Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эндогенный ингибитор Na, К-АТФазы нервных клеток из мозга крыс (изоляция, идентификация, химическая характеристика)

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Эндогенный ингибитор Na, К-АТФазы нервных клеток из мозга крыс (изоляция, идентификация, химическая характеристика)"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ аШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

Р Г 5 ОД

На правах рукописи

1 О, !!.»п

ЕЛЙШВДЩНА Асия Ахметовна

УДК: 577.152.361:542.978: 547.95

ЭНДОГЕННЫЙ ИНГИШТОР 1Га. К-АТ5азы НЕРВНЫХ КЛЕТОК • ИЗ МОЗГА КШС (ИЗОЛЯЦИЯ.' ИДЕНТИФИКАЦИЯ, ХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА)

03.00.04 - Биологическая химия

Авторефе р а т

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Уфа - 1993

Работа выполнена на кафедре биохимии Башкирского государственного медицинского института и в лаборатории биотехнологии и физиологически активных веществ Отдела биохимии и цитохимии Башкирского научного центра Российской Академии наук.

Научные руководители

Официальные оппоненты -

/иаш/.Тгс .

Ведущая организация

доктор биологических наук, профессор Н.Р.Елаев

член-корреспондент АНБ, доктор медицинских наук, профессор Ф.Х.Камилов

член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор В.И.Рубин

доктор биологических наук, профессор Т.Г.Нигыатуллин

Российский государственный шдицинский университет

Защита диссертации состоится " У'" 1993 г

в_часов на заседании специализированного совета

К 084.35.02 при Башкирской государственном медицинском институте по адресу: 450000, Уфа. Ленина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЕГМИ (450000. Уфа. Ленина. 3).

Автореферат разослан " » 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор медицинских наук.

профессор Э.Г.Давлетов

ОЕЦАЯ ХАРАКТЕИ1СТИКА РАЮИ

Актуальность проблемы. Нарушение эндогенной регуляции активности На-насоса клетки является важнейшим патофизиологическим звеном в развитии ряда заболеваний и неотложных состояний. Это касается, например, эссенциальной гипертонии и гипертонии беременных (Haalyn J.U. et al. , 1982; Kelly R.A. et al. , 1985 и др.), наследственной формы артериальной гипертонии °(Ро-гаева Е.А., 1988), урешш ( Welt; L.G. et al- I964;Bourgolignie

J.J. et al« , 1974) и других патологических состояний. Более того, по мнению НаЪег е., Haupert G.т.Jr,сдвиги в регуляции Na, К-АТ5азы пгравт существенную роль, возможно, в преобладающем большинстве болезней человека.

В связи с этим усилия многих исследователей были направлены на изучение проблемы функционирования и эндогенной регуляции Ne-насоса клетки. Особый интерес представили данные do .Vardener et al«(I96I), впервые высказавших предположение о существовании эндогенных веществ, циркулирующих в крови и оказывающих существенное влияние на активность ка. К-АТФазы плазматических мембран клеток. В дальнейшем подобные соединения били обнаружены и в других тканях и биологических жидкостях.

Проблема изоляции и идентификации эндогенных ингибиторов iia, К-АТФазы привлекла пристальное внимание широкого круга ученых, поскольку ее решение открывает перспективы для терапии заболеваний и неотложных состояний, связанных с нарушенной регуляцией активности Да-насоса клеточных мембран.

Некоторое пз этих ингибиторов к настоящему времени получены в высокоочищенном состоянии, изучены их физико-химические и • биологические СВОЙСТЗа С Clarcson Е.М. et al.,1979; Akagatfa к. et al. , 1984; Haupert G.T.Jr. et al. ,1984; Licbtstein D.et al.. 1985; Cloix J.-F. et al., 1985; Halperin J. et al., 1988). Однако в доступной литературе нами на обнаружено сведений о выделении в индивидуальном состоянии эндогенного ингибитора на, К-АКазы из мозга млекопитающих. Мы не наыли также работ, посвященных детальному анализу кинетики реакции гидролиза АТ$, катализируемой .На, К-АТФазой и ингибируемой данным соединением из мозга. В связи с этим целыэ настоящей работы явилось выделение эндогенного ингибитора Na, К-насоса клетки из мозга крыс и его идентификация. Выбор ткани головного мозга в качестве источника для выделения ингибиторной субстанции продиктован тем,

что место его продукции, по мнению большинства авторов (Alagh-band-Zadeh J., 1983; Haupert G.T.,Jr. et al., 1984; Carilli C.T. et al., 1985; Morgan K. et al., 1985), вероятнее всего, находится в мозге.

В соответствии с целью исследования били поставлены следующие задачи:

1) выделение из мозга крыс ингибитора Na, К-АТФазы в индивидуальном, химически чистом состоянии;

2) разработка оптимального способа получения ингибитора из мозга в препаративных количествах;

3) изучение возможного механизма ингибирования На, К-насо-са клетки выделенным веществом.

Натщная_новизна_2аботы состоит в том, что впервые в индивидуальном состоянии из мозга крыс выделен ингибитор Na, К-АТФ-азы нервных клеток, даны его химическая, кинетическая характеристика и вероятный механизм действия. Выделение эндогенного ингибитора трансмембранного транспорта Н а+ и К+ и его многосторонняя характеристика дополняют и расширяют представления о механизме эндогенной регуляции этого фермента, направленной на поддержание его активности на функционально обусловленном уровне.

Научно-практическая значимость исследования заключается в том, что отработан оптимальный способ получения ингибитора На, К-АТФазы из мозга крыс в препаративных количествах. В перспективе это соединение может быть использовано для патогенетически обоснованного подхода к терапии ряда заболеваний, в основе которых лежит дисфункция На-насоса клетки.

Ш_эащиту_выносятет_етещющие_положе ния:

1) разработанный способ выделения из мозга крыс химически чистого эндогенного ингибитора >Н а, К-АТФазы нервных клеток;

2) кинетические аспекты ингибирования На, К-АТФазной реакции фактором, выделенным из мозга крыс;

3) дозозависимый эффект выделенного фактора на активность На, К-АТФазы микросом мозга.

Апробация_работы. Материалы работы доложены на 57-ой итоговой молодежной научной конференции Башкирского государственного медицинского института (Уфа, 1992); на совместном заседании кафедры биохимии ШЛИ, кафедры фармакологии № I ЕГМИ, Уфимского отделения Российского биохимического общества и лаборато-

рии биотехнологии и физиологически активных веществ Отдела биохимии и цитохимии ЕНЦ РАН (Уфа, 1992).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 научные работы.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на /// страницах машинописного текста, содержит 19 рисунков.. 6 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, 5 глав экспериментальной, части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, содержащего 29 отечественных и 179 иностранных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на 2500 белых лабораторных крысах весом 150-200 г.

Способность низкомолекулярных водорасторимых веществ мозга ингибировать Ка, К-АТФазу оценивали- на микросомно-цитоплазмати-ческой фракции (Осадчая Л.М., 1982).

Определение активности На, К-АТФазы и влияния на нее выделяемых веществ проводили по методу Толстухиной Т.И. (1982).

Содержание белка в суспензии микросом определяли по методу Лоури ( Ьоягу о.н. вЪ аХ.,1951). Ферментативную активность микросом выражали в мкМ Фд/мг'белка/час. На, К-АТФазная активность микросом варьировала в пределах 1,96-8,54 мкМ Ф„/мг белка/

XI

час.

Молекулярную массу исследуемого ингибитора фермента определяли гель-хроматографией на сефадексе &-15 по методу Детерман Г. (1970).

Спектры ЯМР % и 13С регистрировали на спектрометре "Бруке р АМ-300" (300 и 75 МГц, соответственно). В качестве растворителя использовали смесь ср,об и Т)о0 (1:5). Количество вето

щества в 0,5 мл раствора - 4 мг. Число накоплений для ЯМР С -42000. Задержка между импульсами - 2 сек.

ИК-спвктрн регистрировались на спектрофотометре "Зресога 1,1-80" фирмы " Саг1го±вв " (ГДР). Спектры подйракций снимались в таблетках с КЦг и в вазелиновом масле. Область сняттспектров - 500-4000 см-1.

Другие метода, использованные в работе, описаны в соответ-ствуюцих разделах автореферата.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием критерия Стыодента. Различия считались цоото-

верными при Р.$ 0,05.

СОДЕРЖАНИЕ' ДИССЕРТАЦИИ

I. Изоляция эндогенного ингибитора На. К-АИазы из мозга крыс

В процессе поиска эндогенного ингибитора на-насоса нервных клеток нами боли апробированы различные методы препаративной биохимии, а именно: гель-хроматография на Сефадексе 6-25, электрофорез на бумаге в пиридин-ацетатном буфере, восходящая хроматография на бумаге в различных системах растворителей, высокоэффективная жидкостная хроматография на сшшкагеле и в колонке с обращенной фазой, повторная гель-хроматография на колонке с Сефадексом 6-10, ионообменная хроматография на пластинках "БЧ-ххоп " о последующей хроматографией на бумаге в различных системах растворителей. В конечном счете в результате "проб и ошибок". а также с учетом предыдущего опыта (Елавв Н.Р. и ооавт., 1983), разработанный метод выделения эндогенного ингибитора'На, К-АТФазы нервных клеток из мозга крыс свелся к следующей последовательности процедур:

экстракт ткани головного мозга крыс

диализ (24 часа против 20 объемов дистиллированной воды)

диализная жидкость

пики элюции

I-Г

I п

Сефадекс 6-25

элюцая дистиллированной водой

1

-iiv'Hi!

т

3

ь

электрофорез на бумаге (0,2 М пиридин-ацетатный буфер. pH 5,0, 75 мин)

~Г

4

I

под фякпта

I----

1

1 1

7 8

се электрофорез (в тех не ус-ловмх)

3

Ж

По результатам многочисленных экспериментальных данных (Акада№а К. вЪ а1., 1984;НаирвгЬ О.Т.ОГг. оЪ а1., 1984;1.!ог-вап К. вЪ а1., 1985;ШД]^ *Г.А., «Ъ а1. , 1987; М1г 1,1.А. еЪ. а1.1987), ингибитор Не, К-АТФазы из гипоталямуса тлеет низкий молекулярный вес. В связи о этим первым этапом разделения явился диализ экстракта мозга крыс. При гель-хроматографии диализной жидкости на Сефадексе 8-25 смесь низкомолекулярных Еойораст-воримых веществ цитоплазмы нервных клеток элюируется в виде 5 пиков. Профиль элюции представлен на рис. I.

Ríe. I. Гель-хроматография диализуемых веществ цитоплазмы нервных клеток на Сефадексе 6-25 (сплошная линия - профиль элизии, столбиковая диаграмма - влияние пиков элюции на активность illa, К-АТФазы макросом мозга; зе - Р ^0,05).

Как видно, снижение ферментативной активности при действии всех фракций является достоверным, однако минимум А1Фаз-ной активности имеет место при действии материала пика Ш.

Гель-фильтрация низкомолекулярных веществ цитоплазмы ней-роцитов позволяет освободиться от значительного количеотва неорганических солей, фильтрующихся при диализе через полупроницаемую мембрану с пределом пропускаемооти веществ до 1300 Д (Елаев Н.Р. и соавт., 1991). Остаточные количества оолевых при- , месей отдалялись от активного материала методом повторного электрофореза.

' Объектом для последующего разделения явился материал наиболее активного пика Ш. Разделение проводили методом электрофореза на бумаге в 0,2 М пиридин-ацетатном буфере (рН 5.0). Картина разделения представлена на рио. 2.

О

1

б

б

ЯЕвв>

Омрг

4

а

I

4-

Рис. 2. Электрофорез на бумаге в пиридин-ацетатном буфере материала гель-хроматографического пика Щ.

Получено семейство из 8 фракций, 3 из которых движутся к аноду, 5 - к катоду. Результаты тестирования их на .способность ингибировать :Па, К-АТФазу макросом мозга представлены на рис. 3.

1 120

•Ё НО

о к 100

и

90

я 80

1 70

ц ЬЙ 60

* о 50

к 40

л

н о о 30

§ к 20

к «й 10

ж

гЬ

Л

Рис. 3. Влияние электрофоретическях фракций на активность 'Па, К-А2Фазы микросом мозга. я-Р<£0,05.

Достоверно тормозят активность фермента фракции 1,3, 7 и 8, причем наиболее сильно - 7-ая, Тот факт, что на данной стадии фракционирования происходит снижение ингнбируыцей силы наиболее перспективной дая исследования фракции (48,5$ против 4,2$ к контролю после Сефадекса 6-25) связано, возможно, либо с ингибирующиы влиянием на фар-лент неорганических солей, содержащихся в составе хроматографическогб пика Ш, либо с тем, что сочетания некоторых из электрофоретических фракций в условиях целостного организма могут "работать" как более эффективные ингибиторы. •

Однако, поскольку целью работы явилось получение ингибитора Ка-насоса клетки в индивидуальном состоянии, наиболее активную электрофоретическую фракцию 7 подвергли Дальнейшему

фракционированию - реэлектрофорезу в тех же условиях. Местоположение отдельных "пятен" на электрофореграммах. как и при первичном электрофорезе, определяли окрашиванием нингидрином (0,1% раствор в этаноле). Картина реэлектрофореза представлена на рис. 4. -

в

б

4

3

г

I

»в— 0»арт

+

Рис, 4. Реэлектрофорез на бумаге в пиридин-ацетатном . буфере электрофоретической фракции 7.

Фракция 7 при повторном электрофорезе на бумаге разделяется още на 6 подфракцнй, кавдая из которых двинется к катоду. Результаты определения их ингибиторной активности представлены .

в табл. I.

Таблица I

Влияние реэлектрофоретических подфракций на активность ,На, К-АТФазн микросом мозга {% к контролю)

йлюдфракции ом тист,

показателе

2

3

М +

и

57,13+ 3.9 "

II

-с 0.01

5

39,3+ 13,8"

4.4

<0.05

3 '

75.4+ 6,93.5 <0.05 5

53.13+ 31. 10.5 ~ 13.3"

4.5 <0,05 3

5.2 <0.01 5

58.8+ 4.6"

2.2

>0,05

3

Наиболее предпочтительной для дальнейшего исследования в силу своей значительной ингибиторной активности является под-фракция 5, содержащая искомый фактор. Последувдее разделение материала этой под$ракции методами повторного электрофореза в тех же условиях, восходящей хроматографии на бумаге в различных системах растворителей, высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с обращенной фазой не дало новых подфракций, что свидетельствует, возможно, о ее химичеокой чистоте. Однако, учитывая пределы возможности разделения данными методами препаративной биохимии, оставался вопрос о степени гомогенности под-фракции 5. Поэтому она была исследована методом спектроскопии ЯМР% и 13С*. Анализ спектров ЯМР выявил соответствие сигналов строго определенным полям, что свидетельствует о принадлежности изучаемого соединения к вполне определенному классу. Совокупность тлеющихся данных позволила сделать заключение о степени гомогенности исследуемой подфракций в пределах 95-98$.

Таким образом, использованный вариант сочетания методов препаративной биохимии позволил получить химически чистый ингибитор На, К-АТОазы нервных клеток из мозга крыс. Несмотря на определенные потери активного материала, неизбежные при его

Выражаем благодарность д.х.н., руководитель группы ЯМР-ис-следований лаборатории спектральной химии Института органической химии ШЦ РАН Л.МДалилову за действенную помощь п проведении данного раздела работы и расшифровке спектров.

4

5

6

ъ

р

элвдщ с колонки при гель-хроматографии и извлечении, из бумаги, данный способ выделения ингибиторного начала приемлем ввиду своей технической несложности. Этот способ предлагается как метод выделения ингибитора На, К-АТОазы нервных клеток в препаративных количествах. Ориентировочная концентрация ингибиторного фактора, вычисленная с учетом возможных потерь при его получе-т нии, составляет в среднем 10-15 мкг на I мозг крысы.

П. Определение молекулярной .массы эндогенного ингибитора н а, К-АТФазы из мозга крыо

Молекулярную массу исследуемого ингибитора определяли методом гель-хроматографии на Сефадексе 6-15 о использованием в качестве маркеров окситоцина, глутатиона, натрия углекислого ^ глицина. МР выделенного из мозга соединения оказалось около 190 Д.

Ш. Зависимость активности на, К-АТФазы макросом мозга от концентрации эндогенного ингибитора в системе in vitro

Для определения ICgQ (концентрации ингибитора, вызывающей снижение ферментативной активнооти на 50$ при стандартных условиях) исследовали зависимость активности #а. К-АИазы микрооом мозга от концентрации эндогенного ингибитора в сиотеме in vitro (2,5xI0~®; 5x10 ; 7.5XI0"8; I,25xI0"7; I.75xI0~7; 2,5xI0""7; 3,5xI0"7; 5xI0'7; 7,5xI0~7; 3xIO"6; 3.5Д0"6 M). Параллельно определялась зависимость активности и а, К-АТФазы от концентрации ее классического ингибитора растительного происхождения - уабаина (IxIO-3, IxIO"4, IxIO"5, IxIO"6, IxIO"7 M). Результаты исследования представлены на рис.- 5.

ICjq эндогенного ингибитора, определенная по графику, оказалась равной 3,5xI0~7 М, для уабаина - IxIO"® М. Как оказалось, действие изучаемого ингибитора на активность N а, К-АТФазы микро-сом мозга двухфазно: низкие концентрации (2,5-7,5xI0~8 М) на фермент оказывают активирующий эффект, более высокие - вызывают его ингибирование вплоть до полной блокады (3-3,5x10М). Действие ке уабаина на фермент более "мягкое": сравнимые с кон-. центрациями эндогенного ингибитора дозы уабаина вызывают менее ощутимые изменения активности энзима.

Природа подобной зависимости эффекта воздействия на фермент от концентрации эндогенного регулятора остается пока не-

[I] хЮ~7, М

Рис. 5. Завиоимооть активнооти иа, К-АТФазы микрооом . мозга от концентрация ингибитора из мозга крыс (а) я уабаина (б).

ясной, хотя эта закономерность повторяется от опыта к опыту. Подобный дозозавиоимый эффект на клеточном, организменном уровне выявлен при действии некоторых ядов, лекарственных веществ (Меллер Р.. 1977; Варшавский В.И., 1989). Сведений относительно влияния эндогенных регуляторных веществ на определенные энзимы в зависимости от концентрации в доступной литературе обнаружить не удалось. Данных об активирующем влиянии ингибитора из мозга на на, К-АТйазу также не обнаружено. Механизм подобного действия требует специального исследования. Вопрос о том, связано ли это о действием на активный центр фермента, или в него вовлечены другие механизмы, остается пока открытым.

1У. Влияние температуры на ингибиторную активность эндогенного фактора из мозга-

Изучали влияние высоких и низких температур на- ингибиторную активность исследуемой подрракции 5. Обнаружено, что процедура "замораживание - оттаивание", повторенная многократно (3-4 раза) не влияет на способность выделенного ингибитора из мозга тормозить гидролиз ферментом АТО. Не отмечено такяэ снижение ингибиругацей способности подфракции 5 при действии внсо-

ких температур. Электрофореграммы высушивались при температуре Ю0°С, и это не приводило к снижению ингибиторной активности исследуемой подЪракции. Ддя подтверадения отсутствия влияния высоких температур на ингибиторную активность было проведено дополнительное исследование: водный раствор подфракции 5 подвергали 10-ъшнутному кипячению. Как показали результаты, актив-, ность изучаемого вещества до кипячения была 34,4% после кипячения - 36,7$ к контролю (п = 2).

Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод об устойчивости материала подфракции 5 к действию высоких.и низких температур. Это позволяет хранить исследуемое •вещество при низкой температуре в течение нескольких дней без потери его ингибиторной активности.

, 7.1. Определений обратимости ингибирования Na, К-АТФазной реакции эндогенным фактором из мозга крыс

Ддя.определения данной ингибиторной характеристики изучаемое соединение в количестве 100 мкг инкубировали с микросомно-цитоплазматической фракцией в присутствии 0,05 M трис-HCI буфера (рН 7,6) при температуре 37°С в течение 30 мин. Далее инку, бационную смесь разводили 0,3 M раствором сахарозы (1:6) и центрифутаровали в те.ченив 60 мин при 20000g . Полученный осадок микросоы ресуспендировали в среда выделения и определяли активность на, КтАТФазы без добавления в систему, исследуемого ингибитора, В результате экспериментов было установлено, что отличие опыта от контроля не является статистически достоверны:.! (Р > 0,2). Регенерация активности фермента обеспечивается, по-видимому,"сильным разведением .инкубационной ореды. Последующее центрифугирование и осаждение микросом приводит к отделению от них ингибитора в составе надосадочной жидкооти. Таким образом, ингибирование На, К-АТФазы микрооом мозга, вызываемое выделенным ингибитором, носит обратимый характер. Это хорошо согласуется с мнением других исследователей об обратимости действия ингибиторов Na, К-АТФазы из различных биологических источников ( Haupert G.Т.,Jr. et al., 1984; Cloix J.-F.et al., 1985; Cloix J.-F. , 1987; Crabos M. et al., 1987; Hamlyn J.M. <>t r.l. , 1987; Mir M.A. , 1987; Hamlyn J.M. , 1989).

У.2. Идентификация типа обратимого торможения

реакции гидролиза АТФ эндогенным ингибитором из мозга крыс

С целью идентификации механизма торможения и определенш констант заторможенной и незаторможенной реакций, а также К^ , была исследована зависимость скорости на, К-АТФазной реакции' от концентрации субстрата в присутствии и отсутствии ингибитора. Использовались следующие концентрации АТФ: 1х10-4, 2,5x10""*, 5х10-4, МО-3, 2.5x10 М. Окончательные результаты выражали в мкМ Од /мг белка/час. Для интерпретации полученных экспериментальных данных использовали сочетание 7 методов их графического выражения (Л.Уэбб, 1966). Два из них приведены на рис. 6.

Рис. 6. Зависимость скорости гидролиза АТФ N а, К-АТ*а-зой микросом мозга от концентрации субстрата п отсутствии (а) и присутствии (б) ингибитора фермента из мозга крыо в прям их (А) и двойных обратных величинах (Б).

Соответствующие расчеты по графикам и их сопоставление позволили определить, что реакция АТФ, катализируемая а. К-АТФазой микросом мозга, и ингибируемая выделенным соедини:: ■.ем характеризуется следующими кинетическими констант:)":".

- К ш незаторможенной реакции - 6хЮ-4;

„о

- К п заторможенной реакции - 1,2x10 ;

- vmax =7,6 мкМ Фц/мг белка/час;

- Kj_ = 4xI0"7;

- константы взаимодействия: «£ = 13, ^ = 1.

На основании анализа графических методов выражения экспериментальных данных и полученных кинетических констант можно полагать, что выделенный из мозга крыо низкомолекулярный ингибитор тормозит Ыа, К-АТФазную реакцию, конкурируя с субстратом за активный сайг. Согласно данным Jorgensen P.L. (1988), сайтом связывания AT^'Mg является Асп-369 «¿-субъедишшы энзима. Поэтому правомерно предположить, что, поскольку выделенный наш ингибитор обладает конкурентным типом торможения, возможным-местом связывания его с ферментом также является Асп-369. Так как вычисленная нами К,т для АТФ составила 6x10"^. a Ki для изучаемого ингибитора - 4х10~7, то можно прийти к заключению о том, что сродство выделенного из мозга фактора к Ма, К-АТФазе нервных клеток выше, чем у субстрата этого фермента.

Материал подфракции 5 был исследован методами инфракрасной* и ЯМР и С-спектроскопии. Анализ полученных спектров позволяет в качестве рабочей гипотезы выдвинуть предположение о том, что в структуре полученного из мозга крыо соединения присутствует значительное количество аминогрупп, а также, возможно, такие компоненты, как карбамидная группа, остатки J3— аланина, холина, ацетата. Однако проблема полной химической

структуры ингибитора N а, К-АТФазы из мозга-является предме-

задачей „ м том специального исследования и является последувдей работы; '

Если попытаться экстраполировать результаты, полученные в модельной системе, на цельную клетку, то можно представить схему регуляции активности N а,- К-АТФазы плазматичеоких мембран нервных клеток эндогенным ингибитором следующим образом. Вероятнее всего, эндогенный ингибитор N а-насоса, очищенный из ткани мозга, крыо, является постоянным компонентом цитозоля ней-роцитов. Он синтезируется либо самими клетками-мишенями, за исключением клеток коры ( Morgan К. et al.I985), либо специализированными мозговыми структурами (вероятнее всего, гипота-лямусом ( Alaghband-Zadoh J. et al., 1983; Haupert G.T.,Jr.et al. . I9B4; Qarilll C.T. et al.,1985; Morgan K. ot al-,1985))'

* Внрадаем признательность сотруднику лаборатории спектральной xni'.mi Института органической химии ЕНЦ РАН Никифоровой Г.И. па помощь в проведении данного раздела работы.

и транспортируется по аксонам во все клетки. Точкой приложения данного ингибитора, судя по величине Ю^, является </+-иза1)орма фермента (мозговая форма), отвечающая за специфическое тканевое .действие фермента (Коденцова В.М, и Гулидога Г.П., 1988; ВвггеМ-Ввг1;гап<1 I. et а1. , 1988). Активность ее регулируется концентрацией ингибитора в клетке: низкие концентрации (в пределах 2,5-7,5х10~8 М) активируют, более высокие не, наоборот, фермент ингибируют вплоть до полной блокады. Механизм активирующего влияния данного агента пока не ясен. Возрастающие в клетке концентрации фактора вытесняют АТ5 из активного центра N а, К-насоса путем нековалентного связывания о карбоксильной группой Асп-369.

Таким образом, действие исследуемого соединения из мозга на N а, К-АТФазу отличается от механизма ингибирования фермента сердечными гликозидами, которые не препятствуют фосфоршшрова-нию аспартата, а блокируют конформационный переход фермента

путем связывания с К+-центрами, экспонированными наружу. Вероятнее всего, изучаемый эндогенный фактор из мозга крыс ока- ' зывает модифицирующий эффект на энзим о внутренней поверхности плазматической мембраны нервной клетки, поскольку конкуренция с АТФ за активный центр путем влияния о внешней ее поверхности вряд ли возможна.

Итак, из мозга крыс получен в индивидуальном, химически чистом состоянии низкомолекулярный регулятор активности N а, К-АТФазы нервных клеток, предложен механизм модифицирующего влияния на фермент и способ его выделения в препаративных количествах. Полученные результаты в определенной степени расширяют представления о системе эндогенной регуляции функциональной активности N а-насоса клетки в условиях целостного организма. а также открывают перспективы для разработки новых подходов к лечению ряда заболеваний, патофизиологическим звеном в развитии которых является дисфункция этого важнейшего клеточного ферментного механизма.

ВЫВОДЫ

I. Из ткани головного мозга интактных крыс выделен в индивидуальном, химически чистом-состоянии фактор, который идентифицируется как специфический высокоаффинныЯ (К ! = 4x10"?) об- ' ратимый конкурентный ингибитор На, К-АТ5ази нервных ¡слеток.

2. Полученный ингибитор характеризуется следующим физико-химическими свойствами: молекулярная масса около 190 Д. растворим в воде и метаноле, в растворе приобретает резко положительный заряд, не теряет ингибиторную активность при 10-минутном кипячении.

3. Б действии физиологического ингибитора на Ка , К-АТЕаэ-ную активность микросом мозга выявлена двухфазность: низкие (до 7,5x10"® М) концентрации оказывают активирующее влияню на реакцию гидролиза АТФ, более высокие, наоборот, вызывают ее торможение.

4. Использованный вариант сочетания методов фракционирования смеси «изкомолекулярннх водорастворимых веществ цитоплазмы нервных клеток предлагается как метод выделения ингибитора N а, К-АТФазы нервных клеток в препаративных количествах благодаря своей технической несложности для выполнения в лабораторных условиях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ф.Х.Камилов, Н,Р.Елаев, А.А.Байгильдина. Функциональная активность возбудимых тканей как отражение регулирующего действия эндогенных дигоксиноподобных факторов на N а, К-АТОазу. // Актуальные вопросы биомедицинской и клинической антропологии. - Тез. докл. конференции. - Красноярск, 1992. - с. 97-98.

2. А.А.Байгильдина. Способ выделения эндогенного уабаино-подобного ингибитора к а, К-АТФазы нервных клеток. // Вопросы теоретической и практической медицины. - Тез. докл. конференции. - Уфа, 1992. - с. 25.

3. А.А.Байгильдина, Н.Р.Елаев, Ф.Х.Камилов. Низкомолеку- ■ лярный ингибитор N а, К-АТФазы нервных клеток из мозга крыс.

// Здравоохранение Башкортостана. - 1992. - И Л. - с.,4-1Г.

ГП "Принт" Зак. № 6, тир. 100 экз.