Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Энтеротропные токсины CLOSTRIDIUM DIFFICILE (токсины А и В) как основа диагностических тестов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Энтеротропные токсины CLOSTRIDIUM DIFFICILE (токсины А и В) как основа диагностических тестов"

РОССИЙСКАЯ АКАЛЕШЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО- МССЛЕДОШЕЛЬСШ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ЭПВДЕРШ)ГИЙ И МИКРОБИОЛОГШ имени ПОЧЕТНОГО АКАДЕМИКА Н. Ф. ГАМАЛЕИ

На правах рукописи

КОРОЛЕВА ВЕБЕРА МАРАТОВНА

ЭНГЕРОТКШШЕ ТОШЛЖ CLOSTRIDIUM DIFFICILE (ТОЙГИНЫ Л И В) КАК ОСНОВА ДИАГНОСТИЧЕСКИХ Г7Г0В

03.00.07 - ШЕкробиология

Автореферат дксозртацкя на соискание ученой степени кандидата медицине!«« йаук

Мэскра - 1992 г.

Работа выполнена в Научно-йсслодовахедьисои институте эти ологии и микробиологии икэни Е Ф. Гамаж I Российской АШ

Научный руководитель - доктор медицинских наук, профессор

Т. И. Сер. еева

Официальные оппоненты - доктор медицинегах наук, профессор

й А.-¿лая

доктор медицинских наук Г. И. Кремлзв

Бг дуная организация - ГШИСК км. к А. Тарасевича Гос. комитет;

сан. -эпвд. надзора Росс йеной Зэдера:

Й- ^ _1992 года в М

Защита состоится " / *" '__ 1992 года в чг

,на заседании Специализированного совета К 001.07.01 в И им. К Гамалеи РАМН (123096, г.Шсква, ул. Гамалеи, 18).

С диссертацией шзаю ознакомиться в библиотеке Ю им. Н. Ф. Гамалеи.

»Ь -Ж.

Автореферат разослан " V " ____ 1992 г.

Ученый секретарь ^поциализкрораиного совета,

доктир медицинских наук Е. И. Коптелова

iäjinCTEKA _____________,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА■ РАБОТЫ

уадькость проблемы. В последние годы в результате широкого и гда необоснованного пркмененкя антибиотиков отмечается учащение гаев кишчных инфекций, зыз.-йпак условно-патогенной югкрофло-

Клоетридш (Кх) дкффицыв относятся к числу микроорганизмов,,' \ логгтееасая роль которых при разшиии антмбдоттокндуцнравзиных »чнш. инфекций проглеяива-гря -ео^ешзо четко.

Кая установлено, CL difficile з 00-100 % наблюдений является >вныш зоабудгаелямя исевдошиЗракозньга "олктов ( ШЮ, отличаю-¡я высокой легальностью (до 50 %) » а таюкэ з 15-20 % случаев -та колитов и дкарейяш заболеваний, возникающих, как правило, з 'льтате иредаствувдей, нерационально проводимой антибиотикоте-34 (Н.Larson, 1978; %G&orgô, 1979; Р. Gulligan, 1981; J.Stephen, 19S0).

Зольную . тревогу в последнее вре:й! вызывают внутрибольничные сот зктероклостридаозсн» обусловленных CL difficile (ЭКЮ у поданных w детей лиадсаго возраста, а у дядей, ослабленных еяьнын цребыэаанем в стационарах ( W. George,1979; A . Zedd,1983; ndar.lSSS).

Согласно поелгдшш д&нида, ведрд^з роа в патогенезе ЗКД кгра-ссюзшж фактора ватоганвоете Cl.difficile«- а именно, зктеро-нй (токсин" А) м s&hoïokchh (toî«сия В) (M.Taylor,1085; ШпзД085; D.Lyerly»188S).

О значимости БВД ноэокошаямюго ярокс.-оэде^ия свидетельствуют ж во яаучеьи» зяутрибольшчных етшзчных жфгкций з США з -1S82 ït„ , noKssssssîe, 'что з 371 случае указанных инфекцкй одна гаябохее частых этиологических агентов яздззяись , lfficile (H. Du Pont.1986).

Хоте за последние 8-10 лег за рубежом разработаны методы лабс-оной диагностики ЭКД, до ¡юсюднего времени п отечественной ла-торной и клиничестой практике ис Были отработаны методические здн л1вдаглостигч таких заоолояаний. В связи о этим этиологи-

- - г -

чеокую рода Cl. difficile среди бактериологически нерасЕифровакньв острых кизечных заболеваний в навей стреме юето только предполагать, так как очень высок остается п^пце&т острых кияечных ккфекщгё (ОКИ) невыясненной этиологии, особенно у детей.

Б связи с вшешложеняш, вопросы разработки каучно-штодичес-киу подходов для лабораторной дианетики ВЩ длятся особенно шегуальными. В основе со ?ания методов диагностики, '. как извес-ию, хешт 1 дтеланое изучение факторов татогешаста микроорганизма, нг которые нацелена средства диагностики.

Дедь работа Целью диссертационной работы была изучэиие токснкое Cl.difficile (антерстоксина и даготоксша) и разработка на их осно-ей дкатясст-чесгах ïec-гов, а тачже научта-методических подходов для лабораторной диагностики ЭКД.

Основные задачи исследования:

1. Шутить условия культивирования и > токсикообразоваиия u. difficile, сконструировать питательные среды из коьшонентов отечественного производства.

2. Разработать огашагьщга схему выделения гомогенного эитеро-токсча Cl. difficile и обработать тесты для оценки активности внте-ротоксина и цитотоксина.

3. Получить антитоксические сыворотки к натиьноуу токсин«7 и ээтеротоксшу Cl.difficile я m ¡tx освою отработать диагностические тесты (РИГА, ' Ко-аггйетишция) для обнаружения соответствующих токсинов 01. difficile.

4. Отработать схему ьи!кробйологичэского и токсикологического исследования на наяичиз Cl. difficile в патологическом материале ¡и правя. гк апробации разраЗотэнанх лабораторных методоя на кдгзши-ческой материале о? ждей, больных острыми кишечными инфегадаш. Научная навивка работы, Усовершенствованы методы кудмиетроЕЗгшн Cl. difficile с ' использованием разработанных питательных сред на основе компонентов отечественного производства. Установлен режим

ммвнровання Cl. difficile, оптимальный, лля выработки токсинов dlffk Ле.

Впервые разработана оригинальная схема разделения токсического плекса Cl. difficile к выделена гомогенного . энтеротоксина. По-раны оптимальнее схемы тмушзшдщ кроликов дш получения е;гво-ок к эктеротокскну Cl. difficile.

Отработаны достутшнз и ев-чцкфзг'кые тесин дгя определения биоло-еекой активности знтеротокеггаа м цзгаотоксздаа CL difficile, кгическая ценность. Отработана условия получения и испытана ьнссть тест-токсина Cl. difficile, необходимого для стандартиза-дивгноетичоекнх 'тестов. , Ередлогдан • зф&ггсгявный .щадящий метод зврэкивання энтеротоксина. ~~ï основа полученных 'сывороток psgpa-аиы тесты дач лабораторной диагностики ЭВД, включая РИГА с диаг-гихушм :ftrZ-.^/Eov-î.o6jjzaio2i£i эротрозд^арнда энтеродкффицяле

Еперзиэ s отечественной практике с исполисваняем разр-'ютан-методических приемов Ееследаваян материалы ог больных/ постав-хабораторьлй диагноз "энсерокностраднсэ да®®да@" у ребенка, а ив расаифрозека вяутрзйсяьйичная всиншеа SKI 7 взрослых дядей.

и утверэдеиы Советом по Внедрении НйИЗМ ш

. Гамалеи "Метоятаегшэ рекомендации .10 лабораторной дштносзжа »раашс мойтридаозоа» . обусловленных токскгекнш® штаммами ilffteile" (1992 г.).

■

збация диссертация. Диссертация апробирована на научной конфетти отдела бактериальных икфекций НйИЭМ им. К Ф. Гамалеи РАШ ;враяя 1SS2 г.

ттзщ. По штериал&ч диссертации опубликовано 4 печатных рабо-

гк^ура и сбт^м диссертации: • Диссертация изложена на 125 страии-машнопксного текста и иллюстрирована 12 рисунками и 1? табли-!. Работа состоит из введения, обзооа литературы, 7 глаз

собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литератур содержащего 165 источник, б том числе 6 отечественных и 159 иное ранних.

УАТЙРМЛЫ H JET ОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Бактериальные диамин. В качестве продуцентов тог-ина исподьзоза пггамм Д-1 Cl. difficile, полученный из института им. Паетера {-..ja ция). Для научения культуралышх свойств использовались штам CI. difficile No 258, 259 , 8384, 10453, 8835, полученные из ГНИИ им. 1 Л Тарасевича, Д-2 (коллекция лаборатории столбняка

газовой гангрены ШШЭК км. Е Гамалеи).

Антигены, токсины, сыворотки. Для изучения специфичности ДЙЗ использовали культурсианые супернать..гы Enterobacter gergovia Enterococcus faecalis, E. Coli. Proteus morgana, Proteus vulgari: Kl.bsiella oxytoca. Salmonella SSPP, Staphylococcus aureus 1876 i : га л лекций лабораторий ожоговых и стафилококковых инфекций, штам Cl.sardelii, Cl. hystolyticum. Cl. septicum, Cl. oedematien: Cl. perfringens 27 и ВрбК, Cl. sporogenes из коллекции лаборатор! столбняка и газовой гангрены.

В качестве тест-сиво,, jtkh Использовали стандартную сьшорои Cl.sordelii (ГШИСК им. Л.А. Тарасевича); в качестве контроль^ тесг-токсинов применяли 50 2 глицериновые токсины перфрингенс столбнячный (МНИЙВС им. ÎL It Мечникова), токсины гистолитикум, сег тикум, эдематиенс (Уфимский НПО "Имыуиопрепарат", Пермский НШ1ВД •энтеротоксин перфрингенс, стафилококковый энтеротоксин (НИИЭМ иь а Ф. Гау нэп Российской АМН).

Куль-уры 'клеток. Для оценки цитотоксической активности токеш CI.difficile применяла перевиваемые линии культур клеток фибре бластов колно-мышечного лоскута "мбриона челоэека М-19, М-2С, М-22, получеьньа из лаборатории культур тканей института полис m лита и рнруыых экйефалктсв Российской AJH.

юобиологические методы. . Культивирование штамма-прсдеуцента Д-1 diffi-ile производили з диализных контейнерах. логические методы. Цитотоксическу» активность токсина и диарео-ную активность энтеротоксина -пределяли по разработанным нами там.

Летальную активность определяли на белых мышах весом 12-14 г ыражалш в Dlm/мл. Для пог-'ченп антитоксических сывороток даму-'ирове-и кроликов породы Шшшлла весом 2-2,5 кг. паративниа методы. Осаидение токсина из культурального суиерьа-та осуществляли путем добавления сернокислого аммония до 40 % вдэтш при pH 7,0. Осадок отделяли на центрифуге РС-б при 6000 мин и температура +4 С в î „.ченйк 30 шнут. Гель-фильтрацию про-или на сефадзксе G-75, затем на сефакриле S-300 Ьаптао i а-"ьКВ"-1Шзеция). Для выделения гомогенного энтеротоксина difficile на заключительном этапе очистки использовали метод ряыой шьстновЙирчой хроматографии на CNBr-активированное сефа-э 4В ("Pharssoia", Шзецкя).

ико-химические и химические методы. Дня характеристики белкового тага препаратов энтеротоксина использовали метод диск-злектрофо-а в полиакрзшшедном геле rio Davis (ÎS64).

Уолекулярну» шесу белка определяв з электрофорезе по методу mill (1970) с применением белковых маркеров "Pharmacia" (Шве-)•

Концентрацию белка определяли по методу Лоур'п. увологичзсшг методы. Для яммукохимического анализа препаратов эльчовали реакцию двойной иммунодиффуэии по Quchterloni (15)49). постановки реакции ке-агглюгинации стафилококковый реагент бе-А (Санкт-Петербургский ИЭМ им. л'астерз) сенсибилизировали снеци-ескими иммуноглобулинам: из иннулной сньорогкн к натчьному сину CI. difficile.

Знгеротоксин С).difficile определяли 2 РШ'Д класричэоиим

- б -

способом по Кравченко А. (1947), применяя зритроцитарный диагност] куу. Последний представлял собой эритроциты барана, стабилизирова] Foie акролеиновый альдегид,ом, обработанные танином и сенсибилизированные антителами к высокоочшенному энтеротоксину "1.difficile i методике Воскова Ф. и соавт. (1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕЖЛ&НИЯ.

х. Изучение условий культивирования и токсинообразования.

Подбор питательной среды.

Первоначально наш было изучено ? динашке токсинообразоьан: Cl. difficile in vitro с оценкой биологической активности токсина культурал чой жидкости. В целях выбора наиболее активного продуце та токсина исследовали 3 токсигенных штамма Ui. difficile: шта; Д-1, Mo 253, 259. В экспериментах по изучению закономерное?, токсиногенеза в динамике на протяжении 14 суток культивирования б ^ да использована подобранная нами контрольная среда на осно brain-heart infusion broth.

Анализ данных по изучению динамики токсинообразовен CI difficile выявил те же закономерности, которые отмечены в раб тах зарубежных авторов: токсин выявлялся в культурельной жидкое уде через сутки инкубирования, причем его активность постепенно к растала, достигая максимума на 5-8-Э'сутки, затем снижалась вило до исчезновения на 9-10 -е суткп кульгивированил.

В связи с малой доступностью и дороговизной сред, используем »а рз'бешм для культивирования ь чокзинсобразования Ci.cHfticil нами проведен подбор сред« из kcwcmé-jítoíj о'^чес-твенаогз ррои BOiwTsa, оптнмаяьаоГ: для -то^чше^раз^г^кч/. C».difr\cilí í целою использсзаля с р2<шч«ых сочетания? пептон "Д*, дрежжог .•экстракт "Олайн-г", дьуьа^ >цг-¡шыА ®a'-í'0ph0;aic.!KM ««юи?.. тио^лш; левую кислоту, аычьогептйд. В качестве юкт;>:«л;.-ток олла ьг-да грз на основе Brain lie,art- Infusion Lrotn.

Опытная среда по эффективности не уступала контрольной среде, днако, недостатком ее являлось то, что дрожжевой экстракт "Олайне"' кзывал помутнение среды с большим количеством белого рыхлого осада. Замена дрожжевого зкстр-чта "Олайне" дрожжевым экстрактом НИИВС им., л. И. Уечкшадва (ЭКЮ позволила избежать вьяадения осадах ри сохранении сходного уровня токсмнообразования.

Попытки найти замену г угаг компонентам среда, в частности, гптонг . "Ж' - бактофо'ком-МКБ» а вминопептида - стимулятором роста шзфилькых микроорганизмов ( МЮШВС им. И. И. Мечникова) дали хорошие ;зультаты и обеспечили возможность выбора компонентов при констру-хзванш среды.

На этом основании был сделан выбор в пользу окончательного ва-îaura среды для токсикообраэовгния Cl.difficile следующего есста-

на 1 л среда:

NagHPC^ х 2 - 10 г

Крахкая раетвсрший - 5 г

Аминопептвд - 25 г

Пептон - 5 г

Экстракт дрогаэзой - 10 г

(МНШВС та Е Ж Мгчкикова) Ткогямкояевая кислота - 0,3 мл

рН 7,2 - 7Л

В качестве продуцента энтеротоксина ж цихотомеина Cl. difficile л отобран пгмбожее токсишшый тгаш» Д-i," у которого была лрове-на селекция колоний лучаих продуцентов токсина и отобрана суб-дьтура, характеризующаяся более высокой токсигенносгью.

Помаю подбора оптимального состава среды, потребовалась опти--зация условии вкращиванич микроба-продуцента. Бил отработан .ve-5 культивирования Ci. difficile в диализных контейнерах, псзводяю-Ь уь.зн:-.шитъ количество баллаотньк веществ и поручить токсин в бо-

лее сконцентрированном виде. Установлено, что - токсинообразоваш

тест-штамма Д-1 в диализном контейнере начинается в 1-е аут(

роста, когда летальная активность 'тоиа составляли 100 Б1т/мл,

цитотскоическая - 100 ЦГЕ /мл. Максимум токскнооб}. кования набш

дался на 5 - 7 сутки культивировали?,: активность токсина была сам

зетс-гвенно 2400-3000 01га/»а и 10 ; . 10 ЦТЕ /МЛ-

ои

Диогена аск*хлссю5разоЬднця гаочпа Р, С.Р№Р1С11£

при мулыкАирю&внии & Ои&лиг&ок п&дее

о к mutina cr»k»

i «игоото'.си'-чтс^с!«»

Q К m иЬм UC ГГЦ»

о --г—-1-г—!-г-

Í 2 3-4 & 6 7 е 9 10 Л1 12 13 H 1S »& ^с/кэЬммп _ октиЬчооп* та^сима Ь '

обоэгчамеми* : » летолы-ю«^ тесте* í DLH »чл J

——— . QKUT*j6i-*QC:iT>t» то*Сиип Ь иитсутюкси'^есхом mecnft I UEsa i

2. Отработка тестов для определения биологической активности

токсина CI.difficile. ... '

Ддя изучения биологических свойств токсинов Cl.difficile и в явления индивидуальных знтеротоксика и цитотоксииа нами отработ ряд биологических тестов. 0 целью определения цитотоксической а тивиости применен цитотоксический тест на клетках кожэ-мыш&чно лоскута эмбриона человека, причем из впервые, испотанных ддя зт (■елей линий культур клеток №-19, М-20, Ы-21 и М-22 (НИИ лолиомиел га и выруоньк энцефалитов)' все оказались пригодными длл это тес'ю.

Для оценки знтеротоксиедской активности токсина Cl.diffioí предложены два метода- классический диареогенкый тест, впервые в полненный в напей модификации на кишечнике мыли, и, второй - Хс^а тарный тест для знтепотсксина Cl.difficile - реакция холодоиой г

глхяинации кроличьих эритроцитов. Летальный тест был общим для их токсинов и проводился по общепринятой методике. 3. Получение антитоссической сыворотки к нативкому токсину Cl. difficile

В целях установления специфичности этих тестов, а такке для(' )

еделения возможности нейтрализации. действия токсинов

difficile в биологических л тунологических реакциях, необходи-

было располагать сыворотками к нативному токсину Cl.difficile.

этого нативный токсин Cl. difficile, полученный в диализном кон-

2

нере, с активностью 100 Dlm/мл и 10 ЦТЕ gQ/мл, обезвреживали мальдегидом в конечной концентрации 0,4 % и использовали для унизации кроликов, при этом были испытаны 3 различные схемы им-изации (табл.1).

Таблица 1,

Активность антитоксических сывороток к нативному токсину Cl. difficile.

Схеш иммунизации i Кодачество î инъекций 1 на курс 1 1 Ï Нагрузка по белку (мкг) Нэйтраяизудая активность! сывороток 1

в летально?,4'! . ' тесте.. ; i A' " '/mj^. '1 в' щггогокси-1 ческом тесте! ADEgg/мл. 1

! схема 1 11 1 300x5 100x5 10 I i 15 1 1 «

[ I схема ! 2 300x2 .43,5 ' 1 0,1 1

! 11 схема 5 . 300x5 ' 3 1 15 !

.. - 10 -

Анализ антилетальной и антнцстоти«:кческой активности свиде тельствует о том» что наиболее активные сыворотки в летальном тест были получены при использовании короткой схеш иммунизации (11 схе ма), однако указанные сыворотки обладали низкой антмитотокеическо активностью. В то ж время наиболее активные сыворотки в цитотокси ческом тесте получены при использовании длительных схем ишунизаци ( I и III схеш).

В качестве оптимальной следует признать III схему имммуниза ций, обеспечивающую получение сывороток» • обладающих достаточно неШ,г>алйзу10щей активности в обоих испытанных биологических теста при значительно меньшем количестве расходуемого антигена по срав нению с I схемой. -

По-видимому, эш ротоксин как к-'шонент наживного токсина яв лается более активным мммуногеном, так как он индуцировал иммунны сгвет через сравнительно короткий промежуток времени (около меся ца), тогда как цитотоксин индуцировал иммунный ответ только чере 2-3 месяца, когда титр аятиэнтеротоксинов уже снижался в 4 раза

4, Получение и , характеристика гомогенного энтеротоксиа 01. difficile. .

Kaie известно из данн'в лит- натуры, . ¿едущим фактором патоген ности CI. difTicil© является знтеротсксин. В целж{ выделения энтеро-токсина был разработан метод очистки, состоящий из 5 этапо: (табл. 2).

Этап гель-филътравди на сефадексе а-75 представлен на рис.2.

. Как следует из кривой распределения оптической плотности й< фракциях, белок, обладавший кai"большей летальной активностью, злви-ровал в* I пике. По данным злагарофореаа в препарате на этом зтап< выявлялось 3 белковых полосы, что указывало на необходимость еп дальнейшей очистка. Для этого токсин концентрировали сульфатом аммония до 60 У, насииения и растворенный осадок использовали дл гзль-филътгяции не. сефакриле S-300 {рис. 3).

06'È2ii. ИЛ

Относительная агаив-ÎOCTb,

активность s Dim

Концентрация

IST/tAS

Удельная

активность. Dim та 1 w белка

Выход, Т.

Степень очистки

! ГСульгуральнкй i фильтру ¡-----------------—.—

! Концентрирование 'сульфатом шлшдая(40Х)

320

6000

70000

1920000

Í820C0Q

2,3

х5,0

2608,?

466ö»7

100

34,79

1,79

I Гель-фшштрацкя ка ¡сефадексе 6-75

15000

Î320000

2,26

6637,1

68,73

2,54

! Концентрирование ¡сульфатом амл<оняя(602)

15 .

88000

' 1320000,

13,26

637,1.

íГель-фильтрация йа !сефакрияе S-300

17000

102000D

0,64

26562,5

68,75

53,13

2,54

10,18.

I Аффинная хрокатографж ! на СНБг-шшшировашшй i сефарсзе 4В.

60

14400

'864000

42

34000

45-

13,03

й e si

Рис. 2. Эгаа очистки эигеротоксипа на сефадексе G-? Ш оси абсцисс - количество #>ехций (с ъеы фракцда 3 од Ко осям ординат: ¡ - оаткчесгдая шютность прзг 280 нм;

П - летальная активность (Dlm/ш).

! ts¡

Рис. 3. Этап очисти ээтеротокеика ка сефакрияе S-S По оси абсцисс - количество фракций (обтек фракции 3 мг Ito осям ордивет: 1 ~ эпическая плотность ¿три 280 нм;

11 - летальная активность (Din/мл).

Токсический комплекс фракционировался в зиде 3 белковых пхков. причем токсическая активность обнаруживалась только во фракциях 2 пика Этот этап не обеспечил выхода чистого препарат

3 результате применения ка ашшжяельйоы зтаяе метода после-йовазеззьной двуяэтапной котюобмешой хроматограф® на ДЭЛЭ оефа-дексе "-25 были получены практически гомогенкь» внт&ротоксш и ци-тотоксие однако» выход этих препаратов бьш краГ г кнзок. С целый повнзэния выпда гомогенного знтеротоксина был исполивован метод непрямой имиуаоаффинной хроматографии, в котором в качестве лиггада бшм использованы антитела к белкам-примесям, сспуясгвувдиы гнтеро-токсину на этапе гель-фильтрации на сефакрзше Б-ЭОО.

Рис, 4. Этап очислш знтеротетила CL difficile методом ишуноафмшой хроматограф;«! . : Но оси абсцисс - количество .фракций (объем каждой фракции 3 мл). По осяы ординат: I - опгнческгя плотность при 280 ни:

II - летальная активность (Dlm/кд); ' •

III - знтероточскческая активность iog^ (ЭЕ/мл). Как следует из рис.4., препарат, полученный после гель-фнль-грации на сбфакриге 5-300, в основном, свободно элюируется чер*?"1, юлонку с ишг/иссзрбеот.-ди После подачи градиентрН (2,2) элюиру-

-'¿4 -

еаря 2-Я пик, в котором сосредоточены белки-примеси.

Фракции 1-го пика обладали 3-мя ащти биологической ач чос: - и (летальной/ энтеротокекческой и цитотоксичеекой).

Ш данным иммукохимичеекого анализа, а также анализа мет электрофореза в ПААГ, получег ыа грепараты знтерогоксина бшш г гены (рис. 5).

Высокая удельная биологическая активность (34000 01 ¡г/ы белка) также свидетельствует о высокой чистоте полученного преп та

Рг.е. 5. Электрофоретичессйг анализ (ыегодом дэвта) npenapai знтеротоксина Cl. üifficile на различных стадиях очис

1 - истяеньял токсин ••

2 - препарат поо/э гель-фильтрацил на б-?.*!

3 - препарат после гель-фильтрации на се^акрилг S-3Q0

4 - препарат после аффинной хроматографии

По дачным дискового электрофореза в присяг SPS телегу; кая масса очинённого балкэ е сопоставлении со стэидартчим-.г Mapti нымк белками составляет приблизительно 500- 55G кДа.

Изучение биологически: свойств энтеротоксина Cl. difficile j/ка-шает на его высокие патогенетические потенции: он проявляет ле-ш>ную, цитотогаическув, гемагглюгинационнуо и зитеротоксичеек. j давность в дозах 29,4 нг,. 12 ы\ 0,25 мкг и 0,0145 мкг/кг аеса ¡»ответственно ( ркс. б).

Рис. 6. Диареогеиный тест на дотированной петле тонкого нишечника мши.

1-4 - дозы энтеротоксина - 10 вг, Зш, 1,5 нг, 0,4 нг

5 - контроль ' „

5. Получение антисывороток к высокоочищенному энтеротоксину I. difficile.

Получение высокоочишенных препаратов . энтергтоксина (поело ;ль-фильтрации на сефакряле S-3QÛ) явилось основой для создания кокоактив'-:.чх антитоксических сьаороток.

Стандартный метод получения анатоксина в присутствии 0,4 % >рмальдегид& оказался непригоден. Поэтому нами были ппедло;кены и •работ,'ины ыадящие условия дега^икации токсина пед зал^гой 1 I дч-ша или ъ условиях диализа против растворов 0,4 Z фог альдегида в 'чении 3-х суток. Помимо отработанной ранее схекы Иммунизации для

-16-'г

получения сыворотки к дативному токсину, была испытана специальная » ^мбинироьанная схема иммунизации, включающая одновременное введение антигена различными путями (внутрикожяо, в лимфоузлы, внутримышечно), давшая хорошие результаты: титра сыр^роток возросли в 2-2,5 рача (256 а£ м, - в летальном тесте, 1180 АЭ2/1 л - в дчареогенном тесте при титре 1:32 тз РДД по Оухтзрлони.

6. Разработка диагностических иммунотестов для выявления растворимых антигенов ''токсинов) Cl.difficile.

Зги сыворотки послудаш! основой для создания диагностических препаратов в целях экспресс-диагностики ЗКД.

Обязательным компонентом любой диагностической системы является стандартный токсин, поэтому нами был приготовлен глицериновый те-т-токсин диффицилс на основе фракций I пика, формирующегося после гель-фильтрации нативного токсина на сефадексе G-75. Полученный токсин диффяциле в 50 2 глицерине в течение всего срока наблю-

> t

дения (2 года) бая стабилен и токсичность его составила 1000 Dlm/мл.

Первоначально была испытана реакция ко-агглюгииации с использованием антисыворотки к нативному толсииу Cl. difficile при тестировании различных материалов от больных с подозрением на энтерок-лострндиоз диффициле (центрифугат кишечного содержимого, культу-ральаая жидкость посевов, изолированные колонии микроорганизмов). Показана пеоспекпшкость этого метода в качестве отборе гаго, ориентировочного для обнаружения энтеротоксигенньж Cl.difficile с обя-

г.

аателткми последуэдим подтверждением в других тестах.

В езязи с отсутствием в литературе данных об использовании РИГА для обнаружения знтеротоксина Cl. difficile, нами впервые была разработана данная тест-система применительно к г.тим целям.

Наиболее актирные диагностику^ ДИЭЭД были получены при сенси-•Ьи.ялг.шуш эритроцитов йарнла иммуноглобулинами из акткэн^ерохокси-чоскух сывороток с ксшюнгсацкеЯ белка 13,5-15 :лкг/мл.

Чувствительность диагностикуиа при титровании с гомогенным эк-теротоксином Cl.difficile в РИГА составляла 5-8 иг/ил. Для оценки специфичности ДИЭЭД был испытан с различными культурами микроорганизмов (18 штаммов) и токсинами (5) (табл.3). .

Таблица 3.

Ч, вствительрость w специфичность ДИЭЭД при испытании

с культурачи микроорганизмов и токсинами

Штаммы 1 Титр Штаммы микроорганизмов Титр 1

микроорганизмов 1 в РИГА и токсины в РИГА i

с ДИЭЭД с ДИЭЭД 1 _____ (

Cl.difficile Д-1 1 1:2000 Staph, aureus 0 !

N 8335 ! 1:1000 Enter, gergov iae 0 i

H 258 1 1:2000 E.coli 0 !

H 259 i 1:2000 Proteus morgana 0 1

N 8S84 1 1:1000 roteus vulgaris 0 !

N 10453 i 1:2000 Klebs. cxytoca ' 0 !

H Д-2 I 1:256 Salmonella SSPP 1:0 !

21. sordelii i 0 Столбнячный токсин С) 1

21. hystolyticum 1 0 Токсин септикуы 0 :

21. sept i cura ! 0 «¿-токсин Ci.porfringens 1:10 ;

21. oedematiens 1 0 Энтеротоксин перфршгенс 0 !

21. sporogene? ! 0 Энтеротоксин стафилогсогаявый о ;

21. perfringsrs BpGk! 1:16 Энтеротоксин гомогенный 1:!

i i Cl.difficile ( /мл)' ••1:236 ■!

- iee-

Диагкостякум обнаружил высокую специфичность при выявлен токсина Cl.difficile и практически не давал перекрестных реакций испытанными ютамыами других патогенных микроорганизмов. Низкие ти ры . порядка 1:3-1:16 были отмечены лишь при испытании Cl. perfringens типа А Врбк и его «¿-токсином, а также сальмонелла SSPР. Так как указанные клостридии не участвуют б кииечной патол гии, то перекрестные реакции ДИЭЭД в низких титрах практическо значения не и..--ют. Отдифференцировать же сальмоноллы позволит ст дия бактериологического исследования в анаэробных условиях.

7. Отработка схемы бактериологического и токсикологичееко исследования материатог от больных.

Результатом проведение исследований явилась схема выделения идентификации Cl.difficile (рис.7), включающая параллельное багам риологическое и тог.ск ологическсе исследование. Данная схема лег. в основу подготовленных нами "Штодических рекомендаций т;о лабор; торнсй диагностике знтеооклостридио&ов диффишлэ, обусловлена токсигенними нташауи Cl.difficile".

С использованием этой схемы были обследозаны материалы t больных 23 детей в воврвсте от 1-6 месяцев до 12 лет с подозренш на ОКИ. В результате вперзые ь отечественной практике был постав к

«S

лабораторный дг^цоз "энтероклострмдта диффициле" у ребенка, еде ланы регамевдацми по этиотролному лечению, что привело к полом тельному результату.

С помощью разработанных методов впервые в стране нам удалое расшифровать вспышку ьнутригоспитальной кишечной инфекции в пс*ш атрическо».; диспансере в апреле 1991 г. с высоким процентом летал нсстн ( 12%) и язл;нияш язвенного колита у погибших больных, ni этом токоии Cl.difficile обнаружен у 3 из 13 больных (23%). гоксигенные итаммы выделены у 8 и?, 13 (б1,5%1 сбс-ледованлых бо.чьнь . ( габд. 4.).

СХЕМА

выделения и идентификации Cl. difficile в клиническом материале

зе дуемый материал + физ. раствор t.pH 7,2) - 1:1 - перемешать (жидкий материал не разводить)

Разгул I (ктериологическое исследование

Раздел II

Токсикологическое

исследована

«атериалу прибавить этанол до гечной концентрации 50 Z , иере-вать, инкубация 1 час при ком-'ной температуре

Центрифугирование 6000 об/мин - 25 мин

Надосадочная едкость

А.

;ев на плотную пи-гельную среду (ана-. э^ные условия, С - 43 час )

5ор и исследование цельных колоний жроскопия, окраска э Гра(лу)

:ев отобранных ко-[шй в лидкук) пита-сьную среду

зледозани* фермеп-гквьък: с£о?ств еу-чных культур ($юр-:(тс.о;1Л мая и ит а, лезитозы, сахэро-проверка в тест--иетемг "С!-33" ), 5 Н К£» ТС 11" С! 1Г Э НПО;'" И

г:лс- Ъ-:: суток

Посев на жидкую питательную среду, мелатель-но с добавк циклосерика (250 ккг/мл) и цефок-ситина (8 мкг/шО Инкубация 37 С - 48 час

ЫИКрССГ-ОПИЯ ( в случае обнаружения микроорганизмов, похожих на Cl. difficile, дэ-лее исследовать гю схеме "А").

Фильтрация ч рез фильтр ">«11 ipcre" 0,22 или 0,45 мк

Обнаружение:

1) цитотоксина на культура клеток Р.) энтеротоксика -реакции ХГА и в РИГА с ДИЭЭД 3) легального токсина на белых мьшах

(Все тесты сопро-Еоздагь постановкой реакции нейтрализации с д;;аг -ности^ескики ан-

TUTCKOHVçcKVifûi

-кеорсглзм" CL. difficile;

- £0 -в

Таблица 4. .

Результата исследования материалов от больных (апрель-май 1991г

: 1 ¡Токсикологи- 1 1 -1 Б.. .териологическое

! 1 1ческо° иссле-1 исследование

! N 1 1дованиз 1

! п/Ш 1 ( титр 1 выделение титр токси-

! 1 !___} Нащ нты 1 х> РКГА ) 1 С1.сНто11е на в РИГА

1 1.1 Б юй а . ! 1:32 1 да - , 1:32

1 2. \ Б-ной Ш. 1 1:64 I . Да 1:32

1 3.! Б-ной В. 1 1:8 1 да„ 1:128

1 4.1 Б- ной и. 1.0 •: да 1:32

1 Ь.1 Б-ной П. 1 0 1 да 1:32

) 6.1 Б-ной Б. I 0 1 нет 0 .

1 ?. 1 Б-ной Б. 1», С 1 да 1:16

; 8.1 Б-ной а 10 1 нет 0

1 9.1 Б-ной м. Г 0 1 нет 0

1 101 Б-ной А, .10 1 да 1:32 .

1 ".11 Б-ной Е 1 0 - 1 нет 1:8

1 121 Б-ной Г 1 0 ! нет 0

1 131 Б-иой В. ; о . да 1:32

Эти клинические данные позволяют нам полагать, что энтср юэтетридиозы диффицкле в стране, по-еидимому, встречаются нёрадк что требует обязательного налаживания лабораторной диагностики зт заболеваний.

ВЫВОДЫ.

1. Сконструирована питательная ерэда из компонентов отечес Еенкого производства и изучен прсцоос токоинс'образовагшя ряда шта мов С1.сИг~ПсЛо, в результате чего, отобран актирный .продуй-:

- 2.1 -

гоксина.

2. Отработаны условия культивирования Cl.difficile в диализном юнтейнере, получен ряд серий нативного токсина, обладающего ..е-•альной, цитотоксической и диареогенной активностями.

3. Впервые в отечественной лабораторной практике разработаны датото' ст с использованием перевиваемых линий культур клеток фиб-юбласто_ кожно-мышечного лоскута эмбриона человек., i М-19, М-20, 1-21, М-22 ' для определения цитотоксической активности и тест на юдели лигированной петли тонкого кишечника мыши для оненгл диарэо-■енной активности токсина диффициле.

4. Разработана оптимальная схема очистки основных факторов зн-еропатогеннссти Cl.difficile - энтеротоксина и цитотсксина. Пред-ожена оригинальная методика с использованием метода аффинной хро-атографии для выделения, гомогенного энтеротоксина Cl. difficile, пэрвые в отечественной научной практике получен гомогенный нтеро-оксин Cl. diffici le, дана его биологическая, физико-химическая и ммунохимкческая характеристик-'.

5. Впервые приготовлены диагностикумы иммуноглобулиновье эрит-оцитарные знтеродиффициле (ДИЗЭД) на основе диагностических анти-оксических сывороток к вькокоочищенночу энтеротоксину 1. difficile. Установлена высокая чувствительность (5-10 иг/ил эн-еротоксина) и специфичность в РИГА для обнаружения эятеротоксиген-их штаммов Cl. difficile.

6. Предложена ~хема бактериологического и токсикологического ^следования патологического материала на присутствие Cl.difficile их токсинов, на основе чего подготовлены "Мэтодическне рексмг.'да m по лабораторной диагностике энтеральных клостридиозог. обуслоя-. ?нных токсигэниьш !камма4Я1 Cl. difficile". .

7. Епервые в отечественной практике поставлен лабораторный ля-чюз "эн1еро11ностри,г"оз диффишле" у ребенка, а также р-чсшифговаг1-' гутрибс-льничлая вепта ЗВД у взрослых .исд.-й.

- т9-

СПИСОК ГЛБОТ. ОПШИКОВШШ ПО 7 EMS ДИССШАДИЯ

1. АЛЧЙШБАЕВА Е Н., БАКУНИН И. Е Изучение услогий токсиногел за niostridium difficile in vitro // ШМЭД. - 1987.- N 2.- С? 119-120.

2. Перспективы разработка методов лабораторной диагностика иммунопрофилактики юиечных клсстрадкозов сельскохозяйственных а воткых / f. U. Сергеева, ЕЕ Еакулкл, £.& Оешянютая, ЕЕ Ажи баэва // Кн. "Современные проблемы профилактики зоонозных боаезн и пути их решения". Тез. респ. конф. - Гродно» 1SÖ7.

3. Получение диагностической антитоксической сыворотки Clostridium difficil« /ЕЕ Алчкйбаэва, ЖЕ Бакулин, JL Л. Ыкррк ва, Т. И. оэргеява // ИЭЕ Г 19«9. - N 4. - Стр. 22-24 .

4. СЕРГЕЕВА Т. Е , АЯЧИЕБАЕЕА R R , ВАКУЛИН Е Е Нозокошальн] характер агаибиотжог'йувдрозанных кишзчных клострадисзсв. обуело: ленных Clostridium difficile // Гигиена и санитария.- 1988.- N 9. Стр. 56-60. •