Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Енергетичнi процеси плазмiдомiстких штамiв та iх роль у забеспеченнi кон'югацii у стафiлококiв

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Енергетичнi процеси плазмiдомiстких штамiв та iх роль у забеспеченнi кон'югацii у стафiлококiв"

АКАДЕМ Щ НАУК ЗТСРА! 1С1 1НСТИТУТ М1КР0В10Л0Г11 I В1РУС0!ЮГ1! 1и. Д.К.ЭДБОЛОТЕОГО

Но правах рук'йппсу УЖ 573.222.6:579.861,2:6Г5.ЕЗ

ГАВРИЛКК В!г,тер:я Грагор1вая

ЕНЕГОГГИЧШ ЛРОЦЕСИ ПЛАЗМ I ДОМ! СТЕТХ ШТА.Ч1В ТА IX РОЛЬ У ЗАБЕЗПЕЧЕШИ КОН'ЮГАЦП У СТАФ1ЛОКОК1В

03.00.07 - М!проб[олог!я

Автореферат

дпоортацП на здоб^тгя паукового етупеня кандидата <НологИних паук

КвГь - 1994

Робота виконена на кафедр! м1кроб1ологЛ Дн1'пропетрсвського державного ун1вероитету.

Вауковий кер1вник: академ1к АН ЕШ Укра1яи, доктор б1олог!ч-нех наук, професор В1НН1КОВ АЛ.

0ф{ц1йн1 опояенти: доктор <51олог}чних наук, вед. а.с.

ВАРБАНЕЦЬ Л .Д. '

доктор ыедичних наук, професор ' КРЕМЕКЧЛЩКИЙ Г.М.

Пров1днз установа: Ки!всышй науково-досл1дний 1яститут

еп1деы1олог11 та !нфекц!йних аахворшань 1ы. Л .В .Громзшевського Шнадраву Укра!шь

Захиот з 1дбудетьоя " УУ" 1994 р. у

_годин на зао1д.1Ня1 спец!ал!зова.чо1 вчеао! ради

ДО 16.16.01 при 1пстптут1 Шкроб1олог1! 1 в1русолог11 1ы. Д.К.Заболотного АН Укра!нп за адресов:

252143, и. Ки1в, вул. Заболотного, б. 154 1МШ ¡г.'. Заболотного.

3 дасертая1еи ыожна ознайсыитись у б1бл!отвц1 1нстягуту 1:1кро51 ологН 1 в'русологИ 1ы. Д.К,Заболотного АН Укра!ни.

Автореферат роз1сланиа " 199£ р..

Вче1шй секретар-спец!ал1зовапо1 ради

ГОШ л.м.

ЗЛГАЛЫЙ ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТй

Актуальн!оть проблема. У зв'язку з икрским винористанняы ан-тибактер!альних препарат!в, сбуыовлдзэчях селекц!ю резистентпиж п?аы1в, з!дбудися знача! згЛаи важясст! та ступени пошпрення ста-Ф1локойоеих !н$екц!й. Нагроыгдаенпя та !ятеногазна цнряуляц!я ст!й-кнх до антиб!з?ик!в вар!ант!в м!кроорган1зы!в визначаетьоя наяв-н!стю в кл!танах позахромосомних генетлчних елемент!в - плази!д, як! передаются з ейсоксв чгстстс® в популяц!ях сгзф!лсяоа!л в результат! генетзчних рекоыб!нгц!й.

Здсбуття К.-плаэм!д обумовпло н'оыплексп! st.ilmi як окремих ф!-з!олог!чнпх прояв!в гпттсдгяяьност!, так t нзпрямк!в процео!в об-ы!ну реяовин цЬчкоч, ко викяякае перекручення ел!н!*шоГ картина va мгруянде д!згясоишу i д!кування захворгваяь сгаф!лояоноао! ет»с:ог!Т. ша тин дан! про характер епливу плоем!д на ме?абол!зм c??'5!soko::í3 надзвичайно обмезвн! та оуперечгак!, тому яесбх!дао глибоке пор!бияльне дссл!д~ешш ф1з1олпг1чках особливостей ! ывта-бол!чш1Х процес!в у штам!в, як! м(отять плазм i дп з детеры!нантамя сг!йкост! до л!кароькнх препарат1в.

Одним !з «ожлевпх кехая!зм!в перэдвч! генетичних факторiв aj¡-пкНотикорезистентнсст! у популяд!лх гтаф!локок'в виявляеться про-цео коя'югаиН. На думку l'ownsetvd ot ai. /1906/, кэя'вгпцН пеленать догНнантна роль в обиfиÍ гев-этпчною 1нформац!ею у отаф!ло-ксе!э на псзерхп! кеалпн ыекрооргая!зыу. Коя'кищШшЯ продао у стгф!локон!в в1дтфпто недавно, гзыу sin погребу» детального тивчец-ая. Так, в1доути! дай! про мзхаШан провикнення макромолекул' ДНК через цитоплазматячну мембрану стаф!лококово1 кл!теяи. В тоЗ гэ час одепжан! енопериментальи! с[акти, як! ов!дчать про пряыу участь трааапеибранкого елзктрох1м1чяого погенн!ал} 1он!э водно (¿J1 ¡f) у 8д1йовеип1 транспорту ¡-укла! новях яге лот у ход! рекомб1:тц!йнгз: процео!в у iнших н!крооргля1зы!з /Гринев, 1986/. Показана тскоз роль протонруш1йноГ сели в забезпеченн! прояккаення фагово! ДНК в результат! трансдувцН у огвф!локск1в /Винников, 1988/. Kpítí гсго в л1тератур! е дан!, як! оэ1дча?ь проти ун!вероа^ы!оот! xeuloouo-тачно1 кондепцЬ, та про незг.лежн!сть приео1в транспорту пукле!-новах кислот в!д AjÜlf, виконувчого липе регуляторну фушщ!ю.

Мета представлено! роботи полягаля у доол1дженн1 oícdrajoo-тей б!олог1чних os пак ! кат"5од1чних процео!в плагм1ди/.г ¡mata, а гыкон взаеыеза'язку еяергвгвчквх процее!з з aoa'rrsnlflüía rjair-

еяоргсм nxasulaaot да у стаф!локок!в.

При вивояшш! ц1е1 робота було поставлено так! савданяя:

1. Доол1дигл еплйе плазы!д, кодуючих ст1Ек!сть до ряду антЕ-б!стик!в, на ф!з1олого-б!ох1ы!чн! характеристики та параметра poesy штам!в етаф!локок1в, кл1 ыавть плазы!ди.

2. Провести пор!вяяльяиЯ анал1з особллвосгей функц1онуваш!я ооновнпх катабол1чних цикл!в стаф1локок1в у зв'язху з здобуттям Кг-плпзы!д.

3. Вязначити роль протонруш!йноГ сили, !! генераторов та компонент но мембранах донорнс! J pt-пипIентно! кл!тии у кон'югап!й-нсыу транспорт! ДНК у отаф1локох!в.

4. Вивчити заяешПсть прсцесу кон'ЕгадП ста$!локок1в в1д к!лькост! внутр1шньсжл1?инних внеокоенергетичних фосфсрильованих спояук.

Ваукова нопипа та практпчне значения робота. Вперше булл показан! зы!нн б!олог!ч1ШХ властивоотей та напряык; ыетабол!чи.шс прсцео!в у патогенних стаф!локок!в, викллкаппх плазмГдгии з детер-и!напташ ст!йкост! до ряду антиб!отик!в. Встановлено, що здобуття Е-плззм!д кл1хинашг стаф!локок!в суяроводауеться втротою олрешх влаетивостеВ пагогенност!. ПлззгЛдн! втаки стаф!локок!в характери-рувтьея шЛноа сп!вв!днопекня основных катабол!чних цакл!в nopln-няльно з безпяазгЛдним вар!актоы. Пбказано п1двищення рол1 гл!ко-л!ру та зянжешш чаоткоио! ygacrl деятозофосфагного циклу у нага-<5ол1зм1 вуглевод!в. Фуккц1опування НТК опрякозано на !нтеясиф!ка-ц!а анаплеротпчних та б!о«штетдчних процоо!в. Впорше показано, що г,оа'Егац1я у ста$1локок1в с енергозаьоаниы прсцеооы. Вставовле-' на роль протовруа1йяоГ силе та П комаояенг!в у кон'г?гац1Сному транспорт! плазы!дно! ДИК. ЗдШсаенвя кон'югац1йного процеоу залезать в!д генерьцП А^ЯН1' на мембран! як донорно!, так i рецип1ея-тно! кл!таш. Показаио, що наязн!оть внутр!шньокл!тияш1х запас!в ATР кесбх!днз г(льк!1 для габезпечення поч&гкобих стал,!й коя'игадН у стаф!локок

Практично значения робота полягаа у ыожливос?! викорксговуза-та представлен! результата у подальп!й рсзро5к1-матод1в д!сгности-ка клШчних пгам!в патогенних стаф1локоя!в, сбыегення нагроыад-яення 1х резиетевшие вар!авт1в, а такок пошуку засоб!з поперед-гення ы!кбгхтер!алько1 передач! $ахтор!в антиб!отикост!йкоот!.

Апробац!я робота, Ыа'тер!али jcacepTaui'i було представлено на Всесоюзна кснферездН "Актуальные ni-зблеш химиотерапии бактери-

альнах инфекций" /Москва, 1991/, на 2Г М1жнародному конгрео! ФЕЕС /Дубл1н, 1992/, на У1 Укра1неькоыу 6tox5u'<noMy з'!зд( /КиГв, 1992/, яа Койотояськаму си;.'поз1ум! /США, 1923/, на Ш УкрзТноько-ыу м1нроб1олог1чнсму з'1зд! /Одаса, 1993/, па п Îдсумлових пауко-вих яокференц!ях ДНУ /139Г-1993/.

На захдст виноояться паотупи! положения:

1. Особливост! |i3io,Toro-6ioxlMi4Haxознакхпарамзгр1з poosy шгомîb стаф1локск1я, я:гf мавгь плазм1да рездогенгпоот! до анги-б1отик!в.

2. Зм1нд сп12п{д!юте'щя к£,?абод1чних цикл1в у ттам!в атаф!яо-kohIb у зв'язиу 1з здобуттям р.-плаз.'Лд.

3. Участь про?онруш5йно! оили у зд1йсаэип1 коп'югацМиогз процесу у стаф!локок1в.

Суруктура та обсяг дясертад!йно? робота. Дисертац1я м!стзть: ватуп, огляд л!тературя, матер!али та метода досл!джешш, три роздал вяаендх яосл1дхзаь, ззл1пченял I впоновяп. Робота зайыаз 143 стор!няи машинописного тексту, про!яюс.рована 12 таблицяии та 24 на.танкаип. Список л(тератури м1стпть 198 найывнувань роб1т в1тчпз-пянзх та заруб ¡гдих автор!в.

ЗМ1СГ РОБОТИ I. Maïeptomi та метода коол1даення

Об'вктоы доол!дкешш служили штамп StapUyîococeu3 aureuo з ыузею культур Щ1 еп1дем1олог1Г та uinpoôloxorl! lu. Гаыала! АМН Poalf. Плазм1дн! вар1анта була сдержак! авторама виаел1доя граяс-дукцН та л(зогея1эацИ вих!дяого безплазм!дного итаыу 8325-4. Для досл1дазння лзаемозв'язку кон'югац!2ного транспорту ДНК а енер-гетичпига процеоамк у рол1 донора сикормтовували атаи pg-873, еот-рий м1«тдть пяпзи{ду резкстеитност! до гентаи!цияу, а у рол1 рецл-п1внта - штям 1055, янпй »as детерм1нанти ст1йкоот1 до ряду антк-б!отик1в та два фаги оерогруп BIP.

2>1з1олого-б1ох1м}чя1 ознани доол1джвяях штам1в вдзначалд га-гальнов!донини методами /Герхардт f др., 1984/. Результата ревкц'й ревотрувзли протягоц 7-10 д(б.

Для в:.ачепня ростгвих характеристик :таф1локо:;:'. эарогузояа ¡а м'ясо-пептоянсму бульоп! (рН 7,2-7,4) при отрушузояя! яа ауттвя! на кротяэ! 24 годин пра С?0 С. Qatznty густаяу (ОД) проб csulpsua-яи спек рофотоыетричнии засобои на CO-'cfj UG!/.C) пра .1 ~ 540 Ни.

Визначения ОД проводили з одночаснам вис1вом 1з розр1днення цих проб на м'ясо-пептонному arapl та настигшим п1драхунком яаттездат-них кл!тин. Швцдк1сть под!лу кл!тин та чао генерацП обчиелввали загаяьноприйнятиы методом /Шлегель, 1988/.

Вивчення продес1в обм1ну проводили на ц!лих mimnax, безкл!~ тинному гсмогенаг! та фраки!í мембранних вез ¡куч. Руйнування кд(-TKG проведали сбробкои ультразвуком на апарат! МзЕ потужн!ств 150 Вт при 20 КГЦ протяго.ч 15 хвил. з 1нтервалоы у I хвилину. Нозруйнован! кл!тшш J кл!тднн! фрагмента осаджували центрифугу-ванням при 15000 об/хв. на протяз! 45 хвил., мембраны! вез1кули -пгт 40000 об/хвил. на протяз! 60 хвилин. Кондентрад!ю б1лку отковала за методом Lo v/r у. /1951/.

Активн!сть ферыент!в гл1кол!зу, пентозофосфатного шляху, цвк-лу тракарбонових кислот та пов'язаакх з ним акаллоротнчгшх 1 б!о-епнтетичяпх реакц!й вязначали за зм!нов оптично? гусгини на спектрофотометр! " Specord UV Via " при 30° С, н1длод1дао загальяо-прийпятим методам. Активп!сть С-фоефофруктокшази вигначали за методом van Diáken a. Qusyle /1977/; альдолази фруктозо-I.6-ДИ-фосфату - за методом Wood et al. /1982/; глюкозо-6-фосфатдег!д-рогенази та 6-фосфоглшонатдег!дрогенази - за методом Kornberg, üorecicer- /1955/; цйтрат-синтази - за методом Müller-Kruft, Babel /lS83/; оукцивагдег1дрогенааа - за методом irschik, OoXze /1976/; ыалагдег1дрогедази - за методом Л1 1Пм Бэяг /1970/; иал!к-ейзиму - за ыетодсм Iloppfp'escl з соавг. /198О/; дег!дрогсназ глу-такату, аланfну, гл!цму 1 аспартату - за методом Doherty /lS70/,

Кон'Вгац!Йнпй перенос плазм!да з маркером от1йкостх до гента-ы!цану здШснювалн на мемСраннвх ф!яьтрах виробйЕЦТва ф!рми Schleicher- ь Schall (Шыетшпа). Результата схреиувашш рееетрува- ' ли по утворзнюз тракокон'югант!в на с ере довит i з оелективвкж маркерами (2 МКг/гл гептам!цияу 1 3 МКг/ыл ер1тром!цину).

В доол!дах по. впвчешш наливу 1яг!01тор!в, роз*вднувач1в та 1онофорних антаб1отдк?в на лроцео коя'игацП эказак! озолуия буяи гнеаей!: а) до зы!шуаання культур донора та penualeara; б) у nepi-од 1нкубуваинл на ff лир i сум2ш2 донорни:: I редап!ентннх ед1мш протягоы 5 годан.

Гензрац1зо траксыембранноГ р!знщ! елентрох!ы!чках потенц!ал1в на мембранах кл!тия донорного та рецап1ентного штаы!в стаф!локон1в-визначалп га методом Liberman,.Skulacbev /19?0/ is застосуваа-лям сиятетачних д1поф!дьнах прокпкаючих IohIb теграфен!лфойфон!в (TP?1"). „

Кал!бровку реестровую! величали проводила зз вбираниям io-!î1h в!дпов!дно з р!внянням Нарпсга. При вг-ченп! величин компонента прстонруш1йао1 сиял неубранного погеац«?алу ( А4.') f грзд!вяту протон la (- ZApH) кя1тлн стаф!локок!п випорЕотовузаяа tomi.TPF*" й еал!цялово! кислота ( зль ) то еле^грода, еелектпва! за циыи lo-иакя /Грянсс и др., 1980/.

2. Особлквост! ф!з!елого-б!с;:!и!чййх ллаогквоетеЯ та данам1жа росту штам1в •втаф1яоаои1в, «авть.плазы!дп резяетеят-iíoctí до anintflosasla

В паз: чао залгнивтьоя в!дкрнтам питания про еплив поо!ния плязм!д антнб1оталсрозя5геагпоет1 на ф!з!олог1и та óíoxímId стйф1-лскоку. Ml ж та з'яеузанпя цього пптанпя мае принцппсво значения для ?рсзуа1ивя законом1ряостей фориуваппя аа*иб1о?шсоет1йках попу-г-;;,: ,'т?ф!локоя1в, для розробкп б!льш над!йноГ д!агяостш!й нл!-ñívr'.x aiaiklB стаф1лопоя1в, для розпгарешш наших уязлзнь про озпа-ка, що детерм!ну»ть плаз»1да.

7 га'ягку з ции з робот! було проведено пор1вняльне вивчення б!олог1чних властивостей та динам!ки росту I розмнозгення штам!в стгф!локол !э, ио лееугь плазм1ди резистентном! до ряду bhtbÖIotk-

klb.

У ход! досл1дгзнь було зивчеяо 35 ф1з!олого-б!сх1к!чгшх озная, до ялих входили: зд!бн!с?ь оазслмззга та збродзувата pîзн 1 цунря та бэгатоатоын! спирта, вирсбдятл пигмент, слнтезувзти фермента, до визначають патогенн!оть ста$1аокок1в."

Результата доал!д!п зяов!дтали, цо з прпдбапаян плазм1д розлс-тантност! ям1пилавь лияе деягЛ 4 зивченнх б1олог(чних вгастивсотой доея1дгргваио! колекцИ шгам1в отзф1локок!в. Бпр1анти, що м(отять плазм1дя резистенгноог! до еритром1цпну, хлсрам$ен!колу, та ыпо-?ййпост1Скиа и там в тратили лецит!нззну та л1пазну антквиост!. Выявлен! 3JJ i на в гемол1тичи1й активное?! у хлораыфен1колст1Яиих игз-м!в, л!зогенно1'о по фагу вар!анту з ынокагшою аг1Як1сти до антя-ÖIotkkIb та сслеЯ заяапх иетал!з. Шввдк1е?ь заявления плазиоьоагу-лазно! активност1 вар!ювалз у деяких культур. Так, еритроы1цпн.)-вг!йкий л1"1Гонь.!Й га ипохиняост1йккй атаыя виявллли познтивну р»-анц!ю на наявп1гть длазнокоагулаза лише через 15 годин (няубацП, у тай час ял lia! культура - у n«pal 4 годаш:. Зрахоаусчл ¡io3Í,jc.-леппя wegri;-n .íícz ot al. /1979/, ыогла вивловити пу/луясияя про lMOBipny пеяву у стаф!локои1в псевдояоагулазио! sztkíhcotI ,

'¿:шг як, на думку алтор!в, виязпти наявл1ать 1огшшо! плазыоаозгу-лааи иоЕлкво т{льки протягоа перших годин !нкубац! Г.

Таким чипом, представлен! дая! засв!дчують втрагу дсяаих б!о-лог1чних властивовтей, ио належать до фактор!в патогенност1 у итаы!в етаф!локок!в, як1 ы1стять плазы!ди. Це в певн!й м!р! узгод-куеться з коицепц!ею Ьасеу /1975/ про ?е, ио реал!зац!я гене-твчно! !нформац!! ллазм!д потребуе додагкових витрат снергИ за рахуной аниження енергозабезпечення синтезу фермент!в, до вязпа-чають патогенн1сть стаф!локок!в.

При вивчени1 динам!кп росту безплазм!дного та в: 1щуючих пляз-н!ди шгам!в сте|>1локок1в не виявлеяо зшн у характер! та швидкос-т! росту. МоАна пркпуотата, що досл1даен! плазы!ди не мають вплив на р1ст1вн1 параматри через ыаяу молеиулярну «асу та низькокоп!й-н!сть.

Одержан! результата впявила, що комплекс Ее досл!джеиня заю^..-' новазнаних критёрНв патогенное?! не дае повного уявлення про сере-буд!вн! процеси, як1 безперечно в!дбуваються в отафГлпкокових кл!~ тинах з набухтяы генегичних детернЦюнт резистентност! до л!карсь-квх препарат1б. *

Серед б!олог!чпл>: влаотавсстей стаф!локок!в, що забезпечують 1х аиттсд!яльн!оть, иайыеш досл1дяешша, я:: 1 ран!ще, лкшазться фермента, як1 вианачаюк, 1нтепспвн1сть б1осинтетичках та еиергс-тичних процес!в.

3. АктивгЛогь ряду фсршвт!в цантральгшх ке?абол!чша алях!я у пл-ззы1до.ч1егких ста#!локок!в

Для лодальиого дзсл1д5еяня впянву плсз!лд бягиб!отикорезис-теитност! на спрямован!сть метабол1чних шлях!в обра ко! колекцН итам1в отаф!локок1Б ыи вавчьли ряд осаовних реакц!й катабод1зыу •вуглевод!в, а таков деяк! анаплеротичн! та анабол1чн1 реакцН об-и!ну речовап вгаф!локок!в. «

ВияЕлен! пезн!' з;1!нп в активност! клйчозих фермент ¡в г-?кол!-оу, Еентозсфссфатнсго иляху, циклу трикарбоновпх кислот та позм-заних з шш б1оаактетичш1Х реокцШ у ллазм1дом1откЕх стаф!локок!в. Так, ввханоБлон! виа1 р!вн! активное!! фосфа1рук?ок!нази та а ль дола си фруктоза-!,6-двфосфату в ¿юлах 120-52 для культур, ио несуть плг;з.ч1ди о детера!нантаыи ст1йкост! до'антиб1от£д1в (ыгя.1 а). Бор1вш;ио нпзьк! р!аа1 активное? 1 дег!дрогашз гдикозо-$-фоо§ата '2а 6-фосфоглвг,оната альтернативного гл!код!зу пентозофосфатного

in. i zw

fî7>

1 2 S A 5 6 t S S tt 11

(%t ma

cc eo

AO

го о

ш,

2SD

îûa •so 100 so a

И

ь

I

1 2 3 « 5 S 7 S 9 IQ 11

1% 1

iao

to

e<¡

40 ZD О

(fil S 03

ICQ

газ

100

1 г s « s в г a я ю и

f г 3 4 S S T 8 9 10 11

so

1 2 3 A S s г в g to 11 штапаы

Я

-L

1 2 3* s s 7 a a w и шл/аты

m

Мал. I. AkthühIctí, фериент1в ллазШдсЫетяпх ета$1лококи' Фераенти: а - ал-.долазз фруктозо-Х.б-дафоефату; б - г.такозо-6-*ов~ $0тдвг1дрогеййза ; в - аугцинатдоИдюгеназа; г - иалатдехМдрогека-за; д - алан!ндег1дрогеназа; s - гл1циидег1дрсгелчзд. Штамл: I - 8325-4; 2 - NT-3; 3 - N7-4; 4 - NC-I; 5 - NC-4; 6 - 9Э4; V - NE-Í; 8 - NP-8; Э - NE-5; 10 - NF-I; II - W-J373

циклу у плазм!днях ®там!в (30-9С&) св1дчать про знигеяня рол! цьо-го шляху в енергетичноау мзтабол!зм1 отаф1локок!в у зв'язку з при-дбапням геяетиччих фаг;гор1в антиб1оет.ксзг!Ёкоат! (мал. 1,6).

Вквчеяня !нтеяомвноог1 реакцШ циклу Кребса дозволило вотано-зита, що фупгц!онування ЦТК. у антпб!отикорезистентних штам!в спря-мовано на пооилення анабол!чнпх процес!в, тод! як катабол1чн! ре-оецИ цпклу явно спов1льнеп1. Про це сл(д*',ать дан! про знияення активномI цитрат-спнтази на 7-3£# та оукцинагдег!дрогенази ка S6-7S' (мал. 1,в) у стаф!яокок!в, во ы!стять плазм1де, б пор1нкян~ и1 з беоплазм1дним вар!аптом, а тохох надто яизы;1 аггивяост! !гт-цитратдег1дрогсназп, ^ -кетоглутарагдег!дрогеназп, малатдег!дро-геиази, катал1зуячо! перотгорзння L -ыалата в оксаловцетат. Иоряд з цем встаяовлен1 ваа! р!ш1 активнее*! опаилерогичяах фермвнт!в: мал1к-©Н81ыу у 1,1-1,6 рази; «¿катдег'.дрогеназа, що ферментуs аво-роиш реайц1в (в!дновлсшщ оиоалсац'отата,} у1,2-5рзз1в (мал. 1,г), 'а також фермеяг1в, камл1зуач2Х святее ам!воййвлэг: глутвмагу, злйн!ну yl, 5-3,8 разк, acnapsaiy та гл!даяу у i, 1-2,4 рази для г< и гиб 1 отикос тt йких штаа!в (мал. I, д, а). 3 ус!х розглялутих фермент! в найб!льшу гшчш1оть чаш ЫАДН - аалзжи! дег!дрогонази елзн!яу, аопартату та гл!дашу, що вказуе ка актЕв!зац!ю б'сокнте-тичних процео!в н.кл!ткиах плазн!доы1стких стсф1локод!в.!

Наведений енспериазнтаяышй ыатар!ал дозволив оц!питя ступ!яь врояву р1знпх шдях!в метаболîs«y у доол!дквлих культур сгаф!ло::о-3îIb- Катабол^не роэдевлеивя гяшозе сд52огаетьоя перезагао за шляхом Ембдепа-Иейвргофа-ПсрЕаса £а фоп1 зниагияя актквкост! пронес !в пеатозофосфагаого цлдяу. Усоз Мнения осногнтосреакшй циклу' тргкарбоновпх кполог йсш'яиаио з 1йтенс::ф!кац!с2 спаллеротичних процео1в та реакцШ синтезу ^/Ласшедот,

Таккм чинсм, Stil на акгщщост! окремих иетабогйттх прсцес_5в, 'обумовленз вплявоы пдзг:л!д, очезвдво, визначае яайб1льш доц!льнай шлях трансфорыацИ оперг! ! та метабол!т1£ для б1осЕптезу плазм!до-м!схкиыа ст8ф1л«'.ок-ла. У зв'яаау s цны лог!чно було доел в^аемозв'язок wiz -рсцесамв oöalny речоакн та передачею гензтпчнлх фактор!в антиб!с1ш;оот!йкост! у стаф!локок1в. •

4. Участь протойрупШно! сила у коа'югазШному транспорт!

Jffilï у стаф1лог.сг;!в

Вквчення ыехан!зыу передач! пяаза!д рззистентност! проводов на приклад! кон'югац!йного процееу ti Coro залакноот! в!д ензрго-тачаого становиса кон'вгувчвх кя!тан стаф!локои!в.

Вкгззгя) процези вавчалася на ыодел! переносу коя*югатнвпоГ пла^ли з детергЛнантою ст!йксст! до геятаи!цзшу в!д rsíthh до-норного штпму Рй-873 в кл1тпня р?цпп1вьтного ттвму 1055. Для вв-вчеяня процес1в взавмозв'язяу викориотовуволи 1пг1б1тор"ий анал1з. КонтролыП досл!ди дозволили дШтн виеиовиу, ио роэ'еднуэач!, . ¡онофорн! аатиб1отш?н та )нг!б1тори енергетичного обмi ну чинили !яг!б!руючнй вплпв на мембраянай потекц!ал, fioro генчратора та складов!, не стриыуючи .татт8здатн1сть пл!тан доол1джуваяих птпг.Ив стаф!локок!в.

Застосуваяпл роз'едиувача сзп'.слвлального фссфорилетаяня т -хлор«1с исяарболi яфея1 эт 1 дря зону (ХКФ) довело, so дисс!пац!я електрохЫчяого потенц!алу на мембранах к он* игу этих кл!тип як деяорного, тай I рещш!ентпого птпм1в призводить до пригнИэшш пронесу утворзння-трапокоя'»гапт1в-па ва!х етапах кон'игоц1£вого переносу (мал. 2). Присинеяня генврацИ протонруиНйно! вилл п!д вплилом специфИпого !нг!б!тора Н4" - АТРазя N, М'-дг.циклогвк-о !лкарбодк!.ч!ду (ДЩ) такоя супрэводяувться снижения» процентного виходу рекомб1нантнпх кл!тап От. 3). Протз 1нг1б!руючпй ефскт проявляется зяачпо спльн!пе при cípo6nt донорного та рецц-. '-"¡тного втам!в до початку схреяуваяня. Д1я ДЦКД на псп'вгац!йяпЯ перенос плсзгЛди послаблвваяась при !нкубувани! кон'пгуючих ел!тин на (Шьтрах з його присутност!: частота кон'вгацИ зппяувзлаоь у середпьоыу на 40-44&. 1нг1б1тор дихального ланцюга - ц!ан!втий кпл!й (KGN), "навивки, буз особливо ефектпвниы при гнезенн! до !н-кубац1йного середоээза п!д час схреп5ування пл 1 пи: процеигяай т-х!д трарскоа*огант!в знияувавзя на 98$, а пяредоброб^а дояорнях ■ та рещш1ен?ш1Х кл!тин ц!ап!дом вризводила до неполного !нг!б1ру-вапня процесу коа'ягацИ (мял. 4). Ц! екопсраментальн! факта св!д-чзть про залеян'оть лоп'юга^йяого транспорту ДНК в!д .£ункц1оп;1зан-ня обох гвнерэ2ор1в пре:саруз1йво! сила, причешу аяееоя ко.глого генератора з енергозабезиечзпая досл!дауваного рроцесу р!зпай. Можпа припуетити, со працеа Н^-АТРазаого комплексу эабезпечувться 61л1ллоэ nipos »«¡ц1ад1я коц'югацШпого процеоу, а ф7якц!0яування двхаякзого ланцвг'а б!льп необх!дно для переносу Макромолекул ДНК . через цитопяазиатачну мембрану к,тг!тия сгзф!лсхоя1в.'

1нг!б!ру:тЗ ефокт доал!дхуваних сполук слостер!газся як прз обрсбд! донорних, так 1,рЕЦип1ентнах кл!?:ш, Це вказув на необх!д-я!сть врмутнест!, Ajiít на спрягаютах мембранах коя'игуючих.: sl-тпа. •

логарифм концентрации ХКФ

Нал. 2. Вшив протонофорного роз'еднувача ХКФ на кон'югец1о у сггф!локок1в. Кон'югац1ю кл!тинаын птш!в Рб-873 (донор) та 1055 (рецап1ент) проводила на ыеыбраннах ф1льтрах протягоы 5 годан. Внх1д транокои'югант1в при дН ХКФ; кд!тини донора (I), кл1гини репдп! ента (¡2), кл1тини донора I рецкя!ента (3) та при 1нкубуваш11 с;/н1ш1 коа'югуачих кл1тин на ф!льтр1 в приоутаоот! ХКФ у середови-щ! для н1дрощування (4)

Для оц1нка рол! компонент^ електрох1ы!чного потенц1алу в кс£:'вгац1йноыу процев! ми за^тооовувалд 1онофорн1 онтиб1отака: вал!нем1цин та н1гер1цан, щ<? виборково пригн5чують гепзрац1и избранного потеяц!алу га град1внту протон!в. Одертаний окоперимен-•. зльйей ыртер1ал св1дчить про участь обох скяадових ..ротонрушШ-ао! оили в енерг,озабгзпеченн1 транспорту ДНК п!д час кон'вгацП втаф1:ивок!в. Так, проведепкя кок'егзцН в оаредовшяах р!гцо! кис-

Мал. 3. Д1я ÎHrlolTcpa ДЦКД на коп*oran!йнк;'. процес у стаЛ1лоиок!п. Кон*югед?н н1а пл1тянамя штам!в Р(7-Я73 (донор) та IG55 (penan!ент) проведал« по мембрдянпх ф!дырах протягоч 5 ¡годин. Впх1д трано-кон'югаят!з при дН ДЦКД па: кл1тшш донора (I), raíтяни рацх!п1ен-та (2), кл1тияа донора î рецип1сита (3) та лри 1яяубуванн1 cywJqf ноя'вгуочлх кл!аия на ôLus'pi в прлсутност! ДЦКД У середовпд! для п1дрощувагшя (4)

летнсют! <рН 6,0-7,5) засв1дчило, що /\У та -ZApU уявляютьяя взасмозан1ннЕМа та ехвЁзалентпама в забезнеченн! .цього прсцесу (мал. 5). В елаболуяному середовги! впяав вал!ном5цаиу на мейбран-нпй пот-знц!ал празводать до )дг1б1рува1шя процеоу утворенпя трзпс-йсл'пгаят1в, год! як в слабокислому еередовищ! зннжеши волачини дУ компенсуаться екв1кзлоят1ШМ зсИлшенпям -гДрН, i тому 70Я'югац1йний перепое ДНК стримусться мало. OÍ.'CÍks кд!тан донор-

Мал. 4. Вплив КСИ на кон'вгац!йний транспорт ДНК у стаф!локок1в Кон'вгац1с м|е кя^тинаыа штлы1в Р6-873 (донор) га 1055 (редиа1енг) проводила на ыецбрашшх ф!льтрах прогягоу 5 годин. Бих1д транс-кед'юган^в при д11 КСЫ на: кя!тини донора (I), кл1гини рецип1сн-(2), кя^ини донора I рещш1еата (3) та при 1нкубуваин1 сум!ш1 нод'вгуючих хд^ин на ф1льтр1 в присутаоот! КС1* у середовшц1 для п!дрояуваннл (4)

вою та редшПентного штаы1в и!гер1щ1ноы за уиов закиодення 1нкуба-ц1йногз середовида викликае зниканпя чаототи код'югацН I, навпики, при с1лье висохих.значениях рН 1аг1б1рувча д!я н1гер1цину ш> утво-'„вння рзЕ-иб1наяг!в агайвав. Очевидно, по чуглив1сть кон'сгац!йно-го процеоу до а1гер1пину в слабокисло«? .ередоЕиц! поягнювгьея иш, во ав^иення ведачл.ш -2дрН не супрсводяувалоо!. екв!валеягиш вбНыааннси иембравного потенц1аяу.

Мал.'5. ЗалешПстьшПб^руИоХдП вал!ном1цияу та я!гер1цяяу на процес яон'югацН у стаф!локск1л В1Д величина рН 1ш<убац!Яного. еерадоваща..Коя'огац1п ы1а кя<типамт> F5-873 (дояс-р) та IC55 (ре-. цкп!ент) проводила на мчмбраянах ф!ль?рсх протлгсм 5 годин. Вих!д траяояон'вгаят1в при д!Г В2л1ясм1щ;яу.(а) та а!гер!яп<у (б) ва: ил1тиш1 донора (I), кл1таяя рецкп1снта (2) та при Ьжубуванн! су-utml яоя'вгуючих кл!тин :т ф!лыр! в ариоутяост! ¡овофоряих антл-б!отик1в у середовищ! для п!дрсаузання (3)

•Ваявлена залежн!егь пронесу ксн'югацН л !д транемембранпого еяектрох!и!чкого иотеиц!алу послузила приводом для з'ясуванпя роя! вяутр!аньонл!таяяих запасia ATP в зд1йснеян1 транспорту длазм1дноГ ДНК. Заотооуваяня араеяату, по впкликае р!зяз зшгення яоЕцеягра-цП внутр1пшьокл!тиян1,,с ыакроерг!чяих спояук, засз1дчзло, по нчлв-н1с?ь АТР з я он' ¡огувчих *гл I тиках яеобх1дн* т1льяя для проходаашш початкових стад!Я коя'югацН, тод! як оам перьноо кон.'згатяэноГ

шшзлПди проходит^ пезалекао в!д концентрацII внутр1шньокл(тинного адеяоз!нтрифоофату (нал. 6). Одержан! дан! св!дчать про те, що роль АТР зводаться до регуляторно! фуккцН, а джереяоц елерг!? для кон'югац!йного транспорту ДНК служить протонрушхйна сила,

логарифм концентрации арсеиата

Иая. 6. ЗаяоыПсгь коц*вгац1йцого транспорту ДНК в!д auim кокцен-грацИ впутр!щьокл!ти1шого А""1 п!д впливоы арсенату у стаф!локо-к!в. Кон'югац!в uts кл!тинаыа итагНв PG-873 (донор) та 1055 (реци-Шент) проводили ва ыеибрьаиих фильтрах протягоа 5 годин. Вих!д травсЕОН'вгонт1в при д!! ороенату на: кл!тш1я донора (I), кл!гини редка!еата (2),кл!тана донора I рецип!енга (3) та при !ккубувап-н! oytilw! кон'огувчи'х KfltTHH на ф!льтМ в прасутнсст! ароенату у середоввд! для и!дроаування (4)

Представлений експеримепталышй матер!зл уэгодяувтьея э коп- ' цепц!вю про вечторальний перенос макромолекул нукле!новях тслот п!д чао процес!в генетичних реко4мб!нац!й у бактер!3.

ВИСНОБКИ

1. Для ряду штам1в стаф1лолон1в, до м!етять плазм1дп антп-б!отикоре:шатентноет1, ветановлен! зм!нл гемол!тпчно! антпвп05.т1, а також втрата лециг1наэно! та л!пазно! активностей. Плазу!дя! та впх!дннй безплазм1днийвар1анти характеризуются схожими параметрами розту.

2. Встановлена зм1на оп1вв1дяоп1зння пентрпльних метасол1чних шлях(в у стеф1лскок!в у зв'язку з здобуттям генетичних детерм!яан? ат!йкост1 до антпб!отгш!в: п!двищення рол! гл!кол!тичного иляху катабол!зму гликози на фон! зяижепня активност! фермзнт!в пентозо-фосфатного циклу; упов!льнення катабол!чшх реакц!й циклу трзкар-бонових кислот пов'язано з !ятенсиф!кац!ею апаплеротичнях процзз!л

. I резкц13 синтезу ам!яокиолот.

3. Чутлив10ть Процеоу КОП'ЮГацП кл!тин З-ЬорН-. пигеиз до ппляву роз'«днувач!в окислйлал*яого фосфорплхвання та 1иг1д1гср1з е.-^-ргообн 1 ну св!дчать про енергозалелшлй характер кои'югац1Дяого транспорту ДНК. Для зд!йснення цього процеоу необх!дяа генерац!я протонруш1йно1 сили на мембранах кон'вгувчах кл!тин як донсрного, так 1 рецип!ентного штам!а

4. Впзначено вклад генератср1в трансмембранно! р!зняц! елокт-рох!м1чнпх ,потенц!ал!в у зобезпеченп! коя'югац!йпого процеоу. 1а-г1б!руючп2 вплив ¡онофорних антаб!отик!з у середовкиах р!зно! каа-лотност! на кои'юггц!в св!дчить про нйо6х!дн!оть учсот! обох ком-понент1я лротонруз!йно1 сила - мембранного потенц!алу ! град1зяту протон!в - у кон'югдц1й!]с!.;у перенос! плазм!дно! ГНК.

5. Злажеяпя ноэдентргцП внутр1пньснл!тяпйнх виоояоенергетнч-яих фосфорильованих сполуг. у коа'эгуючях кл!тинах в арсенатному еередовни! пркплодить до 1<рпгн!чення початкових етап!з кон'вгац!?, в той час як сам процео переносу плазм!дп прот!:?ас незалезно В1Д к!лькост! внутр1сньокл1тинних фосфорильованих сполук.

HAYKOBI FOSOTH, ОПУШКОВАШ ЗА ТЕМОЮ ДИСБРТАЦП

1. Банников А.И., Сырцов В.В., Гаврилюп B.F., Незтеренг-о JI.H. Активность ряда ферментов энергетического обмена у стафилококков, устойчивых к антибиотикам // Микробиологический журнал. -1989, - Т. 51, JS I. - С. 22-25.

2. Банников. A.Hi, Сырцов В.В.", Гавралэк В.Г. Характеристика сс-еосных энергетических реакций у стафилококков, чувствительных и устойчивых к антибиотикам // Материалы УП сьезда УМО. -

. 1939. - Ч. 2. - С. 81-82.

3. Ванников А.Й., Черевач Н.В., Гаврилюк В.Г. Физиолого-биохими-ческие свойства штаммов стафилококков, содержащих плазыида устойчивости к антибиотикам // Сб. Актуальные проблема химиотерапии бактериальных инфекций. - Тез. докл. Всесовзн. конф.,

Москва. - 1991. - С. 124-125.

4. Gavrilyuck V..G., Cherevach N-V;, Golodok L.P., Vinaxkov A.I. She participation of trans-membrane proton gradient in

the conjugation ргосеаэез of staphylococci // 21 st FE53 Heating, August 9-14-, Irsland.-1992.-P. 123.

5. Гаврилик В.Г., BIhhIkob a.I. Досл1дження енергетичного забез-пёченкя процесу коп'югацН у етаф1локок!в.// Тез. дои. Укр. б1ох1м- зМзду. К Ив: Видавшщтво УСТА. -» 19Э2. - Ч. I. -

С. 30.

6. Чере.,..ач Н.В., Гаврилюк В.Г., В1нн1ков A.I. Б1ох1ы1ча1 та з1олог1чн1 ознаки стаф1локок!в, ст!Лких до аитиб1отщ;!в // Тез доп. Укр. 6ioxiu. з'1зду. - Ки1в: Видавництво УСТА. - 1992. -Ч. 3. - С. 89-90.

7. Vinnikov Л.1., Gavrilyck v.g. Correlation between energy processes and plasmid DI{A translocation of staphylococci // Keystone Symposia on Molecular and Cellular Biology J.Cel. Biochen.-1993.-P.25.