат (SITS).