Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние эндогенных и экзогенных модификаторов на активность Na+, K+-атфазы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние эндогенных и экзогенных модификаторов на активность Na+, K+-атфазы"

На правах рукописи

<щ

БАТОЦЫРБНОВА Екатерина Геннадьевна

ВЛИЯНИЕ ЭНДОГЕННЫХ И ЭКЗОГЕННЫХ МОДИФИКАТОРОВ НА АКТИВНОСТЬ К+-АТФАЗЫ

/экспериментальное исследование/

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

БАТОЦЫРЕНОВА Екатерина Геннадьевна

ВЛИЯНИЕ ЭНДОГЕННЫХ И ЭКЗОГЕННЫХ МОДИФИКАТОРОВ НА АКТИВНОСТЬ 1Г-АТФАЗЫ

/экспериментальное исследование/

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова

Научный руководитель:

доктор биологических наук профессор Комов Вадим Петрович Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор Скворцевич Евгений Георгиевич докюр медицинских наук профессор Михайлов Сергей Сергеевич

Ведущая организация: Институт эволюционной физиологии и биохимии им. Сеченова И.М.

Зашита диссертации состоится " /^"июня 2005 года в 14 часов на заседании диссертационного совета К 208.088.01 в ГОУ СПб Химико-Фармацевтической Академии (197046, г. Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, дом 14)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ВПО СПХФА

Автореферат разослан "/££_" мая 2005 года Ученый секретарь диссертаци вета

кандидат биологических наук

Караваева Анна Владимировна

Актуальность проблемы. Ма+,К+-АТФаза - фермент с олигомерной структурной организацией, встроенный в плазматическую мембрану животных клеток. Функции, выполняемые данным ферментом разнообразны: перенос ионов Na+ и К+ против их концентрационного градиента, участие в создании мембранного потенциала клетки, в регуляции водно-солевого обмена. В ряде тканей роль Ка+,К+-А'ГФазы связана с транспортом субстратов для клеточного метаболизма. Выявлено участие №+,К+-АТФазы в реализации межклеточных контактов и еб связь с цитоскелетом. Последние годы активно изучается рецепторная функция фермента и его влияние на работу ядерного аппарата клетки (Лопина О.Д., 2001).

Учитывая выше сказанное, естественно предположить наличие сложной, гибкой, разноуровневой системы регуляции активности Ка+,К+-АТФазы, В связи с этим усилия многих исследователей были направлены на поиски регуляторов активности фермента.

Решение этой проблемы имеет не только научное, но и практическое значение. В частности, изменение концентрации модификаторов активности фермента в организме, как полагают, связано с развитием и течением гипертонии, патогенеза хронической сердечной, почечной недостаточности, ишемии (de Wardener Н.Е., 1985; Haddy F.J. 1990; Schwinger R.H., 2003;). Проводились исследования, выявляющие корреляцию между поведенческими реакциями и высокой активностью №+,К+-АТФазы. Снижение активности №+,К+-АТФазы, по-видимому, является одним из патогенетических факторов развития аллергического энцефаломиелита. Эти изменения наблюдаются еще до появления клинических признаков данного заболевания (Кучмеровская Т.М. и соавт., 2001). Существует также мнение, что злокачественное перерождение некоторых тканей начинается с того, что клетка не в состоянии восстановить нормальное соотношение Na+/K+. Это происходит вследствии повреждения мембраны и повышенной

проницаемости для этих ионов или в результате взаимодействия сердечных гликозидов различного происхождения с №+,К+-АТФазой. Следствием эгого может быть запуск метаболических реакций, приводящих к индукции онкогенов (Nakagawa Y., et.al, 1992; Numazawa S., et.al, 1996; Szabo E., et.al, 1998).

Поэтому неудивительно, что большое внимание уделяется поиску как эндогенных так и экзогенных модификаторов активности Na4,K+-ATPa3bi.

К настоящему времени из коры надпочечников и гипоталамуса млекопитающих получен в очищенном сосюянии эндогенный оуабаин -высоко специфичный ингибитор №',К4-АТФазы, химическая структура которого идентична структуре сердечных гликозидов растительного происхождения (Schoner W., 2001)

Важность выполняемых функций №+,К+-АТФазой, существование нескольких изоформ фермента, их различная устойчивость к сердечным гликозидам (существует оуабаинрезистентная форма Na',К+-АТФазы) (Болдырев A.A., 2001) дают основания предполагать наличие в организме позвоночных других модификаторов данного фермента, отличающихся по структуре от выделенного эндогенного оуабаина. И действительно, в результате многочисленных экспериментов были получены вещества, воздействующие на активность №+,К+-АТФазы, по структуре не являющиеся гликозидами (Елаев Н.Р., 1994).

Целью настоящей работы явилось выделение эндогенного ингибитора Ыа^К^-АТФазы из мозга крупного рогатого скота, характеристика его структуры, а также синтез новых биологически активных соединений, способных изменять активность изучаемого фермента.

Исходя из поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1.Выделение и очистка из мозга крупного рогатого скота ингибитора Ка+,К+-АТФазы. Характеристика его структуры.

2. Изучение влияния выделенного ингибитора на скорость АТФазной реакции.

3.Синтез КГ-оксидов пиридина и хинолина, оценка возможности их использования в качестве экзогенных веществ-модификаторов активности №+,К+-АТФазы.

4. Сопоставление специфичности эндогенных и экзогенных ингибиторов №+,К+-АТФазы.

Научная значимость работы состоит в том, что выделен и очищен до гомогенного состояния из мозга крупного рогатого скота новый ингибитор №+,К+-АТФазы нервных клеток. Идентифицирована химическая структура и изучены его свойства. Выделенное соединение, тройное к №+,К+-АТФазе, является представителем нового класса ингибиторов этого фермента. Данный ингибитор, отличающийся по строению от эндогенного оуабаина, характеризуется аналогичной специфичностью, ингибирующей активностью сопоставимой с действием оуабаина. Впервые показано, что синтезированные ТЧ-оксиды пиридина и хинолина и их производные, ингибирующие На+,КГ-АТФазу нервных клеток, также проявляют высокое сродство к данному ферменту. Полученные данные расширяют представления о возможностях влияния модификаторов активности изучаемого фермента на физиологические процессы в организме.

Научно-практическая значимость исследования заключается в том, что выделенный ингибитор, его характеристики могут быть использованы для патогенетически обоснованного подхода к терапии ряда заболеваний, связанных с нарушением функций Ка+,К+-АТФазы. Получение гетероароматических Ы-оксидов пиридина и хинолина и их производных может послужить основой для разработки новых фармакологических препаратов, используемых для экзогенной регуляции активности фермента.

На защиту выносятся следующие положения:

1. В ткани головного мозга крупного рогатого скота обнаружен неизвестный ранее ингибитор Na+,K+-ATOa3bi.

2. Этот ингибитор оказался ациклическим аминоспиртом с молекулярной массой 200 Да. Он относится к новому классу модификаторов №+,К+-АТФазы.

3. Предложена примерная формула и возможный механизм действия выделенного ингибитора Ыа+ДС+-АТФазы.

4. Разработан синтез N-оксидов пиридина и хинолина и их производных, специфически ингибирующих активность Ка+,К+-АТФазы.

5. Сопоставлены степени аффиности эндогенных и экзогенных ингибиторов по отношению к Ка+,К+-АТФазе.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на 11 международном симпозиуме по органическому синтезу в Амстердаме (Амстердам, 1996); на международной конференции студентов и молодых ученых Санкт-Петербургского медицинского университета им. И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 127 страницах машинописного текста, содержит 21 рисунок, 13 таблиц. Состоит из введения, 5 глав, выводов, приложения и списка литературы, содержащего 36 отечественных и 121 иностранных источников.

Материалы и методы исследования

Работа выполнена на 20 кг головного мозга крупного рогатого скота.

Способность низкомолекулярных веществ мозга ингибировать Na+,K+ -АТФазу оценивали на микросомно-цитоплазматической фракции (Елаев Н.Р., 1978).

Определение активности Na+,K+ -АТФазы и влияния на нее выделяемых веществ проводили по методу Толстухиной Т.И. (1982).

Содержание белка в суспензии микросом клеток головного мозга определяли по методу Лоури (Lowry О.Н. et al, 1951).

Молекулярную массу исследуемого ингибитора фермента определяли гель-хроматографией на сефадексе G-25 medium.

Для определения структуры ингибитора были сняты соответствующие спектры: Ж, УФ, ПМР, 13С-ЯМР, масс-спектры.

Для изучения влияния гетероароматических N-оксидов на активность Na1",^-АТФазы было взято 18 N-оксидов. 6 N-оксидов были синтезированы по описанным в литературе методикам. N-оксиды 4-хлор(4-бром)хинолина синтезированы по разработанной нами методике. Остальные вещества были любезно предоставлены сотрудниками кафедры биологической и биоорганической химии Петрозаводского государственного университета.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием критерия Стьюдента. Различия считались достоверными при Р<0,05.

Содержание диссертации

1. Выделение эндогенного ингибитора Na"1",!^-АТФазы из ткани головного мозга крупного рогатого скота

Так как ТСХ и ВЭЖХ очень пеудоб&ы для количественного разделения больших количеств биологического материала нами был разработан препаративный метод очистки ингибитора, заключающийся в использовании адсорбционной колоночной хроматографии на силикагеле Z 100/250.

На первом этапе микросомно-цитоплазматическую фракцию, полученную из гомогената мозга крупного рогатого скота, диализовали против 10 объёмов дистиллированной воды. Диализат концентрировали в вакууме и разделяли на колонках, заполненных силикагелем L 100/250, элюент - вода (рис.1).

V /

ООО 1

л г\

и 1

• • ' • • • ■ 12 3 4 8 • 6 7 а

Рис. 1. Разделение методом ТСХ микросомно-цитоплазматической фракции, полученной из мозга крупного рогатого скота (подвижная фаза-вода, первая стадия). Таким образом, диализат разделили на четыре фракции, каждая из

которых была проверена на наличие соединений, модифицирующих

активность Ка+,К+-АТФазы.

Затем системой растворителей хлороформ-этанол-вода=5:13:5

вещества, содержащиеся в первой фракции и проявляющие итибирующий

эффект (М=61±6; 11=10; р<0,05), разделяли на колонках с силикагелем Ь

40/100. Было выделено 4 фракции, которые вновь проверяли на наличие

ингибиторов и активаторов активности №+,К+-А'ГФазы (рис.2).

0 0

г 1 Оп

\ Л 00 4 » Г"*

оооо

• • « • 1 2 Я 4 • • • * В б Г 9

Рис. 2. Разделение методом ТСХ фракции 1 (см. рис.1) (подвижная фаза-хлороформ-этанол-вода = 5:13:5, вторая стадия).

Далее вещества, содержащиеся во фракции 1.1. и ингибирующие фермент (М=58+5; п=10; р<0,05) разделяли методом ТСХ на силуфолах с использованием системы растворителей хлороформ-этанол-вода (5:13.5) (рис.3).

i.i 1 1.1.2

1.1.3

1.1.4

Рис. 3. Разделение методом ТСХ фракции 1.1 (подвижная фаза: хлороформ-этанол-вода =

5:13:5, третья стадия) Вещества с пластинки элюировали водой и снова анализировали их

способность модифицировать активность №+,К+-АТФазы.

Полученные результаты позволяют предполагать наличие в мозге

нескольких ингибиторов фермента.

Работу начали по исследованию структуры соединения, которое

содержится в ткани в максимальной концентрации (фракция 1.1.3, самое

сильное проявление парами йода,) и ингибирутощее Ка+,К+-АТФазу

(М=75±5; п=9; р<0,001).

Как было показано методом масс-спектрометрии основным

компонентом этой фракции является хлористый аммоний, (фрагменты HCI и

NFLt). Как известно, метод гель-фильтрации позволяет освободиться от

значительного количества неорганических солей, фильтрующихся при

диализе через полупроницаемую мембрану с пределом пропускаемое™

веществ до 1300 Да. Таким образом, методом гель-хроматографии на

Sephadex G-25 medium удалось отделить ингибитор от NH4C1.

I

I

I I I

I i

Молекулярная масса выделенного из мозга соединения оказалась около 200 Да.

После обработки 8 кг мозга крутого рогатого скота было выделено около 4 мг ингибитора, белого твердого вещества, индивидуальность которого доказана методами ТСХ, ВЭЖХ. Оно хорошо растворимо в воде и метаноле и очень плохо в хлороформе. Интересно, что хроматографирование (ТСХ) водного раствора (рН=7) очищенного ингибитора (хлороформ-этанол-вода (4:5:1)) даёт три пятна (рис.4).

Рис. 4. Ингибитор при рН=7 (подвижная фаза: хлороформ-этанол-вода = 4:5:1) Повторное хроматографирование каждого пятна из трёх, в тех же

условиях, даёт опять три пятна, но отличающиеся по интенсивности окраски.

В тоже время, слабое подкисление НС1 (до рН=6) или подщелачивание

твёрдым Ка2С03 (до рН=7,5-8) водного раствора ингибитора приводит к

тому, что на хроматограмме после окрашивания парами йода проявляется

единственное фиолетовое пятно (рис.5 и 6).

Рис.5. Ингибитор при рН=8 Рис.6. Ингибитор при рН=6

Подвижная фаза-хлороформ-этанол-вода=4:5:1. Проявление парами йода.

Подобное хроматографическое поведение возможно связано с наличием ионогенных групп в исследуемом соединении, проявляющие кислотно-основные свойства в зависимости от рН среды.

Именно в нейтральной среде, где возможно сосуществование соединения в виде нескольких ионных форм и появляются при хроматографическом разделении три пятна. В тоже время добавление к разделяемой смеси кислоты или основания смещает указанное равновесие влево или вправо и на хроматограммах проявляется единственное пятно.

Для определения структуры выделенного соединения были сняты ИК-, УФ-, 13С-ЯМР-, ПМР- и масс-спектры.

Суммируя имеющиеся данные, мы склонны считать, что выделенный ингибитор содержит как минимум четыре атома углерода и три силилируемые функциональные фуппы (амина- в аммонийной форме и, возможно, гидроксильные), являясь ациклическим аминоспиртом, или его производным, содержащим простую эфирную связь. Примерная формула ингибитора:

Таким образом, молекулярные массы эндогенного ингибитора, определенные экспериментально и рассчитанные по предложенной формуле, практически совпадают.

Также был проверен ингибирующий эффект выделенного вещества от его концентрации. Полученные данные указывают, что способность ингибировать фермент мало зависит от разбавления и проявляется даже в

рН=6

рН=7

рН-8

он - сн2 - (сн2ь - сн2 - мГ

к,=с2н5о2

Ы2=С2Н5СГ

концентрации 10"8 М, что свидетельствует о его высокой ингибиторной активности и специфичности.

Для выявления влияния данного ингибитора на скорость АТФазной реакции был проведен рад опытов с использованием различных концентраций АТФ и ингибитора.

Из данных литературы известно, что №+,К+-АТФаза гидролизует АТФ в широком диапазоне концентраций: от 1-2 мкМоль до 2-3 мМоль (Лопина О. Д., 1999). Поэтому для эксперимента были взяты следующие концентрации АТФ: 1 мкМ, 10 мкМ, 100 мкМ и 1 мМ. Концентрации ингибитора были равны 0,15 мг/мл и 0,015 мг/мл. Для определения активное ги №+,К+-АТФазы в данных опытах использовался мембранно-связанный фермент (микросомы клеток мозга крупного рогатого скота) при рН=7,55 и температуре 37° С.

Согласно данным литературы зависимость активности данного фермента от концентрации субстрата имеет вид кривой с промежуточным плато при 1=37°С, рН=7,4-7,5, что предполагает наличие двух или более типов субстрат-связывающих центров (Лопина О.Д., 1999). Полученные результаты подтвердили эту зависимость (рис.7 и 8). Кроме того, нами показано, что при добавлении ингибитора необходимо увеличить концентрацию субстрата (АТФ) для достижения 55% ферментативной активности по отношению к контролю.

Концентрация АТФ, мкМ

Рис.7 Зависимость активности №+,К+-АТФазы микросом клеток мозга крупного рогатого скота от концентрации АТФ в присутствии ингибитора Ю^М (при 37 0 С, рН=7,55)

концентрация АТФ.мкМ

Рис.8 Зависимость активности №+,К+-АТФазы макросом клеток мозга крупного рогатого скота от концентрации АТФ в присутствии ингибитора 10"7М (при 370 С, рН-7,55)

Такой эффект возможно связан с тем, что выделенный ингибитор, не

являющийся нуклеотидом, связывается с одним из субстратных центров, к

которому обладает большим сродством, чем АТФ, что приводит к

полученному результату. Возможно также, что ингибитор связывается с тем

же центром, что и АТФ, ввиду более высокого сродства к данному сайту.

Согласно данным литературы субстрат-связывающие центры находятся с

цитоплазматической стороны мембраны, исходя из этого, мы предполагаем,

что выделенный эндогенный фактор оказывает регулирующий эффект на

Ка+,К+-АТФазу с внутренней стороны плазматической мембраны клетки

(всЬетег-ВоЫз в., 2002). Таким образом, можно полагать, что Ыа+,К+-

АТФаза имеет два или более субстрат-связывающих центра и сродство АТФ

к этим центрам сопоставимо для обнаруженного нами ингибитора.

Увеличение концентрации АТФ приводит к вытеснению аминоспирта из

субстратного центра фермента по механизмам сходным для конкурентного

ингибирования, хотя Ыа+,К+-АТФаза не подчиняется классической кинетике

Михаэлиса-Ментена.

2. Влияние гетероароматических ]Ч-оксидов на активность

мембранной ^+ДС+-АТФазы

Согласно данным литературы различные производные,

гетероароматических К-оксидов проявляют высокую биологическую

активность, а именно: антибактериальную, гербицидную, апоптогенную. Так как в литературе нет информации о модифицирующем действии гетероароматических Ы-оксидов на активность ферментов, поэтому одной из наших задач было изучение влияния экзогенных Ы-оксидов на активность Ка+,К+-АТФазы. Часть этих веществ была синтезирована по описанным в литературе методикам, а ]Ч-оксиды 4-хлор(бром)хинолина были синтезированы по разработанному нами способу.

Для проведения данных опытов были взяты следующие концентрации >1-оксидов: 10"4 М; 10"6 М; 10"8 М; Ю"10 М. В результате проведенных исследований выявлено, что исследованные М-оксиды, кроме 4-аргентотиохинолин И-оксида, в концентрации 10"4 М обладают выраженным ингибиторным эффектом активности №+,К+-АТФазы микросом мозга крупного рогатого скота. 4-аргентотиохинолин Ы-оксид показал наоборот, активирующий эффект, что возможно, связано с присутствием атомов серебра.

Возможно в этой концентрации ионы серебра активируют самую медленную стадию каталитического цикла Ыа+,К+-АТФазы, а именно, коиформационный переход Е1-Е2, что и определяет активирующее влияние соединения. В дальнейшем уменьшение концентрации Ы-оксида не оказывает подобного эффекта. При концентрации 10"6 М сохраняется подавление активности Ка+,К+- АТФазы данными соединениями, кроме 2-(2,4-диметоксистирил)хинолин И-оксида. Такая резкая смена воздействия (с ингибирования на активирование) возможно связана со стереоэффектами стирильных производных.

При концентрации Ю~10 М подавления активности №+,К+- АТФазы не наблюдалось, за исключением №оксидов 4хлор(бром)хинолина, при воздействии которых эффект ингибирования сохранялся. Такое влияние возможно связано с необратимым воздействием данных соединений на белковую структуру фермента, либо с влиянием на липидное окружение

АТФазы, что, как известно, играет огромную роль в организации молекулярного комплекса.

Полученные результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1

1Ч-оксид/концентрация КИМ Ю^М Ю^М ю10м ~88Г

ГЧ-оксид хинолина 40 (-) 24 (-) 30(0

4-ОруО 28 (-) 29(-) 37(0 102*

И-оксид 4-(2,4-динитро бензомеркапто)хинолина 64 (-) 72 (-) 73 (0 91*

И-оксвд 2-(2,4-диметокси стирил)хинолина 58(-) 188 (+) 73(0 100*

ТЧ-оксид 4-(4-метокси стирил)пиридина 65(-) 83 (-) 81(-) 95*

И-оксид 4-аргентотио хинолина 154 (+) 74(-) 71(-) 96*

1М-оксид 2-((4-диметиламино-фенилимино)метил хинолина 56(-) 60(-) 57(-) 90*

№оксид 4-азидохинолина 65(-) 72 (-) 74(0 97*

4БОО 47 (-) 45 (-) 50(-) 106*

2БОО 60(-) 60 (-) 69(0 103*

4 N00 ЗЗ(-) - 32 (-) 33(0 101*

2-ме гилЫОО 41(0 43 (-) 50(-) 92*

И-оксид 4-(2,4-диметоксисти-рил) пиридина 38 (-) 37 (-) 37(-) 108*

К-оксид 4-метилпиридина 81 <-> 82 (-) 64(-) 98*

Ы-оксид бензокса-2-диазол-1,3 66(-) 65 (-) 64(-) 97*

3-имино-4-тиоксо-3,4,5,6,7,8-гексагадроизохинолин-2-1М-оксид 28 (-) 29 (-) 83 (0 99*

И-оксид 4-хлорхинолина 68(-) 72 (-) 77(-) 76(0

И-оксид 4-бромхинолина 75(-) 77(0 85 (-) 82(0

Примечание: представлены данные в % по отношению к контролю для 10 опытов. *-отличаются от контроля: р>0,05. «+»- эффект активирования «-»- эффект ингибирования

3. Влияние гетероароматических ^оксидов на активность ГОа+,К+-АТФазы эритроцитов крысы

В свете полученных результатов и имеющихся литературных данных,

свидетельствующих о высокой биологической активности И-оксидов, было решено изучить влияние ЪГ-оксидов на активность №+,К+-АТФазы эритроцитов крысы. Для такого исследования мы взяли №оксид хинолина (С?0) и И-оксид 4-нитрохинолина (4КСЮ). Такой выбор был продиктован тем, что в наших опытах эти вещества показали достаточное сильное ингибирование фермента. Литературные данные указывают на высокую биологическую активность 4NQO. Он является канцерогеном, мутагеном, апоптогеном. С?0 - ингибитор эритроидной дифференцировки клеток линии К562, но не является апоптогеном (Волкова Т.О. и соавт., 2001).

В данной работе влияние СЮ или 4-N<30 на ионный состав эритроцитов крыс сравнивали с действием оуабаина, который является хорошо известным ингибитором Ыа+,К+-АТФазы.

Известно, что активность 1Ча+,К+-АТФазы в тканях крыс, включая эритроциты, обладает весьма низкой чувствительностью к оуабаину (Уатас1а К., 1997). Поэтому в исследованиях на крысах этот ингибитор применяется в высоких концентрациях - в пределах 1-10 мМ.

Инкубация эритроцитов в течение 60 мин при 37 °С в присутствии оуабаина или 4-Ы(30 сопровождалась значительным повышением внутриклеточного содержания Ыа\ Увеличение содержания Ыа+ под влиянием 2 мМ оуабаина было статистически достоверно выше (2,10±0,19 ммоль/л), чем с 1 мм оуабаина (1,65±0,15 ммоль/л, р=0,048). Внутриклеточное содержание возрастало в равной степени при обработке клеток 0,1 или 0,5 мМ 4-ЫСЮ (0,65±0,10 и 0,72±0,23 ммоль/л соответственно). Одновременное добавление к инкубационной среде 1 мМ оуабаина и 0,5 мМ 4-ЫСЮ вызывало такое же увеличение содержания Ыа+ (1,60+0,22), как в присутствии одного оуабаина (1,65±0,15 ммоль/л). В

отличие от 4-NQO, QO в концентрации 0,1 и 0.5 мМ не вызывал статистически достоверного изменения содержания Na+ в эритроцитах крыс. Известно, что в интактных клетках разного типа, включая эритроциты, Na+,K+-Hacoc функционирует не с максимальной скоростью и его активность существенно возрастает при повышении внутриклеточной концентрации Na+ (Wiley J.S., et al, 1980). В следующей серии экспериментов изолированные отмытые эритроциты крыс предварительно инкубировали в стандартной среде при 4 °С в течение 20 ч. При этих условиях достигалось приблизительно двукратное повышение концентрации Na+ в клетках.

Исходная концентрация Na+ в «нагруженных» эритроцитах была в 2.4 раза выше, чем в свежеизолировнных клетках. Инкубация этих эритроцитов в стандартной среде в течение 1 ч при 37°С (контроль) сопровождалась значительным (р<0,001) уменьшением содержания Na+ по сравнению с исходным уровнем. В присутствии в инкубационной среде оуабаина или 4-NQO внутриклеточное содержание Na+ значительно возрастало по сравнению с контролем. При совместном добавлении к среде 1 мМ оуабаина и 0,1 мМ 4-NQO изменение содержания Na+ в клетках было таким же, как и в присутствии одного оуабаина. Изменения в содержании Na+, вызываемые 1 и 2 мМ оуабаина были значительно больше (5,10±0,62 и 3,93±0,56) по сравнению со свежеизолированными эритроцитами в первой серии опытов. 4-NQO в концентрации 0,1 мМ также вызывал значительно большее повышение содержания Na+ в «нагруженных Na+» эритроцитах (1,48 ± 0,41 ммоль/л). Таким образом, прирост внутриклеточного содержания Na+, вызываемый 2 мМ оуабаина 0,1 мМ 4-NQO, был примерно одинаков на свежевыделенных и «нагруженных» эритроцитах (в 2,3 раза, что соответствует увеличению исходной концентрации Na+). Учитывая, что концентрация 4-NQO в 20 раз меньше концентрации оуабаина, можно предположить, что сродство 4-NQO к Ыа+,К+-АТФазе выше, чем оуабаина.

Внутриклеточное содержание К+ не изменялось статистически достоверно под влиянием оуабаина и 4^0О в обоих сериях опытов. В первой серии содержание К+ составляло 83,3±1,2, 82,9±1,0 и 84,9+1,3 ммоль/л клеток соответственно в контроле и в присутствии 1 мМ оуабаина или 0,1 мМ 4-ЫС?0. Во второй серии опытов эти величины равнялись 85,1±1,6, 81,7±2,5 и 84,0±2,1 ммоль/л в контроле, в присутствии оуабаина и 4~М<30.

Ингибирующее действие 4-Ы0Ю на №+,К+-насос было максимальным при концентрации 0,1 мМ, поскольку эффект не изменялся при повышении его концентрации до 0,5 мМ.

Полученные данные свидетельствуют о том, что именно наличие МЭ2-группы в 4-ИрО обусловливает его действие на Ма+,1С*-насос. По всей вероятности, ингибирующее действие 4^<30 опосредуется через его взаимодействие с ЭН- или Р04-группами в молекулах №+,К+-АТФазьт Эта идея поддерживается многочисленными данными об ингибировании №+,К+-насоса в разных типах клеток, включая эритроциты, в условиях гипоксии или окислительного стресса (Bogdanova А.У., е! а1, 2003).

В свете полученных результатов и имеющихся литературных данных, интересно сравнить специфичность действия на мембранную №+,К+-АТФазу выделенного нами ингибитора, эндогенного оуабаина, палитоксина, сангинарина и гетероароматических И-оксидов (табл.2). Выделенный нами ингибитор и эндогенный оуабаин отличаются структурно -первое вещество, по-видимому, является ациклическим аминоспиртом, оуабаин имеет стероидную структуру, идентичную структуре растительных гликозидов. Молекулярные массы данных ингибиторов также отличаются МгингибИтора =200 Да, Мгоуабаина =585Да. Несмотря на различия в структурах оба соединения являются высоко специфичными по отношению к №+,К+-АТФазе. Эндогенный оуабаин 50% ингибирование проявляет при концентрации 3-7x10"8 М. Ишибирующий эффект выделенного нами

соединения проявляется в концентрации 10"8М, что также свидетельствует о его высокой специфичности.

Синтезированные Ы-оксиды пиридина и хинолина и их производные по своей структуре отличаются от выделенных эндогенных ингибиторов, но проявляют себя как вещества, также обладающие высокой аффинностью к На+,К+-АТФазе. В нашем' исследовании некоторые синтетические модуляторы при концентрации 10"8 М, при которой эндогенные модификаторы ингибировали фермент на 50%, обладали способностью подавлять ферментативную активность более чем на 50% (в среднем на 70% по отношению к контролю). В литературе упоминается о двух известных на сегодняшний день ингибиторах Ыа+,К+-АТФазы экзогенного происхождения, а именно об сангинарине и палитоксине. Сангинарин близок по химическому строению к сердечным гликозидам. Формула палитоксина очень объемная, содержит большое количество ароматических составляющих, то есть по структуре это соединение стоит особняком в классе экзогенных ингибиторов Ыа+,К '-АТФазы. Данные вещества изменяют конформацию фермента таким образом, что ионные потоки оказываются направленными по градиенту концентрации. Как показали опыты по замене а-субъединицы в активном центре фермента, фосфорилирование фермента не является необходимым фактором для действия данных соединений. Таким образом, ионный насос прекращает работу, что приводит к потере клеткой ряда важных функций. Место связывания данных веществ ферментом неизвестно на сегодняшний день, существуют только предположения, что по-видимому, эти токсины связываются с ЕГР формой фермента. Проведенные эксперименты показывают их высокую специфичность к Ка+,К+-АТФазе. Сангинарин, подобно оуабаину, оказывает положительный инотропный эффект в концентрации 6-6,5x10^ М и именно при данной молярности достигается 50% ингибирование фермента, что отличает его по данным показателям от эндогенного оуабаина. Хотя 100% остановка ферментативной активности

происходит при содержании сапгинарина 1x10"4 М, что сопоставимо с действием сердечного гликозида. Палитоксин известен тем, что в концентрации 10'9 - 10 ~10М ингибирует №+,К+-АТФазу примерно на 50%, то есть является более токсичным.

Таким образом, эндогенные ингибиторы №+,К+-АТФазы: оуабаин и выделенный нами фактор, обладают примерно сходным сродством к исследуемому ферменту, а именно в пределах концентраций 10'6 -10"8 М они проявляют свое физиологическое действие. По механизму ингибирования данные соединения возможно отличаются. Оуабаин действует с внешней стороны мембраны, блокируя конформационный переход Ег-Е]. Ациклический аминоспирт, вероятнее всего, воздействие оказывает с внутренней стороны мембраны (табл.2).

Представители класса экзогенных ингибиторов фермента обнаруживают воздействие на №\К+-АТФазу в пределах 10"4 -Ю"!0 М и степень ингибирования значительнее, вплоть до полной остановки ферментативной активности. Опыты на эритроцитах крысы показали, что гетероароматические ^-оксиды, по-видимому, действуют на энзим с внешней стороны мембраны и по тому же сайту, что и оуабаин. Действие иалитоксина и сангинарина отличается от такового всех известных ингибиторов, как эндогенного так и экзогенного происхождения. В соответствии с выше сказанным и последними данными литературы, сгановшся понятным, что Ка+,К+-АТФаза вовлечена в гораздо более сложную систему регуляцию ее активности в организме, чем это описывалось ранее. Наличие различных изоформ субъединиц фермента, экспрессия которых регулируется в зависимости от типа ткани, стадии развития организма, позволяет рассматривать их как подтипы рецепторов, специфичных для различных модификаторов, различающихся по строению, механизму действия и степени аффинности. Поэтому выявление селективных эндогенных ингибиторов (для разного типа субъединиц)

подобно нашему амнноспирту, является исключительно важным для решения задач оценки экспрессии этих изоформ в разных тканях, что поможет в решении ряда клинических проблем. Также обнаружение новых экзогенных высоко специфичных регуляторов активности №~,К~-АТФазы, а именно гетероароматических 1Ч-оксидов, может быть использовано для разработки новых лекарственных препаратов направленного действия, основанного на знании их молекулярных мишеней.

Таблица 2

Ингибитор I» 1юо Механизм ингибирования

Эндогенные 1. Оуабаин 3-7х10'8М Ю^М Связывается с внешней стороной плазматической мембраны (блокирует Е2-Е] переход)

2. Ациклический аминоспирт 10"8М Внутренняя сторона мембраны

Экзогенные 1. Сангинарин 6-6,5x10"6 М Ю^М Связывается с Е[ формой энзима, изменяет ионные потоки.

2. Палитоксин ю-Мо-шм Тоже что и сангинарин

3. Гетероарома-тические N-оксиды 10"4- 10"8М Связывается с внешней стороной плазматической мембраны

Выводы

1. Из ткани головного мозга крупного рогатого скота выделен и очищен до гомогенного состояния неизвестный ранее ингибитор №+,К+-АТФазы.

2. Индивидуальность выделенного ингибитора показана методами ТСХ и ВЭЖХ. Молекулярная масса ингибитора составляет 200 Да.

3. Выделенный ингибитор является аминоспиртом, на что указывают данные ИК-, УФ-, ПМР-, 13С-ЯМР-, масс-спектров.

4. Предложены примерная формула выделенного ингибитора, а также возможный механизм его действия.

5. Разработана новая методика синтеза гидрогалогенидов N-оксидов 4-галогенхинолинов.

6.Синтезированые N-оксиды пиридина и хинолина и их производные являются высоко специфичными ингибиторами мембранной №+,К+-АТФазы и могут быть рекомендованы для разработки на их основе фармакологически активных препаратов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Андреев В.П., Калистратова Н.Г., Рыжаков A.B. Новый способ получения гидрогалогенидов N-оксидов 4-галогепхиполинов из N-оксида 4-нитрохинолина // ХГС. - 1996. -№ 4, № 346. - С. 516-518

2. Andreev V.P., Korvachyova E.G., Rodina L.L. The activation of the nucleophilic substitution reaction by Brensted's and Lewis's acids in the range of heteroaromatic N-oxides. Book of abstracts 11th International conference of organic synthesis(ICOS-11 ), Amsterdam,The Netherlands. -1996. - P. 452.

3. Андреев В.П., Корвачева Е.Г., Теканова C.B., Стирильные производные N-оксидов хинолинов и пиридинов и их донорно-акцепторные комплексы. Тезисы докл. Юймежд. конферея. молодых ученых по химии и химической технол. МХКТ-96. - 1996. - С. 66.

4. Андреев В.П., Батоцыренова Е.Г., Рыжаков А.В , Родина JI.JI. Процессы внутримолекулярного переноса заряда в ряду стирилышх производных N-оксидов пиридина и хинолина// ХГС. - 1998. № 8. С. 1093-1102

5. Андреев В.П., Батоцыренова Е.Г., Данилова JI.A. Новые регуляторы активности Na^,K+-ATOa3bi природного и синтетического происхождения // Вестник Педиатрической Академии. СПб, выи. 2. - 2004. С. 71-74.

6. Батоцыренова Е.Г. Хроматографическое разделение низкомолекулярных модификаторов активности №+,К+-АТФазы из диализата нервной ткани

//Сборник тезисов международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых. СПб. - 2004. - С.72.

7. Батоцыренова Е.Г., Гусев Г.П., Иванова Т.И. Влияние М-оксида хинолина и М-оксида 4-нитрохинолина на активность Ка+,К+-АТФазы эритроцитов крысы //Материалы международной научно-технической конференции «Наука и образование 2004». Мурманск. - 2004. - МГТУ, часть VI. - С. 102105.

8. Батоцыренова Е.Г., Комов В.П., Карпишенко А.И. Синтетические ингибиторы №+,К+-АТФазы, выделенной из мозга крупного рогатого скота. Тезисы. - 2005. - Сборник тезисов ВМедА (в печати).

Батоцырева Екатерина Геннадьевна

ВЛИЯНИЕ ЭНДОГЕННЫХ И ЭКЗОГЕННЫХ МОДИФИКАТОРОВ НА АКТИВНОСТЬ К+-АТФАЗЫ (Экспериментальное исследование)

03 00.04-биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано к печати 7 05 2005. Формат 60 х 90/16 Бумага тип Печать ризограф. Гарнитура «Тайме» Печ л 1,5 Тираж 100экз Заказ 549 Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия 197376, Санкт-Петербург, ул ПрофессораПопйва, 14

*

р12 29 7

РНБ Русский фонд

2006-4 7517

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Батоцыренова, Екатерина Геннадьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА I. Выделение и изучение структуры Ыа+,К+-АТФазы

1.1. История открытия фермента и его функции

1.2. Строение №+,К+-АТФазы

1.3. Молекулярная гетерогенность Na+,K+-ATOa3bi

1.4. Каталитический цикл Ыа+,К+-АТФазы 15 (ф 1.5. Четвертичная структура Ш+,К+-АТФазы

ГЛАВА И. Модификаторы активности Na+,K+-ATOa3bi

2.1. Эндогенные модификаторы активности №+,К+-АТФазы

2.1.1. Катионы кальция

2.1.2. Фосфорилирование Ыа+,К+-АТФазы протеинкиназами

2.1.3. Ванадат-анион

2.1.4. Нейромедиаторы

2.1.5. Сердечные гликозиды

2.1.6. Влияние АФК на активность Иа+,К+-АТФазы

2.1.7. Влияние N0 на активность Ыа+,К+-АТФазы

2.2. Экзогенные модификаторы активности Ыа+,К+-АТФазы

2.2.1. Палитоксин

2.2.2. Сангинарин

ГЛАВА III. Материалы и методы исследований

3.1. Определение активности Ыа+,К+-АТФазы

3.2. Определение активности Ыа+,К+-АТФазы эритроцитов крысы

3.3. Получение микросом и диализата микросомно-цитоплазматической фракции из мозга крупного рогатого скота

3.4. Обнаружение веществ после разделения смесей методом ТСХ на силуфоле и на пластинках с закрепленным слоем силикагеля

3.5. Кислотный гидролиз ингибитора Ыа ,К -АТФазы из мозга крупного рогатого скота

3.6. Определение молекулярной массы ингибитора, выделенного из мозга крупного рогатого скота

3.7. Физико-химические методы исследования структуры ингибитора Ыа+,К+-АТФазы, выделенного из мозга крупного рогатого скота

3.8. Синтез Ы-оксидов пиридина и хинолина и их производных

3.9. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА IV. Экспериментальные результаты

4.1. Выделение эндогенного ингибитора

4.2. Влияние Ы-оксидов пиридина и хинолина на активность №+,К+-АТФазы

ГЛАВА V. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние эндогенных и экзогенных модификаторов на активность Na+, K+-атфазы"

Актуальность проблемы. Ыа+,К+-АТФаза — фермент с олигомерной структурной организацией, встроенный в плазматическую мембрану животных клеток. Функции, выполняемые данным ферментом разнообразны: перенос ионов Na+ и К+ против их концентрационного градиента, участие в создании мембранного потенциала клетки, в регуляции водно-солевого обмена. В ряде тканей роль Ыа+,К+-АТФазы связана с транспортом субстратов для клеточного метаболизма. Выявлено участие Ыа+,К+-АТФазы в реализации межклеточных контактов и её связь с цитоскелетом. Последние годы активно изучается рецепторная функция фермента и его влияние на работу ядерного аппарата клетки (Лопина О.Д., 2001).

Учитывая выше сказанное, естественно предположить наличие сложной, гибкой, разноуровневой системы регуляции активности №+,К+-АТФазы. В связи с этим усилия многих исследователей были направлены на поиски регуляторов активности фермента.

Решение этой проблемы имеет не только научное, но и практическое значение. В частности, изменение концентрации модификаторов активности фермента в организме, как полагают, связано с развитием и течением гипертонии, патогенеза хронической сердечной, почечной недостаточности, ишемии (de Wardener Н.Е., 1985; Haddy F.J. 1990; Schwinger R.H., 2003;). Проводились исследования, выявляющие корреляцию между поведенческими реакциями и высокой активностью №+,К+-АТФазы, что может непосредственно влиять на способность к обучению. Снижение активности Ыа+,К+-АТФазы, по-видимому, является одним из патогенетических факторов развития аллергического энцефаломиелита. Эти изменения наблюдаются еще до появления клинических признаков данного заболевания (Кучмеровская Т.М. и соавт., 2001). Существует также мнение, что злокачественное перерождение некоторых тканей начинается с того, что клетка не в состоянии восстановить нормальное соотношение Na+/K+. Это происходит вследствие повреждения мембраны и ее повышенной проницаемости для этих ионов или в результате взаимодействия сердечных гликозидов различного происхождения с Ма+,К+-АТФазой. Следствием этого может быть запуск метаболических реакций, приводящих к индукции онкогенов (Nakagawa Y. et al., 1992; Numazawa S. et al., 1996; Szabo E. et al., 1998).

Поэтому неудивительно, что большое внимание уделяется поиску как эндогенных, так и экзогенных модификаторов активности Ыа+,К+-АТФазы.

К настоящему времени из коры надпочечников и гипоталамуса млекопитающих получен в очищенном состоянии эндогенный оуабаин -высоко специфичный ингибитор Ыа+,К+-АТФазы, химическая структура которого идентична структуре сердечных гликозидов растительного происхождения (Schoner W., 2001)

Важность выполняемых функций Ыа+,К+-АТФазой, существование нескольких изоформ фермента, их различная устойчивость к сердечным гликозидам (существует оуабаинрезистентная форма Ыа+,К+-АТФазы) (Болдырев A.A., 2001) дают основания предполагать о существовании в организме позвоночных других модификаторов данного фермента, отличающихся по структуре от выделенного эндогенного оуабаина. И действительно, в результате многочисленных экспериментов были получены вещества, воздействующие на активность Na+,K+-ATOa3bi, по структуре не являющиеся гликозидами (Елаев Н.Р., 1994).

Целью настоящей работы явилось выделение эндогенного ингибитора Ыа+,К+-АТФазы нервных клеток из ткани головного мозга крупного рогатого скота, характеристика его структуры, а также синтез новых биологически активных соединений, способных изменять активность изучаемого фермента.

Исходя из поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1.Выделение и очистка из мозга крупного рогатого скота ингибитора Ыа+,К+-АТФазы. Характеристика его структуры.

2. Изучение влияния выделенного ингибитора на скорость АТФазной реакции.

3.Синтез И-оксидов пиридина и хинолина, оценка возможности их использования в качестве экзогенных веществ-модификаторов активности Ш+,К+-АТФазы.

4. Сопоставление специфичности эндогенных и экзогенных ингибиторов №+,К+-АТФазы.

Научная значимость работы состоит в том, что выделен и очищен до гомогенного состояния из мозга крупного рогатого скота новый ингибитор №+,К+-АТФазы нервных клеток. Идентифицирована химическая структура и изучены его свойства. Выделенное соединение, тройное к Ыа+,К+-АТФазе, является представителем нового класса ингибиторов этого фермента. Данный ингибитор, отличающийся по строению от эндогенного оуабаина, характеризуется аналогичной специфичностью, ингибирующей активностью, действующей при концентрации до 10"8 М, что сопоставимо с действием оуабаина. Впервые показано, что синтезированные И-оксиды пиридина и хинолина и их производные, ингибирующие Ка+,К+-АТФазу нервных клеток, также проявляют высокое сродство к данному ферменту. Полученные данные расширяют представления о возможностях влияния модификаторов активности изучаемого фермента на физиологические процессы.

Научно-практическая значимость исследования заключается в том, что выделенный ингибитор, его характеристики могут быть использованы для патогенетически обоснованного подхода к терапии ряда заболеваний, связанных с нарушением функций №+,К+-АТФазы. Получение гетероароматических Ы-оксидов пиридина и хинолина и их производных может послужить основой для разработки новых фармакологических препаратов, используемых для экзогенной регуляции активности фермента.

На защиту выносятся следующие положения:

1. В ткани головного мозга крупного рогатого скота обнаружен неизвестный ранее ингибитор №+,К+-АТФазы.

2. Этот ингибитор оказался ациклическим аминоспиртом с молекулярной массой 200 Да.

3. Предложена примерная формула и возможный механизм действия выделенного ингибитора Na+,K+-ATOa3bi.

4. Разработан синтез N-оксидов пиридина и хинолина и их производных, специфически ингибирующих активность Na+,K+-ATOa3bi.

5. Сопоставлены степени аффиности эндогенных и экзогенных ингибиторов Ка+,К+-АТФазы.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на 11 международном симпозиуме по органическому синтезу в Амстердаме (Амстердам, 1996); на международной конференции студентов и молодых ученых Санкт-Петербургского медицинского университета им. И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Батоцыренова, Екатерина Геннадьевна

ВЫВОДЫ

1. Из ткани головного мозга крупного рогатого скота выделен и очищен до гомогенного состояния неизвестный ранее ингибитор Ыа+,К+-АТФазы.

2. Индивидуальность выделенного ингибитора показана методами ТСХ и ВЭЖХ. Молекулярная масса ингибитора составляет 200 Да.

3. Выделенный ингибитор является аминоспиртом, на что указывают данные ИК-, УФ-, ПМР-, 13С-ЯМР-, масс-спектров.

4. Предложены примерная формула выделенного ингибитора, а также возможный механизм его действия.

5. Разработана новая методика синтеза гидрогалогенидов КГ-оксидов 4-галогенхинолинов.

6. Синтезированые И-оксиды пиридина и хинолина и их производные являются высоко специфичными ингибиторами мембранной Ма+,К+-АТФазы и могут быть рекомендованы для разработки на их основе фармакологически активных препаратов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Батоцыренова, Екатерина Геннадьевна, Санкт-Петербург

1. Акопова О. В., Харламова О.Н., Вавилова Г.Л. Влияние L-аргинина наактивность Ыа+,К+-АТФазы эндотелия аорты крысы // Биохимия. 2002. -Т.67,№9.-С. 1277-1281.

2. Андреев В.П., Елаев Н.Р., Унжаков А.Р. Регуляция норадреналином биосинтеза №,К-АТФазы и ее низкомолекулярного ингибитора // Нейрохимия. 1984. - Т.З, № 4. с. 443-448.

3. Андреев В.П., Рыжаков A.B., Теканова C.B. Стирильные производные N-оксида хинолина // ХГС. 1995. - № 4. - С. 518-521.

4. Андреев В.П., Батоцыренова Е.Г., Рыжаков A.B., Родина Л.Л. Процессы внутримолекулярного переноса заряда в ряду стирильных производных N-оксидовпиридина и хинолина // ХГС. 1998. - №8. - С. 1093-1102.

5. Болдырев A.A., Лопина О.Д., Свинухова И.А. Роль структуры субстрата в функционировании Иа+,К+-АТФазы // Биохимия. 1989. - Т.54, № 6. - С. 895-907.

6. Болдырев A.A., Рубцов A.M., Лопина О. Д. и др. Влияние лигандов на вращательную подвижность Ыа+,К+-АТФазы // Биохимия. — 1995. Т. 60. - С. 1032-1039.

7. Болдырев A.A. Функциональные взаимодействия между глутаматными рецепторами разных классов // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. 2000. -Т. 130, №9.-С. 244-251.

8. Болдырев A.A. Ыа+,К+-АТФаза как олигомерный ансамбль // Биохимия. -2001.-Т. 66, №8 .-С. 1013-1025.

9. Болдырев A.A., Булыгина Е.Р., Герасимова O.B. и др. Функциональная взаимосвязь между На+,К+-АТФазой и NMDA-рецепторами в гранулярных клетках мозжечка крыс // Биохимия. 2004. - Т.69, № 4. - С. 530-536.

10. Булыгина Е.Р., Ляпина Л.Ю., Болдырев A.A. Активация глутаматных рецепторов ингибирует Ыа+,К+-АТФазу гранулярных клеток мозжечка // Биохимия. 2002. - Т. 67, № 9. - С. 1209-1214.

11. Бурдь В.Н., К-Х ван Пе. Галогенирующие ферменты в биосинтезе антибиотиков // Биохимия. 2001. - Т. 66, № 10. - С. 1407-1411.

12. Глебов Р.Н., Дмитриева Н.М. Свойства Ыа+,К+-АТФазы из коры головного мозга крыс // Биохимия. 1974. - Т. 34, вып.4. - С.822-824.

13. Елаев Н.Р. Корреляция Ка,К-АТФазной активности и синтеза белков в мембранах нервных клеток при воздействии АЦХ // Цитология. 1978. - Т. 20, № 8. - С. 970-972.

14. Елаев Н.Р., Андреев В.П., Шаврина Н.В. Эндогенные активаторы и ингибиторы №+,К+-АТФазы, индуцируемые АЦХ // Бюлл. Экспер. Биологии и медиц. 1983. - Т. 95, № 2. - С. 40-42.

15. Елаев Н.Р., Байгильдина A.A. Ингибитор №+,К+-АТФазы мембран нервных клеток. Выделение и общая характеристика // Биохимия. 1994. - Т. 59, №3.-С. 389-394.

16. Зубер В.Л. Метод тонкослойной хроматографии // Методы биохимических исследований. Ленинград: Изд. Ленинградского университета, 1982.-С. 19-24.

17. Капля A.A. Структурно-функциональные свойства изоформ каталитической субъединицы №+,К+-АТФазы при мембранотропныхвоздействиях // Тез. докл. 2-го съезда биофизиков. Россия: М., 1999. - Т. 2.-С. 513-514.

18. Колямшин O.A., Кормачев В.В., Митрасов Ю.Н., Братилов Б.И. N-окиси пиридинов // Деп.ОНИНТЭ. Чебоксары. 1987. - 95с.

19. Кривой И.И., Лопатина Е.В., Кравцова В.В. Роль К+-каналов и Na+,K+-АТФазы в гиперполяризации мембраны скелетных мышечных волокон, вызываемых ацетилхолином // Биол. Мембраны. 2001. - Т. 18, № 1. - С. 1015.

20. Кучмеровская Т.М., Чичковская Г.В., Шиманский И.А. и др. Изучение • активности Na+,K+-ATOa3bi и НАД+-гликогидролазы в тканях морскихсвинок при экспериментальном аллергическом энцефаломиелите // Доп. Нац. Ан. Укршни. 2001. - Т. 3. - С. 185-188.

21. Лопина О. Д. Na+,K+-ATOa3a: структура, механизм и регуляция активности // Биол. Мембраны. 1999. - Т. 16, № 6. - С. 584-600.

22. Лопина О.Д. Взаимодействие каталитической субъединицы Na+,K+-АТФазы с клеточными белками и другими эндогенными регуляторами // Биохимия.-2001.-Т. 66, №10.-С. 1389-1400.

23. Муртазина Д.А., Петухов С.П., Рубцов A.M. и др. Фосфорилирование а-субъединицы Ыа+,К+-АТФазы из солевых желез уток под действием сАМР-зависимой протеинкиназы ингибирует активность фермента // Биохимия.m2001. Т. 66, № 8. - С. 1066-1077.

24. Орехов С.Н. О возможном механизме действия мембранносвязанного кальция на активность аденозинтрифосфатазы и проницаемость эритроцитов для одновалентных катионов // Биохимия. 1978. - Т.43, № 2. - С. 208-215.

25. Павлов К.В., Соколов B.C. Электрогенный транспорт ионов Na+,K+-АТФазой // Биол. мембраны. 1999. - Т. 16, № 6. - С. 604-637.

26. Петруняка В.В., Панющкина Е.А., Северина Е.П. Активация и ингибирование №+,К+-АТФазы мембран эритроцитов эндогенными Са+2зависимыми регуляторами. Са+2 зависимое действие уабаина на Са+2 -АТФазу // Биол. мембраны. - 1990. - Т. 7, № 4. - С. 352-358.

27. Рубцов A.M., Личунь Я., Лопина О.Д. и др. Исследование вращательной подвижности мембранносвязанной №+,К+-АТФазы // Биохимия. 1994. - Т. 59.-С. 1909-1916.

28. Тицкий Г.Д., Туровская М.К. Кинетика образования ацилоксипиридиниевой соли и ее реакции в анилином в ацетонитриле // Журн. орган, химии. 1992. - Т. 28, № 9. - С. 1911 -1916.

29. Толстиков Г.А., Джемилев У.М., Юрьев В.П., Гайсина М.Г. Новый способ получения N-окисей ароматических азотистых гетероциклов // ХГС. — 1971. — №7.-С. 1005.

30. Толстухина Т.И. Определение Na+,K+- активируемой, М§+2-зависимой АТФазной активности в субклеточных фракциях // Методы биохимических исследований. Ленинград: Изд. Ленинградского университета, 1982. - С. 258-260.

31. Федосова Н.У., Бердашкевич Е.А., Федосов С.Н., Болдырев A.A. Влияние температуры и pH на гидролиз АТР Иа+,К+-АТРазой солевых желез утки // Биохимия. 1993. -Т.58, № 7. - С. 1082-1089.

32. Чекмасова A.A., Анисимов А.Г., Немова H.H. Обработка тимидином клеток сублинии К562, резистентной к 2-(4'-диметиламиностирил)- хинолин -N- оксиду, приводит к резкому усилению синтеза в клетках гемоглобина // Цитология. 2001. - Т. 43, № 4. - С. 409-410.

33. Чибалин A.B., Лопина О.Д., Петухов С.П., Василец Л.А. Фосфорилирование Ма+,К+-АТФазы протеинкиназой С и сАМР-зависимой протеинкиназой//Биол. Мембраны. 1991. —Т. 8.-С. 1140-1141.

34. Яковенко Л.В., Твердислов В.А., Твердислова И.Я. Молекулярная модель параметрического Na+- насоса клеточных мембран // Тез. докл. 2-го съезда биофизиков. Россия: М., 1999. - Т. 2. - С. 5 81.•

35. Aizman O., Uhlen P., Lai M. et al. Ouabain is a steroid hormone that signals with slow calcium oscillations // Proc. Natl. Acad. Sci. 2001. - Vol. 98. - P. 13420-13424.

36. Akagawa K., Hara N., Tsukada Y. Partial purification and properties of the inhibitors of Na+,K+-ATPase and ouabain-binding in bovine central nervous system //J. Neurochem. 1984. - Vol. 42. - P. 775-780.

37. Akera T., Brody T.M. Inotropic action of digitalis and ion transport // Life Sci. 1976.-Vol. 18.-P. 135-142.

38. Antolovic R., Bruller H.J., Bunk S. et al. Epitope mapping by aminoacids-* sequence-specific antibodies reveals that both ends of the a-subunit of Na+,K+

39. ATPase are located on the cytoplasmic side of the membrane // Eur. J. Biochem. -1991.-Vol. 199.-P. 195-202.

40. Antolovic R., Kost H., Mohadjerani M. et al. A specific binding protein for cardiac glycosides exists in bovine serum // J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273. - P. 16259-16264.

41. Askari A., Huang W. Na+,K+-ATPase: evidence for the binding of ATP to the phosphoenzyme // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1982. - Vol. 104. - P. 1447-1453.

42. Bagrov A.Y., Fedorova O.V., Maslova M.N. et al. Endogenous plasma Na+,K+-ATPase inhibitory activity and digixin-like immunoreactivity after acutemyocardial infarction // Cardiovasc. Res. 1991. - Vol. 25. - P. 371-377.

43. Bagrov A.Y., Fedorova O.V., Dmitrieva R.I. et al. Characterization of a urinary bufodienolide Na+,K+-ATPase inhibitor in patients after acute myocardial infarction // Hypertension. 1998. - Vol. 3. - P. 1097-1103.

44. Bauer N., Neu H., Kirch U. et al. Release of endogenous ouabain to blood exercise of circulation in under the control of epinephrine and angiotensin-II // Biol. Chem. -2001.- Vol. 3 82. P. 109-111.

45. Beguin P., Nang X., Firsov D. et al. The y-subunit is a specific component of the Na+,K+-ATPase and modulates it's transport function // EMBO J. 1997. -Vol. 16.-P. 4250-4260.

46. Beltowski J., Marciniak A., Wojcicka G., Gorny D. Nitric oxide decreases renal medullary Na+,K+-ATPase activity through cyclic GMP-protein kinase C dependent mechanism // J. Physiol. Pharmacol. 2003. - Vol. 54(2). - P. 191-210.

47. Blaustein M.P. Phisiological effects of endogenous ouabain: control of intacellular Ca stores and cell responsiveness // Am. J. Physiol. 1993.- Vol. 264.-P. 1367-1387.

48. Blaustein M.P., Juhaszowa M., Golovina V.A. The cellular mechanism ofaction of cardiotonic steroids. A new hypothesis // Clin. Exp. Hypertens. 1998. -Vol. 20.-P. 691-703.

49. Bogdanova A.Y., Ogunshola O.O., Bauer C., Gassmann M. Pivotal role of reduced glutathione in oxygen-induced regulation of the Na+,K+-pump in mouse erythrocyte // J. Membrane Biol. 2003. - Vol. 195. - P. 33-42.

50. Boldyrev A.A., Bulygina E.R. Na+,K+-ATPase and oxidative stress // Ann. N.Y. Acad.Sci. Vol. 834. - P. 666-668.

51. Boulanger B.R., Lilly M.P., Hamlyn J.M. et al. Ouabain is secreted by the adrenal gland of the awake dogs // Am. J. Physiol. 1993. - Vol. 264. - P. E413-E419.

52. Brink C., de Jager P.J. N-oksiede van die metielpiridiene. I. Die Daarstellung van stirielpiridiene wet behulp van N-oksialkielpiridinium derivate // Tydskr.Natuurwet. 1963. - Vol. 3, № 2. - P. 74-80.

53. Brody M.J., Fink G.D., Buggy J. et al. The role of the anteroventral third ventricle region in the experimental hypertension // Circ. Res. 1978. - Vol. 43 (suppl.I). - P. 2-1.

54. Bulygina E. Activation of glutamate receptors inhibits Na+,K+-ATPase of cerebellum granule cells // Biochemistry. 2002. - Vol. 67. - P. 1209-1214.

55. Butt A.N., Semra Y.K., Lane S.J. et al. Endogenous ouabain secretion in man is not regulated by ACTH // J. Steroid Biochem Mol. Biol. 1998. - Vol. 66. - P. 151-157.

56. Cayanis E., Russo J.J., Wu Y.-S., Edelman I.S. Serum independence of low K+ induction of Na+,K+-ATPase. Possible role of c-fos // J. Membr. Biol. Vol. 125. -P. 163-170.

57. Cloix J.F., Crabos M., Wainer I.W. et al. //Biochem. Biophys. Res. Commun. -1985.-Vol. 131.-P. 1234-1240.

58. Colonna T.E., Huynh L., Fambrough D.M. Subunit interactions in the Na+,K+-ATPase explored with the yeast two-hybrid system // J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272.-P. 12366-12372.

59. Dean R.B. Theories of electrolyte equilibrium in muscle // Biol. Symp. 1941. -Vol.3.-P. 331-348.

60. Dluhy R.G., Willians G.H. Endocrine hypertension. In Willams textbook of Endocrinology, 9th edn. 1998. - P. 729-749.

61. Dobrota D., Matejovicova M., Kurella E.C., Boldyrev A.A. Na+,K+-ATPase under oxidative stress: molecular mechanisms of injury // Cell Moll. Neurobiol. -1999.-Vol. 19.-P. 141-149.

62. Donnet C., Arystarkhova E., Sweadner K.J. Thermal denaturation of the Na+,K+-ATPase provides evidence for a-a oligomeric interaction and y-subunit association with the c-terminal domain // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276. - P. 7357-7365.

63. Eisner D.A., Smith T.W. The Na+,K+-pump and its effectors in cardiac muscle. N.Y. - Raven press. - P. 863-902.

64. Ferrari R., Ceconi C., Curello S. et al. Oxygen free radicals and myocardial damage: protective role of thiol-containing agents // Am. J. Med. — 1991. Vol. 19.-P. 95S-105S.

65. Fedorova O.V., Kolodkin N.I., Agalakova N.I. et al. Marinobufogenin an endogenous a-1-sodium pump ligand in hypertensive Dahl salt-sensitive rats // Hypertension. 2001. - Vol. 37. - P. 462-466.

66. Geering K., Meyer D.I., Paccolat M.P. et al. Membrane insertion of a- and ß-subunits of Na+,K+-ATPase // J.Biol.Chem. 1985. - Vol. 260. - P. 5154-5160.

67. Glynn I.M. Annual review prize lecture. "All hands to the sodium pump" // J. Physiol. 1993. - Vol. 462. - P. 1-30.

68. Gottlieb S.S., Rogowski A.C., Weinberg M. et al. Elevated concentrations of endogenous ouabain in patients with congestive heart failure // Curculation.• 1992. Vol. 86. - P. 420-425.

69. Göbel B.O., Duhm J. Effect of furosemide on ouabain resistant Na+ and K+ ion fluxes and volume of human erythrocytes // Pfluegers. Arch. 1982. - Vol. 394. -P. R28-R40.

70. Gruber K.A., Whitaker J.M., Buskalew V.M. Endogenous digitalis-like substance in plasma of volume-expanded dogs // Nature. 1980. - Vol. 287. - P. 743-745.

71. Guennoun S., Horisberger J-D. Cysteine-scanning mutagenesis study of the sizth transmembrane segment of the Na+,K+-ATPase a-subunit // FEBS Letters. -2002.-Vol. 513.-P. 277-281.

72. Haas M., Askari A., Xie Z. Involvement of Src and epidermal growth factorreceptor in the signal transducing function of Na+,K+-ATPase // J.Biol. Chem. -2000. Vol. 275. - P. 27832-27837.

73. Haber E., Haupert G. The search for a hypothalamic Na+,K+-ATPase inhibitor // Hypertension. 1987. - Vol. 9, No 4. - P. 315-324.

74. Habermann E. Palytoxin acts through Na+,K+-ATPase // Toxicon. 1989. -Vol. 27.-P. 1171-1187.

75. Haddy F.J. Digitalis-like circulation factor in hypertension: potential messenger between salt balance and intracellular sodium // Cardovasc.Drug ther. -1990.-Vol. 4. -P.343-349.•

76. Hamlyn J.M., Ringel R., Schaeffer J. et al. A circulation inhibitor of Na+,K+-ATPase associated with essential hypertension // Nature. 1982. - Vol. - 30. P. 650-652.

77. Hamlyn J.M., Blaustein M.P., Bova S. et al. Identification and characterization of a ouabain-like compound from human plasma // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1991. Vol. 88. - P. 6259-6263.

78. Hamlyn J.M., Lu Z., Manunta P. et al. Observations on the nature, biosynthesis, secretion and significance of endogenous ouabain // Clin. Exp. Hypertens. 1998. - Vol. 20. - P. 523-533.

79. Harris E. J. Linkage of sodium and potassium active transport in humanerythrocytes. Active transport and secretion // Symp. Soc. Exptl. Biol. — 1954. -Vol. 8.-P. 228-230.

80. Haupert G.J., Carili C.T., Cantley l.C. Hypothalamic sodium-transport inhibitor is a high-affinity reversible inhibitor of Na+,K+-ATPase // Am. J. Physiol. 1984. -Vol. 247.-P. F919-F924.

81. Herrera V., Cova T., Sasson D., Ruiz-Oparo N. Development cell-specific regulation of a\, a2, a3 Na+,K+-ATPase gene expression // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 1994. - Vol. 266. - P. C1301 -C1312.

82. Huang W. Different sensitivities of the Na+,K+-ATPase isoforms to oxidants // Biochim. Biophys. Acta. 1994. - Vol. 1190. - P. 108-114.

83. Ito K., Isao T., Higashiyama M. et al. Channel induction by palytoxin in yeast cells expressing Na+,K+-ATPase or its chimera with sarco/endoplasmic reticulum Ca+2-ATPase // FEBs letters. 2003. - Vol. 543. - P. 108-112.

84. Ivashevskaja S.N., Aleshina L.A., Andreev V.P. 4- (4'-dimethyIamino)N-oxide from powder data // Acta Cryst. 2003. - E. 59. - P. 1006-1008.

85. Jarishvili Т. Some aspects of regulation of Na+,K+-ATPase by neurotransmitters // Bull. Georg. Acad. Sci. 2001. - Vol. 163, № 2. - P. 343-345.

86. Jody K., Hirsh and Chau H. Wu. Palytoxin-induced single-channel currents from the sodium pump synthesized by in vitro expression // Toxicon. 1997. -Vol. 35, №2.-P. 169-176.

87. Karlish S.J., Beauge L.A., Glynn I.M. Vanadate inhibits Na+,K+-ATPase by blocking a conformational change of the unphosphorylated form // nature. 1979. -Vol. 282.-P. 333-335.

88. Katritzky A.R., Simmons P. Interacting at a distance in conjugated systems. Part I. The basicites of (amino- and nitro-phenyl) — pyridine and -pyridine 1-oxides // J.Chem. 1960, № 4. - P. 1511 -1516.

89. Kelly R.A., O'Hara D.S., Mitch W.E., Smith T.W. Identification of Na+,K+-ATPase inhibitors in human plasma as nonesterified fatty acids and lysophospholipids //J. Biol. Chem. 1986. - Vol. 261. - P. 11704-11711.

90. Kitano S., Morimoto S., Nishibe A. et al. Exogenous ouabain is accumulated in the adrenals and mimics the kinetics of endogenous digitalys-like factor in rats // Hypertens. 1998. - Vol. 21. - P. 47-56.

91. Kometiani P. Multipli signal transduction pathways link Na+,K+-ATPase to growth-related genes in cardiac myocites. The roles of Ras and mitogen-activated protein kinases //J.Biol. Chem. 1998.-Vol. 273.-P. 15249-15256.

92. Komiyama Y., Nishimura N., Nishino N. et al. Purification and characterization of ouabain-binding protein in human plasma // Clin. Exp. Hypertens. 1998. - Vol. 20. - P. 683-690.

93. Komiyama Y., Nishimura N., Munakata M. et al. Identification of endogenous ouabain in culture supernatant of PC 12 cells //J. Hypertens. 2001. - Vol. 19. - P. 229-236.

94. Kramer H. J., Heppe M., Weiler E. et al. Further characterization of the endogenous natriuretic and digoxin-like immunoreacting activities in human urine: effects of chages in sodium intake // Renal Physiol. 1985. - Vol. 8. - P. 80-99.m

95. Kuntzweiler T.A., Arguello J.M., Lingrel J.B. Asp.804 and asp 808 in the transmembrane domain of the Na+,K+-ATPase alpha subunit are cation coordinating residues // J. Biol. Chem. 1996. - Vol. 271. - P. 29682-29687.

96. Kurella E., Kukley M., Tyulina O. et al. Kinetic parameters of Na+,K+-ATPase modified by free radicals in vitro and in vivo // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1997. -Vol. 834.-P. 661-665.

97. Laredo J., Hamilton B.P., Hamlyn J.M. Ouabain is secreted by bovine adrenocortical cells // Endocrinology. 1994. - Vol. 135. - P. 794-797.l.-P. 1-18.

98. Laredo J., Hamilton J. P., Hamlyn J.M. Secretion of endogenous ouabainfrom bovine adrenal cells. Role of zona glomerulosa and zona fasciculate // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. - Vol. 212. - P. 487-493.

99. Lemas M.V., Hamrick M., Takeyasu K., Fambrough D.M. 26 Amino acids of an extracellular domain of the Na+,K+-ATPase a-subunit are sufficient for assembly with the Na+,K+-ATPase J3-subunit // J. Biol. Chem. 1994. - Vol. 269. -P. 8255-8259.

100. Lichstein D., Samuelov S. Endogenous "ouabain-like" activity in rat brain // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1980. - Vol. 96. - P. 1518-1523.

101. Lichstein D., Mine D., Bourrit A. Evidence for the presence of "ouabain-like" compound in human cerebrospinal fluid // Brain. Res. 1985. — Vol. 325. - P. 1319.

102. Lichstein D., Gati I., Samuelov S. et al. Identification of digitalis-like compounds in human cataractous lenses // Eur. J. Biochem. 1993. - Vol. 216. -P. 261-268.

103. Lichstein D., McGowan M.N., Russel P., Carber D.A. Digitalis and digitalislike compounds down-regulate gene expression of intracellular signaling protein 14-3-3 in rat lenses//Hypertension.-2000.-Vol. 23.-P. S51-S53.

104. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the folinphenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. - Vol. 193. - P. 265-275.

105. Manunta P., Stella P., Rivera R. et al. Left venteicular mass, stroke volume and oubain-like factor in essential hypertension // Hypertension. 1999. - Vol. 34. - P. 450-456.

106. The MERCK INDEX // An encyclopedia of chemicals, drugs and biologicals. 13-ed. 2001. -№ 7068; № 8433.

107. Mohammadi K., Kometiani P., Xie Z., Askari A. Role of protein kinase C in the signal pathways that link Na+,K+-ATPase to ERK // J. Biol. Chem. 2001. -Vol. 276.-P. 42050-42056.

108. Morgan K., Lewis M.D., Spurlock G., et al. Characterization and partial purification of the sodium-potassium-ATPase inhibitor released from cultured rat hypothalamic cells // J. Biol. Chem. 1985. - Vol. 260. - P. 13595-13600.

109. Nakagawa Y., Rivera V., Larner A.C. A role for the Na+,K+-ATPase in the control of human c-fos and c-jun transcription // J.Biol.Chem. 1992. - Vol. 267. P. 8785-8788.

110. Numazawa S., Inone N., Nakura H. et al. A cardiotonic steroid bufalin-induced differentation of THP-1 cells. Involment of Na+,K+-ATPase inhibition in the early changes in proto-oncogene expression // Biochem. Pharmacol. 1996. -Vol. 52.-P. 321-329.

111. Overbeck H.W., Pamnani M.B., Akera T. et al. Depressed functional of a ouabain-sensitive sodium-potassium pump in blood vessels from renal hypertensive dogs // Circ. Res. 1976. - Vol. 38 (suppl. II). - P. 48-52.

112. Perrin A., Brasmes B., Chambaz E.M., Defayer G. Bovine adrenocortical cells in culture synthesize an ouabain-like compound // Mol. Cell. Endocrinol. -1997.-Vol. 126.-P. 7-15.

113. Plesner I.W., Plesner L., Norby J.G., Klodos I. The steady-state kinetic mechanism of ATP hydrolysis catalysed by membrane-bound Na+,K+-ATPase from ox brain. A minimal model // Biochim. Biophys. Acta. 1981. - Vol. 643.• P. 483-494.

114. Post R.L., Merrit C.R., Kinsolving C.D., Albright C.D. Membrane adenosine triphosphate as a participant in the active transport of sodium and potassium in the human erythrocyte//J.Biol. Chem.- 1960.-Vol. 235.-P. 1796-1798.

115. Repke K., Portius H.J. Über den einfluss verschiedener kardiotonischer verbindugen auf die transport -ATPase in der zellmembrane des hezzmuskels // Arch, exptl. Pathol. Pharmakol. 1963. - Vol. 245. - P. 59-60.

116. Repke K.R., Schoen R. Flip-flop model of Na+,K+-ATPase function // Acta Biol. Med. Ger. 1973. - Vol. 31. - P. K19-K30.

117. Ringer S. Regarding the influence of the organic constituents of the blood on the contractility of the ventricle // J. Physiol. 1885.- Vol. 6. - P. 361-381.

118. Ryzhakov A.V. Molecular complexes of heteroaromatic N-oxides and their reactions with nucleophiles // Heterocycles. 2003. - Vol. 60, № 2. - P.419-435.

119. Scheiner-Bobis G., Farley F.A. Subunit requirements for the expression of functional sodium pumps in yeast cells // Biochim. Biophys.Acta. 1994. - Vol. 1193.-P. 226-234.

120. Scheiner-Bobis G., Meyer D., Christ M., Habermann E. Palytoxin induces K+ efflux from yeast cells expressing the mammalian sodium pump // Mol. Pharmacol. 1994.-Vol. 45.-P. 1132-1166.

121. Scheiner-Bobis G. Sanguinarine induces K+ outflow from yeast cells expressing mammalian sodium pumps // Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 2000. - Vol. 363. - P. 203-208.

122. Scheiner-Bobis G., Schoner W. A fresh faset for ouabain action // Nat. Med. -2001.-Vol. 7.-P. 1288-1289.

123. Scheiner-Bobis G. The sodium pump // Eur. J. of Biochem. 2002. - Vol. 269, Is. 10.-P. 2424-2433.

124. Scheiner-Bobis G., Htibschle T., Diener M. Action of palytoxin on apical H+X-ATPase in rat colon // Eur. J. of Biochem. 2002. - Vol. 269, Is. 16. - P. 3905-3911.

125. Schoner W. Endogenous digitalis-like factors // Clin. Exp. Hypertens. 1992. -Vol. A14.-P. 767-856.

126. Schoner W. Endogenous cardiotonic steroids // Cell Mol. Biol. -2001. Vol. 47.-P. 273-280.

127. Schoner W. Endogenous cardiac glycosides a new class of steroid hormones // Eur. J. Biochem. -2002. Vol. 269. - P. 2440-2448.

128. Schatzmann HJ. Herzglykozide als hemmstoffe fur den aktiven kalium und natriumtrasport durch die eiythrocytenmembran // Helv.Physiol. Pharmacol. Acta. - 1953.-Vol. 11.-P. 346-354.

129. Schwinger R.H., Bundgaard H., Muller-Ehmsen J., Kjeldsen K. The Na+,K+-ATPase in the failing human heart // Cardiovasc. Res. 2003. - Vol. 57.

130. Seifen E., Adams R.J., Riemer R.K. Sanquinarine: A positive inotropic alkaloid actions which inhibits cardiac Na+,K+-ATPase // Eur. J. Pharm. 1979. -Vol. 60, Is. 4.-P. 373-377.

131. Shainskaya A., Karlish S.J. Evidence that the cation occlusion domain of Na+,K+-ATPase consists of a complex of membrane-spanning segments. Analysis of limit membrane-embedded tryptyc fragments // J. Biol. Chem. 1994. - Vol. 269.-P. 10780-10789.

132. Shao Y., Pressley T., Ismail-Beigi F. Na+,K+-ATPase mRNA Pi expression in rat myocardium effect of thyroid status // eur. J. Biochem. - 1999. - Vol. 260,

133. Skou J.C. The influence of some cations on an adenosinetriphosphatase from peripheral nerves // Biochim. Biophys. Acta. 1957. - Vol. 23. - P. 394-401.

134. Skou J.C. The influence of some cations on an adenosinetriphosphatase from peripheral nerves // Biochim. Biophys. Acta. 1957. - Vol. 23. - P. 394-401.

135. Skou J.C. Overview the Na+,K+-pump // Methods Enzymol. 1988. - Vol. 156. -P. 1-25.

136. Skriver E., Maunsbach A.B., Hebert H. et al. Two dimensional crystalline arrays of Na+,K+-ATPase with new subunit interactions induced by cobalt-tetraammineATP //j. Ultrastruct. Mol. Struct. Res. 1989. - Vol. 102. - P. 189195.

137. Songu-Mize E., Bealer S.L., Caldwell R.W. Effect of AV3V lesions on development of DOCA-salt hypertension and vascular Na+-pump activity // Hypertension. 1982. - Vol. 4. - P. 575-580.

138. Sweadner K.J. Isosymes of the Na+,K+-ATPase // Biochim. Biophys. Acta. -1989.-Vol. 988.-P. 185-220.

139. Szabo E., Francis J., Birrer M.J. Alterations in differentiation and apoptosis induced by bufalin in c-jun over expressing U-937 cells // Int.J.Oncol. 1998. -Vol. 12.-P. 403-409.

140. Takeda K., Kawamura M. The functional unit of Na+,K+-ATPase is a monomeric a(3 protomer //Biochem. and Biophts. Res. Commun. 2001. - Vol. 280,No. 5.-P. 1364-1366.

141. Tal D.M., Katchalsky S., Lichstein D., Karlish J.D. Endogenous "ouabain-like" activity in bovine plasma // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1986. - Vol. 135.-P. 1-8.

142. Tamura I. Identification of linoleic and oleic acids as endogenous Na+,K+-ATPase inhibitors from acute volume-expanded hog plasma // J. Biol. Chem. -1985. Vol. 260. - P. 9672-9677.

143. Taniguchi K., Kaya S., Abe K., Mardh S. The oligomeric nature of Na+,K+-transport ATPase//J. Biochem.-2001.-Vol. 129.-P. 335-342.

144. Tran C.M., Scheiner-Bobis G., Schoner W., Farley R.A. Identification of an aminoacid in the ATP binding site of Na+,K+-ATPase after photochemical labeling with 8-azido-ATP // Biochemistry. 1994. - Vol. 33. - P. 4140-4147.

145. Tripodi G., Valtorta F., Torielli L. et al. Hypertension-associted point mutation in the adducing a and ß subunits affect action cytoskeleton and ion transport//J. Clin. Invest. 1996.-Vol. 97.-P. 2815-2822.22 +

146. Vilsen B., Andersen J.P., Petersen J., Jorgensen P.L. Occlusion of Na and 86Rb+ in membrane bound and soluble protomeric aß subunits of Na+,K+-ATPase // J. Biol. Chem. 1987. - Vol. 262. - P. 10511 -10517.

147. Wiley S., Hutchinson J.S., Medelsohn F.A. O., Doyle A.E. Increased sodium permeability of erythocytes in spontaneously hypertensive rats // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 1980. - Vol. 7. - P. 527-535.

148. Xie Z., Kometiani P., Liu J. et al. Intracellular reactive oxygen species mediate the linkage of Na+,K+-ATPase to hypertrophy and its marker genes in cardiac myocytes //J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274. - P. 19323-19328.

149. Xie Z., Askari A. Na+,K+-ATPase as a signal transducer // Eur. J. Biochem. -2002. Vol. 269. - P. 2434-2439.

150. Yamada К., Goto A., Omata M. Adrenocorticotropin-induced hypertension rats:role of ouabain-like compound // Am. J. Hypertens. 1997. - Vol. 10. -403-408.