Фактор VIII

Саенко, Евгений Львович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Фактор VIII
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Фактор VIII"

На правах рукописи

Саенко Евгений Львович

ФАКТОР VIII: БИОХИМИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 6 ДПРШ

Москва 2012

005019261

Работа выполнена в Центре Теоретических Проблем Физико-Химической Фармакологии РАН

Научный консультант:

Атауллаханов Фазоил Иноятович, доктор биологических наук, профессор, директор ЦТП ФХФ РАН

Официальные оппоненты:

Васильев Сергей Александрович, докто медицинских наук, профессор, заведующи научно-клинической лабораторие

клинической коагулологш

Гематологический научный центр МЗСР РФ

Ягужинский Лев Сергеевич, докто биологических наук, профессор, заведующи лабораторией структуры и функци биологических мембран, Научнс исследовательский институт физике химической биологии им. А.Н. Белозерскогс МГУ

Дудченко Александр Максимович, докто медицинских наук, заведующи

лабораторией функциональной геномики липидомикк, ФГБУ Научнс

исследовательский институт обще патологии и патофизиологии РАМН

Ведущее учреждение: ФГБУ «ФНКЦ детской гематологи!

онкологии и иммунологии им. Дмитри Рогачёва» Минздравсоцразвития РФ

Защита состоится 2012 г. в часовой минут на заседали

диссертационного совета Д208.135.02 по защите докторских диссертаций пр ФГБУ «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения социального развития РФ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Гематологического научног центра МЗСР РФ по адресу: г. Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4.

Автореферат разослан

"УЗг " 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Зыбунова Елена Евгеньевна

Актуальность темы. Фактор VIII (FVIII) является критически важным белком системы свёртывания крови. Генетический дефицит или дефект фактора VIII является причиной гемофилии А, наиболее распространенного наследственного заболевания свёртывания крови, поражающего одного из 5000 мужчин. Болезнь сопровождается тяжелыми кровотечениями, нередко со смертельным исходом, и спонтанными кровоизлияниями в суставах [Plug et al. 2006]. Изучение молекулярных механизмов ключевых взаимодействий FVIII с компонентами системы свёртывания крови, несомненно, является фундаментальной задачей биохимии человека. В настоящей работе были исследованы молекулярные механизмы принципиально важных взаимодействий FVIII на разных стадиях его жизненного цикла. В частности, мы установили механизм взаимодействия FVIII с фактором фон Виллебранда (vWf), происходящего сразу же после секреции FVIII в кровоток и критически важного для выживания FVIII в циркуляции, механизмы активации FVIII тромбином и активированным фактором X (FXa), а также механизмы протеолитической инактивации FVIII активированным протеином С (АРС) и плазмином. Мы также впервые установили механизм рецептор-опосредованного клиренса FVIII из кровотока, идентифицировали сайты и критически важные аминокислотные остатки FVIII и рецептора, участвующие во взаимодействии.

Главным способом лечения гемофилии А является заместительная терапия больных гемофилией А концентратами FVIII, приготовленными из плазмы крови доноров, или более безопасными и современными, но весьма дорогостоящими, рекомбинантными препаратами FVIII [Lee 2002]. Наиболее обещающим подходом для увеличения эффективности и доступности терапии гемофилии А является создание рекомбинантного полноразмерного FVIII со свойствами, улучшенными по сравнению с природным диким типом. Полученные нами фундаментальные данные о расположении функционально важных сайтов FVIII создают основу для модулирования ключевых взаимодействий FVIII в направлении увеличения времени жизни в кровотоке, большей чувствительности FVIII к активации, большей стабильности активированной формы FVIII и её большей устойчивости к протеолитической инактивации. В свою очередь, модулирование ключевых биохимических взаимодействий FVIII перспективно для создания терапевтических препаратов FVIII нового поколения.

Цель работы. Изучить критически важные молекулярные механизмы, ответственные за поддержание уровня FVIII в кровотоке, его функциональную активность, инактивацию и клиренс из циркуляции. Задачи исследования:

1. Установить молекулярные механизмы связывания FVIII с vWf и диссоциации этого комплекса в результате протеолитической активации.

2. Изучить молекулярные основы узнавания и протеолиза FVIII важнейшим физиологическими активаторами - тромбином и фактором Ха.

3. Определить механизмы протеолитической инактивации FVIJ активированным протеином С и плазмином и регулирования этих процессо протеином S и vWf.

4. Установить важнейшие эпитопы связывания гемофилийны ингибиторных антител на молекуле FVIII и механизмы ингибировани функциональной активности FVIII.

5. Изучить молекулярный механизм рецептор-опосредованного клиренс FVIII из кровообращения.

Научная новизна. Установлены молекулярные механизмы, взаимодействия FVI] с важнейшими физиологическими лигандами на различных стадиях его жизни - с секреции в кровоток до клиренса из циркуляции. Эти механизмы определяю поддержание уровня FVIII в кровотоке, его протеолитическую активации инактивацию и клиренс из циркуляции. В частности, были локализованы сайт) FVIII, отвечающие за связывание FVIII с vWf, необходимое для защиты FVIII о протеолитической деградации, преждевременного связывания с фосфолипидами клиренсными рецепторами. Изучение механизма активации FV1II, необходимог для диссоциации его комплекса с vWf, позволило установить молекулярны механизмы взаимодействия FVIII с двумя важнейшими протеазами-акшваторам1 фактором Ха и тромбином. Были локализованы сайты связывания тромбина и FX на молекуле FVIII и идентифицированы отдельные аминокислоты в этих сайта; играющие ключевую роль в связывании.

В ходе изучения молекулярных механизмов инактивации FVIII нами был впервые показано, что протеин S, являющийся классическим кофакторо активированного протеина С, способен ингибировать функциональную активное! FVIII путём ингибирования связывания FVIII с активированным фактором Г (FIXa) в теназном комплексе. Эта способность протеина S определяете перекрыванием сайта связывания FIXa и идентифицированного нами сайт связывания протеина S на молекуле FVIII. Нами был открыт и ещё один механиз регулирования протеолитической инактивации FVIII, обусловленный прямо конкуренцией vWf и активированного протеина С (АРС) за общий сайт связывани на молекуле FVIII.

Поскольку серьезным осложнением при заместительной терапии гемофили А является образование антител, связывающих FVIII и ингибирующих ег функциональную активность, мы установили важнейшие эпитопы связывай* антител больных гемофилией А на молекуле FVIII и установили молекулярнь: механизмы инактивации FVIII этими антителами.

Одним из ограничений заместительной терапии при лечении гемофилии А является относительно короткое время полужизни БУШ. Мы изучили механизмы, отвечающие за регулирование уровня РУШ в кровотоке и определяющие клиренс РУШ из циркуляции. Открытие молекулярных основ этого метаболического пути РУШ позволило разработать концепцию создания рекомбинантного РУШ с улучшенными фармакокинетическими характеристиками для более эффективной терапии гемофилии А.

Научно-практическое значение. Главное направление лечения гемофилии А -заместительная терапия, заключающаяся в периодическом введении дорогостоящих концентратов РУШ, которые получены либо из плазмы крови доноров, либо рекомбинантным путём. Поскольку в настоящее время наблюдается устойчивый сдвиг в сторону использования в клинике более безопасных рекомбинантных препаратов РУШ, стоимость которых выше препаратов РУШ из плазмы крови, возникает необходимость создания препаратов РУШ нового поколения с повышенной терапевтической эффективностью. Наши исследования, в ходе которых были впервые установлены молекулярные механизмы и важнейшие сайты РУШ, ответственные за его активацию, стабильность, инактивацию и клиренс из циркуляции, служат основой для создания РУШ, обладающего улучшенными терапевтическими свойствами. Такой РУШ необходим для улучшения качества и удешевления терапии больных гемофилией А. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Локализованы сайты РУШ, ответственные за связывание с и установлены механизмы образования комплекса РУШ с у\У£, а также механизмы диссоциации комплекса при его активации и последующего связывания РУШ с фосфолипидом.

2. Локализованы сайты связывания РУШ, участвующие во взаимодействии с важнейшими активаторами — тромбином и активированным фактором X и установлены соответствующие молекулярные механизмы активации

3. Установлены новые механизмы, регулирующие инактивацию РУШа, такие как непротеолитический механизм инактивации РУШа протеином Б, протеолитическая инактивация плазмином, а также прямое vWf-зaвиcимoe регулирование инактивации РУШ активированным протеином С.

4. Определены важнейшие эпитопы РУШ, связывающие различные классы ингибиторных антител больных гемофилией, и установлены механизмы инактивации РУШ этими антителами.

5. Установлен механизм клиренса РУШ из кровотока, опосредованный рецепторами семейства рецепторов липопротеинов низкой плотности, и установлены механизмы контроля уровня и активности РУШ четырьмя различными рецепторами этого семейства.

Апробация работы. Работа прошла апробацию 14 февраля 2012 г. на заседали межлабораторного семинара Центра теоретических проблем физико-химическо фармакологии РАН.

Материалы диссертации доложены автором на следующих конференциях съездах: XVIth Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasi: Florence, Italy, June 6-12, 1997; 41st Annual Meeting of the American Society с Hematology, New Orleans, Louisiana, USA, December 3-7, 1999; XVIIth Congress с the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Washington, DC, US/ September 15-21, 1999; International Congress on Thrombosis, Porto, Portugal, May 5-i 2000; XVIII Congress of the International Society of Thrombosis and Haemostasis, Pari; France, July 6-12, 2001; XXV International Congress of the World Federation с Hemophilia, Seville, Spain, May 19-24, 2002; XXXV Nordic Conference о Coagulation, Reykjavik, Iceland, August 10-13, 2002; XIX Congress of the Internatiom Society of Thrombosis and Haemosytasis, Birmingham, UK, July 12-18, 2003; 45 Annual Meeting of the American Society of Hematology, San Diego, CA, December 6-i 2003; Hemophilia 2004 World Congress, Bangkok, Thailand, October 17-21, 2004; Fift Bari Interantional Conference on Hemophilia and Allied Disorders, von Willebran Factor and Platelet Glycoproteins, Pizzomunno, Vieste del Gargano, Italy, May 22-2Г 2005; XXth Congress of International Society of Thrombosis and Haemostasis, Sydney Australia, 5-13 August, 2005; 47th Annual Meeting of the American Society с Hematology, Atlanta, Georgia, USA, December 10-13, 2005; State of the Ai International Symposium on Pharmacokinetics of Factor Concentrates in Hemophili. Toronto, Canada September 29-30, 2005; 36th Haemophilia Symposium, Hamburg Germany, November 18-19, 2005; XXth Hemophilia Forum, Telfs, Austria, 16-19 Marcl 2006.

Публикации. По материалам диссертации опубликована 91 работа, в том числе 6 статей в реферируемых научных изданиях и 31 работа в материалах конференций съездов.

Личное участие автора в получении результатов. Автором полносты выполнены эксперименты по изучению взаимодействия FVIII с фактором фо Виллебранда, синтетическими фосфолипидами и тромбоцитами. Автором был проведены эксперименты по картированию эпитопов ингибиторных антитед выделенных из крови больных гемофилией А, установлению механизме ингибирования активности FVIII этими антителами, а также по изучению влияни мутаций в молекуле FVIII на время полужизни активированной формы FVII Сайты связывания тромбина, фактора Ха, плазмина, протеина С и S был установлены и охарактеризованы в ходе совместных исследований автора группой учёных Медицинского Университета города Нара, Япония. В эти исследованиях автор провёл измерения кинетики ключевых белок-белковы

взаимодействий в реальном времени методом плазмонового резонанса. В ходе изучения рецептор-опосредованного клиренса FVIII автор руководил группой сотрудников и разрабатывал дизайн всех экспериментов. Кроме того, на начальной стадии этих исследований автором были проведены ключевые эксперименты, показывающие, что гепато-рецептор (LRP) из семейства рецепторов липопротеинов низкой плотности связывает FVIII в очищенной системе и осуществляет его эндоцитоз и клиренс in vitro и in vivo.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 303 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырёх глав, 27 таблиц, 84 рисунков, выводов и библиографического указателя, включающего 346 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении показана важность исследуемой темы для понимания гемостаза и для лечения гемофилии А, сформулированы цели и задачи и дана общая характеристика работы.

Глава 1 посвящена обзору литературы. В этой главе описаны внешний и внутренний пути гемостаза и показано, почему отсутствие или дефект FVIII приводит к нарушению свёртываемости крови - гемофилии А. Проводится обзор методов лечения больных гемофилией А, главным из которых в настоящее время является заместительная терапия путём повторных внутривенных инъекций препаратов FVIII, полученных из плазмы крови или рекомбинантным путём. Поскольку одним из наиболее серьёзных осложнений при заместительной терапии FVIII является образование ингибиторных антител к FVIII примерно у 30% больных гемофилией А, в главе 1 были рассмотрены иммунологические механизмы формирования ингибиторных антител к FVIII и подходы к лечению пациентов с ингибиторами FVIII.

Обсуждены основные аспекты биологии FVIII: структура FVIII и его связывание с vWf, активация FVIII и сборка теназного комплекса, значение центрального В домена FVIII для поддержания уровня и функциональной активности FVIII в плазме крови, стабильность активированного FVIII, непротеолитический и протеолитический механизмы инактивации теназного комплекса. Поскольку в настоящей работе была впервые установлена роль рецепторов из семейства LDL в регулировании уровня и активности FVIII кровообращении, нами проведён обзор семейства LDL рецепторов и их лигандов.

На Рис. 1 показана доменная структура нативного FVIII и его активированной формы, играющей ключевую роль в активации фактора X во внутреннем пути свёртывания крови.

NH,

CI 1 C2 I COOH

372 740 1649 1689 2019 2173 2332

Тромбин или FXa

373

740

372 1690,1722

•Me?---

2332

CI C2

50 kDa

73 kDA

Рис. 1. Структура FVIII и его активированной формы. FVIII, гликопротеин с молекулярной массой около 300 кДа, состоит из трёх гомологичных А доменов, двух гомологичных С доменов и уникального центрального В домена. Тяжелая цепь FVIII, состоящая из А1-А2-В доменов, и лёгкая цепь из АЗ-С1-С2 доменов соединены через ион металла. Для выполнения своей роли кофактора активированного фактора IXa, FVIII должен быть протеолитически активирован тромбином или активированным FX. Активированный FVIII является гетеротримером (А1/А2/АЗ-С1-С2), в котором А1 домен и активированная лёгкая цепь (АЗ-С1-С2) сохраняют прочную связь через ион металла, а димер А1/АЗ-С1-С2 удерживает А2 за счёт непрочных ионных взаимодействий.

Из Рис. 2 следует, что FVIII является ключевым компонентом свёртывани.. крови, так как по внутреннему пути, включающему активированный FVIII, F' активируется примерно в 50 раз эффективнее, чем по внешнему пути.

В главе 2 описаны материалы и методы работы, в том числе методг выделения белков из плазмы крови и из других источников, методы экспрессии т очистки рекомбинантных белков, методы исследования белок-белковог взаимодействия, локализации эпитопов антител, исследования кинетики реакци протеолитической активации FVIII, протеолитической и непротеолитическо инактивации, кинетики эндоцитоза FVIII в клеточных моделях in vitro и in vivo мышах.

Приводится описание очистки и характеризации фактора фон Виллебранд^ приготовления и очистки его протеолитических фрагментов. Описан иммуноаффинная очистка FVIII и приготовление его важнейших субъединиц фрагментов. Были использованы следующие важнейшие методы экспериментальные процедуры: приготовление синтетических пептидо (состоящих из последовательностей FVIII) с помощью пептидного синтезатор 9050 Milligen (Millipore, USA), изучение белок-белковых взаимодействий { реальном времени с помощью плазмонового биосенсора Biacore 3000 (Biacore, Sweden), приготовление фосфолипидных везикул, меченых биотином, и и иммобилизация на коммерческих чипах, покрытых биотином (Amersham Pharmaci

Biotech, Sweden), приготовление ангидро-тромбина и ангидро-FXa, представляющих собой каталитически неактивные производные тромбина и FXa.

Внешний путь, TF-зависимый комплекс

Внутренний путь, Теназый комплекс

0> IX"

Viii«; I ю» *

(г

в 50-раз эффективнее

Протромбиназный комплекс

Рис. 2. Роль внутренней теназы в кровесвёртывании. РХ активируется примерно в 50 раз эффективнее по внутреннему пути теназным комплексом, состоящим из связанных на фосфолипиде активированного Р1Х и активированного П/Ш. который является кофактором Р1Х и ускоряет реакцию активации РХ примерно в 100 раз. В свою очередь, активированный РХ в протромбиназном комплексе активирует протромбин в тромбин, являющийся ключевым ферментом свертывания крови.

Описано получение рекомбинантных белков и их мутантов, использованных в работе. Рекомбинантный дикий тип А2 домена (\vt-A2) и панель А2 мутантов были сконструированы и экспрессированы с помощью бакуловирусной системы. Белок был экспрессирован в клетках насекомых (819) и очищен с помощью иммуноаффинной хроматографии. Варианты С2 домена, содержащие амино-терминальные, карбокси-терминальные и внутренние делеции экспрессировали в Е.соИ и работали с экстрактами клеточной среды.

Мутагенез РУШ проводили, используя экспрессионный вектор рМТ2, содержащий ДНК РУШ. Мутированные и разрезанные по требуемым сайтам фрагменты были легированы в конструкцию РУШ с удалённым В доменом (ВОО-РУШ). Клетки обезьян С08-1 были трансфецированы плазмидами ВГЮ-РУШ, В00-01и69411е, BDD-Arg698Leu, BDD-Arg698Trp, ВОО-А^'Шэ, В00-Л1а28401и, ВОВ-А1а289Ьеи с помощью диэтил-аминоэтилдекстранового метода. Конструирование гибридных форм РУШ, содержащих свиные последовательности, производилось на базе ВВО-РУШ. Картирование эпитопов антител с помощью пептидных библиотек проводилось с помощью пептидного набора фаговых

дисплеев Ph.D.-7 (New England Biolabs, USA), представляющего собой библиотек случайных гептамеров.

Описано также получение четырёх использованных в работе рецепторов и семейства рецепторов липопротеинов низкой плотности (LDL). Рецептор LRP бы выделен из человеческой плаценты, растворимая форма человеческого VLDL1 была получена с помощью дрозофильной экспрессионной системы (Invitroger USA) и иммуноаффинно очищена, мегалиновый рецептор (gp330) был выделен и бычьих почек, а растворимая форма рекомбинантного человеческого LDLR был любезно предоставлена доктором Мертенсом (Coagulation Laboratory, Amsterdarr Netherlands).

Расчёт кинетических параметров из кинетических кривых, полученных реальном времени с помощью плазмонового биосенсора, проводился согласн одно- или двух- сайтовой модели связывания с помощью компьютерных nporpaMi Ligand, Sigmaplot 1.02, Sigmaplot 3.0 и Sigmaplot 8.0 (Systat Software, USA).

Глава 3 содержит результаты работы и их обсуждение.

3.1. Молекулярные основы взаимодействия FVIII с vVVf и фосфолипидами.

3.1.1. Локализация центра связывания фактора фон Виллебранда н факторе VIII. Для поддержания нормального уровня фактора FVIII в кровоток необходимо образование его комплекса с vWf, происходящее сразу после секреци FVIII в кровоток и предотвращающее связывание FVIII с фосфолипидами. 1 процессе коагуляции комплекс протеолитически активируется, FVIII диссоциируе с vWf и участвует в сборке теназного комплекса, активирующего фактор X. 1 началу наших исследований сайты FVIII, вовлечённые в связывание с vWf, механизм диссоциации FVIII с vWf после активации комплекса не был установлены. Мы показали, что экспрессированный нами рекомбинантный С домен FVIII (остатки 2170-2232) связывается с vWf. Поскольку синтетически пептид 2303-2332, задающий ранее локализованный фосфолипид-связывающи сайт С2 домена, в отличие от контрольных пептидов, ингибировал связывани FVIII с vWf (Рис. 3), мы заключили, что взаимоисключающее связывание FVIII vWf и фосфолипидами обусловлено вовлеченностью аминокислотных остатко 2303-2332 С2 домена FVIII в оба этих процесса. Таким образом, мы впервы показали наличие сайта связывания vWf на молекуле FVIII и объяснил молекулярный механизм конкуренции фосфолипида и vWf.

Рис. 3. Влияние синтетического пептида на связывание FVIII с vWf определенное методом ELISA. Возрастающие концентрации пептида были добавлены на этапе связывания FVIII с vWf. Связывание FVI1I в присутствии пептида выражено как процент связывания в отсутствии пептида. Символы на рисунке соответствуют пептидам из следующих областей FVIII:«, 2303-2332; о, случайный пептид из аминокислот 23032332; А, пептид 351-365, х, пептид 2218-2233.

3.1.2. Механизм ингибирующего действия vWf на связывание FVIII с фосфолипидами. Для определения минимальной структурной единицы vWf, способной блокировать связывание FVIII с фосфолипидами, мы приготовили минимальный протеолитический фрагмент vWf (остатки 1-272), способный связывать FVIII, и больший фрагмент vWf (остатки 1-1365).

Было обнаружено, что минимальный FVIII-связывающий фрагмент vWf (1272) способен полностью предотвращать взаимодействие FVIII с фосфолипидными поверхностями. Хотя больший по размеру фрагмент vWf (остатки 1-1365) также обладает этой способностью, остатки vWf 273-1365, очевидно, не являются необходимыми для защитного действия. Мы также показали, что минимальный FVIII-связывающий фрагмент vWf 1-272 узнает аминокислотную последовательность С2 домена FVIII, вовлеченную в связывание фосфолипида. Таким образом, vWf предотвращает взаимодействие FVIII с фосфолипидами в результате связывания сайта, образованного остатками 1-272 vWf, с фосфолипид-связывающим сайтом 2303-2332 С2 домена FVIII.

3.1.3. Роль области 1649-1689 легкой цепи FVIII в формировании сайта связывания для vWf. Для выполнения своей роли кофактора активированного фактора IX в теназном комплексе, FVIII должен быть протеолитически активирован. При активации FVIII тромбином или активированным фактором X

происходит удаление области 1649-1689 A3 домена FVIII, что приводит к резком; понижению аффинности FVIII по отношению к vWf, диссоциации комплекса FVII с vWf и последующему связыванию активированного FVIII на фосфолипидно1 поверхности [Lollar et al. 1988]. Важность области 1649-1689 для связывани: FVIII с vWf может быть объяснена либо тем, что эта область и сайт С2 домен; находятся в непосредственной пространственной близости и вместе образую' высокоаффинный центр связывания для vWf, либо тем, что область 1649-168! необходима для поддержания оптимальной vWf-связывающей конформации сайт; в С2 домене FVIII. Для того, чтобы определить истинный механиз« взаимодействия FVIII с vWf, мы приготовили протеолитические фрагмент! лёгкой цепи FVIII, позволившие разделить индивидуальные вклады области 1649 1689 и С2 домена в связывание FVIII с vWf. С помощью V8 протеазы из S. Аигеи был приготовлен протеолитический фрагмент, состоящий из аминокислотам остатков 1672-1794 A3 домена, и фрагмент, состоящий из остатков 1795-2332 i включающий в себя часть A3 домена и полностью С1 и С2 домены.

Фрагмент 1672-1794 связывается с vWf, хотя и с существенно более низко] аффинностью, чем FVIII. Удаление области 1672-1689 путем обработки фрагмент тромбином приводит к полной потере связывания этого фрагмента с vWf, чт доказывает участие области 1672-1689 FVIII в связывании с vWf. Фрагмент 1795 2332 также связывается с vWf с низкой аффинностью, в то время как реассоциаци фрагментов 1672-1794 и 1795-2232 восстанавливает аффинность полученног димера до аффинности FVIII. Исследование конформации С2 домена с помощь* конформационно-чувствительного антитела, узнающего область 2170-2327 С: домена FVIII, показало, что конформация С2 домена в этом фрагменте отличаете от конформации С2 домена в FVIII. Эти данные позволяют предположить, чт область 1672-1689 не только напрямую участвует в связывании vWf, но i требуется для поддержания оптимальной vWf-связывающей конформации сайта С2 домене, так как только в присутствии N-концевого фрагмента 1672-1794 фрагмент 1695-2332, содержащий С2 сайт, был способен связываться с vWf максимальной аффинностью. Мы также показали, что конформационны изменения в С2 домене, происходящие при протеолитической активации FVII! приводят к потере оптимальной конформации vWf-связывающего сайта в С домене и снижению аффинности активированного FVIII по отношению к v\V более чем в 1000 раз.

3.1.4. Влияние активации FVIII на его взаимодействие с vWf фосфолипидами. Поскольку после активации FVIII связывается на фосфолипиде мы изучили влияние конформационных изменений в С2 домене на аффинност FVIII по отношению к фосфолипидам. Поскольку С2 домен претерпевае информационные изменения при удалении области 1649-1689, мы использовал

производную FVIII, не содержащую эту область. Нами было обнаружено, что аффинность производной FVIII по отношению к синтетическим фосфолипидным везикулам и к активированным тромбоцитам примерно в 10 раз выше по сравнению с нативным FVIII. Эти данные позволяют сделать вывод о том, что удаление области 1649-1689 лёгкой цепи FVIII приводит к конформационным изменениям в С2 домене, выражающимся не только более чем в 1000-кратном уменьшении аффинности по отношению к vWf, но и в 10-кратном увеличении аффинности FVIII к фосфолипиду.

Мы показали, что увеличение аффинности FVIII к фосфолипиду при активации тромбином связано с конформационными изменениями в С2 домене. Нами была использована уникальная способность моноклонального антитела ESH8 фиксировать конформацию С2 домена. Как показано на Рис. 4, ранее установленный эпитоп ESH8 не является непрерывным и состоит из двух участков С2 домена, остатков 2227-2241 и 2259-2279 [Villard et al. 2001]. Связывание моноклонального антитела ESH8 с этими разными, но пространственно близкими участками С2 домена выражается в уникальной способности этого антитела блокировать конформацию С2 домена и полностью предотвращать конформационные изменения С2, вызванные удалением активационного пептида 1649-1689 (Рис. 4). В то же время антитело ESH8 не влияет на взаимодействие FVIII с vWf и фосфолипидом.

Мы установили, что когда конформация FVIIIa была зафиксирована антителом ESH8, его связывание с фосфолипидом характеризовалось аффинностью близкой к аффинности неактивированного FVIII. В то же время, аффинность активированного FVIII по отношению к фосфолипиду в отсутствие антитела ESH8 была в 10 раз выше, чем интактного FVIII. Таким образом, конформационные изменения, происходящие в С2 домене при активации FVIII ведут к уменьшению его аффинности по отношению к vWf на три порядка и к увеличению сродства к фосфолипиду на один порядок.

3.2. Молекулярные основы взаимодействия FVIII с физиологическими активаторами — тромбином и активированным фактором X.

3.2.1. Локализация сайтов связывания тромбина, ответственных за активацию фактора VIII. Активация FV1II тромбином является важнейшим механизмом регулирования внутреннего пути свертывания крови. При протеолизе, катализируемом тромбином, по остаткам Arg740, Arg372 и Arg1689 FVIII превращается в активную форму (FVIIIa) [Eaton et al. 1986]. Сайты связывания тромбина, ответственные за два важнейших места расщепления на молекуле FVIII по остаткам Arg372 и Arg1689 , не были прежде известны. Как было показано в

разделе 3.1, протеолиз FVIII по Arg1689 приводит к быстрой диссоциации FVIII из его комплекса с vWf и последующему связыванию с фосфолипидом. Мы установили, что С2 домен FVIII содержит сайт связывания тромбина, ответственный за протеолиз по Arg1689. Исходной точкой в исследовании послужило наблюдение, что антитело, узнающее С2 домен FVIII, подавляет тромбин-катализируемый протеолиз FVIII по Arg'689.

Рис. 4. Конформация С2 домена FVIII была зафиксирована антителом ESH8 с эпитопом, состоящим из остатков С2 домена 2231-2248 и 2269-2274. Это антитело препятствует изменению конформации С2 при удалении активационного пептида аЗ (1649-1689), сохраняя vWf-связывающую конформацию С2. В отсутствии антитела ESH8 конформация С2 изменяется, что сопровождается уменьшением его аффинности к vWf и возрастанием аффинности к фосфолипиду (PL).

Для того чтобы исследовать взаимодействие между FVIII и тромбином, мь использовали тромбин с модифицированным активным центром (ангидро-тромбин). Ангидро-тромбин был иммобилизован на пластике и последующее связывание фрагментов FVIII с ангидро-тромбином было детектировано е помощью ELISA. Было показано, что С2 и А2 домены связывались с ангидро тромбином. Эти данные означают, что тромбин имеет как минимум два сайт; связывания на молекуле FVIII, один из которых расположен в С2 домене, а другоГ в А2 домене. Поскольку предотвращение связывания тромбина с С2 доменом нь вело к уменьшению скорости расщепления по Arg372 в FVIII, мы заключили, чт< связывание тромбина на сайте С2 домена отвечает только за протеолиз по Arg1689.

Нами были предприняты попытки локализации сайта связывания тромбина А2 домене, ответственного за протеолиз FVIII по Arg372. Было обнаружено, чп моноклональное антитело 413 с эпитопом в области 484-509 блокирует связывание А2 домена с тромбином (Рис. 5). Это означает, что эпитоп антитела 413

перекрывается с центром связывания тромбина. Мы также проверили способность синтетического пептида 484-509 ингибировать связывание А2 домена с ангидро-тромбином. Как видно из Рис. 5, пептид 484-509 частично ингибировал связывание А2 домена с ангидро-тромбином.

Индивидуальные остатки области 484-509 А2 домена, играющие ключевую роль в связывании тромбина, были идентифицированы с помощью ряда рекомбинантных мутантов А2 домена, в которых положительно заряженные остатки были замещены на Ala. Пять мутантов А2 домена, в которых Arg , Arg489, Arg490, His497 и Lys499 были заменены на Ala, связывали ангидро-тромбин с аффинностью в 2-5 раз ниже по сравнению с диким типом А2 домена.

Рис. 5. Измерение связывания А2 домена с иммобилизованным ангидро-тромбином с помощью ELISA. На панели А показано связывание рекомбинантного дикого типа А2 домена с ангидро-тромбином. Расчётная кривая получена с помощью односайтовой модели связывания. Во вставке, ангидро-тромбин и дикий тип А2 домена (80 нМ) были инкубированы с иммобилизованным ангидротромбином. Значение абсорбции, показывающее связывание А2 домена с ангидро-тромбином в отсутствии конкурентного белка, было принято за 100%. На панели Б показано ингибирование связывания А2 с иммобилизованным ангидро-тромбином моноклональным антителом 413 с эпитопом 484-509 (о), А2 пептидом 484-509 (•), или мутантным пептидом 484/489/490/497/499/А1а"м-509(а).

3.2.2. Роль С2 домена в связывании FVIII с активированным фактором X. К моменту начала нашего исследования оставался открытым вопрос о локализации сайта связывания FXa на молекуле FVIII. Локализация сайта связывания FXa во многом аналогична вышеизложенной локализации сайтов связывания тромбина. Используя моноклональное антитело с эпитопом среди остатков 2248-2285 С2 домена, нам удалось установить, что эта область критична для связывания FXa. Более детальная локализация центра связывания среди аминокислот 2253-2270 С2 домена была проведена с использованием перекрывающихся синтетических пептидов из области 2248-2285 С2 домена. Мы показали, что локализованный

нами центр связывания FXa ответственен за расщепление FVIII по Arg1689 илк Arg1721, которые одинаково важны при активации FVIII активированным фактором X. Активация FVIII была подавлена в присутствии 100 мкМ пептида 2253-2270. Е отличие от прежде разработанных антикоагулянтов, таких как антикоагулянтный пептид клеща и антистатин, которые ингибируют ферментативную активность FXe за счет связывания с его активным центром, механизм ингибирования пептидом 2253-2270 заключается в предотвращении связывания FXa с FVIII, которо« необходимо для успешного катализа.

3.2.3. Ингибиторные антитела к FVIII, предотвращающие его активацик фактором Ха. Мы показали, что ингибирование связывания FVIII с FXa являете? механизмом подавления активности FVIII антителами-ингибиторами FVIII присутствующими в крови больных гемофилией. Четыре ингибиторных антитела ингибирующих активацию FVIII фактором Ха были получены из крови больны* тяжелой формой гемофилии А. Эпитопы этих антител были локализованы в С терминальной области С2. Интересно, что ингибирование связывания FVIII ( активатором, фактором Ха, являлось единственным ингибиторным механизмом для четырёх исследованных нами антител, так как они не ингибировали связывание FVIII с фосфолипидом и активацию FVIII другим физиологически важным активатором - тромбином.

3.2.4. Влияние мутаций, обнаруженных в FVIII при гемофилии А, на врему жизни активированного FVIII. Малое время полужизни активированно{ гетеротримерной формы FVIII (А1/А2/АЗ-С1-С2) связано с быстрой спонтанно} диссоциацией А2 субъединицы и димера А1/АЗ-С1-С2. Мы экспрессировали v охарактеризовали следующие точечные мутанты FVIII, встречающиеся у больны? гемофилией A: Arg531His, Ala284Glu, Ser289Leu, Asp694Ile, Arg698Leu и Arg698Trp. С помощью разработанного нами анализа кинетики диссоциации А2 домена i реальном времени было оценено влияние мутаций на стабильность активированно{ формы FVIII. Время полужизни активированных форм мутантов FVIII было в 2-i раз короче по сравнению с активированным диким типом FVIII. Поскольку, Kai показал анализ трёхмерной модели FVIII, все исследованные мутацш расположены на границе соприкосновения AI и А2 доменов, проведённое нам! выявление аминокислот, имеющих критическое значение для стабильносп активированного FVIII, создает условия для разработки терапевтической рекомбинантного FVIII, обладающего повышенной стабильностью за счё' увеличения энергии взаимодействия А2 и AI доменов.

3.3. Молекулярные основы протеолитической инактивации FVIII. В этом разделе были описаны новые механизмы инактивации теназного комплекса активированным протеином С (АРС) и протеином S, а также плазмином.

3.3.1. Защитное действие ингибиторных антител при инактивации FVIII активированным протеином С. Мы обнаружили, что антитела из крови трёх больных гемофилией А ингибируют связывание с АРС и последующую инактивацию FVIIIa, катализируемую АРС. Было показано, что эти антитела ингибируют взаимодействие FVIII с АРС за счёт блокирования ранее локализованного сайта связывания АРС (остатки 2009-2018 A3 домена FVIII). Поскольку в присутствии антител комплекс FVIII с vWf диссоциирует, естественно предположить что область 2009-2018 вовлечена во взаимодействие с vWf. Мы также впервые показали присутствие комплексов FVIII с ингибиторными антителами у пациентов с гемофилией А. Присутствие таких комплексов обусловлено антителами, предотвращающими протеолитическую инактивацию FVIII активированным протеином С.

3.3.2. Защитное действие vlVf при инактивации FVIII активированным протеином С. Мы предположили, что ингибирование антителами взаимодействия vWf с FVIII и ингибирование протеолиза FVIII катализируемого АРС может объясняться перекрыванием сайтов связывания vWf и АРС на FVIII. В этом случае vWf защищает FVIII от протеолиза катализируемого АРС благодаря блокированию сайта связывания АРС, ранее локализованного в A3 домене среди остатков 20092018. Для проверки этой гипотезы мы синтезировали перекрывающиеся пептиды 1996-2007, 2001-2011, 2005-2014, 2009-2018, 2013-2022 и 2018-2028 и изучили их влияние на связывание FVIII с иммобилизованными ангидро-АРС и vWf. Было установлено, что пептиды 2009-2018 и 2013-2022 максимально ингибировали связывание FVIII с ангидро-АРС и vWf, тогда как эффект остальных пептидов был слабее. Кроме того, кроличье антитело к пептиду 2009-2022 полностью ингибировало связывание FVIII с иммобилизованными ангидро-АРС и vWf и АРС-катализируемую инактивацию FVIII. Таким образом, область 2009-2022 важна для связывания FVIII как с АРС, так и с vWf. Мы заключили, что vWf способен защищать FVIII от АРС, блокируя сайт связывания АРС на молекуле FVIII.

3.3.3. Механизм ингибирования внутренней теназы протеином S, независимый от активированного протеина С. Протеин S служит кофактором для АРС при протеолитической инактивации FVIIIa и FVa на фосфолипидных мембранах [Walker 1980]. Мы впервые показали, что протеин S связывается с FVIIIa и препятствует сборке теназного комплекса путём конкуренции с фактором 1Ха за связывание на FVIIIa.

Прямое доказательство взаимодействия FVIII с протеином S было получено при изучении связывания FVIII и его фрагментов с иммобилизованным протеином S. Мы показали, что высокоаффинные сайты связывания протеина S находятся на А2 и A3 доменах FVIII. Поскольку сайты связывания FIXa также находятся на А2 и

A3 доменах FVIII, мы предположили, что протеин S может ингибировап связывание FIXa с FVIII за счёт конкурирования за общие сайты связывания. Былс показано, что протеин S, действительно, конкурирует с FIXa за связывание нг FVIIIa, так как каталитически неактивная производная FIXa (EGR-FIXa) полностьк ингибирует связывание А2 и A3 доменов с иммобилизованным протеином S Поскольку сайт связывания FIXa был ранее локализован среди остатков 484-509 А2 домена FVIII, эти остатки могут быть важны и для связывания протеина S Экспериментальное подтверждение было получено нами при ингибированш связывания А2 домена FVIII с иммобилизованным протеином S моноклональны\ антителом с эпитопом 484-509 и синтетическим пептидом 484-509 Перекрывающиеся синтетические пептиды из области 484-509 использовались дл; более детальной локализации сайта связывания протеина S. Поскольку укороченный пептид 484-497 ингибировал связывание А2 домена с протеином 5 почти так же эффективно, как пептид 484-509, мы заключили что остатки 484-49' наиболее важны для связывания протеина S. Нами было также показано, чтс рекомбинантные мутанты А2 домена Ser488Ala, Arg489Ala и Arg490AIa связываются < протеином S с аффинностью примерно в 4 раза ниже, чем дикий тип А2 доменг или контрольный А2 мутант Тут487А1а. Таким образом, три последовательны? остатка Ser488, Arg489 и Arg490 наиболее важны для связывания протеина S на сайк 484-509 А2 домена FVIII.

3.3.4. Роль центрального В домена при инактивации FVIIIa активированныл протеином С и активированным фактором X. Анализ данных, накопленных зг время клинического применения с 1999 года укороченной версии рекомбинантногс фактора FVIII, не содержащей центрального 120 кДа В домена, показал, чтс вероятность эпизодов кровотечения при использовании укороченного FVIII (BDD' FVIII) в 2.5 раза выше в сравнении с полноразмерным FVIII (FL-FVIII) [Gruppo е al. 2003; Gruppo et al. 2004]. Эти данные свидетельствуют, что В домен играс функционально важную роль в биохимии FVIII и, в частности, может влиять ni протеолитическую устойчивость FVIII.

Как видно из Рис. 6, АРС- и FXa-катализируемая инактивация BDD-FVII протекает намного быстрее, чем рекомбинантного FL-FVIII и полноразмерноп FVIII, выделенного из плазмы крови (PD-FVIII). Действительно, скоростг инактивации BDD-FVIII в присутствии АРС и FXa соответственно в 3 и 5 ра выше, чем FL-FVIII и PD-FVIII (Рис. б, панели Б и В). В присутствии АРС и его кофактора протеина S скорость инактивации BDD-FVIII в 2 раза выше, чем FL-FVIII и PD-FVIII (Рис. 6, панель А). Таким образом, FVIII лишённый В домен: инактивируется протеазами существенно быстрее, чем полноразмерный FVIII.

Рис. 6. Кинетика инактивации FVIIIa выделенного из плазмы (•), полноразмерного рекомбинантного FVIII (■) н рекомбинантного FVIII с удалённый В доменом (Л). Инактивация проводилась АРС в присутствии протеина S (панель А), отдельно взятым АРС (панель Б) и FXa (панель В). Остаточную активность FVIIIa определяли с помощью АРТТ анализа.

3.3.5. Механизм инактивации FVIIIa плазмином. Плазмин является не только ключевым ферментом фибринолитической системы, но и напрямую инактивирует активированный FVIII [Nogami et al. 2007]. Скорость катализируемой плазмином инактивации FVIIIa в 12 и 4 раза выше, чем скорость инактивации FVIIIa, катализируемой FXa и АРС, соответственно. Плазмин инактивирует FVIIIa за счет тех же расщеплений молекулы по Arg336 и Lys36, что и FXa. В результате наших исследований мы локализовали сайты связывания плазмина на молекуле FVIIIa.

Поскольку FIXa и плазмин конкурируют за связывание с А2 доменом FVIIIa, мы предположили, что сайт связывания FIXa (остатки 484-509) может быть важен и для связывания плазмина. Блокирование связывания А2 домена с иммобилизованным ангидро-плазмином антителом, узнающим эпитоп 484-509, и синтетическими пептидами 479-504 и 484-509 показало, что область А2 домена, включающая остатки 479-509, действительно, представляет собой сайт связывания плазмина. Использование панели рекомбинантных аланиновых мутантов А2

» 377 т 466 1 471

домена позволило установить ключевую роль остатков Lys , Lys , Arg и особенно Arg484 в докинге плазмина на сайте 484-509 и значение этого докинга для инактивационного расщепления FVIIIa по остатку Arg336.

Ещё одно расщепление FVIIIa, катализируемое плазмином и приводящее к необратимой инактивации кофактора, происходит по остатку Lys36 в Al домене

лёгкой цепи FVIII. Поскольку протеолитические производные лёгкой цепи FVIII |645АЗ-С1-С2 и |б90АЗ-С1-С2 связывались с ангидро-плазмином с близкими аффинностями, тогда как аффинность 1722АЗ-С1-С2 была примерно в 3 раза ниже, мы заключили, что остатки 1690-1721 вовлечены в формирование центра связывания плазмина на лёгкой цепи молекулы FVIII. Учитывая, что плазмин связывается с кластерами положительно заряженных аминокислот, мы нашли такие кластеры в областях 1690-1705 (Lys1693 и Lys1694) и 1804-1818 (Lys1804, Lys1808, Lys'813 и Lys1818), синтезировали соответствующие пептиды и показали, что каждый из них в отдельности и, в особенности, их эквимолярная смесь ингибируют связывание 1649АЗ-С1-С2 с иммобилизованным ангидро-плазмином и инактивационный протеолиз FVIII по Lys36. Таким образом, плазмин связывается с сайтом 484-509 тяжёлой цепи FVIII, отвечающим за расщепление по Arg336 и с сайтами 1690-1705 и 1804-1818 лёгкой цепи FVIII, отвечающими за протеолиз по Lys36.

3.4. Молекулярные основы инактивации FVIII ингибиторными антителами больных гемофилией: картирование эпитопов антител на молекуле FVIII и установление механизмов ингибирования активности FVIII.

Одним из наиболее серьёзных осложнений заместительной терапии гемофилии А является образование ингибиторных антител к FVIII примерно у 30% больных гемофилией А. Ингибиторные антитела блокируют важнейшие сайты FVIII, вовлечённые во взаимодействие с vWf, активаторами, FIXa, фосфолипидом и делают кровоточивость невосприимчивой к введениям FVIII, что в свою очередь усиливает тяжесть заболевания, уменьшает продолжительность жизни и являете« основной причиной смерти таких больных.

Антитела, вырабатывающиеся к FVIII у больных гемофилией А, имеют поликлональную природу и узнают эпитопы в различных доменах FVIII. Мь: исследовали распределение эпитопов антител, выделенных из плазмы больных гемофилией А. В этом исследовании было использовано 23 плазмы больны? гемофилией, которых лечили концентратами FVIII, приготовленными из плазмь крови, и плазмы 11 пациентов, которых лечили рекомбинантными препаратами FVIII.

Мы показали, что все ингибиторные плазмы содержат антитела, нейтрализуемые А2 доменом и лёгкой цепью FVIII (домены АЗ-С1-С2). Во многих случаях, степени нейтрализации плазм легкой цепью (АЗ-С1-С2) и рекомбинантным С2 доменом сравнимы между собой, что свидетельствуют о том, что основная популяция ингибиторных антител узнаёт эпитопы в А2 и С2 доменах, но не в A3 и Cl доменах. Данные иммунопреципитации с использованием А2 и С2 доменов также показали присутствие соответствующего кросс-реактивного

материала во всех исследованных плазмах. Мы заключили, что иммунный ответ при лечении тяжёлых форм гемофилии А имеет сложный характер и выражается в вырабатывании поликлональных антител к А2 и С2 доменам.

Первое систематическое картирование эпитопов антител в С2 домене проводилось нами с использованием перекрывающихся фрагментов FVIII экспрессированных в E.coli. Мы сконструировали плазмиду, содержащую ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность лёгкой цепи FVIII 1974-2332, включающую 47 С-терминальных остатков A3 домена, С1 и С2 домены. На основе этой плазмиды были сконструированы 20 делеционных мутантов, в которых прогрессивно удалялись остатки N-терминальной области (остатки 2179-2293) и С-терминальной области (остатки 2279-2232) С2 домена. Детекция связывания ингибиторов с этими фрагментами производилась с помощью иммуноблота. Было показано, что общая часть эпитопов ингибиторов включает аминокислоты 22482312 С2 домена. Поскольку эпитопы ингибиторов перекрываются с ранее локализованным сайтом связывания фосфолипидов 2303-2332 и vWf, ингибирование связывания FVIII с этими двумя важнейшими лигандами является общим свойством ингибиторных антител, узнающих С2 домен.

Вышеописанные методы детального картирования эпитопов ингибиторных антител с использованием рекомбинантных фрагментов FVIII, экспрессированных в E.coli, имели тот существенный недостаток, что конформация использованных рекомбинантных пептидов может отличаться от нативной и потому давать ошибочное представление о положении эпитопа. Более передовая стратегия картирования эпитопов основана на тестировании действия ингибиторных антител на функционально-активные гибриды FVIII, полученные путём комбинации генов человека и свиньи. Эта стратегия использует тот факт, что человеческие ингибиторы практически не реагируют со свиным FVIII.

Минимально необходимая замена аминокислотной последовательности в человеческом FVIII на гомологичную последовательность свиного FVIII, которая полностью предотвращает взаимодействие гибридной молекулы с данным ингибитором, позволяет идентифицировать остатки, формирующие эпитоп ингибиторного антитела. Этот метод был применён нами для картирования эпитопа ингибиторных антител в А2 домене. Было экспрессировано 13 полностью активных молекул FVIII со свиными вставками в А2 домене.

На Рис. 7 показано ингибирование рекомбинантного человеческого FVIII и четырёх человеческо-свиных гибридов ингибиторными антителами четырёх больных гемофилией (SC, JM, NS и RC) и моноклональным антителом 413, узнающим А2 домен.

S КСО «ХЮ 10 20 30 «о » w

Антитело (нг/мл) Антитело (нг/мл)

года 4ко Антитело (нг/мл)

Рис. 7. Ингибирование человеческого РУШ и гибридного человеческо-свиного РУШ ингибиторными антителами с эпитопами в А2 домене. ЭС, ЛИ, ЫЭ и

ИС - ингибиторные антитела четырёх больных гемофилией А, а МаЬ413 -моноклональное мышиное антитело, узнающее А2 домен. Остаточная коагуляционная активность Р\/Ш после инкубирования с указанным антителом определялась в Бетезда анализе. На графиках показана остаточная активность Р\/||| в зависимости от концентрации антитела. Использовался человеческий рекомбинантный Р\/Ш (о) и гибридные варианты Р\ЛИ содержащего следующие свиные вставки в А2 домене: 387-468 (•), 484-509 (V), 489-508 ('), 484-488 (□).

Как видно из Рис. 7, дикий тип FVIII и гибрид со свиной вставкой 367-468 одинаково ингибируются всеми антителами. Ингибирование гибридов со свиными вставками 484-508, 489-508 и 484-488 было менее 50% при самой высокой использованной концентрации антител. Это означает, что все антитела узнают сходный эпитоп на А2 домене, минимально соответствующий замещению на свиные остатки 484-488.

Впоследствии было показано, что этот класс ингибиторов инактивирует FVIIIa путём непосредственного блокирования взаимодействия остатков 484-509 А2 домена с протеазным доменом FIXa, что дестабилизирует FVIIIa в теназном комплексе и уменьшает его кофакторную активность [Fay et al. 1999].

Существует ещё один, более современный метод картирования эпитопов антител, основанный на использовании библиотек случайных пептидов. Этот метод позволяет картировать сайт связывания антитела на молекуле FVIII путём быстрого скринирования связывания изучаемым антителом более чем 109 случайных пептидов. Мы применили стратегию использования случайных пептидных библиотек фаговых дисплеев для картирования эпитопов ингибиторных антител. Результаты проведённого нами картирования эпитопов ингибиторных антител с использованием всех вышеописанных методов суммированы на Рис. 8.

Тяжёлая цепь

Лёгкая цепь

А1

372

Тромбин, FXa 740 1689

NH,

А2

a2l

аЗ•

х=п

С1

С2

FIXa 484-508

vWf 1649-1689

vWf, PL 2181-2243

2332

соон

vWf, PL 2303-2332

Р1Ха Диссоциация

1811-1818 \z\Nf (2248-2285)

Сайт связывания РХа (2253-2270)

Рис. 8. Важнейшие обнаруженные нами эпитопы РУШ, блокируемые ингибиторными антителами. Показаны доменная структура Я\/1Н и сайты активации тромбином и РХа (372, 740 и 1689). В А2 домене тяжёлой цепи Р\/М1 антитела блокируют сайт связывания Р1Ха (остатки 484-508). В лёгкой цепи антитела блокируют сайт 1818-1818 в АЗ домене, участвующий в связывании активированного Р1Х (Р1Ха) и сайты в С2 домене, участвующие в связывании фосфолипида (Р1_), и активированного РХ (РХа). Блокирование сайта 2248-2285 препятствует конформационному изменению в С2 домене, происходящему при активации Р\Л1|, и вследствие чего антитела узнающие этот сайт препятствуют диссоциации комплекса ЯХЛИЛЛЛЯ.

3.5. Молекулярные механизмы рецептор-опосредованного клиренса FVIII из циркуляции и регулирования активности FVIII.

3.5.1. Идентификация рецептора, ответственного за клиренс FVI1I. К началу наших исследований наименее изученным процессом жизненного цикла FVIII был, несомненно, клиренс. Мы предположили, что комплекс FVIII с vWf выводится из плазмы крови клиренсным рецептором, и показали, что таким рецептором является рецептор белка, ассоциированного с липопротеинами низкой плотности (LRP). Ранее было показано, что LRP-опосредованный клиренс является механизмом удаления из кровотока ряда белков, принимающих участие в коагуляции и фибринолизе. Уникальное место среди лигандов LRP занимает 39-кДа рецептор-ассоциированный белок (RAP), который связывается с LRP с высокой аффинностью и ингибирует связывание всех известных лигандов LRP. LRP входит в семейство эндоцитозных рецепторов липопротеинов низкой плотности, включающее у человека также рецептор липопротеинов низкой плотности (LDLR), рецептор липопротеинов очень низкой плотности (VLDLR), гликопротеин 330 или мегалиновый рецептор (gp330/megalin) и рецептор

аполипопротеина Е (ApoER2). LRP экспрессирован в высокой концентрации на гепатоцитах печени.

2 ?с О

-2 -4

'to*

100 200

300

400

500

200 300 400 500 Время, мин.

Рис. 9. Влияние RAP на клиренс 12SI-FVI1I (нижняя панель) из плазмы мыши. Мышам вводили образцы, содержащие 125!-FVIII (15 нМ) и vWf (750 нМ) в отсутствии RAP (•) или в присутствии RAP в концентрациях 50 мкМ (Д), 150 мкМ (о) и 250 мкМ (□) в общем объёме 100 мкл. Клиренс 125I-FVIII при каждой концентрации RAP изучался в 4 мышах. За 100% принималось количество 125I-FVIII в кровотоке через 1 мин после иньекции. Кривые получены согласно биэкспоненциальной модели клиренса. Отклонения экспериментальных измерений от расчётной кривой клиренса показаны в верхней панели для экспериментов проведённых в отсутствии RAP (•) или в присутствии 250 мкМ RAP (□).

Ключевым экспериментом, доказывающим роль LRP (одного или в сочетании с другим RAP-зависимым клиренсным рецептором из семейства LDL), явился эксперимент, проведённый нами in vivo (Рис. 9). В этом эксперименте в каждую мышь внутривенно вводили 125I-FVIII в комплексе с vWf в присутствии или в отсутствии RAP.

Как видно из Рис. 9, при концентрации RAP 150 мкМ или выше наблюдалось максимальное 3.3-кратное пролонгирование времени полувыведения l25I-FVIII. Кроме того, в отсутствие RAP большая часть радиоактивности была найдена в печени, а не в почках, что хорошо согласуется с высокой экспрессией LRP в гепатических тканях. В дальнейших экспериментах, используя антитело с эпитопом среди остатков 484-509 А2 домена и синтетический пептид 484-509, было установлено, что область 484-509 А2 домена FVIII является сайтом связывания LRP. Этот участок А2 домена FVIII содержит 6 положительно

т 493 т 496 т 499 а 484 а 489 А 490

заряженных аминокислотных остатков: Lys , Lys , Lys , Arg , Arg и Arg

3.5.2. Выявление аминокислотных остатков A2 домена FVIII, формирующих центр связывания для LRP. Поскольку ранее было показано, что положительно заряженные остатки других лигандов играют ключевую роль во взаимодействии с LRP, мы провели аланиновый сканирующий мутагенез остатков области 484—509

и прилежащих областей, расположенных на поверхности А2 домена. Мы генерировали в бакуловирусной системе ряд аланиновых мутантов А2 домена и измерили их взаимодействие с LRP. Наши исследования показали, что аминокислотные остатки Lys466, Arg471, Arg484, Ser488, Arg489, Arg490, His497 и Lys499 критичны для формирования сайта связывания LRP на молекуле FVIII.

Эти данные были подтверждены in vivo. Мы сравнили клиренс 1251-меченого А2, двойного мутанта А2 Arg471Ala/Arg484Ala, аффинность которого к LRP была наиболее низкой, и контрольного двойного мутанта Lys380Ala/Lys523Ala, чья аффинность к LRP не отличалась от А2 дикого типа. Время полужизни А2 мутанта Arg471Ala/Arg484Ala (30±7 мин) в мышах было примерно в 2 раза больше, чем время полужизни контрольного мутанта Lys380Ala/Lys523Ala (18±4 мин), практически не отличающееся от времени полужизни А2 дикого типа. Эти данные подтверждают значение остатков Arg471 и Arg484 для клиренса FVIII.

Наши данные позволяют предположить, что мутации Arg484Ala, Ser488Ala, Arg489Ala, Arg490Ala и His497Ala, уменьшающие аффинность LRP сайта в А2 домене и при этом не влияющие, как мы показали, на кофакторную активность FVIIIa, перспективны для введения в молекулу рекомбинантного FVIII с целью продления его полужизни в циркуляции.

3.5.3. Локализация областей LRP рецептора, участвующих в связывании с А2 доменом FVIII. Для того, чтобы определить область LRP, содержащую сайт связывания А2, мы изучили влияние фрагментов LRP на связывание 1251-А2 с иммобилизованным LRP методом конкурентного анализа. Используя отдельные кластеры LRP и перекрывающиеся триплеты, составляющих эти кластеры комплемент-повторов (CR), показанные на Рис. 10, мы установили, что сайт связывания А2 находится среди комплемент-повторов 3-8 и 23-29 кластеров II и IV LRP рецептора, соответственно.

Использование мутантов А2 привело к более детальному пониманию механизма связывания FVIII, позволив идентифицировать комплемент повторы, вносящие основной вклад в связывание с остатками А2 (Lys466, Arg471, Arg484 и Arg489) играющими ключевую роль во взаимодействии с LRP. Так например, мы показали, что триплеты CR 23-25 и CR 27-29 играют ключевую роль во взаимодействии с остатками Lys466 и Arg471 А2 домена, а триплет 7-9 вносит важный вклад во взаимодействие с остатками Arg484 и Arg489 А2 домена.

Функциональное значение областей LRP, ответственных за связывание А2 домена, было подтверждено клиренсными экспериментами in vivo, продемонстрировавшими способность ключевых триплетов CR удлинять время полужизни А2 домена в мыши примерно в два раза. Это наблюдение может являться исходной точкой для разработки препаратов, избирательно блокирующих область LRP, участвующую в клиренсе FVIII, и значительно пролонгирующих

жизнь этого дорогостоящего лекарственного препарата в крови больных гемофилией А.

Молекула LRP: геп.тич.сия

клеточная мемораиа

lane ~ 1 г з ч s в 7 в 9 101112 kD

ВО- 1,.' 50 - .»

28 ~ ^ШШШ^

Рис. 10. Схематическое представление LRP, кластеров II, III и IV и перекрывающихся триплетов комплемент-повторов (CR) из кластеров II и IV. LRP кластеры и триплеты CR были получены в бакуловирусной экслрессионной системе. Анализ очищенных кластеров II, III и IV и триплетов был проведён в градиентном геле 4-12% с последующей окраской Кумасси. Номера полос на геле соответствуют номерам фрагментов (1-12), показанных на схеме.

O Complement-type repeats (CR) o EGF-iike repeats © YWTD p-propefler domain ■ Transmembrane domain

□ Cytoplasmic domain * Conserved Trp and Asp (Glu) homologous to Trp,0№ and Asp10*5 coordinating Ca?" via backbone chain carbonyi groups in CR 8

3.5.4. Роль гепаран-сульфат протеогликанов в LRP-опосредованном катаболизме FVIII. Эндоцитоз многих лигандов LRP рецептора происходит с участием гепаран-сульфат протеогликанов (HSPGs), одного из компонентов формирующих внешнеклеточный матрикс. В большинстве случаев HSPGs могут также функционировать как независимые от LRP эндоцитозные рецепторы. Все лиганды LRP, взаимодействующие с HSPGs, связывают гепарин. Поскольку FVIII также является гепарин-связывающим белком, мы предположили, что HSPGs участвует в клиренсе FVIII.

Мы провели исследования клиренса FVIII в мышах в присутствии протамина, блокирующего участие HSPGs в клиренсе. Клиренсные кривые были описаны с помощью биэкспоненциальной модели, предполагающей наличие быстрой и медленной компонент клиренса FVIII. Мы установили, что при насыщающей концентрации RAP, блокирующего LRP, быстрая фаза клиренса была полностью подавлена, что приводило к пролонгированию времени полужизни FVIII в 3.5 раза. Введение протамина, блокирующего HSPGs, увеличивало время полужизни FVIII в 1.6 раза, уменьшая скорости как быстрой, так и медленной фаз

клиренса. Это наблюдение означает, что HSPGs участвует как в LRP-опосредованном, так и в LRP-независимом пути клиренса FVIII. Примечательно, что одновременное введение RAP и протамина приводило к 5.5-кратному продлению времени полужизни FVIII, указывая на одновременное участие LRP и HSPGs в клиренсе FVIII.

vWf

jrvni] -..

vWf

|ГУШ|

им- jap 1ЩР

J&. JTXJ>r;* Щ. IT LRP

f\ \ S]

Ifvnil \

Рециркулировани рецепторов

LRP-независимый путь

t Клатриновая капсула

ч г

HSPGs

LRP-зависимый путь

1 СУТИ 1

* I

(^^^sosomes^)

Рис. 11. Молекулярная модель эндоцитоза П/П1. Начальное связывание комплекса Г\/] ]/'Л\Ч происходит за счёт взаимодействия с НЭРСэ, после чего происходит !_КР-опосредованный эндоцитоз через клатриновые капсулы или НБРОз-зависимый эндоцитоз. Поскольку не подвергается эндоцитозу, мы предположили, что комплекс ПЛИЛЛМ диссоциирует прежде, чем П/Ш попадает в эндосомы.

Впоследствии нам удалось локализовать сайт связывания НЗРОэ на БЛ^Ш среди аминокислотных остатков 558-565 А2 домена, причём оказалось, что НБРОв-связывающий сайт не перекрывается с ЬЯР-связывающим сайтом (484-509) А2 домена. Поскольку клиренсные эксперименты показали, что одновременное подавление 1Л1Р- и ГОРОв-зависимых компонент клиренса РУШ приводит к существенному продлению времени полужизни РУШ, одновременное введение мутаций в ЬЯР и НБРОэ может быть перспективно для создания рекомбинантного РУШ нового поколения с пролонгированным терапевтическим действием.

Мы заключили, что клиренс РУШ происходит как по ЬЯР-зависимому, так и частично по ШРйз-независимому пути (Рис. 11). Поскольку, как мы показали на Ы1Р-экспрессирующих клетках печени, не подвергается ЬЯР-

опосредованному эндоцитозу, мы предположили, что комплекс РУШ-уХУГ диссоциирует перед вхождением РУШ в эндосомы (Рис. 11).

3.5.5. Регулирование активности внутренней теназы УЮЬ рецептором. В то время как Ы1Р экспрессирован в больших количествах в печени, что хорошо

сочетается с его ролью гепатического клиренсного рецептора для FVIII, структурно родственный рецептор липопротеинов очень низкой плотности (VLDLR) не присутствует в печени, но в больших количествах экспрессирован в сердце и скелетных мышцах, на эндотелиальных клетках капиллярных кровеносных сосудов, а также на макрофагах внутри артерий человека. Используя растворимый рекомбинантный эктодомен VLDLR мы показали, что FVIII связывается с VLDLR и что сайты связывания VLDLR и LRP рецепторов на молекуле FVIII перекрываются. Мы также показали, что возможная функциональная роль VLDLR заключается в регулировании активности внутренней теназы.

В начальных экспериментах мы показали, что лёгкая цепь FVIII состоящая из A3, С1 и С2 доменов связывается с VLDLR с аффинностью близкой к FVIII. Рекомбинантный фрагмент антитела, узнающий эпитоп 1811-1818, полностью ингибировал связывание FVIII с иммобилизованным VLDLR

В то время как лёгкая цепь FVIII (LCh) хорошо связывалась с VLDLR, экспонирование сайта связывания VLDLR на тяжёлой цепи (HCh), состоящей из доменов AI и А2 доменов, происходило только после активации FVIII тромбином, протеолизующим тяжёлую цепь по остаткам 373 и 740. Близкие значения аффинностей, определённые для тромбин-активированной тяжёлой цепи и для А2 домена, а также отсутствие связывания VLDLR с AI доменом позволяют предположить, что взаимодействие активированной тяжёлой цепи с VLDLR полностью определяется сайтом находящимся в А2 домене. Мы обнаружили, что сайт связывания VLDLR в А2 домене перекрывается или совпадает с сайтом связывания LRP (остатки 484-509). Таким образом, один сайт связывания VLDLR расположен в области 1811-1818, а второй сайт связывания VLDLR расположен в среди остатков 484-509 А2 домена и экспонируется при активации FVIII.

Как было показано в работе других исследователей, VLDLR не участвует в клиренсе FVIII [Bovenschen et al. 2004]. Мы получили доказательства того, что функциональное значение взаимодействия FVIII с VLDLR может сводиться к регулированию активности внутренней теназы. Это заключение подтверждается, во-первых, тем, что растворимый фрагмент рецептора (sVLDLR) оказывает ингибиторное действие на генерирование FXa теназным комплексом, собранным на фосфолипидных везикулах (Рис. 12, панель а). Во-вторых, в экспериментах, проведённых в клеточной культуре, мы детектировали значительно более высокую активность теназы, собранной на диком типе клеток почек эмбриона человека (НЕК 293), которые не эспрессируют VLDLR, по сравнению с активностью теназы на НЕК 293, экспрессирующих VLDLR (Рис. 12, панели в и с).

(а)

120

S 100

во -

2 60 ■

о 40

20 '

0 ■

ib)

Я 120

«Ь ICO

г зо-

а.

о ва-

п АО

» 20-

s Li. 0

10 100 SVLDLRI-8 (nmol/i)

(С)

WT-293

VLDLR-293

Рис. 12. Влияние рецептора VLDLR на активность теназого комплекса. (A) FIXa (2 нМ) и FVIII (1 нМ) инкубировали с фосфолипидными везикулами и указанными концентрациями VLDLR в присутствии (о) или отсутствии 1 мкМ RAP (•). После активации FVIII тромбином, реакцию инициировали добавлением FX (200 нМ). (В) тенаэный комплекс был собран на монослое НЕК 293 клеток дикого типа (•) и трансфецированных VLDLR (А). Эксперименты были проведены в присутствии 1 мкМ RAP (о, Д) и в отсутствии RAP (•,А). Контрольный эксперимент (—) был проведён в отсутствии FVIII. (С) Скорости активации FX в отсутствии и присутствии RAP на диком типе НЕК 293 и на трансфецированных клетках. Данные взяты из панели В.

Мы предположили, что VLDLR регулирует активность внутренней теназы как путём уменьшения при помощи VLDLR-опосредованного эндоцитоза локальной концентрации FVIIIa на поверхности клетки, так и путём блокирования взаимодействия FVIIIa с FIXa в теназном комплексе.

Регуляторная роль VLDLR хорошо согласуется с экспрессией VLDLR на клетках, поддерживающих сборку внутренней теназы, таких как макрофаги, гладкомышечные клетки стенки сосуда и эндотелиальные клетки, образующие внутреннюю выстилку капиллярных сосудов [Multhaupt et al. 1996].

3.5.6. Молекулярные механизмы взаимодействия FVIII с другими рецепторами из семейства липопротеинов низкой плотностью. В предыдущих главах мы описали взаимодействие FVIII с LRP и VLDLR и охарактеризовали функциональное значение этих взаимодействий. Чтобы определить является ли связывание FVIII общим свойством рецепторов семейства LDL, мы исследовали взаимодействие FVIII с мегалином и рецептором липопротеинов низкой плотности (LDLR). Мы установили, что как и для VLDLR, активация FVIII тромбином является условием экспонирования высокоаффинного сайта для связывания мегалина и LDLR. Полное ингибирование связывания А2 домена с LRP, LDLR, VLDLR и мегалином антителом 413 (эпитоп 484-509) означает, что эта область А2 домена содержит последовательность, узнаваемую всеми четырьмя рецепторами. Чтобы определить, какие остатки из области 484-509 ответственны за

взаимодействие с рецепторами, мы изучили связывание панели 20 точечных мутантов рекомбинантного А2 домена и дикого типа А2 домена с иммобилизованными LDLR, VLDLR и мегалином. Тестирование связывания панели точечных мутантов А2 домена с LRP, LDLR, мегалином и VLDLR

т 466 А 471

показало, что положительно заряженные аминокислотные остатки Lys , Arg , Arg489 и Arg490 и незаряженные гидрофобные остатки Туг487 и Ser488 образуют общий рецептор-связывающий сайт А2 домена.

Интересно, что другие исследователи нашли функциональную роль LDLR в метаболизме FVIII. Было показано, что LDLR кооперирует с LRP в регулировании уровня FVIII в крови [Bovenschen et al. 2005]. Одновременное исключение LRP и LDLR вело к 4.2-кратному повышению уровня FVIII в крови, в то время как у генетически дефицитных мышей, у которых были исключены LDLR или LRP рецепторы в отдельности, обнаруживали лишь 1.6-кратное повышение уровня FVIII. Более того, среднее время полужизни FVIII в мыши с исключёнными LRP и LDLR было в 4.8 раз больше, чем в нормальной мыши и значительно выше, чем в мышах с отдельно исключёнными LRP и LDLR. Эти эксперименты позволили предположить, что LDLR наряду с LRP участвует в клиренсе FVIII. Данное утверждение вполне согласуется с высокой экспрессией этих рецепторов в гепатических тканях.

Возможны и другие механизмы, благодаря которым LDL рецепторы могут регулировать активность FVIII. Во внутренней теназе А2 домен ответственен за кофакторную функцию активированного FVIII, поскольку А2 модулирует протеолитический сайт FIXa, повышая энзиматическую активность FIXa примерно в 100 раз [Fay et al. 1998]. Высокая аффинность А2 домена, содержащего сайт связывания LDL рецепторов LRP, VLDLR, LDLR и мегалина, позволяет предположить, что эти рецепторы конкурируют с FIXa за связывание с FVIIIa.

Глава 4 содержит заключительные положения работы.

Целью данного исследования явилось установление молекулярных механизмов взаимодействия FVIII с физиологически важными лигандами на разных стадиях жизненного цикла.

Поскольку сразу после секреции в кровоток FVIII образует прочный нековалентный комплекс с vWf, необходимый для обеспечения нормального времени жизни FVIII в циркуляции, мы изучили механизм взаимодействия FVIII с vWf. Мы установили сайты FVIII, ответственные за связывание с vWf, и показали, что конформационные изменения, происходящие в лёгкой цепи FVIII при его активации приводят более чем к 1000-кратному понижению аффинности по отношению к vWf и 10-кратному повышению аффинности к фосфолипиду, что способствует диссоциации комплекса FVIII с vWf и связыванию активированного

FVIII на фосфолипидной поверхности, необходимому для сборки теназного комплекса.

Установив механизм взаимодействия FVIII с vWf, мы перешли к изучению молекулярного механизма активации FVIII двумя важнейшими активаторами -тромбином и активированным FX. Нам удалось локализовать сайты связывания тромбина и активированного FX и отдельные аминокислотные остатки этих сайтов, наиболее существенные для взаимодействия. При изучении причин нестабильности активированного FVIII мы установили аминокислотные остатки принципиально важные для его устойчивости, что заложило основы для создания FVIII с повышенной устойчивостью к спонтанной инактивации. При изучении протеолитической инактивации FVIII плазмином, мы идентифицировали сайты связывания плазмина в А2 и A3 доменах FVIII и ключевые аминокислоты этих сайтов. Эти данные могут стать основой для создания FVIII, устойчивого к инактивации плазмином.

Одним из серьёзных осложнений при лечении гемофилии А является развитие ингибиторных антител к FVIII, наблюдаемое примерно у 30% больных. В ходе систематического картирования эпитопов антител несколькими независимыми методами мы установили, что важнейшие эпитопы антител расположены в А2 и С2 доменах FVIII. Знание этих эпитопов позволяет делать их менее узнаваемыми для ингибиторных антител путём мутирования ключевых аминокислот эпитопа, не влияющих на кофакторную активность FVIII. Так например, одновременная мутация Arg484, Arg489 и Pro494 из эпитопа А2 домена привела к существенному снижению чувствительности мутантного FVIII к инактивации антителами, не нарушая функциональной активности FVIII. Таким образом, локализация эпитопов ингибиторных антител и выявление ключевых аминокислот в эпитопе открывает возможность создавать рекомбинантный FVIII, с пониженной иммуногенностью, перспективный для терапии больных гемофилией А, осложнённой образованием ингибиторных антител.

Мы изучили ранее не исследованную фундаментальную проблему биологии FVIII - молекулярный механизм клиренса кофактора из циркуляции. Было установлено, что клиренс FVIII является рецептор-опосредованным процессом, происходящим при участии LRP и LDLR рецепторов из семейства рецепторов липопротеинов низкой плотности. Мы показали, что рецептор LRP, экспрессированный в высокой концентрации в печени и являющийся клиренсным рецептором для различных лигандов, участвует также в клиренсе FVIII. Наши коллеги из Нидерландов показали, что, помимо LRP, ещё один гепатический рецептор (LDLR) из семейства LDL рецепторов участвует в клиренсе FVIII. Роль LRP и LDLR была впоследствии подтверждена в генетически дефицитной мыши, у которой отсутствовали LRP и LDLR [Bovenschen et al. 2005]. В таких мышах

среднее время полужизни FVIII было почти в 5 раз больше, чем в нормальной мыши. Один из сайтов FVIII, участвующий во взаимодействии с этими рецепторами, был локализован нами среди остатков 484-509 А2 домена. Методом точечного мутагенеза мы идентифицировали отдельные аминокислотные остатки в сайте 484-509 и вблизи от него, играющие ключевую роль в связывании FVIII с LRP и LDLR. Этими остатками явились Lys46e, Arg471, Arg484, Ser488, Arg489 и Lys523. Мы предположили, что мутирование остатков, не влияющих на функциональную активность FVIII, приведёт к значительному снижению аффинности мутантного FVIII по отношению к клиренсным рецепторам LRP и LDLR и вследствие этого к увеличению времени полужизни FVIII в кровотоке.

В заключение, наши данные могут служить основой для создания усовершенствованного рекомбинантного FVIII пролонгированного действия за счёт модулирования его взаимодействий с важнейшими физиологическими лигандами.

Выводы

1. Исследован механизм взаимодействия фактора VIII с фактором фон Виллебранда:

-установлена минимальная структурная единица vWf, способная стабилизировать FVIII и предотвращать его преждевременное связывание с фосфолипидом;

-локализованы два сайта FVIII, участвующие в связывании vWf, расположенные в N-терминальной и С-терминальной областях лёгкой цепи среди аминокислотных остатков 1672-1794 и 2170-2327, соответственно;

-показано, что при протеолитической активации лёгкой цепи FVIII происходит полная потеря связывания vWf с сайтом 1672-1795 и изменение конформации сайта 2170-2327, приводящее к резкому снижению его аффинности по отношению к vWf и увеличению аффинности к фосфолипиду.

2. Установлен молекулярный механизм активации FVIII двумя важнейшими физиологическими активаторами - тромбином и активированным фактором X:

-локализованы сайты связывания тромбина на молекуле FVIII, расположенные в С2 домене и среди остатков 484-509 А2 домена, отвечающие за катализируемый тромбином протеолиз FVIII по остаткам Arg1689 и Arg372, соответственно;

-установлен сайт связывания активированного фактора X, расположенный среди аминокислотных остатков 2253-2270 С2 домена лёгкой цепи FVIII;

-выявлены причины, определяющие короткое время полужизни активированного FVIII вследствие быстрой спонтанной диссоциации А2 домена;

-идентифицированы гемофилийные мутации Asn694Ile, Arg698Trp, Arg698Leu, Ala284Glu, Ala284Pro, Ser289Leu, Arg53'His и охарактеризовано их влияние на стабильность активированной формы FVIII.

3. Изучен молекулярный механизм инактивации FVIII активированным протеином С и плазмином:

-установлен механизм защитного действия vWf на FVIII при протеолизе активированным протеином С, обусловленный конкуренцией vWf и АРС за общий сайт связывания, локализованный среди аминокислот 2009-2022 в С2 домене FVIII;

-установлено, что APC-независимое ингибирование активности теназного комплекса протеином S обусловлено конкуренцией протеина S с FIXa за сайт 484509 в А2 домене FVIII;

-показано, что центральный В домен FVIII ингибирует протеолитическую инактивацию FVIIIa активированным протеином С и FXa.

4. Установлены молекулярные механизмы инактивации FVIII ингибиторными антителами, вырабатывающимися у больных гемофилией А при заместительной терапии концентратами FVIII:

-обнаружено, что одной из причин, вызывающих образование антител является изменение конформации С2 домена FVIII при пастеризации концентрата FVIII;

-проведено картирование эпитопов ингибиторных антител больных гемофилией А и локализованы важнейшие эпитопы антител среди остатков 484509 и 2248-2312 А2 и С2 доменов;

-установлены молекулярные механизмы ингибирования FVIII антителами, включающие ингибирование связывания FVIII с vWf, фосфолипидом, FIXa, а также с активаторами - тромбином и FXa;

-исследован протеолитический механизм инактивации FVIII антителами больных гемофилией А и установлены сайты FVIII, наиболее подверженные протеолизу.

5. Открыт механизм клиренса FVIII из кровотока и регуляции его функциональной активности в циркуляции рецепторами из семейства рецепторов липопротеинов низкой плотности:

-исследован молекулярный механизм взаимодействия FVIII с двумя рецепторами (LRP и LDLR) семейства рецепторов LDL, принимающими участие в клиренсе FVIII из кровотока;

-локализованы сайты FVIII, участвующие в связывании с этими рецепторами и отдельные аминокислотные остатки, играющие важную роль в этом взаимодействии;

-определён сайт LRP рецептора, участвующий в связывании FVIII; -охарактеризован молекулярный механизм взаимодействия FVIII с мегалином и рецептором липопротеинов очень низкой плотности, принимающими участие в регуляции активности теназного комплекса.

Список сокращений и обозначений

АРС - активированный протеин С

АРТТ — активированное частичное тромбопластиновое время BDD-FVIII - фактор FVIII, не содержащий В домена

CR - лиганд-связывающие комплемент повторы, входящие в состав LRP рецептора и других рецепторов семейства LDL E.coli — кишечная палочка Escherichia coli

EGR-FIXa - каталитически неактивная производная активированного фактора IX

ELISA — метод иммуно-ферментного твердофазного анализа

FV - коагуляционный фактор V

FVa - активированный фактор V

FVII - коагуляционный фактор VII

FVIIa - активированный фактор VII

FVIII - коагуляционный фактор VIII

FVIIIa - активированный фактор VIII

FIX - коагуляционный фактор IX

FIXa - активированный фактор IX

FX - коагуляционный фактор X

FXa - активированный фактор X

FL-FVIII - полноразмерный FVIII

gp330 - рецептор семейства LDL, мегалин

293НЕК - клетки почек человеческого эмбриона дикого типа

HCh - тяжелая цепь FVIII

HSPGs - гепаран сульфат протеогликаны

IgG - иммуноглобулин G

LCh - легкая цепь фактора FVIII

LDL - липопротеины низкой плотности

LDLR - рецептор липопротеинов низкой плотности

LRP - рецептор белка, связанного с липопротеинами низкой плотности из семейства LDL

PCR - полимеразная цепная реакция

PD-FVIII - препараты FVIII, очищенные из плазмы

PL — фосфолипид

RAP - человеческий рекомбинантный рецептор ассоциированный белок, антагонист рецепторов семейства LDL

sVLDLR - растворимый лиганд-связывающий фрагмент VLDLR VLDLR - рецептор липопротеинов очень низкой плотности vWf - фактор фон Виллебранда wt-A2 - рекомбинантный дикий тип А2 домена

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в реферируемых научных изданиях

1. Saenko, E.L., Shima, М., Rajalakshmi, К J., Scandella, D. A role for the C2 domain of factor VIII in binding to von Willebrand factor. J. Biol. Chem., 269: 11601-11605(1994).

2. Saenko, E.L., Scandella, D. A mechanism for inhibition of factor VIII binding to phospholipid by von Willebrand factor. J.Biol. Chem., 270: 13826-13833 (1995).

3. Scandella, D., Gilbert, G., Shima, M., Nakai, H., Eagleson, C., Felch, M., Prescott, R., Rajalakshmi, K, Hoyer, L.W., Saenko, E.L. Some factor VIII inhibitor antibodies recognize a common epitope corresponding to C2 domain amino acids 22482312 which overlap a phospholipid binding site. Blood, 86: 1811-1819 (1995).

4. Healey, J.F., Lubin, I.M., Nakai, H., Saenko, E.L., Hoyer, L.W., Scandella, D., Lollar, P. Residues 484-509 contain a major determinant of the inhibitory epitope in the A2 domain of human factor VIII. J.Biol.Chem., 270: 14505-14509 (1995).

5. Saenko, E.L., Shima, M., Gilbert, G.E., and Scandella, D. Slowed release of thrombin cleaved factor VIII from von Willebrand factor by monoclonal and a human antibody is a novel mechanism for factor VIII inhibition. J.Biol.Chem., 271: 2742427431 (1996).

6. Prescott, R., Nakai H., Saenko, E.L., Scharrer, I., Nilsson, I.M., Hurst, D., Bray, G., and Scandella, D. The inhibitor antibody response is more complex in hemophilia A patients that in most nonhemophiliacs with factor VIII autoantibodies. Blood, 89: 36633671 (1997).

7. Saenko, E.L., and Scandella, D. The acidic region of the factor VIII light chair and the C2 domain together form a high affinity binding site for von Willebrand factor. J. Biol. Chem., 272: 18007-18014 (1997).

8. Zhong, D., Saenko, E.L., Shima, M., Felch, M., and Scandella, D. Some human inhibitor antibodies interfere with factor VIII binding to factor IX. Blood, 92: 136-142

(1998).

9. Saenko, E.L., Scandella D., Yakhyaev, A.V., and Greco, N. Activation of factoi VIII by thrombin increases its affinity for binding to synthetic membranes and activated platelets. J. Biol. Chem., 273: 27918-27926 (1998).

10. Laub, R., Di Giambattista, M., Fondu, P., Branckmann, H.-H., Lenk, H., Saenko E.L., Felch, M., and Scandella, D. Inhibitors in German hemophilia A patients treated with a double virus inactivated Factor VIII concentrate bind to the C2 domain ol FVIII light chain. Thromb. Haemost. ,81:39-44(1999).

11. Pipe, S.W., Eickhorst, A.N., McKinley, S.H., Saenko, E.L. and Kaufman, R.J. Mild hemophilia A caused by increased rate of factor VIII A2 subunit dissociation: evidence for non-proteolytic inactivation of factor VIII in vivo. Blood, 93: 176-183

(1999).

12. Saenko, E.L., Shima, M., and Sarafanov, A. Role of activation of the coagulation factor VIII in interactions with von Willebrand factor, phospholipid, anc functioning within the factor Xase complex. Invited Review, Trends Cardiovasc. Med., 9:185-192(1999).

13. Nogami, K., Shima, M., Nakai, H., Tanaka, I., Suzuki, H„ Morichika, S. Shibata, M., Saenko, E.L., Scandella, D., Giddings, J.C., and Yoshioka, A. Identificatior of a factor VIII peptide, residues 2315-2330, which neutralizes human factor VIII C2 inhibitor alloantibodies: requirement of Cys2326 and Glu2"7 for maximum effect. Br. J. Haematol., 107: 196-203 (1999).

14. Nogami, K„ Shima, M„ Hosokawa, K., Suzuki, T., Koide, T., Saenko, E.L., Scandella, D., Shibata, M., Kamisue, S., Tanaka, I., and A. Yoshioka. Role of factor VII' C2 domain in factor VIII binding to factor Xa. J. Biol. Chem., 274: 31000-31007 (1999).

15. Saenko, E.L., Loster, K., Josic, D., and Sarafanov, A. Effect of von Willebranc factor and its proteolytic fragments on kinetics of interaction between the light chain and heavy chains of human factor VIII. Thromb. Res., 96: 355-363 (1999).

16. Saenko E.L., Yakhyaev, A.V., Mikhailenko I., Strickland D., and Sarafanov, A. Role of the low density lipoprotein-related protein receptor in mediation of factor VIII catabolism. J. Biol. Chem., 274: 37685-37692 (1999).

17. Moreau, A., Lacroix-Desmazes, S., Stieltjes, N., Saenko, E.L., Kaveri, S.V., D'Orion, R., Sultan, Y., Scandella, D., Kazatchkine, D. Antibodies to the FVIII light chain that neutralize FVIII procoagulant activity are present in plasma of non-responder

patients with severe hemophilia A and in normal polyclonal human IgG. Blood, 95: 3435-3441 (2000).

18. Nogami, K., Shima, M., Hosokawa, K., Nagata, M., Koide, T., Saenko, E.L., Tanaka, I., Shibata, M., and Yoshioka, A. Factor VIII C2 domain contains the thrombin binding site responsible for thrombin-catalyzed cleavage at Arg1689. J.Biol.Chem., 275: 25774-25780 (2000).

19. Mondorf, W., Klinge, J., Luban, N.. Bray, G., Saenko, E.L., Scandella, D. Low factor VIII recovery in Hemophilia A patients without inhibitor titer is not due to the presence of anti factor VIII antibodies undetectable by the Bethesda assay. Haemophilia, 7: 13-19(2001).

20. Pipe, S.W., Saenko, E.L., Eickhorst, A.N., Kemball-Cook, G., and Kaufman, RJ. Hemophilia A mutations associated with one-stage/two-stage activity discrepancy disrupt protein-protein interactions within the triplicated A domains of thrombin-activated factor Villa Blood, 97: 685-691 (2001).

21. Nogami, K., Shima, M., Giddings, J.C., Hosokawa, K., Kamisue, S., Morichika, S., Suzuki, H., Shibata, M., Saenko, E.L., Tanaka, I., Yoshioka, A. Circulating factor VIII immune complexes in the patients with type 2 acquired hemophilia A and protection from activated protein C-mediated proteolysis. Blood, 97: 669-677(2001).

22. Ananyeva, N., Kouiavskaia, D., Shima M., Saenko, E.L. Catabolism of the coagulation factor VIII. Can we prolong lifetime of fVIII in circulation? Trends Cardiovasc. Med., 11:252-257 (2001).

23. Scandella, D., Nakai, H. Felch, M., Mondorf, W., Scharrer, I., Hoyer, L.W., and Saenko, E.L. In hemophilia A and autoantibody inhibitor patients the factor VIII A2 domain and light chain are most immunogenic. Thromb. Res., 101: 377-385 (2001).

24. Saenko, E.L., Josic, Dj., Stadler, M., Sarafanov, A., Yow-Pin Lim, Ananyeva, N., Schwinn, H. Molecular modifications in factor VIII concentrates produced from different plasma pools. Thromb. Res., 101: 501-511 (2001).

25. Sarafanov, A., Ananyeva, N., Shima, M., and Saenko, E.L. Cell surface heparan sulfate proteoglycans participate in factor VIII catabolism mediated by low-density lipoprotein receptor-related protein (LRP). J.Biol.Chem., 276: 11970-11979 (2001).

26. Nogami K., Shima, M., Nishiya K., Sakurai, Y., Tanaka, I., Gidding J.C., Saenko, E.L., Yoshioka, A. Human factor VIII inhibitor alloantibodies with a C2 epitope inhibit factor Xa-catalyzed factor VIII activation: a new anti-factor VIII inhibitory mechanism. Thromb. Haemost., 87: 459-465 (2002).

27. Nogami K., Shima, M., Nishiya K., Hosogawa, K., Nagata, M., Saenko, E.L.a Tanaka, I., Yoshioka, A. Anticoagulant effects of a synthetic peptide containing residues

Thr2253-Gln2270 within factor VIII C2 domain that effectively inhibits factor Xa-catalyze( factor VIII activation. Br. J. Haematol., 116: 868-874 (2002).

28. Saenko, E.L., Ananyeva, N.M., Kouiavskaia, D.V., Khrenov, A.V., Anderson J.A.M., Shima, M., Qian, J. and Scott, D. Hemophilia A: effects of inhibitory antibodie: on factor VIII functional interactions and approaches to prevent their action Haemophilia, 8:1-11 (2002).

29. Nogami K., Shima, M„ Nishiya K., Hosogawa, K., Saenko, E.L., Sakurai, Y. Shibata, M., Tanaka, I., Yoshioka, A. A novel mechanism of factor VIII protection b} von Willebrand factor from activated protein C-catalyzed inactivation. Blood, 99: 3393 3398 (2002).

30. Hakeos, W.H., Miao, H., Sirachainan, N., Kemball-Cook, G., Saenko, E.L. Kaufman, R., and Pipe, S.W., and. Hemophilia A mutations within the factor VIII A2-A; subunit interface destabilize Villa and cause one-stage/two-stage activity discrepancy Thromb. Hemost., 88: 781-787 (2002).

31. Saenko, E.L., Ananyeva, N.M., Tuddenham, E.G. D., and Kemball-Cook, G Factor VIII - novel insights into form and function. Br. J. Haematol., 119:323-33: (2002).

32. Saenko, E.L., Ananyeva, N.M., Kouiavskaia, D., Schwinn, H., Josic, D. Shima, M., Hauser, C., and Pipe, S.W. Molecular defects in coagulation factor VIII an< their impact on factor VIII function. Vox Sanguinis, 83:89-96 (2002).

33. Klinge, J., Ananyeva, N.M., Hauser, C., and Saenko, E.L. "Hemophilia - fron basic science to clinical practice", Seminars Thromb. Haemost.., 28: 309-321 (2002).

34. Saenko, E.L., Ananyeva, N.M., Moayeri, M., Ramezani, A., Hawley, R.G Development of improved factor VIII molecules and new gene transfer approaches fo hemophilia A. Current Gene Therapy, 3:27-41 (2003).

35. Mühle, C., Schulz-Drost, S., Khrenov, A., Saenko, E.L., Klinge, J., Schneider H.: Epitope mapping of polyclonal clotting factor VHI-inhibitory antibodies using phagi display. Thromb. Haemost., 91:619-625 (2004).

36. Saenko, E.L., Ananyeva, N.M., Shima, M., Häuser, C. and Pipe, S.W. Th< future of recombinant coagulation factors. J. Thromb. Haemost., 1:922-930(2003).

37. Sarafanov A. and Saenko E.L. High-throughput optimization of proteii expression in the baculovirus system based on determination of relative expressioi efficiency of viral stocks. Anal. Biochem., 328:98-100(2004).

38. Ananyeva N., Lacroix-Desmazes S., Hauser, C., Ovanesov, M.V., Khrenov A.V., and Saenko E.L. Inhibitors in hemophilia A: mechanisms of inhibition management and perspectives. Blood Coagul. Fibrinol., 15:109-124 (2004).

39. Ananyeva, N., Khrenov, A., Darr, F., Summers, R., Sarafanov, A., and Saenki E. Treating haemophilia A with recombinant blood factors: a comparison. Expert Opin. Pharmacother., 5:1061-1070 (2004).

40. Oldenburg, J., Ananyeva N., and Saenko E. Molecular basis of haemophilia A. Haemophilia, 10(Suppl.4): 133-139(2004).

41. Ананьева H.M., Лакруа-Демаж С., Ованесов М.В., Шима M., Атуллаханов Ф.И., Саенко Е.Л. Ингибиторы при гемофилии А. Часть 1. Механизмы ингибирования фактора VIII. Гематол. и трансфузиол., т. 50, №5, с. 2934 (2005).

42. Ананьева Н.М., Лакруа-Демаж С., Ованесов М.В., Хренов А.В., Шима М., Атуллаханов Ф.И., Саенко Е.Л. Ингибиторы при гемофилии А. Часть 2. Современные подходы для нейтрализации их действия. Гематол. и трансфузиол., т. 50, №6, с. 21-29 (2005).

43. Sarafanov, A., Makogonenko, Е., Pechik, I., Radtke, К.-Р. , Khrenov, А., Ananyeva, N., Strickland, D. and E. Saenko Identification of coagulation factor VIII A2 domain residues forming the binding epitope for low-density lipoprotein receptor-related protein, Biochemistry, 45:1829-1840 (2006).

44. Saenko, E.L. and Pipe, S.W. Strategies toward a longer-acting factor VIII. Haemophilia, 12 (Suppl. 30):42-51 (2006).

45. Suzuki H., Shima M., Nogami K., Sakurai Y., Saenko E.L., and A. Yoshioka. Factor V C2 domain contains a major thrombin-binding site responsible for thrombin-catalyzed factor V activation, J. Thromb. Haemost., 4:1354-1360(2006).

46. Khrenov, A., Ananyeva, N., and Saenko, E. Role of the B-domain in proteolytic inactivation of activated coagulation factor VIII by activated protein С and activated factor X. Blood Coagul. Fibrinol., 17: 379-388 (2006).

47. Saenko, E. and Ananyeva, N. Receptor-mediated clearance of FVIII: implications for pharmacokinetic studies in individuals with Haemophilia, Haemophilia, 12 (Suppl. 4), 15-22 (2006).

48. Sébastien Lacroix-Desmazes, Jagadeesh Bayry, Joseph Reinbolt, Valérie Roussel-Robert, Evgueni L. Saenko, Johan Hoebeke, Michel D Kazatchkine and Srini V Kaveri. Catalytic IgG from patients with Hemophilia A inactivate therapeutic factor VIII. Journal of Immunology, 177:1355-1363 (2006).

49. Muhle, С ., Klinge, J., Khrenov, A. V, Saenko, E. L. and Schneider, H. Spectrum of antigenic FVIII domains recognized by antibodies from haemophiliacs. Haemostaseologie 28 (Suppl. 1), 1-2 (2006).

50. Panteleev, M.A., Ananyeva, N.M., Ataullakhanov, F.I., and Saenko, E.L. Mathematical models of blood coagulation and platelet adhesion: clinical applications, Current Pharmaceutical Design, 13: 1457-1467 (2007).

51. Sarafanov, A.G., Makogonenko, E.M., Andersen, O.M., Mikhailenko, I.A., Ananyeva, N.M., Khrenov, A.V., Shima, M., Strickland, D.K., and Saenko, E.L. Localization of the low-density lipoprotein receptor-related protein regions involved in

binding to the A2 domain of coagulation factor VIII. Thromb. Haemost., 98:1170-118 (2007).

52. Nogami K., Saenko, E.L., Takeyama, M., Gidding, J.C., Yoshioka, A., Shima M. Identification of a thrombin-interactive site within the FVIII A2 domain that i; responsible for the cleavage at Arg372. Br. J. Haematol., 140:433-443 (2008).

53. Ananyeva, N.M., Makogonenko, Y.M., Kouiavskaia, D.V., Ruiz, J., Limburg V., Meijer, A.B., Khrenov, A.V., Shima, M., Strickland, D.K., Saenko E.L. The bindinj sites for the very low density lipoprotein receptor and low-density lipoprotein receptor related protein are shared within coagulation factor VIII. Blood Coagul. Fibrinol. 19:166-177 (2008).

54. Nogami, K., Nishiya, K., Saenko, E.L., Takeyama, M., Tanaka, I., Yoshioka A., Shima, M. Identification of a plasmin-interactive site within the A2 domain of th< factor VIII heavy chain. Biochim. Biophys. Acta. 1784:753-63 (2008).

55. Ananyeva, N.M., Makogonenko, Y.M., Sarafanov, A.G., Pechik, I.V. Gorlatova, N„ Radtke, K.-R., Shima, M., Saenko, E.L.. Interaction of coagulation facto VIII with members of the low-density lipoprotein receptor family follows commoi mechanism and involves consensus residues within the A2 binding site 484-509. Blooi Coagul. Fibrinol., 19:543-55 (2008).

56. Takeyama, M„ Nogami, K., Saenko, E.L., Soeda, T., Nishiya, K., Ogiwara K., Yoshioka, A., Shima, M. Protein S down-regulates factor Xase activity independen of activated protein C: specific binding of factor VIII(a) to protein S inhibits interaction with factor IXa. Br. J. Haematol., 143:409-20 (2008).

57. Nogami K., Nishiya K., Saenko E.L., Takeyama M., Ogiwara, K., Yoshiok; A., Shima M. Identification of a plasmin-interactive sites in the light chain of factor VII responsible for proteolytic cleavage at Lys36. J. Biol. Chem., 284:6934-45 (2009).

58. Takeyama M, Nogami K, Saenko EL, Nishiya K, Ogiwara K, Shima M Identification of a protein S-interactive site within the A2 domain of the factor VII heavy chain. Thromb. Haemost., 102:645-55 (2009).

59. Ananyeva NM, Lee TK, Jain N, Shima M, Saenko EL. Inhibitors ii hemophilia A: advances in elucidation of inhibitory mechanisms and in inhibito management with bypassing agents. Semin. Thromb. Haemost., 35:735-51 (2009).

60. Marlar, R.A., Saenko, E. Editorial: critical need for pediatric hematologists t specialize in hemostasis and thrombosis. Blood Coagul. Fibrinol.., 21 (Suppl 1):1-: (2010).

Публикации в трудах конференций и съездов

1. Saenko, E.L., Scandella, D. The role of the acidic region of the factor VIII light chain in its binding to von Wilebrand factor, XVIth congress of the ISTH, Florence, Italy, June 6-12, 1997. Blood (1997), Abstract 571.

2. Sarafanov, A.G., Ananyeva, N.M., and Saenko, E.L. Activation and Inactivation of the Intrinsic Factor Xase Complex Assembled on Plasma Lipoproteins. 41s' Annual Meeting of the American Society of Hematology, New Orleans, Louisiana, December 37, 1999. Blood (1999), Abstract 457a.

3. Saenko, E.L., Yakhyaev, A.V., Mikhailenko, I., Strickland, D., and Sarafanov, A. Role of the low density lipoprotein-related protein receptor in mediation of catabolism of coagulation factor VIII. XVIl"1 Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Washington, DC, USA, September 15-21, \999.Thromb. Haemost., Supplement, (1999), P.l.

4. Sarafanov, A., Behr, E., and Saenko, E.L. Comparison of coagulation factor VIII binding properties of the two phosphatidylserine-containing surfaces formed on HPA and LI biosensor chips. International BIAsymposium-1999. November 7-10, 1999, San Francisco CA. Biotechniques (1999), 54: 112.

5. Saenko, E.L., Ananyeva, N.M., Josic, D., Schwinn, H., and Sarafanov, A.G. Regulation of the Intrinsic Factor Xase Complex by Plasma Lipoproteins. 16th International Congress on Thrombosis, Porto, Portugal, May 5-8, 2000. Haemostasis, Supplement 1, P. 74 (2000).

6. Saenko, E.L., Sarafanov, A.G., Ananyeva, N.M. Role of cell surface heparan sulfate proteoglycans in factor VIII catabolism. XVIII Congress of the International Society of Thrombosis and Haemostasis Paris, July 6-12, 2001, France. Thromb. Haemost., Supplement, (2001), P. 206.

7. Sarafanov, A., Ananyeva, N., Shima, M., and Saenko, E. L. Role of cell surface heparan sulfate proteoglycans in fVIII catabolism. XVIII Congress of the International Society of Thrombosis and Haemostasis, Paris, France, July 6-12, 2001. Thromb. Haemost., Supplement (2001), Abstract OC867.

8. Saenko, E.L. and Ananyeva, N.M. Target epitopes for factor VIII inhibitors. XXV International Congress of the World Federation of Hemophilia, Seville, Spain, May 19-24, 2002. Hemophilia, Supplement (2002), P. 12-14.

9. Saenko, E.L. and Ananyeva, N.M. "The mechanisms of inactivation of factor VIII by factor VIII inhibitors". XXV International Congress of the World Federation of Hemophilia, Seville, Spain, May 19-24, 2002. Hemophilia, Supplement (2002), P. 115118.

10. Saenko, E.L. and Ananyeva, N. M. Role of the low-density lipoprotein-related protein in mediation of FVIII clearance. XXXV Nordic Conference on Coagulation,

Reykjavik, August 10-13, 2002, Molecular Medicine. Proceedings of the XXXV Nordi Conference on Coagulation, 2002, P. 24.

11. Saenko, E. LRP mediated catabolism of factor VIII. XIX Congress o International Society of Thrombosis and Haemosytasis, Birmingham, UK, July 12-18 2003. J. Thromb. Haemost., 2003; Supplement 1, Abstract SY05.

12. Sarafanov, A.G., Makogonenko, Y.M., Ananyeva, N.M., Strickland, D.K, Radtke, K-P., and Saenko, E.L. "Identification of residues within the A2 domain of facto VIII critical for binding to low-density lipoprotein receptor-related protein". The 45' Annual Meeting of the American Society of Hematology, San Diego, CA, December 6 9th, 2003. Blood (2003) 102: 88a.

13. Kouiavskaia, D., Ruiz, J., Strickland, D., and Saenko, E.L. Very low densit lipoprotein receptor interacts with coagulation factor VIII. The 45th Annual Meeting o the American Society of Hematology, San Diego, CA, December 6-9th, 2003. Bloo, (2003), 102: 541a.

14. Saenko, E. and Ananyeva, N. The factor VIII protein: its life time and structur function relationship. Hemophilia 2004 World Congress, Bangkok, Thailand, Octobe 17-21, 2004. Haemophilia, 2004; Suppl. 10, Abstract 02 S 01.

15. Makogonenko, E.M., Sarafanov, A.G., Ananyeva, N.M., Strickland, D.K., an Saenko, E.L.Localization of binding sites for low-density lipoprotein receptor i coagulation factor VIII. 47th Annual Meeting of the American Society of Hematology December 10-13, Atlanta, Georgia, USA. Blood (2005) 106, Abstract 1013.

16. Makogonenko, E.M., Sarafanov, A.G., Ananyeva, N.M., Radtke, K.-P Strickland, D.K., and Saenko, E.L.B domain of coagulation factor VIII regulate exposure of its heparin-binding site. 47th Annual Meeting of the American Society c Hematology, December 10-13, 2005, Atlanta, Georgia, USA. Blood (2005) 106, Abstrac 1014.

17. Sarafanov, A.G., Makogonenko, E.M., Andersen, O.M., Khrenov, A.V Mikhailenko, I.A., Ananyeva, N.M., Strickland, D.K., and Saenko, E.L. Fragments c activated coagulation factor VIII bind to multiple sites within low-density lipoprotei receptor-related protein. 47th Annual Meeting of the American Society of Hematology December 10-13, 2005, Atlanta, Georgia, USA. Blood {2005) 106, Abstract 1019.

18. Nogami, K., Shima, M., Nishiya, K., Saenko, E.L., Takeyama, M., Tat sum' K., Tanaka, I., Yoshioka, A. Identification of a plasmin-interactive site within the A domain of the factor VIII heavy chain. 47th Annual Meeting of the American Society c Hematology, December 10-13, 2005, Atlanta, Georgia, USA. Blood (2005) lOf Abstract 1018.

19. Sarafanov, A., Makogonenko, E., Radtke, K-P., Pechik, I., Khrenov, A Ananyeva, N., Strickland, D. and Saenko, E. Identification of Coagulation Factor VIII A Domain Residues Forming the Binding Epitope for Low-Density Lipoprotein Receptoi

Related Protein. XXth Congress of International Society of Thrombosis and Haemosytasis, 5-13 August 2005, Sydney, Australia. J. Thromb. Haemost. (2005) 3, Suppl. 1, Abstract PI840.

20. Sarafanov, A, Makogonenko, E, Andersen, O, Khrenov, A, Mikhailenko, I, Strickland, D, and Saenko, E. Identification of Regions in Low-Density Lipoprotein Receptor-Related Protein Responsible for Interaction with A2 and A1/A3-C1-C2 Portions of Coagulation Factor VIII. XXth Congress of International Society of Thrombosis and Haemosytasis, 5-13 August 2005, Sydney, Australia. J. Thromb. Haemost. (2005) 3, Suppl. 1, Abstract OR248.

21. Makogonenko, Y., Sarafanov, A., Pechik, I., Andersen, O., Ananyeva, N., Radtke, K.-P., Strickland, D. and Saenko, E. The A2 domain of coagulation factor VIII shares residues critical for interaction with three members of LDL receptor superfamily -LRP, VLDL and megalin receptors. XXth Congress of International Society of Thrombosis and Haemosytasis, 5-13 August 2005, Sydney, Australia. J. Thromb. Haemost. (2005) 3, Suppl. 1, Abstract P0646.

22. Panteleev, M.A., Ananyeva, N.M., Ataullakhanov, F.I., Saenko, E.L.. Two subpopulations of activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic fX-activating complex. XXth Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Sydney, Australia, August 6 - 12, 2005 J. Thromb. Haemost. (2005), 3, Suppl. 1, Abstract P0376.

23. Kouiavskaia, D., Ruiz, J., Strickland, D. and Saenko, E. Identification of Factor VIII Binding Sites for Very Low Density Lipoprotein Receptor. XXth Congress of International Society of Thrombosis and Haemostasis, 5-13 August 2005, Sydney, Australia. J. Thromb. Haemost. (2005) 3, Suppl. 1, Abstract PI841.

24. Panteleev, M.A., Ananyeva, N.M., Greco, N.J., Ataullakhanov, F.I., Saenko, E.L.. Factor Villa regulates substrate delivery to the intrinsic factor X-activating complex. XXth Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Sydney, Australia, August 6 - 12, 2005 J. Thromb. Hemost. (2005) 3, Suppl. 1, Abstract PI 242.

25. Saenko, E, Ananyeva, N. Receptor-mediated Catabolism and Clearance of Factor VIII. XXth Congress of International Society of Thrombosis and Haemosytasis, 5-13 August 2005, Sydney, Australia. J. Thromb. Hemost. (2005) 3, Suppl. 1, Abstract SYM36.

26. Panteleev, M.A., Ananyeva, N.M., Ataullakhanov, F.I., Saenko, E.L. Factor Villa regulates substrate delivery to intrinsic factor X-activating complex. 30th FEBS Congress and 9th IUBMB Conference 'The Protein World', Budapest, Hungary, July 2-7, 2005, FEBS J. (2005) 272, Suppl. 1: 405.

27. Ananyeva, N.M., Panteleev, M.A., Greco, N.J., Ataullakhanov, F.I., Saenko, E.L. Factor Villa regulates substrate delivery to the intrinsic factor X-activating complex.

10th Congress of the European Hematology Association, June 2-5, 2005, Stockholrr Sweden, Proceedings of European J. Haematol (2005), Abstract 0312.

28. Saenko, E.L. Regulation of Factor VIII Life-Cycle by Receptors from LD Receptor Superfamily. 36th Haemophilia Symposium, Hamburg, Germany, Novembe 18-19, 2005. Hemophilia Therapy, Editors: W. Schramm and R. Zimmerman! Publisher: Goldener Schnitt, Sinzheim, Germany, Vol. II, 23-33.

29. Saenko, E. The future of recombinant factors. Fifth Bari Interantioni Conference on Hemophilia and Allied Disorders, von Willebrand Factor and Plateli Glycoproteins, Pizzomunno, Vieste del Gargano, Italy, May 22-25, 2005. Materials c the Fifth Bari International Conference (2005), 8.

30. Saenko, E.L., Ananyeva, N.M. Life-cycle of FVIII: Implications for PI Studies in Individuals with Hemophilia. The State of the Art International Symposiui on Pharmacokinetics of Factor Concentrates in Hemophilia, September 29-30, 200! Toronto, Canada. Haemophilia (2006) Suppl. 4, 15-22.

31. Saenko, E.L. Receptor-mediated regulation of FVIII plasma level an clearance. XXth Hemophilia Forum, 16-19 March 2006, Telfs, Austria. Proceedings i the XXh Hemophilia Forum (2006), 5.

Подписано в печать: 07.04.12

Объем: 2,0 усл.п.л. Тираж: 50 экз. Заказ № 7158 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, Проспект Вернадского д.39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Саенко, Евгений Львович

Введение.

ГЛАВА 1. Обзор литературы.

ГЛАВА 2. Материалы и методы.

2.1. Методы изучения молекулярных основ взаимодействия FVIII с vWf и фосфолипидами.

2.2 Методы изучения молекулярных основ взаимодействия FVIII с физиологическими активаторами - тромбином и активированным фактором X.

2.3. Методы изучения молекулярных основ протеолитической инактивации FVIII.

2.4. Методы изучения молекулярных основ инактивации FVIII ингибиторными антителами больных гемофилией А.

2.5. Методы исследования молекулярного механизма рецептор-опосредованного клиренса FVIII из кровотока и регулирования активности FVIII.

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Молекулярные основы взаимодействия FVIII с vWf и фосфолипидами.

3.1.1. Локализация центра связывания для фактора фон Виллебранда на факторе VIII.

3.1.2. Механизм ингибирующего действия vWf на связывание FVIII с фосфолипидами.

3.1.3. Роль кислой области легкой цепи FVIII в формировании центра связывания для vWf.

3.1.4. Влияние активации FVIII на его взаимодействие с vWf и фосфолипидами.

3.1.5. Влияние vWf на взаимодействие легкой и тяжелой цепи в молекуле FVIII.

3.2 Молекулярные основы взаимодействия FVIII с физиологическими активаторами -тромбином и активированным фактором X.

3.2.1. Локализация сайтов связывания тромбина, ответственных за активацию фактора VIII.

3.2.2. Роль С2 домена в связывании FVIII с активированным фактором X.

3.2.3. Ингибиторные антитела к FVIII, предотвращающие его активацию фактором Ха.

3.2.4. Влияние мутаций, обнаруженных в FVIII при гемофилии А, на время жизни активированного FVIII.

3.3 Молекулярные основы протеолитической инактивации FVIII.

3.3.1. Защитное действие ингибиторных антител при инактивации FVIII активированным протеином С.

3.3.2. Защитное действие vWf при инактивации FVIII активированным протеином С.

3.3.3. Механизм ингибирования внутренней теназы протеином S, независимый от активированного протеина С.

3.3.4. Роль В домена при инактивации FVIII активированными протеином С и фактором X.:.

3.3.5. Механизм инактивации FVIII плазмином.

3.4. Молекулярные основы инактивации FVIII ингибиторными антителами больных гемофилией А.

3.4.1. Картирование эпитопов ингибиторных антител больных гемофилией А на молекуле FVIII.

3.4.2. Механизмы инактивации FVIII ингибиторными антителами больных гемофилией А.

3.5. Молекулярный механизм рецептор-опосредованного клиренса FVIII из кровотока и регулирования активности FVIII.

3.5.1. Роль LRP в эндоцитозе и клиренсе FVIII.

3.5.2. Идентификация аминокислотных остатков А2 домена FVIII, формирующих центр связывания для LRP.

3.5.3. Локализация областей LRP рецептора, вовлечённых в связывание с А2 доменом FVIII.

3.5.4. Роль гепаран-сульфат протеогликанов клеточной мембраны в LRP-опосредованном эндоцитозе FVIII.

3.5.5. Регулирование активности внутренней теназы VLDL рецептором.

3.5.6. Молекулярные механизмы взаимодействия FVIII с другими рецепторами из семейства LDL.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фактор VIII"

Актуальность темы

Самые ранние упоминания о болезни несвёртываемости крови (гемофилии) встречаются в Египетских папирусах и в Талмуде. И, действительно, гемофилия А (классическая гемофилия), является одним из самых распространенных наследственных заболеваний свертывания и сопровождается тяжелыми кровотечениями, нередко со смертельным исходом, и спонтанными кровоизлияниями в суставах. Гемофилия А - представляет собой наследственный дефицит фактора VIII (FVIII), который кодируется Х-хромосомой. Эта болезнь поражает приблизительно одного из 5000 мужчин. FVIII был открыт Патеком (1936-37), а в 30-е и 40-е годы были получены грубо очищенные FVIII, но его существование и сама природа гемофилии были предметом споров еще несколько десятилетий, главным образом потому, что в крови присутствует комплекс FVIII с фактором фон Виллебранда (vWf), а не отдельный белок FVIII. Образование комплекса с vWf защищает FVIII от протеаз, преждевременного участия в коагуляции, клиренса и необходимо для поддержания нормального уровня FVIII в циркуляции, так как дефицит vWf или нарушение его связывания с FVIII приводит к вторичному дефициту FVIII.

Каковы же причины отсутствия функционально активного FVIII при гемофилии А? Такими причинами являются большие и малые инсерции и делеции в гене FVIII, появление стоп кодонов, сплайс мутаций и миссенс мутаций. В результате этих мутаций в гене FVIII экспрессируется белок с отсутствующей или нарушенной функциональной активностью, либо экспрессия и/или секреция белка частично или полностью подавлена. Встречается также приобретенная форма гемофилии А, обусловленная развитием аутоантител к FVIII, инактивирующих его функциональную активность.

FVIII является (32-глобулином крови с молекулярным весом 293 кДа, присутствующим в плазме в довольно низкой концентрации равной 0.7 нМ. Являясь прокофактором, в процессе свёртывания крови FVIII активируется тромбином и, в меньшей степени, фактором Xa (FXa). Активированный FVIII нестабилен и спонтанно теряет активность в результате диссоциации на субъединицы, а также протеолитического расщепления активированным протеином С и факторами 1Ха и Ха. При выполнении своей кофакторной роли, FVIIIa связывается с фактором 1Ха на фосфолипидных мембранах в присутствии кальция, формируя комплекс внутренней теназы, который активирует фактор X (FX). Активированный FX, в свою очередь, является протеазой протромбиназного комплекса, генерирующего ключевой фермент свёртывания - тромбин. Поскольку способность "внутренней теназы" активировать FX примерно в 50 раз выше, чем "внешней теназы", состоящей из связанных на мембране тканевого фактора и активированного седьмого фактора [1], недостаток функционально активного FVIII ведёт к недостаточной активации FX по "внутреннему" пути и выражается в кровоточивости.

В нашей работе мы исследовали молекулярные механизмы принципиально важных взаимодействий FVIII с его лигандами на разных стадиях его жизненного цикла. Мы установили механизм взаимодействия FVIII с vWf, происходящего сразу же после секреции FVIII в кровоток и критически важного для выживания FVIII в циркуляции. Были впервые локализованы сайты FVIII, вовлечённые во взаимодействие с vWf и установлен молекулярный механизм диссоциации FVIII с vWf при активации.

В ходе изучения молекулярных механизмов активации FVIII тромбином и активированным FXa были установлены сайты связывания тромбина и FXa на молекуле FVIII ответственные за индивидуальные активационные расщепления FVIII этими протеазами. Были изучены причины спонтанной инактивации активированного FVIII за счёт диссоциации одной из субъединиц и выявлены отдельные аминокислотные остатки, отвечающие за удержание этой субъединицы в составе функционального активированного FVIII.

Нами были изучены молекулярные механизмы протеолитической инактивации FVIII активированным протеином С (АРС) и плазмином, который может быть не менее эффективным, чем АРС инактиватором FVIIIa. Мы также впервые установили механизм рецептор-опосредованного клиренса FVIII из кровотока, идентифицировали сайты FVIII участвующие во взаимодействии с клиренсными рецепторами и отдельные аминокислотные остатки этих сайтов, вносящие наибольший вклад во взаимодействие.

Почему же так важны установленные нами молекулярные механизмы, отвечающие за различные ступени жизненного цикла FVIII? Дело в том, что конструирование принципиально улучшенного рекомбинантного FVIII нового поколения будет, несомненно, производиться путём тонкого усовершенствования природной молекулы FVIII. Несмотря на существующие попытки улучшить свойства FVIII, в частности пролонгировать время жизни FVIII в кровотоке, относительно простыми способами, такими как модификация FVIII с помощью полиэтиленгликоля (PEG), сиалирование молекулы FVIII или даже пришивкой к FVIII молекулы другого белка (альбумина), все эти методы не выдерживают критики с точки зрения долгосрочного безопасного использования подобных препаратов FVIII. Действительно, существуют серьёзные опасения, что PEG накапливается в крови и может быть при долгом употреблении PEG-FVIII токсичен, а изменение метаболического пути FVIII с помощью сиаловой кислоты может существенно изменить иммунный ответ на FVIII у больных гемофилией А и привести к выработке ингибиторных антител к FVIII, что и при использовании нативного FVIII является частым и серьёзным осложнением при лечении гемофилии.

Гораздо более обещающим подходом является создание рекомбинантного полноразмерного FVIII, чьи свойства были бы улучшены по сравнению с природным диким типом FVIII за счёт введения точечных мутаций для модулирования взаимодействия FVIII с вышеперечисленными лигандами, определяющими его жизненный цикл. Полученные нами фундаментальные знания о точном расположении таких функционально важных сайтов на молекуле FVIII, как сайты связывания vWf, тромбина, активированного FX, активированного протеина С, плазмина, остатков отвечающих за стабильность активированного FVIII, а также сайтов связывания клиренсных рецепторов создают основу для модулирования ключевых взаимодействий FVIII в сторону увеличения времени жизни в кровотоке, большей чувстительности FVIII к активации, большей стабильности активированной формы FVIII и её меньшей чувствительности к протеолитической инактивации. В конечном итоге, такой FVIII нового поколения обладал бы значительно улучшенными свойствами в качестве лекарства для лечения гемофилии А.

На самом деле, базируясь на данных фундаментальных исследований настоящей диссертации, уже созданы молекулы FVIII с повышенной устойчивостью активированной формы [2]. А получение рекомбинантного FVIII, обладающего повышенной чувствительностью к активации тромбином [3], подтверждает, что модулирование жизненно важных взаимодействий молекулы FVIII станет возможным в ближайшем будущем и, скорее всего, будет весьма перспективно для создания терапевтических препаратов FVIII нового поколения.

Цель работы. Целью работы явилось систематическое изучение критически важных, ранее неизученных механизмов, ответственных за поддержание уровня FVIII в кровотоке, его функциональную активность, инактивацию и клиренс из циркуляции.

Задачи исследования.

1. Установление молекулярных механизмов связывания FVIII с фактором vWf и диссоциации этого комплекса в результате протеолитической активации.

2. Изучение молекулярных основ узнавания и протеолиза FVIII важнейшими физиологическими активаторами - тромбином и фактором Ха.

3. Выявление молекулярных механизмов протеолитической инактивации FVIII активированным протеином С и плазмином и регулирования этих процессов протеином S и vWf.

4. Локализация важнейших эпитопов связывания гемофилийных ингибиторных антител на молекуле FVIII и установление соотвествующих молекулярных механизмов ингибирования функциональной активности FVIII.

5. Изучение молекулярных механизмов рецептор-опосредованного клиренса FVIII и регуляции его уровня и активности с целью разработки подходов к созданию рекомбинантного терапевтического FVIII нового поколения.

Научная новизна

Установлены основополагающие молекулярные механизмы, определяющие взаимодействия FVIII с лигандами на различных стадиях его жизни - от секреции в кровоток до клиренса из кровотока. Эти механизмы определяют поддержание уровня FVIII в кровотоке, его протеолитическую активацию, инактивацию и клиренс из циркуляции. В частности, были локализованы сайты FVIII, отвечающие за связывание FVIII с vWf, необходимое для защиты FVIII от ч протеолитической деградации, преждевременного связывания с фосфолипидами и клиренсными рецепторами. Изучение механизма активации FVIII, необходимого для диссоциации его комплекса с vWf, позволило установить молекулярные механизмы взаимодействия FVIII с двумя важнейшими протеазами-активаторами: фактором Ха и тромбином. Были локализованы сайты связывания тромбина и FXa на молекуле FVIII и были идентифицированы отдельные аминокислоты в этих сайтах, играющие ключевую роль в связывании. Нами были изучены причины нестабильности активированного FVIII за счёт спонтанной диссоциации его А2 домена. Изучение влияния гемофилийных мутаций на стабильность FVIII позволило идентифицировать ряд аминокислот, определяющих стабильность активированного FVIII. Эти исследования заложили фундамент для создания мутантного FVIII с повышенной устойчивостью по отношению к спонтанной инактивации. Были также изучены молекулярные механизмы инактивации FVIII. В ходе этих исследований нами было впервые показано, что протеин S, являющийся классическим кофактором АРС, способен ингибировать функциональную активность FVIII путём ингибирования связывания FVIII с FIXa.

Наши исследования показали, что эта способность протеина S определяется перекрыванием сайта связывания FIXa и идентифицированного нами сайта связывания протеина S на молекуле FVIII. Нами был открыт и ещё один механизм регулирования протеолитической инактивации FVIII, обусловленный прямой конкуренцией vWf и АРС за общий сайт связывания на молекуле FVIII. Поскольку серьезным осложнением при заместительной терапии гемофилии А является образование антител, связывающих FVIII и ингибирующих его функциональную активность, мы установили важнейшие эпитопы связывания антител больных гемофилией на молекуле FVIII и установили важнейшие молекулярные механизмы инактивации FVIII антителами. Одним из ограничений при заместительной терапия при гемофилии А является относительно короткое время полужизни FVIII. Мы изучили механизмы, отвечающие за регулирование уровня и активности FVIII в кровотоке и определяющие клиренс FVIII из циркуляции. Было показано, что два рецептора из семейства рецепторов липопротеинов низкой плотности, принимают участие в регулировании активированного FVIII и теназного комплекса, собранного на мембранах клеток, участвующих в коагуляции. Были также идентифицированы два других рецептора из семейства рецепторов липопротеинов низкой плотности, принимающих участие в клиренсе FVIII из циркуляции. Были открыты сайты связывания этих рецепторов на молекуле FVIII и установлен молекулярный механизм рецептор-опосредованного клиренса FVIII. Открытие молекулярных основ этого метаболического пути FVIII позволило разработать концепцию создания рекомбинантного FVIII с улучшенными фармакокинетическими характеристиками для более эффективной терапии гемофилии А.

Научно-практическое значение. Гемофилия - это наиболее часто встречающееся генетическое заболевание, поражающее 1 из 5000 мужчин. Главное направление лечения гемофилии А - заместительная терапия, заключающаяся в периодическом введении концентратов FVIII, которые получены либо из плазмы крови доноров, либо рекомбинантным путём. Стоимость импортных препаратов FVIII может составлять более 100 тысяч долларов в год на одного больного гемофилией и более 90% полной стоимости лечения больного. Заместительная терапия совершенствовалась от переливания цельной крови и использования плазмы в 40-х годах, плазменных концентратов в 50-х, криопреципитатов в середине 60-х, лиофилизованных препаратов FVIII, выделенных из плазмы, пригодных для длительного хранения, с конца 60-х до использования рекомбинантного FVIII с начала 90-х годов XX века. Главным преимуществом рекомбинантного FVIII является его несомненная безопасность, а именно практически нулевой риск передачи патогенов, переносимых кровью, что до недавнего времени являлось основной проблемой при использовании препаратов, очищенных из плазмы крови. На данный момент существует несколько импортных рекомбинантных препаратов FVIII, представляющих как полноразмерный FVIII, так и его укороченный, но полностью активный вариант, не содержащий В домена. Поскольку в настоящее время наблюдается устойчивый сдвиг в сторону использования в клинике рекомбинантных препаратов FVIII, стоимость которых выше препаратов FVIII из плазмы, возникает необходимость улучшения свойств рекомбинантного FVIII и создания препаратов FVIII нового поколения с повышенной терапевтической эффективностью. Возможные пути улучшения эффективности FVIII включают повышение устойчивости активированного FVIII за счёт удлинения времени полужизни FVIII в кровотоке, а также улучшения кинетики активации и повышения стабильности молекулы активированного FVIII по отношению к спонтанной и протеолитической инактивации. Наши исследования, в ходе которых были впервые установлены молекулярные механизмы белок-белковых взаимодействий, ответственных за стабильность FVIII, его активацию, инактивацию и клиренс из циркуляции, служат основой для создания FVIII нового поколения для улучшения качества и удешевления терапии больных гемофилией А.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) Локализованы сайты FVIII, ответственные за связывание с vWf, и установлены механизмы образования комплекса FVIII с vWf, а также механизмы диссоциации комплекса при его активации и последующего связывания FVIII с фосфолипидом.

2) Локализованы сайты связывания FVIII, участвующие в связывании важнейших активаторов — тромбина и активированного фактора X и установлены соответствующие молекулярные механизмы активации.

3) Установлены новые механизмы, регулирующие инактивацию FVIIIa, такие как непротеолитический механизм инактивации FVIIIa протеином S, протеолитическая инактивация плазмином, а также прямое vWf-зависимое регулирование инактивации FVIII, катализируемой активированным протеином С.

4) Локализованы важнейшие эпитопы FVIII, связывающие различные классы ингибиторных антител больных гемофилией, и установлены механизмы инактивации FVIII этими антителами.

5) Установлен механизм клиренса FVIII из кровотока, опосредованный рецепторами семейства рецепторов липопротеинов низкой плотности, и установлены механизмы контроля уровня и активности БУШ четырьмя различными рецепторами этого семейства.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Саенко, Евгений Львович

Выводы

1. Исследован механизм взаимодействия фактора VIII с фактором фон Виллебранда:

-идентифицированы гемофилийные мутации Asn694Ile, Arg698Trp, Arg698Leu, Ala284Glu, Ala284Pro, Ser^Leu, Arg531His и охарактеризовано их влияние на стабильность активированной формы FVIII.

3. Изучен молекулярный механизм инактивации FVIII активированным протеином С и плазмином:

-показано, что центральный В домен FVIII ингнбнрует протеолнтическую инактивацию FVIIIa активированным протеином С и FXa.

Благодарности

В первую очередь, мне хочется выразить искреннюю благодарность руководителю моей работы, профессору Фазоилу Иноятовичу Атауллаханову, который не только вдохновил меня на написание работы, но и многократно поддерживал меня необходимыми советами и добрым словом в процессе работы.

Мне также хочется поблагодарить моих сотрудников и коллег, участвовавших в выполнении работы в Американском Красном Кресте и Мерилендском Университете. Это Наталья Михайлова Ананьева, Андрей Гарунович Сарафанов, Алексей Ванатиевич Яхъяев, Михаил Владимирович Ованесов, Алексей Владимирович Хренов, Диана Владимировна Куявская, Игорь Владимирович Печик, Алексей Маркович Белкин, Сергей Ежевский, Сергей Литвинович, Юрий Матзука, Валерий Новохатний, Ирина Михайленко, Николас Греко, Ричард Прескотт, Шелисса Брю, Трем Джемисон, Молли Миглиорини, Ширли Миекка, Вольфганг Мондорф, Доротея Сканделла, Леон Хойер, Дэвид Скотт, Роберт Хаули, Кен Ингхам и Дадли Стрикланд.

Я благодарен моим московским коллегам из ФГБУ Гематологического Научного Центра МЗСР РФ и Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН: Михаилу Александровичу Пантелееву, Елене Ивановне Синауридзе, Анне Николаевне Баландиной, Михаилу Александровичу Ханину, Ольге Александровне Фадеевой, Сергею Сергеевичу Карамзину и Елене Николаевне Липец.

Я также благодарен коллегам из других стран и институтов за многолетнее плодотворное сотрудничество:

• Медицинский Университет и Госпиталь Нары (Нара, Япония) - Мидори Шима, Хироаки Накаи, Йошикатсу Савамото, Кейджи Ногами и Акира Йошиока

• Мичиганский Университет (Анн Арбор, США) - Стивен Пайп и Рендал Кауфман

• Гарвардский Университет (Бостон, США) - Гари Гилберт

• Институт Кордельер (Париж, Франция) - Себастьян Лакруа-Демаж и Шрини Кавери

• Королевский Колледж (Лондон, Великобритания) - Эдвард Тадденхам и Джеффри Кембалл-Кук

• Университет Эрлангена-Нюренберга (Эрланген, Германия) - Йене Клинге, Холмс Шнайдер и Христиана Мюхле

Особую благодарность приношу Елене Капник (Национальные Институты Здоровья, США) за неоценимую помощь в подготовке литературы.

детергентом), который практически не связывался с фосфолипидом (Таблица 3.15). Поскольку пониженная способность образцов 1028 серии конкурировать с 1251-С2 за связывание с NMC-VIII/5 может быть результатом конформационных изменений в С2 домене, мы измерили значение 150 для контрольного образца концентрата FVIII, инактивированного при 100°С в течение 24 часов. Как видно из Таблицы 3.15, значение 150 для этого образца было в 13-50 раз выше, чем для образцов 1021 и 1028 серий, что позволяет сделать заключение о том, что конформационные изменения в образцах серии 1028 далеки от максимально возможных изменений, соответствующих полной денатурации и инактивации контрольного образца FVIII. Из Таблицы 3.15 видно также, что значения 15о полученные в конкурентном анализе с использованием моноклонального антитела 37, чей эпитоп не перекрывается с сайтами связывания фосфолипида и vWf [168], отличаются для серий 1021 и 1028 значительно меньше, чем в случае использования антитела NMC-VIII/5. Эти данные позволяют сделать следующие выводы: (а) использование конформационно-чувствительного антитела позволило обнаружить конформационные изменения в С2 домене FVIII; (б) эти изменения более выражены в эпитопе антитела NMC-VIII/5, содержащем сайты связывания фосфолипида и vWf, но не в эпитопе антитела 37, не содержащем эти сайты; (в) как может быть заключено из сравнения конкурентной способности образцов серии 1028 и контрольного образца FVIII, пастеризованного в течение 24 часов, изменения в сайте связывания антитела в образце 1028 незначительны по сравнению с денатурированным контрольным образцом. Таким образом, различия в значениях 150, полученных для образцов серии 1021 и 1028 в конкурентном анализе, указывают на малые изменения в конформации С2 домена FVIII в этих образцах.

В данном исследовании мы установили, что пул плазмы является решающим фактором образования антител к FVIII. На самом деле, образцы серий 1021 и 1028, приготовленные с помощью одинаковых процедур из контрольной плазмы США и из бельгийской плазмы с повышенными значениями коагуляционных маркеров, отличались друг от друга по способности связывать фосфолипид и по способности конкурировать с антителами за связывание 1251-С2 домена. Образцы серии 1028 обладали меньшей способностью связываться с фосфолипидом и способностью конкурировать с 1251-С2 доменом, что указывало на конформационные изменения в С2 домене. Эти изменения затрагивали эпитоп антитела NMC-VIII/5, включающий сайт связывания фосфолипида, но не эпитоп антитела 37 (2170-2218). Характерным отличием бельгийской плазмы от контрольной плазмы (США) было присутствие в бельгийской плазме 40 кДа протеолитического фрагмента тяжёлой цепи FVIII, являющегося ранним индикатором будущих конформационных изменений в С, наиболее проявляющихся после выполнения процедур вирусной инактивации, таких как обработка детергентом и пастеризация. Интересно, что эти процедуры не являются главной причиной конформационных изменения, так как свойства образов 1021 серии приготовленных из плазмы США, не содержавшей 40 кДа фрагмент, лишь незначительно зависели от процедур вирусной инактивации (Таблица 3.15). В то же время, мы показали, что комбинация обработки детергентом и пастеризации оказывает критическое действие на образцы приготовленные из бельгийской плазмы, так как образец 1028В не связывается с фосфолипидом и имеет значительно пониженную в сравнении с другими образцами 1028 серии способность связываться с NMC-VIII/5 в конкурентном анализе. Поскольку образцы серии 1028 были приготовлены из той же плазмы и с помощью тех же процедур, что и концентраты коммерческие OCTAVI SDP и BISINACT, чьё использование вызывало образование антител специфичных к С2 домену FVIII, мы заключили, что обнаруженные нами конформационные изменения в С2 домене являются причиной возникновения таких антител. Поскольку конформационные изменения не были обнаружены в С2 домене образцов 1021 серии, приготовленных из контрольной плазмы США, мы заключили, что именно источник плазмы является причиной конформационных изменений в С2 домене FVIII, проявляющихся при проведении процедур вирусной инактивации. Сами же по себе процедуры вирусной инактивации, такие как обработка детергентом и пастеризация, не вызывают конформационных изменений в С2 домене FVIII, приготовленного из качественной плазмы, не подверженной протеолизу, детектируемому по появлению 40 кДа протеолитического фрагмента тяжелой цепи FVIII. Таким образом, именно частичный протеолиз исходного сырья для приготовления концентрата FVIII и является главной причиной образования антител к FVIII, имеющим эпитоп в С2 домене, обнаруженных при использовании концентратов OCTAVI SDP и BISINACT, приготовленных из некондиционной бельгийской плазмы.

Антитела, вырабатывающиеся к FVIII у больных гемофилией имеют поликлональную природу и узнают эпитопы в различных доменах FVIII. Мы систематически исследовали распределение эпитопов антител выделенных из плазмы больных гемофилией А. В этом исследовании было использовано 23 плазмы пациентов с гемофилией А, которых лечили коммерческими концентратами FVIII средней чистоты, приготовленными из плазмы крови, или рекомбинантными полноразмерными FVIII (Recombinate или Kogenate). Все больные имели тяжелую форму гемофилии А, так как активность FVIII в крови не превышала 2% [288]. Специфичность ингибиторных антител исследовалась двумя методами: нейтрализацией определённым доменом или пептидом FVIII и иммунопреципитацией мечеными фрагментами FVIII. Первый метод позволяет определить процент антител, нейтрализуемых определённым фрагментом, что характеризует, насколько популяция антител, узнающих этот фрагмент, ответственна за общий ингибиторный титр антитела. Иммунопреципитация с использованием меченых фрагментов позволяет определить количество антител, связывающихся с определённым фрагментом. Поскольку далеко не все связывающиеся с FVIII антитела ингибируют его функциональную активность, наличие антител к определённому фрагменту FVIII не обязательно означает высокий ингибиторный титр этих антител, определяющий их ингибиторную способность. В Таблице 3.16 [289] показаны результаты нейтрализации ингибиторного титра 21 одной ингибиторной плазмы больных тяжёлой формой гемофилии А, которых лечили препаратами FVIII, приготовленными из плазмы крови. Как видно из Таблицы 3.16, состав ингибиторных антител сложен, так как они как правило включают антитела к А2 домену и лёгкой цепи (АЗ-С1-С2). Поскольку почти все ингибиторные антитела были в значительной степени нейтрализованы С2 доменом, на основании наших исследований можно заключить, что он содержит один из главных ингибиторных эпитопов [288,289].

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Саенко, Евгений Львович, Москва

1. Krishnaswamy S, Field KA, Edgington TS, Morrisey JH, Mann KG. Role of the membrane surface in the activation of human coagulation factor X. J Biol Chem 1992; 267: 26110-26120.

2. Wakabayashi, H. Varfaj F., DeAngelis, J., and Fay, P. J. Generation of enhanced stability factor VIII variants by replacement of charged residues at the A2 interface. Blood 2008,112:2761-2769.

3. Voorberg J, van Stempvoort G, Bos JM, Mertens K, van Mourik JA, Donath MJ. Enhanced thrombin sensitivity of a factor VHI-heparin cofactor II hybrid. J Biol Chem 1996; 271: 20985-20988.

4. Mann, K. G., Nesheim, M. E., and Church, W. R. Surface-dependent reactions of the vitamin K-dependent enzyme complexes. Blood 1990, 76: 1-16.

5. Morrissey, J. H., Macik, B. G., Neuenschwander, P. F., and Comp, P. C. Quantitation of activated factor VII levels in plasma using a tissue factor mutant selectively deficient in promoting factor VII activation. Blood 1993, 81: 734-744.

6. Bom, V. J., Bertina, and R.M. The contribution of Ca2+, phospholipids and tissue-factor apoprotein to the activation of human blood coagulation factor X by activated factor VII. Biochemical Journal 1990,265: 327-336.

7. Osterud B, Rapaport SI. Activation of factor IX by the reaction product of tissue factor and factor VII: additional pathway for initiating blood coagulation. Proc Natl Acad Sci USA 1977; 74: 5260-5264.

8. Brass, L. F. Thrombin and platelet activation. Chest 2003, 124: 18S-25S.

9. Mann, K. G. and Kalafatis, M. Factor V: a combination of Dr Jakyll and Mr Hyde. Blood 2003,101:20-30.

10. Fay PJ. Subunit structure of thrombin-activated human factor Villa. Biochem BiophysActa 1987; 952: 181-190.

11. Ahmad SS, Rawala-Sheikh R, Walsh PN. Components and assembly of the factor X activating complex. Sem Thromb Hemostas 1992; 18: 311-323.

12. Mann, K. G., Krishnaswamy, S., and Lawson, J. H. Surface-dependent hemostasis. Semin.Hematol. 1992,29: 213-226.

13. Hockin, M. F., Jones, K. C., Everse, S.J., Mann, and K.G. A model for stoichiometric reagulation of blood coagulation. The Journal of Bological Chemistry 2002,277: 18322-18333.

14. Girard, T.J., Warren, L.A., Novotny, W.F., and et al. Functional significance of the Kunitz-type inhibitoiy domains of lipoprotein-associated coagulation inhibitors. Nature 1989; 338: 518-520.

15. Cawthern, K. M., van't Veer, C., and Lock, J. B. Blood coagulation in hemophilia A and hemophilia C. Blood 91, 4581-4592. 1998.

16. Nesheim, M. E., Tashwell, J. B., and Mann, K. G. The contribution of bovine Factor V and Factor Va to the activity of prothrombinase. The Journal of Biological Chemistry 1979,254: 10952-10962.

17. Olson, S. T., Bjork, I., Shore, and J.D. Kinetic characterization of heparin-catalyzed and uncatalyzed inhibition of blood coagulation proteinases by antithrombin. Methods inEnzymology 1993, 222: 525-559.

18. Seligsohn, U. Factor IX deficiency. J.Thromb.Hemost. 1993,70:68-71.

19. Gailani, D. and Broze, G. J. Factor XI activation in a revised model of blood coagulation. Science 1991, 253: 909-912.

20. Colman RW. Contact activation pathway: Inflammatory, fibrinolytic, anticoagulant, antiadhesive and antiangiogenic activities. Hemostasis and Thrombosis: Basic Principles and Clinical Practice. 2001; 103-121.

21. Otto J. An Account of an hemorrhagic disposition existing in certain families. Med Repos 1803; 6: 1-4.

22. Brinkhous K. Clotting defect in hemophilia: Deficiency in a plasma factor required for platelet utilization. Proc Soc Exp Biol Med 1947; 66: 117.

23. Mann KG. Biochemistry and physiology of blood coagulation. Thromb Haemost 1999; 82: 165-174.

24. Ovanesov MV, Lopatina EG, Saenko EL, Ananyeva NM, Ul'yanova LI, Plyushch OP, Butilin AA, Ataullakhanov FI. Effect of factor VIII on tissue factor-initiated spatial clot growth. Thromb Haemost 2003; 89: 235-242.

25. Hoffman M, Monroe DM, III. The action of high-dose factor Vila (FVIIa) in a cell-based model of hemostasis. Semin Hematol 2001; 38:6-9.

26. Saenko EL, Ananyeva NM. Hemophilia A: role of factor VIII in coagulation. In: Lee CA, Berntorp EE, Hoots WK (editors). Texbook of Hemophilia. Balckwell Publishing, 2005; 27-33.

27. Klinge J, Ananyeva NM, Hauser CA, Saenko EL. Hemophilia A-from basic science to clinical practice. Semin Thromb Hemost 2002; 28: 309-322.

28. Fernandez-Palazzi F, Hernandez SR, De Bosch NB, De Saez AR. Hematomas within the iliopsoas muscles in hemophilic patients: the Latin American experience. Clin Orthop 1996; 19-24.

29. Mannucci PM. Hemophilia: treatment options in the twenty-first century. J Thromb Haemost 2003; 1: 1349-1355.

30. Lee C. The use of recombinant factor VIII products in previously treated patients with hemophilia A: pharmacokinetics, efficacy, safety, and inhibitor development. Semin Thromb Hemost 2002; 28: 241-246.

31. Lusher JM. First and second generation recombinant factor VIII concentrates in previously untreated patients: recovery, safety, efficacy, and inhibitor development. Semin Thromb Hemost 2002; 28:273-276.

32. Ananyeva N, Khrenov A, Darr F, Summers R, Sarafanov A, Saenko E. Treating haemophilia A with recombinant blood factors: a comparison. Expert Opin Pharmacother 2004; 5: 1061-1070.

33. Gruppo RA, Brown D, Wilkes MM, Navickis RJ. Comparative effectiveness of full-length and B-domain deleted factor VIII for prophylaxis~a meta-analysis. Haemophilia 2003; 9: 251-260.

34. Morfini M, Cinotti S, Bellatreccia A, Paladino E, Gringeri A, Mannucci PM. A multicenter pharmacokinetic study of the B-domain deleted recombinant factor VIII concentrate using different assays and standards. J Thromb Haemost 2003; 1: 2283-2289.

35. Saenko E, Josic D, Stadler M, Sarafanov A, Lim Y-P, Shima M, Ananyeva N, Schwinn H. Molecular modifications in factor VIII concentrates produced from different plasma pools. Thromb Res 2001; 101: 501-511.

36. Saenko EL, Ananyeva N, Kouiavskaia D, Schwinn H, Josic D, Shima M, Hauser CA, Pipe S. Molecular defects in coagulation Factor VIII and their impact on Factor VIII function. Vox Sang 2002; 83: 89-96.

37. Pipe SW, Kaufman RJ. Characterization of a genetically engineered inactivation-resistant coagulation factor Villa. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 1185111856.

38. Gale A J, Radtke KP, Cunningham MA, Chamberlain D, Pellequer JL, Griffin JH. Intrinsic stability and functional properties of disulfide bond-stabilized coagulation factor Villa variants. J Thromb Haemost 2006; 4: 1315-1322.

39. Radtke, K. P., Griffin, J. H., Riceberg, J., and Gale, A. J. Disulfide bond-stabilized factor Villa activity and improved potency in whole blood clotting assays. J.Thromb.Hemost. 2007, 5: 102-108.

40. Barrow RT, Healey JF, Gailani D, Scandella D, Lollar P. Reduction of the antigenicity of factor VIII toward complex inhibitory antibody plasmas using multiply-substituted hybrid human/porcine factor VIII molecules. Blood 2000; 95: 564-568.

41. Pipe, S. W. Coagulation Factors with Improved Properties for Hemophilia Gene Therapy. Seminars in Thrombosis and Hemostasis 2004, 30: 227-237.

42. Saenko E.L., Ananyeva, N. M., Shima M., Hauser, C. A. E., and Pipe, S. W. The future of recombinant coagulation factors. J Thromb Haemost 2003, 1: 1-8.

43. Oldenburg J, Brackmann HH, Schwaab R. Risk factors for inhibitor development in hemophilia A. Haematologica 2000; 85: 7-13.

44. Scharrer I, Bray GL, Neutzling O. Incidence of inhibitors in haemophilia A patients~a review of recent studies of recombinant and plasma-derived factor VIII concentrates. Haemophilia 1999; 5: 145-154.

45. Hoots WK, Lusher J. High-titer inhibitor development in hemophilia A: lack of product specificity. J Thromb Haemost 2004; 2: 358-359.

46. Aledort LM. Comparative thrombotic event incidence after infusion of recombinant factor Vila versus factor VIII inhibitor bypass activity. J Thromb Haemost 2004; 2: 1700-1708.

47. Ehrenforth S, Kreuz W, Scharrer I, Linde R, Funk M, Gungor T, Krackhardt B, Kornhuber B. Incidence of development of factor VIII and factor IX inhibitors in haemophiliacs see comments. Lancet 1992; 339: 594-8.

48. Brackmann HH, Oldenburg J, Schwaab R. Immune tolerance for the treatment of factor VIII inhibitors-twenty years' 'bonn protocol'. Vox Sang 1996; 70 Suppl 1: 30-35.

49. Klinge J, Auerswald G, Budde U, Klose H, Kreuz W, Lenk H, Scandeila D. Detection of all anti-factor VIII antibodies in haemophilia A patients by the Bethesda assay and a more sensitive immunoprecipitation assay. Haemophilia 2001; 7: 26-32.

50. Qian J, Borovok M, Bi L, Kazazian HH, Jr., Hoyer LW. Inhibitor antibody development and T cell response to human factor VIII in murine hemophilia A. Thromb Haemost 1999; 81: 240-244.

51. Koshihara K, Qian J, Lollar P, Hoyer LW. Immunoblot cross-reactivity of factor VIII inhibitors with porcine factor VIII. Blood 1995; 86: 2183-2190.

52. Vehar GA, Keyt B, Eaton D, Rodriguez H, O'Brien DP, Rotblat F, Oppermann H, Keck R, Wood WI, Harkins RN, Tuddenham EGD, Lawn RM, Capon DJ. Structure of human factor VIII. Nature 1984; 312:337-342.

53. Fay P.J., Chavin, S. I., Malone, J. E., Schroeder, D., Young, F. E., and Marder, V. J. The effect of carbohydrate depletion on procoagulant activity and in vivo survival of highly purified human factor VIII. Biophys Biochim Acta 1984, 800: 152-158.

54. Michnick DA, Pittman DD, Wise RJ, Kaufman RJ. Identification of individual tyrosine sulfation sites within factor VIII required for optimal activity and efficient thrombin cleavage. J Biol Chem 1994; 269: 20095-20102.

55. Pan Y, DeFay T, Gitschier J, Cohen FE. Proposed structure of the A domains of factor VIII by homology modeling. Nature Struct Biol 1996; 2: 740-744.

56. Pemberton S, Lindley P, Zaitsev V, Card G, Tuddenham EGD, Kemball-Cook G. A molecular model for the triplicated A domains of human factor VIII based on the crystal structure of human ceruloplasmin. Blood 1997; 89: 2413-2421.

57. Pratt KP, Shen BW, Takeshima K, Davie EW, Fujikawa K, Stoddard BL. Structure of the C2 domain of human factor VIII at 1.5 A resolution. Nature 1999; 402: 439-442.

58. Lollar P, Hill-Eubanks DC, Parker CG. Association of the factor VIII light chain with von Willebrand factor. J Biol Chem 1988; 263: 10451-10455.

59. Vlot, A. J., Koppelman, S. J., van den Berg, M. H., Bouma, B. N., and Sixma, J. J. The affinity and stoihiometry of binding of human factor VIII to von Willebrand factor. Blood 1995, 85: 3150-3157.

60. Leyte A, Verbeet MP, Brodniewicz-Proba T, van Mourik JA, Mertens K. The interaction between human blood-coagulation factor VIII and von Willebrand factor; characterization of a high-affinity binding site on factor VIII. Biochem J 1989; 257: 679-683.

61. Saenko EL, Scandella D. The acidic region of the light chain and the C2 domain together form a high affinity binding site for von Willebrand factor. J Biol Chem 1997; 272:18007-18014.

62. Tuley EA, Gaucher C, Jorieux S, Worrall NK, Sadler JE, Mazurier C. Expression of von Willebrand factor "Normandy": an autosomal mutation that mimics hemophilia A. Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: 6377-6381.

63. Lenting PJ, Donath MJSH, van Mourik JA, Mertens K. Identification of a binding site for blood coagulation factor IXa on the light chain of human factor VIII. J Biol Chem 1994; 269: 7150-7155.

64. Foster PA, Fulcher CA, Houghten RA, Zimmerman TS. Synthetic factor VIII peptides with amino acid sequences contained within the C2 domain of factor VIII inhibit factor VIII binding to phosphatidylserine. Blood 1990; 75: 1999-2004.

65. Hill-Eubanks DC, Parker CG, Lollar P. Differential proteolytic activation of factor VIII-von Willebrand factor complex by thrombin. Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86: 6508-6512.

66. Heijnen FG, Koedam JA, Sandberg H, Beeser-Visser NH, Slot JW, Sixma J J. Characterization of human factor VIII and interaction with von Willebrand factor. An electron microscopic study. Eur JBioche 1990; 194:491-498.

67. Fay PJ, Walker FJ. Inactivation of human factor VIII by activated protein C: evidence that the factor VIII light chain contains the activated protein C binding site. Biochem BiophysActa 1989; 994: 142-148.

68. Fay PJ, Coumans J-V, Walker FJ. von Willebrand factor mediates protection of factor VIII from activated protein C-catalyzed inactivation. J Biol Chem 1991; 266:2172-2177.

69. Hamer RJ, Koedam JA, Beeser-Visser NH, Bertina RM, van Mourik JA, Sixma JJ. Factor VIII binds to von Willebrand factor via its Mr-80,000 light chain. Eur J Bioche 1987; 166: 37-43.

70. Foster PA, Fulcher CA, Houghten RA, Zimmerman TS. An immunogenic region within residues Vall670-Glul684 of the factor VIII light chain induces antibodies which inhibit binding of factor VIII to von Willebrand factor. J Biol Chem 1988; 263: 5230-5234.

71. Leyte A, van Schijndel HB, Niehrs C, Huttner WB, Verbeet MP, Mertens K, van Mourik JA. Sulfation of tyrl680 of human blood coagulation factor VIII is essential for the interaction of factor VIII with von Willebrand factor. J Biol Chem 1991;266:740-746.

72. Zhang B, McGee B, Yamaoka JS. Combined deficiency of factor V and factor VIII is due to mutations in either LMAN1 or MCFD2. Blood 2006; 107: 19031907.

73. Miao HZ, Sirachainan N, Palmer L, Kucab P, Cunningham MA, Kaufman RJ, Pipe SW. Bioengineering of coagulation factor VIII for improved secretion. Blood 2004; 103: 3412-3419.

74. Eaton DL, Wood WI, Eaton D, Hass PE, Hollingshead P, Wion K, Mather J, Lawn RM, Vehar GA, Gorman C. Construction and characterization of an active factor VIII variant lacking the central one-third of the molecule. Biochemistry 1986; 25: 8343-8347.

75. Jankowski MA, Patel H, Rouse JC, Marzilli IA, Weston SD, Sharpe PJ. Defining "full-length" recombinant factor VIII: a comparative stuctural analysis. Haemophilia 2007; 13: 30-37.

76. Bovenschen N, Rijken DC, Havekes LM, van Vlijmen BJ, Mertens K. The B domain of coagulation factor VIII interacts with the asialoglycoprotein receptor. J Thromb Haemost 2005; 3: 1257-1265.

77. Mikaelsson M, Oswaldsson U, Jankowski MA. Measurement of factor VIII activity of B-domain deleted recombinant factor VIII. Semin Hematol 2001; 38: 13-23.

78. Mikaelsson M, Oswaldsson U, Sandberg H. Influence of phospholipids on the assessment of factor VIII activity. Haemophilia 1998; 4: 646-650.

79. Hubbard, A.R., Weller LJ, Bevan SA. Activation profiles of factor VIII in concentrates reflect one-stage/chromogenic potency discrepancies. Br J Haematol 2002; 117: 957-960.

80. Fay PJ, Beattie TL, Regan LM, O'Brien LM, Kaufman RJ. Model for the factor Villa-dependent decay of the intrinsic factor Xase. Role of subunit dissociation and factor IXa-catalyzed proteolysis. J Biol Chem 1996; 271: 6027-6032.

81. Fay PJ, Smudzin TM. Characterization of the interaction between the A2 subunit and A1/A3-C1-C2 dimer in human factor VIIIa. J Biol Chem 1992; 267:1324613250.

82. Lollar P, Parker ET, Fay PJ. Coagulant properties of hybrid human/porcine factor VIII molecules. J Biol Chem 1992; 267: 23652-23657.

83. Lollar P, Knutson GJ, Fass DN. Stabilization of thrombin-activated porcine factor VIII:C by factor IXa phospholipid. Blood 1984; 63: 1303-1308.

84. Mathur A, Zhong D, Sabharwal AK, Smith KJ, Bajaj SP. Interaction of Factor IXa with Factor Villa. J Biol Chem 1997; 272: 23418-23426.

85. Gilbert GE, Arena AA. Activation of the factor Villa-factor IXa enzyme complex of blood coagulation by membranes containing phosphatidyl-L-serine. J Biol Chem 1996; 271:11120-11125.

86. Lenting PJ, van de Loo JW, Donath MJ, van Mourik JA, Mertens K. The sequence Glul 811 -Lys 1818 of human blood coagulation factor VIII comprises a binding site for activated factor IX. J Biol Chem 1996; 271:1935-1940.

87. Fay PJ, Beattie T, Huggins CF, Regan LM. Factor Villa A2 subunit residues 558565 represent a factor IXa interactive site. J Biol Chem 1994; 269: 20522-20527.

88. Jorquera JI, McClintock RA, Roberts JR, MacDonald RA, Houghten RA, Fulcher CA. Synthetic peptides derived from residues 698 to 710 of factor VIII inhibit factor IXa activity. Circulation 1992; 86: 685a.

89. Liles DK, Montoe DM, Roberts HR. The factor VIII peptide consisting of amino acids 698 to 712 enhances factor IXa cleavage of factor X. Blood 1997; 90:463a.

90. Jenkins PV, Freas J, Schmidt KM, Zhou Q, Fay PJ. Mutations associated with hemophilia A in the 558-565 loop of the factor Villa A2 subunit alter the catalytic activity of the factor Xase complex. Blood 2002; 100: 501-508.

91. Fay PJ. Activation of factor VIII and mechanisms of cofactor action. Blood Rev 2004; 18: 1-15.

92. Fay PJ, Scandella D. Human inhibitor antibodies specific for the factor VIIIA2 domain disrupt the interaction between the subunit and factor IXa. J Biol Chem1999; 274: 29826-29830.

93. Jenkins PV, Dill JL, Zhou Q, Fay PJ. Clustered basic residues within segment 484-510 of the factor Villa A2 subunit contribute to the catalytic efficiency for factor Xa generation. J Thromb Haemost 2004; 2: 452-458.

94. Lollar P, Parker CG. pH-dependent denaturation of thrombin-activated porcine factor VIII. J Biol Chem 1990; 265: 1688-1692.

95. Fay PJ, Haidaris PJ, Huggins CF. Role of the COOH-terminal acidic region of A1 subunit in A2 subunit retention in human factor Villa. J Biol Chem 1993; 268: 17861-17866.

96. Fay PJ, Haidaris PJ, Smudzin TM. Human factor VIIIa subunit structure. Reconstitution of factor VIIIa from the isolated A1/A3-C1-C2 dimer and A2 subunit. J Biol Chem 1991; 266: 8957-8962.

97. Mertens K, Bertina RM. Activation of human blood coagulation factor VIII by activated factor X, the common product of the intrinsic and the extrinsic pathway of blood coagulation. Thromb Haemost 1982; 47: 96-101.

98. Hoyer LW, Trabold NC. The effect of thrombin on human factor VIII. J Lab Clin Med 1981; 97: 50-56.

99. Regan LM, Fay P J. Cleavage of factor VIII light chain is required for maximal generation of factor Villa activity. J Biol Chem 1995; 270: 8546-8552.

100. Donath M-JSH, Lenting PJ, van Mourik JA, Mertens K. The role of cleavage of the light chain at positions argl689 or argl721 in subunit interaction and activation of human blood coagulation factor VIII. J Biol Chem 1996; 270: 36483655.

101. Hill-Eubanks DC, Lollar P. von Willebrand factor is a cofactor for thrombin-catalyzed cleavage of the factor VIII light chain. J Biol Chem 1990; 265: 1785417858.

102. Koedam JA, Hamer RJ, Beeser-Visser NH, Bouma BN, Sixma JJ. The effect of von Willebrand factor on activation of factor VIII by factor Xa. Eur J Biochem 1990; 229-234.

103. Donath M-JSH, Lenting PJ, van Mourik JA, Mertens K. Kinetics of factor VIII light-chain cleavage by thrombin and factor Xa. A regulatory role of the factor VIII heavy-chain region Lys713-Arg740. EurJBioche 1996; 240: 365-372.

104. Kjalke M, Heding A, Talbo G, Persson E, Thomsen J, Ezban M. Amino acid residues 721-729 are required for full factor VIII activity. EurJBioche 1995; 234: 773-779.

105. Kemball-Cook G, Tuddenham EG. The Factor VIII Mutation Database on the World Wide Web: the haemophilia A mutation, search, test and resource site. HAMSTeRS update (version 3.0). Nucleic Acids Res 1997; 25: 128-132.

106. Shima M, Ware J, Yoshioka A, Fukui H, Fulcher CA. An arginine to cysteine amino acid substitution at a critical thrombin cleavage site in a dysfunctional factor VIII molecule. Blood 1989; 74: 1612-1617.

107. Acquila M, Caprino D, Pecorara M, Baudo F, Morfini M, Mori PG. Two novel mutations at 373 codon of FVIII gene detected by DGGE. Thromb Haemost 1993; 69: 392-393.

108. Aly AM, Hoyer LW. Factor VIII-East Hartford (arginine 1689 to cysteine) has procoagulant activity when separated from von Willebrand factor. Journal of Clinical Investigation 1992; 89: 1382-1387.

109. Lamphear BJ, Fay PJ. Factor IXa enhances reconstitution of factor Villa from isolated A2 subunit and A1/A3-C1-C2 dimer. J Biol Chem 1992; 267: 3725-3730.

110. Fay PJ, Mastri M, Koszelak ME, Wakabayashi H. Cleavage of factor VIII heavy chain is required for the functional interaction of A2 subunit with factor IXA. J Biol Chem 2001; 276: 12434-12439.

111. Fay PJ., Jenkins PV. Mutating factor VIII: lessons from structure to function. Blood Revews 2005; 15-27.

112. Brandstetter H, Bauer M, Huber R, Lollar P, Bode W. X-ray structure of clotting factor IXa: active site and module structure related to Xase activity and hemophilia B. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92: 9796-9800.

113. Bajaj SP, Rapaport SI, Maki SL. A monoclonal antibody to factor IX that inhibits the factor VIII:Ca potentiation of factor X activation. J Biol Chem 1985; 260: 11574-11580.

114. O'Brien LM, Medved LV, Fay PJ. Localization of factor IXa and factor Villa interactive sites. J Biol Chem 1995; 270:27087-27092.

115. Fay PJ, Koshibu K. The A2 subunit of factor Villa modulates the active site of factor IXa. J Biol Chem 1998; 273: 19049-19054.

116. Lapan KA, Fay PJ. Localization of a factor X interactive site in the A1 subunit of factor Villa. J Biol Chem 1997; 272: 2082-2088.

117. Nogami K, Wakabayashi H, Ansong C, Fay PJ. Localization of a pH-dependent, A2 subunit-interactive surface within the factor Villa A1 subunit. Biochim Biophys Acta 2004; 1701: 25-35.

118. Fay PJ, Smudzin TM, Walker FJ. Activated protein C-catalyzed inactivation of human factor VIII and factor VIIIa. Identification of cleavage sites and correlation of proteolysis with cofactor activity. J Biol Chem 1991; 266:20139-20145.

119. Regan LM, O'Brien LM, Beattie TL, Sudhakar K, Walker FJ, Fay PJ. Activated protein C-catalyzed proteolysis of factor Villa alters its interactions within factor Xase. J Biol Chem 1996; 271: 3982-3987.

120. Koszelak Rosenblum ME, Schmidt K, Freas J, Mastri M, Fay PJ. Cofactor activities of factor Villa and A2 subunit following cleavage of A1 subunit at Arg336. J Biol Chem 2002; 277: 11664-11669.

121. Nogami K, Wakabayashi H, Fay PJ. Mechanisms of Factor Xa-catalyzed Cleavage of the Factor Villa A1 Subunit Resulting in Cofactor Inactivation. J Biol Chem 2003; 278:16502-16509.

122. Regan LM, Lamphear BJ, Huggins CF, Walker FJ, Fay PJ. Factor IXa protects factor Villa from activated protein C. J Biol Chem 1994; 269: 9445-9452.

123. Roelse JC, Koopman MMW, Btller HR, Ten Cate JW, Montaruli B, van Mourik JA, Voorberg J. Absence of mutations at the activated protein C cleavage sites of factor VIII in 125 patients with venous thrombosis. Br JHaematology 1996; 92: 740-743.

124. Bokarewa MI, Falk G, Bremme K, Blomback M, Wiman B. Search for mutations in the genes for coagulation factors V and VIII with a possible predisposition to activated protein C resistance. Eur J Clin Invest 1997; 27: 340-346.

125. Nogami K, Shima M, Nishiya K, Hosokawa K, Saenko EL, Sakurai Y, Shibata M, Suzuki H, Tanaka I, Yoshioka A. A novel mechanism of factor VIII protection by von Willebrand factor from activated protein C-catalyzed inactivation. Blood 2002; 99: 3993-3998.

126. Kalafatis M, Mann KG. The role of the membrane in the inactivation of factor va by plasmin. Amino acid region 307-348 of factor V plays a critical role in factor Va cofactor function. J Biol Chem 2001; 276: 18614-18623.

127. Samis JA, Ramsey GD, Walker JB, Nesheim ME, Giles AR. Proteolytic processing of human coagulation factor IX by plasmin. Blood 2000; 95: 943-951.

128. Pryzdial EI, Lavigne N, Dupuis N, Kessler GE. Plasmin converts factor X from coagulation zymogen to fibrinolysis cofactor. J Biol Chem 1999; 274: 8500-8505.

129. Moestrup SK, Gliemann J, Pallesen G. Distribution of the alpha 2-macroglobulin receptor/low density lipoprotein receptor-related protein in human tissues. Cell Tissue Res 1992; 269: 375-382.

130. Lundgren S, Carling T, Hjalm G, Juhlin C, Rastad J, Pihlgren U, Rask L, Akerstrom G, Hellman P. Tissue distribution of human gp330/megalin, a putative Ca(2+)-sensing protein. JHistochem Cytochem 1997; 45: 383-392.

131. Neels JG, Horn IR, Van den Berg BMM, Pannekoek H, van Zonneveld A-J. Ligand-receptor interactions of the low density lipoprotein receptor-related protein, a multi-ligand endocytic receptor. Fibrinolysis and Proteolysis 1998; 12: 219-240.

132. Herz J, Strickland DK. LRP: a multifunctional scavenger and signaling receptor. J Clin Invest 2001; 108: 779-784.

133. Strickland DK, Kounnas MZ, Argraves WS. LDL receptor-related protein: a multiligand receptor for lipoprotein and proteinase catabolism. FASEBJ1995; 9: 890-898.

134. Neels JG, van den Berg BM, Mertens K, Pannekoek H, Zonneveld A-J, Lenting P. Activation of factor IX zymogen results in exposure of a binding site for low-density lipoprotein receptor-related protein. Blood 2000; 96: 3459-3465.

135. Iakhiaev A, Pendurtchi UR, Voight J, Ezban M, Rao LVM. Catabolism of factor Vila bound to tissue factor in fibroblasts in the presence and absence of tissue factor pathway inhibitor. J Biol Chem 1999; 274: 36995-37003.

136. Bieri S, Djordjevic JT, Daly NL, Smith R, Kroon PA. Disulfide bridges of a cysteine-rich repeat of the LDL receptor ligand-binding domain. Biochemistry 1995; 34:13059-13065.

137. Titani K, Kumar S, Takio K, Ericsson LH, Wade RD, Ashida K, Walsh KA, Chopek MW, Dadler JE, Fujikawa K. Amino acid sequence of human von Willebrand factor. Biochemistry 1986; 25: 3171-3184.

138. Lollar P, Fay PJ, Fass DN. Factor VIII and factor Villa. Methods Enzymol 1993; 222: 128-143.

139. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976; 72: 248-254.

140. Lollar P, Parker CG, Tracy RP. Molecular characterization of commercial porcine factor VIII concentrate. Blood 1988; 71: 137-143.

141. Fay PJ. Reconstition of human factor VIII from isolated subunits. Arch Biochem Biophys 1988; 262: 525-531.

142. Hay JM, Hull R. An Improved Procedure for the Purification of Protein Fused with Glutathione S-Transferase. BioTechniques 1992; 13: 856-857.

143. Scandella D, Mattingly M, Prescott R. A recombinant factor VIIIA2 domain polypeptide quantitatively neutralizes human inhibitor antibodies which bind to A2. Blood 1993; 82:1767-1775.

144. Saenko EL, Shima M, Rajalakshmi KJ, Scandella D. A role for the C2 domain of factor VIII in binding to von Willebrand factor. J Biol Chem 1994; 269:11601-11605.

145. Persson E, Ezban M, Shymko RM. Kinetics of the interaction between the human factor Villa subunits: effects of pH, ionic strength, Ca2+ concentration, heparin, and activated protein C-catalyzed proteolysis. Biochemistry 1995; 34:1277512781.

146. Barenholz Y, Gibbes D, Litman BJ, Goll J, Thompson TE, Carlson FD. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry 1977; 16: 2806-2810.

147. Munson PJ, Rodbard D. LIGAND: a versatile computerized approach for characterization of ligand-binding systems. Anal Biochem 1980; 107: 220-239.

148. Nesheim ME, Pittman DD, Wang JH, Slonosky D, Giles AR, Kaufman RJ. The binding of 35S-labeled recombinant factor VIII to activated and unactivated human platelets. J Biol Chem 1988; 263:16467-16470.

149. Saenko EL, Scandella D, Yakhyaev AV, Greco N. Activation of factor VIII by thrombin increases its affinity for binding to synthetic phospholipid membranes and activated platelets. J Biol Chem 1998; 273: 27918-27926.

150. Kaufman RJ. Selection and coamplification of heterologous genes in mammalian cells. Methods Enzymol 1990; 185: 537-566.

151. Pittman DD, Kaufman RJ. Site-directed mutagenesis and expression of coagulation factor VIII and V in mammalian cells. Methods Enzymol 1993; 222: 236-261.

152. Walker FJ, Scandella D, Fay PJ. Identification of the binding site for activated protein C on the light chain factors V and VIII. J Biol Chem 1990; 265: 14841489.

153. Jemmerson R, Margoliash E. Preparation of site-specific anti-cytochrome c antibodies and their application. Methods Enzymol 1981; 74: 244-262.

154. Takeshima K, Smith C, Tait J, Fujikawa K. The preparation and phospholipid binding property of the C2 domain of human factor VIII. Thromb Haemost 2003; 89: 788-794.

155. Saenko EL, Shima M, Gilbert GE, Scandella D. Slowed release of thrombin-cleaved factor VIII from von Willebrand factor by a monoclonal and a human antibody is a novel mechanism for factor VIII inhibition. J Biol Chem 1996; 271: 27424-27431.

156. Nogami K, Shima M, Hosokawa K, Suzuki T, Koide T, Saenko EL, Scandella D, Shibata M, Kamisue S, Tanaka I, Yoshioka A. Role of factor VIIIC2 domain in factor VIII binding to factor Xa. J Biol Chem 1999; 274: 31000-31007.

157. Lenting P, ter Maat H, Clijsters PFM, Donath M-JSH, Mourik JA, Mertens KA. Cleavage at arginine 145 in human blood coagulation factor IX converts the zymogen into a factor VIII binding enzyme. J Biol Chem 1995; 270: 1488414890.

158. Jenkins PV, Dill JL, Zhou Q, Fay PJ. Contribution of factor Villa A2 and A3-C1-C2 subunits to the affinity for factor IXa in factor Xase. Biochemistry 2004; 43: 5094-5101.

159. Nogami K, Wakabayashi H, Schmidt K, Fay PJ. Altered interactions between the A1 and A2 subunits of factor Villa following cleavage of A1 subunit by factor Xa. J Biol Chem 2003; 278: 1634-1641.

160. Healey JF, Lubin IM, Saenko EL, Hoyer LW, Scandella D, Lollar P. Residues 484-508 contain a major determinant of the inhibitory epitope in the A2 domain of human factor VIII. J Biol Chem 1995; 270: 14505-14509.

161. Sarafanov A, Saenko E. High-throughput optimization of protein expression in the baculovirus system based on determination of relative expression efficiency of viral stocks. Anal Biochem 2004; 328: 98-100.

162. Kounnas MZ, Haudenschild CC, Strickland DK, Argraves KM. Immunological localization of glycoprotein 330, low density lipoprotein receptor related protein and 39 kDa receptor associated protein in embryonic mouse tissues. In Vivo 1994; 8:343-351.

163. Ananyeva NM, Kouiavskaia DV, Shima M, Saenko EL. Intrinsic pathway of blood coagulation contributes to thrombogenicity of atherosclerotic plaque. Blood 2002; 99: 4475-4485.

164. Lajmanovich A, Hudry-Clergeon G, Freyssinet J-M, Marguerie G. Human factor VIII procoagulant activity and phospholipid interaction. Biochem Biophys Acta 1981; 678:132-136.

165. Nesheim M, Pittman DD, Giles AR, Fass DN, Wang JH, Slonosky D, Kaufman RJ. The effect of plasma von Willebrand factor on the binding of human factor VIII to thrombin-activated human platelets. J Biol Chem 1991; 266: 17815-17826.

166. Foster PA, Fulcher CA, Marti T, Titani K, Zimmerman TS. A major factor VIII binding domain resides within the amino- terminal 272 amino acid residues of von Willebrand factor. J Biol Chem 1987; 262: 8443-8446.

167. Layet S, Girma J-P, Obert B, Peynaud-Debayle E, Bihoreau N, Meyer D. Evidence that a secondary binding and protecting site for factor VIII on von Willebrand factor is highly unlikely. Biochem J1992; 282: 129-137.

168. Ginsburg D, Sadler JE. Von Willebrand disease: A database of point mutations, insertions, and deleltions. Thromb Haemostas 1993; 69: 177-184.

169. Saenko EL, Scandella D. A mechanism for inhibition of factor VIII binding to phospholipid by von Willebrand factor. J Biol Chem 1995; 270: 13826-13833.

170. Precup JW, Kline BC, Fass DN. A monoclonal antibody to factor VIII inhibits von Willebrand factor binding and thrombin cleavage. Blood 1991; 77: 1929-1936.

171. Villard, S., Alfonsi P.A., Leonetti, J. P., and Granier, C. The potent murine fVIII inhibitor antibody ESH8 recognizes a complex discontinous epitope on the C2 domain. Thromb Haemost 2001, Suppl July, 272.

172. Fay, P. J., Anderson, M. T., Chavin, S. I., and Marder, V. J. The size of human factor VIII heterodimers and the effect produced by thrombin. Biochem Biophys Acta 1986: 871,268-278.

173. Nordfang O, Ezban M. Generation of active coagulation factor VIII from isolated subunits. J Biol Chem 1988; 263: 1115-1118.

174. Saenko E.L., Loster K, Josic D, Sarafanov AG. Effect of von Willebrand factor and its proteolytic fragments on kinetics of interaction between the light and heavy chains of human factor VIII. Thromb Res 1999; 96: 343-354.

175. Wise RJ, Dorner AJ, Krane M, Pittman DD, Kaufman RJ. The role of von Willebrand factor multimers and propeptide cleavage in binding and stabilization of factor VIII. J Biol Chem 1991; 266: 21948-21955.

176. Nogami К, Saenko E.L., Takeyama M, Giddings J, Yoshioka A, Shima M. Identification of a thrombin-interactive site within the FVIIIA2 domain that is responsible for the cleavage at Arg372. Br J Haematol 2007; 140: 433-443.

177. Nogami K, Nishiya K, Saenko E.L., Takeyama M, Tanaka I, Yoshioka A, Shima M. Identification of a plasmin interactive site within the A2 domain of the factor VIII heavy chain. Biophys Biochim Acta 2008; 1784: 753-763.

178. Saenko EL, Yakhyaev AV, Mikhailenko I, Strickland DK, Sarafanov AG. Role of the low density lipoprotein-related protein receptor in mediation of factor VIII catabolism. J Biol Chem 1999; 274: 37685-37692.

179. Donath MJS, Lenrting P. J., van Mourik JA, Mertens K. The role of cleavage of the light chain at position Argl689 or ASrgl771 in submit interaction and activation of human blood coagulation factor VIII. J Biol Chem 1995; 271: 2742427431.

180. Neuenschwander PF, Jesty J. Thrombin-activated and factor Xa-activated human factor VIII: differences in cofactor activity and decay rate. Arch Biochem Biophys 1992; 296:426-434.

181. Parker ET, Pohl J, Blackburn MN, Lollar P. Subunit structure and function of porcine factor Xa-activated factor VIII. Biochemistry 1997; 36: 9365-9373.

182. Waxman L, Smith DE, Arcuri KE, Vlasuk GP. Tick anticoagulant peptide (TAP) is a nivel inhibitor of blood coagulation factor Xa. Science 1990; 248: 593-596.

183. Dunwiddie CT, Thombeny NA, Bull HG, Sardana M, Friedman PA, Jacobs JWSE. Antistatin, a leeck-derived inhibitor of factor Xa kinetic analysis of enzyme inhibition and identifiication of the reactive site. J Biol Chem 1989; 264: 16694-16699.

184. Healey JF, Barrow RT, Tamim HM, Lubin IM, Shima M, Scandella D, Lollar P. Residues Glu2181-Val2243 contain a major determinant of the inhibitory epitope in the C2 domain of human factor VIII. Blood 1998; 92: 3701-3709.

185. Denson KWE, Biggs R. Laboratory diagnosis, tests of clotting functions and their standartization. Human blood coagulation, aemostasis and thrombosis. Blackwell Scientific, 1998; 310.

186. Barrowcliffe TW. Comparisons of one-stage and two-stage assays of factor VIII:C. Scand J Haematol 1984; Suppl. 41: 39.

187. Over J. Methodology of the one-stage assays of factor VIII (VIII:C). Scand J Haematol 1984; Suppl. 41: 13.

188. Lollar P, Parker CG. Subunit structure of thrombin-activated porcine factor VIII. Biochemistry 1989; 28: 666-674.

189. Duncan EM, Duncan BM, Tunbridge LJ, Lloyd JV. Familial discrepancy between the one-stage and two-stage factor VIII methods in a subgroup of patients with haemophilia A. Br J Haematol 1994; 87: 846-848.

190. Rudzki Z, Duncan EM, Casey GJ, Neumann M, Favaloro EJ, Lloyd JV. Mutations in a subgroup of patients with mild haemophilia A and a familial discrepancy between the one-stage and two-stage factor VIII:C methods. Br J Haematol 1996; 94:400-406.

191. Montgomery RR, Hathaway WE, Johnson J, Johnson L, Montean W. A variant of von Willebrand's disease with abnormal expression of factor VIII procoagulant activity. Blood 1982; 60: 201-211.

192. Pipe SW, Saenko E, Kaufman RJ. Mild hemophilia A caused by increased rate of factor VIIIA2 subunit dissociation: evidence for non-proteolytic inactivation of factor VIII in vivo. Blood 1999; 93: 176-183.

193. Wakabayashi H, Griffith AE, Fay P. J. Combining mutations of charged residues at the A2 domain interface enheaces factor VIII stability over single point mutations .J Thromb Hemost 2009; 7: 438-444.

194. O'Brien DP, Johnson D, Byfield P, Tuddenham EGD. Inactivation of factor VIII by factor IXa. Biochemistry 1992; 31: 2805-2812.

195. DiScipio RG, Davie EW. Characterization of protein S, a gamma-carboxylglutamic acid containing protein from bovine and human plasma. Biochemistry 1980; 18: 899-904.

196. Walker FJ. Regulation of activated protein C by a new protein. A possible function for bovine protein S. J Biol Chem 1980; 255: 5521-5524.

197. Walker FJ. Regulation of activated protein C by protein S. The role of phospholipid in factor Va inactivation. J Biol Chem 1981; 256: 11128-11131.

198. Harris K, Esmon CT. Protein S is required for bovine platelets to support activated protein C binding and activity. J Biol Chem 1985; 260: 2007-2010.

199. Stern DM, Nawroth PP, Harris K, Esmon CT. Cultured bovine aortic endothelial cells promote activated protein C-protein S-mediatedd inactivation of factor Va. J Biol Chem 1986; 261: 713-718.

200. Comp PC, Esmon CT. Recurrent venous thromboembolism in patients with a partial deficiency of protein S. New EngJofMed 1984; 311: 1525-1528.

201. Comp PC, Noxon RR, Cooper MR, Esmon CT. Familial protein S deficiency is associated with recurrent thrombosis. J Clin Invest 1984; 74: 2082-2088.

202. Heeb MJ, Kojima Y, Hackeng TM, Griffin JH. Binding sites for blood coagulation factor X and protein S involving residues 493-506 in factor Va. Prot Sci 1996; 5: 1883-1889.

203. Koppelman SJ, Hackeng TM, Sixma JJ, Bouma BN. Inhibition of the intrinsic factor X activating complex by protein S: evidence for a specific binding of protein S to factor VIII. Blood 1995; 86: 1062-1071.

204. Mannucci PM, Tripodi A, Bertina RM. Protein S deficiency associated with "juvenile" areterial and venous thromboses. Thromb Haemostas 1986; 55: 440448.

205. Solymoss S, Tucker MM, Tracy PB. Kinetics of inactivation of membrane-bound factor Va by activated protein C. Protein S modulates factor Xa protection. J Biol Chem 1988; 263: 14884-14890.

206. Takeyama M, Nogami K, Saenko E, Nishiya K, Ogiwara K, Shima M. Identification of a protein S-interactive site within the A2 domain of the factor VIII heavy chain. Thromb Haemost 2009; 102: 645-655.

207. O'Brien LM, Huggins CF, Fay PJ. Interacting regions in the A1 and A2 submits of factor VIII identified by zero-length cross-linking. Blood 1997; 90: 3943-3950.

208. Pittman DD, Alderman EM, Tomkinson KN, Wang JH, Giles AR, Kaufman RJ. Biochemical, Immunological, and In Vivo Functional Characterization of B-Domain-Deleted Factor VIII. Blood 1993; 81: 2925-2935.

209. Barrowcliffe TW, Raut S, Sands D, Hubbard AR. Coagulation and chromogenic assays of factor VIII activity: general aspects, standardization, and recommendations. Semin Thromb Hemost 2002; 28:247-256.

210. Li X, Gabriel DA. The physical exchange of factor VIII (FVIII) between von Willebrand factor and activated platelets and the effect of the FVIII B-domain on platelet binding. Biochemistry 1997; 36: 10760-10767.

211. Gruppo RA, Brown D, Wilkes MM, Navickis RJ. Meta-analysis of observational studies of full-lenght and B-domain deleted factor VIII for prophylaxis a meta analysis. Haemophilia 2003; 9: 748-750.

212. Gruppo RA, Brown D, Wilkes MM, Navickis RJ. Increased berackthrough bleeding during prophylkaxis with B-domain deleted factor VIII a robust meta-analytic finding. Haemophilia 2004; 10: 449-451.

213. Gruppo RA, Brown D, Wilkes MM, Navickis RJ. Meta-analytic evidence of increased breakthrough bleeding during prophylaxis with B-domain deleted factor VIII. Haemophilia 2004; 10: 747-750.

214. Khrenov AV, Ananyeva NM, Saenko EL. Role of the B domain in proteolytic inactivation of activated coagulation factor VIII by activated protein C and activated factor X. Blood Coagul Fibrinolysis 2006; 17: 379-388.

215. Zeibdawi AR, Pryzdial EL. Mechanism of factor Va inactivation by plasmin. Loss of A2 and A3 domains from Ca2+ dependent complex of fragments bound to phospholipid. J Biol Chem 2001; 276: 19929-19936.

216. Rick ME, Esmon NL, Krizek DM. Factor IX and von Willebrand factor modify the inactivation of factor VIII by activated protein C. J Lab Clin Med 1990; 115: 415-421.

217. Nogami K, Nishiya K, Saenko E.L., Takeyama M, Ogiwara K, Yoshioka A, Shima M. Identification of plasmin-interactive sites in the light chain of factor VIII responsible for proteolytic cleavage at Lys36. J Biol Chem 2009; 284: 69346945.

218. Zhong, D., Saenko, E., Shima M, Felch M, and Scandella D. Some human inhibitor antibodies interfere with factor VIII binding to factor IX. Blood 1998, 92: 136-142.

219. Bovenschen N, Herz J, Grimbergen JM, Lenting PJ, Havekes LM, Mertens K, van Vlijmen BJ. Elevated plasma factor VIII in a mouse model of low-density lipoprotein receptor-related protein deficiency. Blood 2003; 101: 3933-3939.

220. Brackmann HH, Effenberger E, Hess L, Schwaab R, Oldenburg J. NovoSeven in immune tolerance therapy. Blood Coagul Fibrinolysis 2000; 11 Suppl 1: S39-S44.

221. Ananyeva NM, Lee TK, Jain N, Shima M, Saenko E.L. Inhibitors in hemophilia A: advances in elucidation of inhibitory mechanisms and in inhibitor management with bypassing agents. Semin Thromb Hemost 2009; 35: 735-751.

222. Ananyeva NM, Lacroix-Desmazes S, Hauser CA, Shima M, Ovanesov MV, Khrenov AV, Saenko EL. Inhibitors in hemophilia A: mechanisms of inhibition, management and perspectives. Blood Coagul Fibrinolysis 2004; 15: 109-124.

223. Saenko EL, Ananyeva NM, Kouiavskaia DV, Khrenov AV, Anderson JA, Shima M, Qian J, Scott D. Haemophilia A: effects of inhibitory antibodies on factor VIII functional interactions and approaches to prevent their action. Haemophilia 2002; 8:1-11.

224. Gilles JG, Saintremy JMR. Healthy subjects produce both anti-factor VIII and specific anti- idiotypic antibodies. J Clin Invest 1994; 94: 1496-1505.

225. Gilles JG, Desqueper B, Lenk H, Vermylen J, Saint-Remy J-M. Neutralizing antiidiotype antibodies to factor VIII inhibitors after desensitization in patients with hemophilia A. Journal of Clinical Investigation 1996; 97: 1382-1388.

226. Peerlinck K, Rosendaal FR, Vermylen J. Incidence of inhibitor development in a group of young hemophilia A patients treated exclusively with lyophilized cryoprecipitate. Blood 1993; 81: 3332-3335.

227. Josic D, Stadler M, Buchacher A, Pock K, Robinson S, Schwinn H. Degradation products of factor VIII which can lead to increased immunogenicity. Thromb Haemostas 1997; 576.

228. Saenko E, Josic D, Stadler M, Sarafanov AG, Lim Y-P, Shima M, Anastasius V. Molecular modifications in factor VIII concentrates produced from different plasma pools. Thromb Res 2001; 101:1-11.

229. Barrowcliffe TW, Tubbs JE, Wong MY. Evaluation of factor VIII deficient plasmas. Thromb Haemostas 1993; 70:433-437.

230. Barrowcliffe TW, Kemball-Cook G, Tubbs JE. Inhibitor development and activated factor VIII in concentrates. Thromb Haemostas 1993; 70: 1065-1066.

231. Butzow R, Fukushima D, Twardzik DR, Ruoslahti E. A 60-kD protein mediates the binding of transforming growth factor-beta to cell surface and extracellular matrix proteoglycans. J Cell Biol 1993; 122: 721-727.

232. Barrow RT, Healey JF, Jacquemin M, Saint-Remy J-M, Lollar P. Antigenicity of putative phospholipid membrane-binding residues in factor VIII. Blood 2001; 97: 169-174.

233. Scandella DH, Nakai H, Felch M, Mondorf W, Scharrer I, Hoyer LW, Saenko EL. In hemophilia A and autoantibody inhibitor patients: the factor VIIIA2 domain and light chain are most immunogenic. Thromb Res 2001; 101: 377-385.

234. Scandella D, Mattingly M, de Graaf S, Fulcher CA. Localization of epitopes for human factor VIII inhibitor antibodies by immunoblotting and antibody neutralization. Blood 1989; 74: 1618-1626.

235. Muhle C, Schulz-Drost S, Khrenov AV, Saenko E.L., Klinge J, Schneider H. Epitope mapping of polyclonal clotting factor VHI-inhibitory antibodies using phage display. Thromb Haemost 2004; 91: 619-625.

236. McMullen BA, Fujikawa K, Davie EW, Hedner U, Ezban M. Locations of disulfide bonds and free cysteines in the heavy and light chains of recombinant human factor VIII (antihemophilic factor A). Prot Sci 1995; 4: 740-746.

237. Gilbert GE, Drinkwater D. Specific membrane binding of factor VIII is mediated by O- phospho-L-serine, a moiety of phosphatidylserine. Biochemistry 1993; 32: 9577-9585.

238. Lubin IM, Healey JF, Scandella D, Runge MS, Lollar P. Elimination of a major inhibitor epitope in factor VIII. J Biol Chem 1994; 269: 8639-8641.

239. Scandella D, Timmons L, Mattingly M, Trabold N, Hoyer LW. A soluble recombinant factor VIII fragment containing the A2 domain binds to some humananti-factor VIII antibodies that are not detected by immunoblotting. Thromb Haemostas 1992; 67: 665-671.

240. Azzazy HM, Highsmith WE. Phage display technology: clinical application and recent innovations. Clin Biochem 2002; 35: 425-445.

241. Lacroix-Desmazes S, Moreau A, Sporyanarayana, Bonnemain C, Stieltjes N, Pashov A, Sultan Y, Hoebeke J, Kazatchkine MD, Kaveri SV. Catalytic activity of antibodies against factor VIII in patients with hemophilia A. Nat Med 1999; 5: 1044-1047.

242. Paul S, Mei S, Mody B, Eklund SH, Beach CM, Massey RJ, Hamel F. Cleavage of vasoactive intestinal peptide at multiple sites by autoantibodies. J Biol Chem 1991; 266: 16128-16134.

243. Thiagarajan PR, Dannenbring K, Matssura K, Tramontano A, Gololobov, G., Paul S. Monoclonal antibody light chain with prothrombinase activity. Biochemisty 2000; 39: 6459-6465.

244. Li L, Kaveri S, Tyutyulkova S, Kazatchkine MD, Paul S. Catalytic activity of anti-thyroglobulin antibodies. Ann N YAcad Sci 1995; 764: 570-572.

245. Scott NA, Nunes GL, King SB, Harker LA, Hanson SR. Local delivery of an antithrombin inhibits plalalet-dependent thrombosis. Circulation 1994; 90: 19511955.

246. Gilbert GE, Kaufman RJ, Arena AA, Miao H, Pipe SW. Four hydrophobic amino acids of the factor VIIIC2 domain are constituents of both the membrane-binding and von Willebrand factor- binding motifs. J Biol Chem 2002; 277: 6374-6381.

247. Fijnvandraat K, Celie PH, Turenhout EA, Ten Cate JW, van Mourik JA, Mertens K, Peters M, Voorberg J. A human alloantibody interferes with binding of factor IXa to the factor VIII light chain. Blood 1998; 91: 2347-2352.

248. Nogami K, Shima M, Hosokawa K, Nagata M, Koide T, Saenko E, Tanaka I, Shibata M, Yoshioka A. Factor VIIIC2 domain contains the thrombin-binding site responsible for thrombin-catalyzed cleavageat Arg1689. J Biol Chem 2000; 275: 25774-25780.

249. Morfini M, Longo G, Messori A, Lee M, White G, Mannucci P. Pharmacokinetic properties of recombinant factor VIII compared with a monoclonally purified concentrate (Hemofil M). The Recombinate Study Group. Thromb Haemost 1992; 68:433-5.

250. Fulcher CA, Roberts JR, Holland LZ, Zimmerman TS. Human factor VIII procoagulant protein. Monoclonal antibodies define precursor production relationships and functional epitopes. Journal of Clinical Investigation 1985; 76: 117-124.

251. Lollar P, Parker ET, Curtis JE, Helgerson SL, Hoyer LW, Scott ME, Scandeila D. Inhibition of human factor Villa by human anti-A2 subunit antibodies. Journal of Clinical Investigation 1994; 93: 2497-2504.

252. Schwarz HP, Lenting PJ, Binder B, Mihaly J, Denis C, Dorner F, Turecek PL. Involvement of low-density lipoprotein receptor-related protein (LRP) in the clearance of factor VIII in von Willebrand factor-deficient mice. Blood 2000; 95: 1703-1708.

253. Melman L, Cao ZF, Marzolo MP, Wardell MR, Bu G. High affinity binding of receptor-associated protein to heparin and low-density lipoprotein receptor-related protein requires similar basic amino acid sequence motifs. J Biol Chem 2001; 276: 29338-29346.

254. Sarafanov AG, Ananyeva NM, Shima M, Saenko EL. Cell surface heparan sulfate proteoglycans participate in factor VIII catabolism mediated by low density lipoprotein receptor-related protein. J Biol Chem 2001; 276: 11970-11979.

255. Orlando RA, Exner M, Czekay RP, Yamazaki H, Saito A, Ullrich RKD, and Farquhar MG. Identification of the second cluster of ligand-binding repeats in megalin as a site for receptor-ligand interactions. Proc Natl Acad Sei USA 1997; 94: 2368-2373.

256. Quinn KA, Grimsley PG, Dai YP, Tapner M, Chesterman CN, Owensby DA. Soluble low density lipoprotein receptor-related protein (LRP) circulates in human plasma. J Biol Chem 1997; 272: 23946-23951.

257. Crisp RJ, Knauer DJ, Knauer MF. Roles of the heparin and low density lipid receptor-related protein-binding sites of protease nexin 1 (PNI) in urokinase-PNl complex catabolism. J Biol Chem 2000; 275: 19628-19637.

258. Barrow RT, Healey JF, Lollar P. Inhibition by heparin of thrombin-catalyzed activation of the factor VIII-von Willebrand factor complex. J Biol Chem 1994; 269: 593-598.

259. Barrow RT, Parker ET, Krishnaswamy L, Lollar P. Inhibition by heparin of the human blood coagulation intrinsic pathway factor X activator. J Biol Chem 1994; 269: 26796-26800.

260. Narita M, Bu G, Herz J, Schwartz AL. Two receptor systems are involved in the plasma clearance of tissue- type plasminogen activator (t-PA) in vivo. J Clin Invest 1995; 96: 1164-1168.

261. Mann DM, Romm E, Migliorini M. Delineation of the glycosaminoglycan-binding site in the human inflammatory response protein lactoferrin. JBiol Chem 1994; 269: 23661-23667.

262. Warshawsky I, Broze GJ, Jr., Schwartz AL. The low density lipoprotein receptor-related protein mediates the cellular degradation of tissue factor pathway inhibitor. Proc Natl Acad Sei USA 1994; 91: 6664-6668.

263. Chappell DA, Fiy GL, Waknitz MA, Muhonen LE, Pladet MW. Low density lipoprotein receptors bind and mediate cellular catabolism of normal very low density lipoproteins in vitro. JBiol Chem 1993; 268: 25487-25493.

264. Knauer MF, Kridel SJ, Hawley SB, Knauer DJ. The efficient catabolism of thrombin-protease nexin 1 complexes is a synergistic mechanism that requires both the LDL receptor-related protein and cell surface heparins. JBiol Chem 1997; 272: 29039-29045.

265. Knauer MF, Crisp RJ, Kridel SJ, Knauer DJ. Analysis of a structural determinant in thrombin-protease nexin 1 complexes that mediates clearance by the low density lipoprotein receptor-related protein. JBiol Chem 1999; 274: 275-281.

266. Takahashi S, Sakai J, Fujino T, Hattorf H, Zenimaru Y, Suzuki J, Miyamori I, Yamamoto TT. The very low-density lipoprotein (VLDL) receptor: characterization and functions as a peripheral lipoprotein receptor. JAtheroscler Thromb 2004; 11:200-208.

267. Bovenschen N, van Dijk KW, Havekes LM, Mertens К, van Vlijmen BJ. Clearance of coagulation factor VIII in very low-density lipoprotein receptor knockout mice. Br J Haematol 2004; 126: 722-725.

268. Bovenschen N, Mertens К, Hu L, Havekes LM, van Vlijmen В J. LDL receptor cooperates with LDL receptor-related protein in regulating plasma levels of coagulation factor VIII in vivo. Blood 2005; 106: 906-912.

269. Parker ET, Healey JF, Barrow RT, Craddock HN, Lollar P. Reduction of the inhibitory antibody response to human factor VIII in hemophilia A mice by mutagenesis of the A2 domain B-cell epitope. Blood 2004; 104: 704-710.

270. Lethagen S, Berntorp E, Nilsson IM. Pharmacokinetics and hemostatic effect of different factor VIII/von Willebrand factor concentrates in von Willebrand's disease type III. Ann Hematol 1992; 65: 253-259.

Информация о работе