Эндо-инулиназа дрожжей: биосинтез, физико-химические свойства и использование в получении пребиотиков

Рутковская, Татьяна Ростиславовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Эндо-инулиназа дрожжей: биосинтез, физико-химические свойства и использование в получении пребиотиков
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Эндо-инулиназа дрожжей: биосинтез, физико-химические свойства и использование в получении пребиотиков"

Рутковская Татьяна Ростиславовна

ЭНДО-ИНУЛИНАЗА ДРОЖЖЕЙ: БИОСИНТЕЗ, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ПОЛУЧЕНИИ ПРЕБИОТИКОВ

Специальность 03.01.06 -Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Воронеж 2011 г

2 1 ДПР ?011

4844381

Работа выполнена на кафедре микробиологии и биохимии ГОУ ВПО «Воронежская государственная технологическая академия»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Корнеева Ольга Сергеевна

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор

Бирюков Валентин Васильевич

кандидат технических наук Сысоева Марина Геннадиевна

Ведущая организация: Российский химико-технологический

университет им. Д.И.Менделеева

Защита состоится «29» апреля 2011 г. в 14°° ч на заседании диссертационного совета Д 212.035.06 при ГОУВПО «Воронежская государственная технологическая академия» по адресу: 394036, г. Воронеж, пр. Революции, 19, конференц-зал

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУВПО «Воронежская государственная технологическая академия». Автореферат размещен на официальном сайте академии: www.vgta.vrn.ru.

Автореферат разослан «29» марта 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

(¿¿сс/г^ Г. П. Шуваева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В последние годы биокаталитические технологии становятся все более востребованными, так как количество ферментов, эффективно используемых в различных областях промышленности, растет очень быстро. Гликозидгидролазы (гликозидазы), катализирующие расщепление гликозидных связей в олиго- и полисахаридах, - одна из самых широко изучаемых групп ферментов. Представителями гликозидаз являются инулиназы -ферменты, гидролизующие фруктозосодержащие олигосахариды и полимеры (фруктаны) до фруктозы и фруктоолигосахаридов различной степени полимеризации. Инулиназы привлекают к себе внимание вследствие их востребованности в пищевой промышленности, фармакологии, сельском хозяйстве и других областях.

Интерес к эндо-инулиназам вызван тем, что образующиеся в результате их каталитического действия фруктоолигосахариды обладают пребиотическими свойствами. Доказано, что инулин и олигофрутозиды избирательно стимулируют рост и метаболическую активность бифидо- и лактобактерий, не влияя на рост других культур и подавляя развитие потенциально патогенных бактерий. Производимые в настоящее время короткие олигофруктозиды получают из сахарозы с помощью фрукозилтрансферазы, синтезируемой из Aspergillus niger. Этот метод оказался крайне дорогим и многостадийным, в результате чего цена конечного продукта очень высокая (Granger, 2000).

Альтернативным подходом к получению фруктоолигосахаридов является ферментативный гидролиз природных полифруктанов посредством комплексного действия эндо- и экзо-инулиназ, тем более, что инулинсодержащее сырье является легко доступным и недорогим.

НеппБза^ 1999). Это семейство также включает инвертазы, леваназы и два типа 1-фруктозилтрансфераз. Несмотря на многочисленные исследования инулиназ, вопрос о специфичности эндо-инулиназ до сих пор актуален, данные по исследованию пребиотической способности образующихся в результате их каталитического действия олигофруктозидов немногочисленны. В связи с этим получение высокоактивных ферментных препаратов для гидролиза инулинсодержащего сырья до фруктоолигосахаридов, являющихся пребиотиками и способствующих поддержанию нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта, является актуальной задачей биотехнологии. Расширение спектра пребиотических препаратов имеет значение не только для медицинской практики, но и для пищевой промышленности.

Настоящая работа выполнялась в соответствии с научным направлением кафедры микробиологии и биохимии Воронежской государственной технологической академии по проблеме «Научные основы и практическое применение биокаталитических технологий в биоконверсии природных полимеров» и в рамках научно-технической программы «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники».

Цель и задача исследования. Целью диссертационной работы явилось получение высокоактивного ферментного препарата эндо-инулиназы, исследование его некоторых физико-химических свойств и субстратной специфичности, а также получение фруктоолигосахаридов и определение их пребиотической способности.

Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих задач:

- изучение некоторых культуральных, морфологических признаков и биосинтетической способности дрожжей Басскаготусез сеге\1з1ае ВГШ-2;

- оптимизация условий биосинтеза эндо-инулиназы дрожжами Б. сегеу1з1ае ВГШ-2;

- разработка эффективного способа выделения и очистки ферментного препарата;

определение физико-химических свойств, субстратной специфичности и кинетических закономерностей процесса кислотной и термической инактивации эндо-инулиназы;

- получение фрукгоолигосахаридов путем ферментативного гидролиза инулинсодержащего сырья;

- исследование пребиотических свойств олигофруктозидов в опытах in vitro и in vivo;

- обоснование целесообразности использования эндо-инулиназы для получения пребиотиков.

Научная новизна. Впервые получен ферментный препарат эндо-инулиназы из дрожжей S. cerevisiae ВГШ-2, эффективно гидролизующий инулин до олигофруктозидов.

Проведены комплексные исследования физико-химических свойств фермента, его субстратной специфичности. Выявлены закономерности процесса термической и кислотной инактивации фермента. Установлено, что эндо-инулиназа гидродизует как ß-2,1-, так и Р-2,6-фруктозидные связи в субстратах.

Установлены способность фрукгоолигосахаридов увеличивать резистентность бифидобактерий в присутствии антибиотика и проявление мутуализма к нормальной микрофлоре ЖКТ, в частности, к Е. coli, что указывает на положительное воздействие этого углевода на нормобиоз кишечника.

Практическая значимость. Результаты настоящего исследования дают возможность получать олигофруктозиды пребиотического действия, способствующие поддержанию нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта. Это позволит расширить спектр пребиотических препаратов, имеющих значение как в медицинской практике, так и в пищевой промышленности.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены на отчетных научных конференциях ВГТА за 2005-2008 гг, на 3 и 4-м Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005, 2007), международной научно-технической конференции «Инновационные технологии переработки сельскохозяйственного сырья в обеспечении качества жизни: наука, образование и производство» (Воронеж, 2008), III международой научно-технической конференции «Инновационные технологии и оборудование для пищевой промышленности (приоритеты развития)» (Воронеж, 2009), международном симпозиуме «Ökologische, technologische und rechtliche aspekte der ledtnsversorgung» (Ганновер, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 2 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (170 источников) и приложения. Иллюстративный материал включает 36 рисунков и 25 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы и определены основные направления исследования.

ГЛАВА I. Обзор литературы. Осуществлен аналитический обзор данных литературы по исследованию продуцентов инулиназ, характеристике физико-химических и каталитических свойств инулиназ различного происхождения.

Представлен анализ отечественных и зарубежных исследований, касающихся характеристики имеющихся пребиотиков. Отмечено, что данные о способности бифидобактерий развиваться на среде с олигофруктозидами немногочисленны, промышленное отечественное производство пребиотиков на основе олигофруктозидов отсутствует, показана перспективность работ по расширению ассортимента пребиотических препаратов.

ГЛАВА II. Объекты, материала и методы исследований.

Схема экспериментальных исследований представлена на рис.1

Объектом исследования служили селекционированные на кафедре микробиологии и биохимии ГОУВПО ВГТА дрожжи Saccharomyces cerevisiae ВГШ-2. Чистую культуру дрожжей поддерживали на агаризованном пивном неохмеленном сусле. Дрожжи культивировали жидкофазным способом на несменяемой питательной среде исследуемого состава в колбах емкостью 500 см3 на шейкер-культиваторе Infors, частота вращения 120 об/мин, уровень аэрации 1,4 г 02/дм3; температура 32-34°С; рН 4,8; объем питательной среды 100 см3; время культивирования 24 ч.

Рис. 1. Схема экспериментальных исследований

Объектом исследования служили также бактерии Bifidobacterium bifidum, как наиболее значимые представители нормобиоценоза.

Культивирование бифидобактерий проводили на модифицированной среде Блаурокка.

Определение активности Р-фруктофуранозидазы и инулиназы основано на учете редуцирующих веществ, освобождающихся в процессе гидролиза субстратов под действием фермента. Редуцирующие сахара определяли методом Сомоджи-Нельсона и методом Бертрана.

За единицу инвертазной и инулиназной активностей принято такое количество фермента, которое катализирует образование 2 мМ и 1 мМ редуцирующих веществ за 1 мин в стандартных условиях, соответственно.

Математическое планирование эксперимента. При подборе оптимального состава питательной среды и условий культивирования продуцента для достижения максимального биосинтеза эндо-инулиназы использовали полный факторный эксперимент. Определение оптимальных параметров биосинтеза карбогидраз проводили методом «ридж-анализа», который базируется на методе неопределенных множителей Лагранжа.

Выделение и очистка ферментного препарата. По окончании выращивания дрожжи отделяли центрифугированием при 8000 об/мин в течение 15 мин, промывали водой, отпрессовывали до влажности 75%.

Извлечение фермента осуществляли путем разрушения клеток дрожжей с помощью ультразвукового дезинтегратора УЗДН-2Т при мощности 500 Вт и частоте 22 кГц в течение 2 мин в ледяной бане. Гомогенат использовали для получения водной вытяжки (10%) путем настаивания в течение 20 мин при (20±2°С) и центрифугирования при 8000 об/мин в течении 10 мин. Далее дрожжи Хсет-еушае охлаждали до 2-4°С и проводили очистку ферментного препарата.

Для получения высокоочищенного препарата инулиназу осаждали из водной вытяжки различными органическими растворителями (96,5% этиловым спиртом, 98% изопропиловым спиртом) на холоду при температуре смеси 2-4°С. Осадок, содержащий фермент, отделяли центрифугированием в течение 10 мин. Осажденный фермент растворяли в 0,1 М ацетатном буфере, рН 4,5, наносили на колонку размером 21,5x150 мм и элюировали тем же буфером со скоростью 1 мл за 5 мин. В ходе очистки инулиназы применяли сефадекс в-25 (для освобождения фермента от

низкомолекулярных примесей и разделения с близкими по размерам белковыми молекулами). Далее проводили гель-фильтрацию на колонке с сефадексом G-100. Гомогенность полученных фракций фермента определяли с помощью электрофореза в 7,5% полиакриламидном геле (ПААГ) по методу Девиса на приборе фирмы "Reanal".

Определение молекулярной массы осуществляли электрофорезом в 10 %-ном ПААГ в присутствии додецилсульфата Na (ДСН) согласно методу Лаэммли и гельфильтрацией на колонке Sephacryl S-200.

Аминокислотный анализ проводили на автоматическом анализаторе аминокислот ААА-339Т (Чехия). Метод основан на предварительном окислении цистина и метионина смесью перекиси водорода и муравьиной кислоты с последующим гидролизом соляной кислотой.

Общие биохимические и микробиологические методы исследований. Содержание белка в пробах определили по методу Лоури, величину рН - потенциометрически, кинетические характеристики эндо-инулиназы изучали на высокоочищенном препарате. Константы Михаэлиса (Ки) и каталитические константы скоростей ферментативного гидролиза каждого из субстратов (кса!), определяли в диапазоне 6-15 различных концентраций субстрата от «0.1 до 4 - 8 Ям с помощью нелинейного регрессионного анализа соответствующих уравнений Михаэлиса-Ментен. Инактивацию фермента проводили в интервале рН 3,0-7,0 в Na-ацетатном буфере с ионной силой 0,05-0,06. Раствор фермента инкубировали при температуре 30, 40, 50, 60 и 70°С и через определенные промежутки времени определяли остаточную активность.

Микроскопирование культур осуществляли с помощью светового микроскопа Nikon Eclipse 200. Накопление биомассы в культуральной среде определяли методом подсчета дрожжевых клеток в камере Горяева.

Субстраты. В работе были использованы: инулин (Merck, Дармштадт, Германия); леван из Microbacterium levaniformans (Danisco Global Innovation, Финляндия); инулоолигосахариды со степенью полимеризации от 2 до 7; стахиоза, сахароза и раффиноза (Sigma Chemical Co., США).

Среднюю величину степени полимеризации (с.п.) инулина получали методом ЯМР спектроскопии из отношения (и) сигналов НЗ (6 = 4.3 - 4.17 ррт) в фруктозных и HI (5 = 5.43 ppm) в глюкозных остатках по формуле: с.п. - п + 1. Инулин, использованный в данной работе, имел среднюю молекулярную массу 3850 ± 80 Да. Спектры 'Н были сняты на спектрометре АМХ-500 Bruker.

Полноту прохождения гидролиза и чистоту полученных фруктоолигосахаридов проверяли методами ТСХ на пластинах Kieselgel 60 (Merck, Германия), используя в качестве подвижной фазы смесь бутанол-уксусная кислота-вода (3:1:1, по об.); ВЭЖХ на колонке Dextra-Pak и методом !Н и 13С ЯМР спектроскопии с использованием ранее описанных данных по фруктоолигосахаридам (Hammer and Morgenlie, 1990; Baumgartner et al., 2000). Чистота полученных соединений была не менее 95%, что подтверждалось данными ВЭЖХ и ЯМР анализа.

Статистическая обработка результатов. Опыты проводились в 3-4 - кратном повторении. Обсуждаются только те результаты, которые были воспроизведены в каждом опыте, достоверными считали различия с уровнем значимости q^OjOS.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА Ш. Биосинтез эндо-инулиназы и исследование физико-химических свойств фермента. Установлено, что исследуемые дрожжи S. cerevisiae ВГШ-2 характеризуются помимо инвертазной активности высокой способностью к биосинтезу эндо-инулиназы, что отличает их от других дрожжей рода Saccharomyces.

Изучены некоторые культуральные и морфологические признаки дрожжей S. cerevisiae ВГШ-2. Исследование локализации фермента в дрожжевой клетке позволило сделать вывод о том, что наибольшая активность ферментов (90-95%) сосредоточена внутри клетки, т.е. дрожжи синтезирует внутриклеточные гликозидазы. Соотношение инвертаза/инулиназа составило 1,5:1,0. Далее перед нами стояла задача - изменить соотношение в сторону увеличения синтеза инулиназы.

Исследование влияния различных источников углерода и азота на биосинтез эндо-инулиназы. Для определения влияния различных углеводов на рост дрожжей S. cerevisiae ВГШ-2 и синтез

ими инулиназы в питательную среду поочередно включали моносахариды, олигосахариды и полисахариды. Углеводы вносили в количестве 1% по углероду в питательную среду, содержащую, %: пептона - 1,0 и дрожжевого экстракта - 0,5, рН 4,5-6,0. Результаты исследований представлены на рис. 2, из которого видно, что наибольшее накопление дрожжевых клеток наблюдалось на среде с инулином, сахарозой, фруктозой и глюкозой, что объясняется физиологическими потребностями продуцента, однако строгой корреляции между накоплением клеток дрожжей и биосинтезом фермента не наблюдалось.

Активность инулиназы ед/г биомассы

Биомасса, кл/1 см

1 2 3 4 5 6 7 8

9 10 11

400 200

Рис. 2. Влияние источников углерода на активность (А,%) эндо-инулиназы и рост дрожжей Я. сегт$/ае ВГШ-2. 1- глюкоза (контроль), 2 - фруктоза, 3 - рамноза, 4 - инулин, 5 - арабиноза, 6 - сахароза, 7 - лактоза, 8 - мальтоза, 9 - раффиноза, 10 - крахмал, 11 - галактоза,

[ | - активность инулиназы; Щ - биомасса

Наряду с углеродом в процессе биосинтеза ферментов большое значение имеют также источники азота. Для выявления наилучших источников азота при биосинтезе инулиназы 5. сегеушае ВГШ-2 нами были испытаны минеральные соли: (МН4)2504, (МН^НРОд, МН4Н2Р04, Ш4С1, ИаЖЬ, КК03 и источники органического азота: кукурузный экстракт, солодовый экстракт, дрожжевой экстракт. Их дозировали в количестве 0,086% по азоту. Влияние источников углерода

исследовали на фоне фруктозы, которую вносили в количестве 2,5% к массе среды. Лучшим источником органического азота (рис. 3) оказался дрожжевой экстракт, среди минеральных - солей ЫНД^РС^. Из всех прочих солей высокий уровень биосинтеза эндо-инулиназы обеспечивал нитрат калия, азот которого находится в окисленной форме. Интенсивный синтез фермента в присутствии аммонийных солей фосфорной кислоты можно объяснить тем, что они являются как источником азота, так и источником фосфора. Последний, как известно, играет важную роль в биоэнергетике клетки.

Активность инулиназы Количество дрожжевых клеток в 1

%от максимальной см3 питательной среды (х 103)

Рис. 3. Влияние источника азота на активность (А,%) эндо-инулиназы.

1 - КМ03, 2 - №N03.3 - Ш4Ш3, 4 - (ЫН4)3НР04.5 - Ш4Н2Р04, 6 - (МН4)2504, 7 - дрожжевой экстракт, 8 - кукурузный экстракт, 9 - солодовый экстракт,

! 1-активность инулиназы; Ц- количество дрожжевых клеток

Исследование влияния начального значения рН среды, температуры и продолжительности культивирования на рост дрожжей 5". сегелпьше и биосинтез ими инулиназы показало, что данный продуцент проявляет способность к росту в широком диапазоне рН -от 3,0 до 8,0. Максимальный биосинтез фермента наблюдался при

рН 5,5, температуре 30°С и продолжительности культивирования дрожжей 36 ч.

Используя метод полного факторного эксперимента, было изучено взаимное влияние различных факторов на процесс биосинтеза инулиназы дрожжами £ сеге\чи1ае и подобраны оптимальные условия, обеспечивающие максимальный синтеза фермента: температура культивирования 30 С, продолжительность биосинтеза 30 ч, начальное значение рН среды 5,0, концентрация ИН^РОд в среде 0,8%, концентрация фруктозы 3%. В этом случае активность инулиназы составила 1998,2 ед/г дрожжей.

Получение очищенного ферментного препарата эндо-инулииазы и исследование его физико-химических свойств. Изучение физико-химических свойств ферментов, субстратной специфичности, рН- и термостабильности требует их высокой степени очистки. Результаты по очистке представлены в таблице 1. В результате очистки был получен ферментный препарат со степенью очистки 63,3 и удельной активностью 378,75 ед/г белка.

Таблица 1

Очистка инулиназы 5. сег^уй/ае ВГШ-2

Стадии очистки Активность инулиназы, ед Количество белка, мг Удельная активность, ед/мг белка Степень очистки Выход, %

Водная вытяжка дрожжей 4417,00 738,00 5,98 1,00 100

Осаждение изопропанолом в соотношении объемов 1:1.5 2517,70 243,20 10,35 1,73 95

Гель-фильтрация на сефадексе 0-50 1104,30 11,69 93,46 15,62 87

Гель-фильтрация на сефадексе в-100 60,60 0,16 378,75 63,33 75

Эксперименты по исследованию влияния температуры и рН на каталитическую активность инулиназы показали, что температурный оптимум действия фермента лежит в пределах 43-46°С, максимальную активность фермент проявлял при рН 4,5-4,7.

Кислотная и термическая инактивация эндо-инулиназы.

При изучении механизма инактивации инулиназы можно получить ценную информацию по совместному действию на фермент температуры и рН среды. Инактивацию инулиназы б1, сегеушяе ВГШ-2 исследовали в интервале рН 3,0-6,0 в 0,1 М ацетатном буфере. Раствор фермента инкубировали при 30 - 60°С и через определенные промежутки времени определяли остаточную активность (табл.2). Анализ экспериментальных данных показал, что при 40°С и рН 4,0 в течение 48 ч сохранялось 80% активности фермента, что свидетельствует о кислотоустойчивости инулиназы. При температуре 50°С и рН 4,0 остаточная активность составляла около 80% после 1 ч инкубации, на основании чего можно говорить и о достаточной термоустойчивости дрожжевой инулиназы & сегехчя'ше ВГШ-2. Повышение температуры до 60°С приводило к более резкой инактивации фермента.

Таблица 2

Изменение активности эндо-инулиназы под действием рН и

температуры

Температура,°С Время, ч Активность инулиназы, ед при рН

3,0 4,0 5,0 6,0

30 48,0 271,0 400,5 338,6 200,5

40 48,0 136,0 340,2 192,3 130,4

50 1,0 246,0 328,7 313,2 246,2

60 1,0 56,8 162,4 103,0 33,0

Поскольку инактивация многих ферментов подчиняется реакции первого порядка, константу скорости инактивации (К) рассчитывали по уравнению 1:

2,303 Ы

к-— (1)

где [Ео] - исходная активность инулиназы, принятая нами за 100%; [Е] - активность фермента в момент времени т, % от исходной.

Величину К находили как среднее из четырех-пяти определений. Данные, представленные в таблице 3, свидетельствуют о том, что инактивация инулиназы £ ,сеге\ч$1ае ВГШ-2 - типичная реакция

первого порядка, наибольшую стабильность фермент проявлял в зоне рН 4,0 - 5,0 и температур 30 - 40°С.

Таблица 3

Влияние температуры и рН на константу скорости инактивации (К) очищенной инулиназы Б.сегех^ае ВГШ-2

Температура, °С ^(ч1) прирН

3,0 4,0 5,0 6,0

30 0,009 0,004 0,006 0,011

40 0,017 0,007 0,013 0,029

50 0,180 0,075 0,110 0,340

60 1,860 0,885 1,090 2,380

На основании полученных данных, можно сделать заключение о том, что по своим каталитическим свойствам эндо-инулиназа S.cerevisiae ВГШ-2 отличается от известных дрожжевых и бациллярных эндо-инулиназ большей кислото- и термоустойчивостью, что перспективно для ее практического применения.

Специфичность действия эндо-инулиназы. Известно, что природным субстратом инулиназ является инулин. Способность гидролизовать любой субстрат с ß-фруктозидной связью не является очевидной особенностью каждой фруктозидазы. В настоящее время нет ещё полного представления о структуре дрожжевых ß-фруктозидаз, не известно, с какими особенностями в молекулах этих ферментов связаны их инвертазная и инулиназная активности. В связи с этим нами была исследована кинетика действия и субстратная специфичность эндо-инулиназы S. cerevisiae ВГШ-2. Значения констант Михаэлиса (Кга) и максимальных скоростей (Vra) гидролиза различных субстратов под действием эндо-инулиназы были определены экспериментально с помощью метода двойных обратных величин по Лайнуиверу-Берку из графика в координатах 1/S и I/V.

Установлено, что исследуемая эндо-инулиназа кроме инулина гидролизует раффинозу, стахиозу и леван, то есть проявляет химическое сродство как к ß-2,1-, так и ß-2,6-фpyктoзиднoй связи в олигосахаридах (рис. 4). Способность гидролизовать леван отмечена также и для инулиназы Aspergillus awatnori, и для ß-фрукгофуранозидазы Streptococcus salivarius. Проявление активности фермента по отношению

к левану заслуживает особого внимания, так как большинство (3-фруктофуранозидаз и инулиназ не гидролизуют леван. Это позволяет расширить область применения данного фермента в биотехнологии.

Рис. 4. Зависимость скорости (V, мМ/мин) ферментативного гидролиза различных субстратов от их концентрации

1 - инулин; 2- сахароза, 3- раффиноза; 4- стахиоза; 5- леван,

[Б] - концентрация субстрата, мг/см3

Определение кинетических характеристик гидролиза различных субстратов (табл. 4) показало, что выделенный нами фермент проявлял наибольшее сродство по отношению к инулину.

Таблица 4

Значения кинетических параметров эндо-инулиназы сегех1ь'юе ВГШ-2 при гидролизе различных субстратов

Субстрат Концентрация субстрата, мМ К» мМ Ут, мМ/мин на 1 мг белка

Сахароза 0-40 14,3 14,9

Раффиноза 0-30 40,3 8,6

Инулин 0-4,0 8,3 17,6

Стахиоза 0-27 48,6 7,0

Леван 0-6 мг/см3 7,0 мг/см3 0,5

ГЛАВА IV. Исследование пребиотической способности фруктоолигосахаридов. полученных при гидролизе инулина эндо-инулиназой. В настоящее время изучению пребиотического действия олигосахаридов уделяется большое внимание. Создана Европейская комиссия по неперевариваемым олигосахаридам - ENDO (European commission on non-digestible oligosaccharides). В соответствии с положениями, выдвигаемыми ENDO, пребиотические эффекты олигосахаридов реализуются по следующим направлениям: увеличение числа и активности бифидо- и лактобактерий, оптимизация функции кишечника, увеличение абсорбции кальция, магния и др.металлов, модуляция липидного метаболизма, снижение уровня холестерина и триглицеридов, предотвращение развития рака кишечника. На мировом рынке появляется все большее число пищевых добавок и продуктов функционального питания, содержащих олигосахариды, что отражает перспективность данного направления для коррекции нарушений микробиоценоза у человека.

Рядом исследователей было доказано, что в терапии дисбактериозов лечение должно базироваться на использовании таких веществ, с помощью которых можно целенаправленно воздействовать на те или иные бактерии микробного пула с тем, чтобы они сами продуцировали для организма метаболиты, витамины, антибиотики и регуляторы. С этой точки зрения представляло интерес исследовать пребиотические свойства олигофруктозидов, образующихся в результате гидролиза инулина эндо-инулиназой. Нами была исследована способность бифидобактерий к росту на среде с содержанием олигофруктозидов в условиях in vitro.

Для определения эффективности действия различных углеводов на рост микроорганизмов В. bifidum поочередно вносили углеводы в количестве 10 % по углероду в питательную среду следующего состава (% мае.): пептон - 10; NaCl - 5; агар-агар - 0,75; L-цистеин или цистеин солянокислый - 0,1; печеночный отвар, pH 7,5. При изучении динамики роста и кислотообразования физиологически активную культуру бифидобактерий вносили в свежую питательную среду в качестве инокулята. Культуру инкубировали в термостате при 37°С в анаэробных условиях. Указанные показатели определяли в динамике развития популяций в пробах, которые отбирали каждые 12 ч в течение 3-5 суток роста (рис. 5).

Из рис.5 видно, что рост бифидобактерий наблюдался на всех испытанных вариантах сред, однако внесение того или иного источника углерода оказывало различное влияние на динамику накопления микроорганизмов. Максимальное накопление биомассы наблюдалось к 48 ч процесса культивирования бактерий, наилучшее влияние обеспечивали такие углеродные субстраты, как фруктоолигосахариды (ФОС), лактоза и инулин.

Наряду с накоплением биомассы интенсивность метабалических процессов у бифидобактерий контролировали по изменению рН среды, что служит показателем трансформации углевода в органические кислоты как конечные продукты метаболизма. Из рис. 6 следует, что изменение величины рН коррелировало с накоплением биомассы клеток. Максимальное снижение рН наблюдалось на всех испытываемых средах к 48-60 ч, наиболее интенсивное снижение рН происходило при сбраживании ФОС и лактозы. Введение в состав питательной среды ФОС оказывало положительное влияние на морфологию растущих на ней бифидобактерий, что значительно облегчало их визуальную идентификацию при микроскопировании. На основании этого можно заключить, что выраженное стимулирующее действие фруктоолигосахаридов на биосинтез бифидобактерий in vitro указывает на их пребиотические свойства.

D Рис. 5. Динамика

накопления биомассы B.bijtdum на средах с различными углеводами: 1 - ФОС; 2 - глюкоза; 3- фруктоза;

4 - инулин;

5 - контроль, D - оптическая плотность, т - время, ч

Т,ч

ч ..... ч ■

\ Г з 4 \

4'*Ovs4

т, ч

Рис. 6. Динамика изменения рН среды при культивировании В.ЫЩит на средах с различными углеводами: 1 - ФОС; 2 - глюкоза; 3- фруктоза;

4 - инулин;

5 - контроль,

Б - оптическая плотность т - время, ч

Учитывая, что в мировой практике наибольшее практическое значение имеют олигосахара, которые получают прямой экстракцией естественных полисахаридов из растительного сырья, гидролизом растительных полисахаридов или путем энзиматического синтеза, а также пищевые растворимые волокна типа инулина, нами был проведен опыт по коррекции дисбиозов с использованием пребиотиков, полученных путем гидролиза инулина, разработанным ферментным препаратом эндо-инулиназы, что более физиологично для стимуляции микроорганизмов, присутствующих в пищеварительном тракте хозяина, чем введение эубиотиков экзогенно.

Пребиотическую активность полученных фруктоолигосахаридов исследовали в опытах in vivo на теплокровных животных (мышах). В рацион мышей с экспериментальным дисбиозом вводили различные источники углеводов: фруктозу (плацебо), инулин, олигофруктозу. Выделение бактерий из патологического материала и идентификацию штаммов проводили общепринятым методом с использованием соответствующих стандартизированных дифференциально-диагностических сред. Культуры идентифицировали по таксономически значимым признакам для установления родовой и групповой принадлежности.

Накопление биомассы и интенсивность метабалических процессов у идентифицированных видов микроорганизмов представлены в таблице 5 и на рис.7.

Таблица 5

Влияние углеводов на рост и развитие микрофлоры ЖКТ мышей

Штамм Метаболическая активность (значение pH)

инулин фруктоза фруктоолигосариды

Bifidobacterium 4,5 4,5 <4,5

Lactobacillus 5.0 4,5-5,0 <4,5

Fusobacterium 6.0 <6,0 >6,0

Bacteroides 5,5-6,0 < 5,5-6.0 5,5-6,0

Clostridium 5,5-6,0 <6.0 >6,0

Полученные результаты указывают на способность фруктоолигосахаридов подавлять развитие патогенной микрофлоры и стимулировать рост пробиотических культур, что согласуется с результатами опытов in vitro.

На диаграмме показано изменение численности популяций основных видов бактерий, вызванное приемом олигосахаридов. По способности индуцировать рост и развитие бифидобактерий углеводы можно расположить в следующий нисходящий ряд олигофруктоза>инулин>фруктоза.

Clostridium;

ИНУЛИН

Рис, 7. Изменение численности популяций основных видов бактерий, вызванное приемом олигосахаридов

Прочие; 25%

ФРУКТОЗА

Bifidido ba< 30%

Lacto

ФРУКТООЛИГОСАХАРИДЫ

Прочие; 6%

Bifidido bacterium 61%

Прочие; 59%

Lacto bacillus; 8%

Lacto

ciflus; 12%

Отмечено также, что фруктоолигосахариды способствуют восстановлению состава и численности индигенной кишечной микрофлоры теплокровных животных на фоне экспериментального дисбиоза, индуцированного введением антибиотика доксициклина.

ВЫВОДЫ

1. Дрожжи S.cerevisiae ВГШ-2 синтезируют внутриклеточную эндо-инулиназу. Оптимальными параметрами культивирования дрожжей, обеспечивающими максимальный синтез фермента, являются: состав питательной среды, %: дрожжевой экстракт - 2; NH4H2PO4 - 0,8, фруктоза - 3; начальное значение рН среды 5,0; температура 30°С, продолжительность культивирования 30 ч.

2. Оптимальными параметрами каталитической активности инулиназы следует считать: рН 4,5-4,7; температуру 45-47°С.

3. Анализ кинетических параметров Кш и Vmax показал, что эндо-инулиназа проявляла химическое сродство как к р-2,1-, так и к (3-2,6-фруктозидной связи в представленных субстратах, однако наибольшее сродство фермента проявлялось к инулину.

4. Оптимизация условий ферментативного гидролиза инулина позволила установить, что рациональными параметрами процесса гидролиза являются: дозировка эндо-инулиназы 10 ед/г субстрата, температура 45 °С, продолжительность 3 - 3,5 часа. При таких условиях степень гидролиза инулина достигала 78-80 %;

5. Выявленная тенденция положительного влияния различной концентрации олигофруктозидов на рост бифидобактерий В. Bifidum in vitro свидетельствует о пребиотическом действии олигофруктозидов.

6. Результаты проведенных исследований по коррекции экспериментального дисбиоза, индуцированного введением антибиотика доксициклина, с помощью фруктоолигосахаридов указывают на то, что фруктоолигосахариды способствуют восстановлению состава и численности индигенной кишечной микрофлоры теплокровных животных, проявляя тем самым пребиотическую активность.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Шуваева Г.П. Исследование физико-химических свойств инулиназы Saccharomyces cerevisiae ВГШ-2 / Г.П. Шуваева, Т.Р. Рутковская, О.С. Корнеева //Вопросы современной науки и практики. - 2010. - Т. 31. - №10-12. - С. 60-64.

2. Рутковская Т.Р. Инулиназа дрожжей Sacharomyces-cerevisiae ВГШ-2. Препаративное получение и некоторые физико-химические свойства / Т.Р. Рутковская, Г.П. Шуваева Г.П., О.С. Корнеева // Фундаментальные исследования. - 2010. - №10. - С.17-25.

3. Шуваева Г.П. Биоконверсия инулинсодержащего сырья / Г.П. Шуваева, Т.В. Мальцева, Т.Р. Рутковская, З.М. Керимова // Материалы 3-го международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева. - 2005,- Ч. 2. - С. 119.

4. Шуваева Г.П., Рутковская Т.Р. Биотехнологические аспекты переработки инулинсодержащего сырья / Г.П. Шуваева, Т.Р. Рутковская // Материалы XLIV отчетной научной конференции за 2005 год. - Воронеж: ВГТА. - 2006. - С. 164 - 165.

5. Корнеева О.С. Исследование структурных особенностей гликозидаз / О.С. Корнеева, И.В. Черемушкина, Г.П. Шуваева, Т.В. Свиридова, H.A. Чигирина, Т.Р. Рутковская // Материалы 4-го Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева. - 2007. - 4.2. -С.253.

6. Корнеева О.С. Перспективы биокаталитической технологии натурального сахарозаменителя / О.С. Корнеева, О.Ю. Божко, Т.Р. Рутковская // Материалы международной научно-технической конференции «Инновационные технологии переработки сельскохозяйственного сырья в обеспечении качества жизни: наука, образование и производство». - Воронеж. - 2008. - С. 107-108

7. Шуваева Г.П. Особенности инулиназ продуцентов различных таксономических групп / Г.П. Шуваева, О. С. Корнеева, Т.Р. Рутковская // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - Воронеж.: ВГУ - 2008. - вып. 10. - С. 292-295.

8. Корнеева О.С. Особенности структуры инулиназы и бетга-фруктофуранозидазы / О.С. Корнеева, Г.П. Шуваева., Т.Р. Рутковская

// Материалы XLVII отчетной научной конференции за 2008 год: В 3 ч. Ч. 1.-Воронеж: ВГТА.-2009.-С. 116-117.

9. Шуваева Г.П. Исследование молекулярной структуры инулиназы Saccharomyces cerevisiae / Г.П. Шуваева, Т.Р. Рутковская, О.С. Корнеева // Материалы III Междунар. науч.-техн. конф. «Инновационные технологии и оборудование для пищ. промышленности (приоритеты развития)», посвящ. 80-летию ГОУВПО «Воронеж, гос. технол. академия», Воронеж, 22-24 сент. 2009 г. - Воронеж: ВГТА. - 2009. - Т. 2. - С. 32-34.

10.Komeeva O.S. Bevolkerungsgesundheit und die neuegeneration von naturlichen sussstjffen / O.S. Komeeva , T.R. Rutkowskaja, O.M. Omelchenko // Das internanionale symposium Ökologische, technologische und rechtliche aspekte der ledtnsversorgung ., 3-4 dezember 2009 г.-2009.-47-48.

Работы № 1, 2 опубликованы в изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК.

Благодарности

Выражаю глубокую благодарность к.б.н., доценту кафедры микробиологии и биохимии ВГТА Галине Павловне Шуваевой и сотрудникам НИИ вакцин и сыворотки им. М.И.Мечникова РАМН за оказанную помощь в выполнении диссертационной работы.

Подписано в печать 29.03.2011. Формат 60 х 84 1/16 Усл. печ. л. 1,00. Тираж 100 экз. Заказ 74

ГОУВПО «Воронежская государственная технологическая академия» (ГОУВПО «ВГТА») Отдел полиграфии ГОУВПО «ВГТА» Адрес академии и отдела полиграфии: 394036, Воронеж, пр. Революции, 19

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Рутковская, Татьяна Ростиславовна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Микробные инулиназы: получение, физико-химические свойства, строение и практическое применение

1.1.1. Характеристика инулина и продуктов его гидролиза

1.1.2. Микроорганизмы - продуценты инулиназ

1.1.3. Микробный синтез инулиназ

1.1.4. Получение инулиназ и исследование их физико-химических свойств ^

1.1.5. Практическое применение инулиназ

1.2. Олигофруктозиды - распространение в природе, строение, свойства, биологическая роль и применение

1.3. Пребиотики: характеристика, способы получения и роль в поддержании нормальной микрофлоры ^

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Объекты исследований

2.2. Культивирование дрожжей сеге\ч$1ае ВГШ

2.3. Выделение и очистка эндо-инулиназы

2.4. Определение молекулярной массы белка методом электрофореза

2.5. Определение активности (3-фруктофуранозидазы

2.6. Определения инулиназной активности

2.7. Общие биохимические и микробиологические методы исследования

2.8. Аминокислотный анализ

2.9. Оценка пребиотических свойств фруктоолигосахаридов

2.10. Исследование продуктов гидролиза инулина методами хроматографии и ЯМР-спектроскопии

2.11. Статистическая обработка экспериментальных данных

ГЛАВА 3. БИОСИНТЕЗ ЭНДО-ИНУЛИНАЗЫ И ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

ФЕРМЕНТА

3.1. Характеристика культуры дрожжей сегеушя*? ВГШ

3.2. Изучение локализации гликозидаз, синтезируемых

3.3. Исследование влияния различных источников углерода и азота на биосинтез эндо-инулиназы ^

3.3.1. Влияние источников углерода

3.3.2. Роль источников азота

3.4. Влияние некоторых факторов на биосинтез инулиназы

3.4.1. Оптимизация условий биосинтеза эндо-инулиназы дрожжами ¿■.сегеуг^ше ВГШ-2 ^

3.5. Получение очищенного ферментного препарата эндо-инулиназы и исследование его физико-химических свойств

3.5.1. Очистка эндо-инулиназы Я. cerevisiae ВГШ

3.5.2. Определение аминокислотного состава очищенной инулиназы З.сегелпз1ае ВГШ-2 дд

3.5.3. Исследование некоторых физико-химических свойств инулиназы

3.5.4. Кислотная и термическая инактивация эндо-инулиназы

3.5.5. Специфичность действия эндо-инулиназы

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРЕБИОТИЧЕСКОЙ СПОСОБНОСТИ ФРУКТООЛИГОСАХАРИДОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ПРИ ГИДРОЛИЗЕ ИНУЛИНА ЭНДО

ИНУЛИНАЗОИ

4.1. Исследование характера действия инулиназы на инулин

4.2. Выбор оптимальных условий ферментативного гидролиза инулина эндо-инулиназой

4.2.1. Влияние дозировки ферментного препарата

4.2.2. Влияние концентрации субстрата на ферментативный гидролиз инулина

4.2.3. Влияние температуры на ферментативный гидролиз инулина

4.2.4. Влияние рН на ферментативный гидролиз инулина

4.3. Исследование пребиотических свойств фруктоолигосахаридов 116 4.3.1. Исследование бифидогенной активности углеводов in vitro

4.3.2. Определение влияния фруктоолигосахаридов на выживаемость клеток пробиотиков на фоне антибиотика

4.3.3. Изучение типа взаимодействий Bifidobacterium bifidum с Escherichia coli

4.3.4. Исследование регуляции нормобиоза кишечника в присутствии фруктоолигосахаридов ^

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Эндо-инулиназа дрожжей: биосинтез, физико-химические свойства и использование в получении пребиотиков"

Актуальность работы. В последние годы биокаталитические технологии становятся все более востребованными, так как количество I ферментов, эффективно используемых в различных областях промышленности, растет очень быстро. Гликозидгидролазы (гликозидазы), катализирующие расщепление гликозидных связей в олиго- и полисахаридах, - одна из самых широко изучаемых групп ферментов. Представителями I гликозидаз являются инулиназы - ферменты, гидролизующие фруктозосодержащие олигосахариды и полимеры (фруктаны) до фруктозы и фруктоолигосахаридов различной степени полимеризации. Инулиназы привлекают к себе внимание вследствие их востребованности в пищевой промышленности, фармакологии, сельском хозяйстве и других областях. I

Интерес к эндо-инулиназам вызван тем, что образующиеся в результате их каталитического действия фруктоолигосахариды обладают пребиотическими свойствами. Доказано, что инулин и олигофрутозиды избирательно стимулируют рост и метаболическую активность бифидо- и I лактобактерий, не влияя на рост других культур и подавляя развитие I потенциально патогенных бактерий. Производимые в настоящее время короткие олиго фруктозиды получают из сахарозы с помощью фрукозилтрансферазы, синтезируемой из Aspergillus niger. Этот метод оказался крайне дорогим и многостадийным, в результате чего цена конечного продукта очень высокая (Granger, 2000).

Инулиназы, синтезируемые многими микроорганизмами, включая грибы, дрожжи и бактерии, довольно подробно изучены (Onodera et al., 1992; Pessoni et al., 1999; Gupta et al., 1994; Ettalibi et al., 1990, Arand et al., 2004, Pandey et al, 2001, Синицин А.П., 2006, Абелян B.A., 1996). На основе гомологии аминокислотных последовательностей и сходного механизма действия инулиназы отнесены к 32-ому семейству гликозидгидролаз (Coutinho and Henrissat, 1999). Это семейство также включает инвертазы, леваназы и два типа 1-фруктозилтрансфераз. Несмотря на многочисленные исследования инулиназ, вопрос о специфичности эндо-инулиназ до сих пор актуален, данные по исследованию пребиотической способности образующихся в результате их каталитического действия олигофруктозидов немногочисленны. В связи с этим получение высокоактивных ферментных препаратов для гидролиза инулинсодержащего сырья до фруктоолигосахаридов, являющихся пребиотиками и способствующих поддержанию нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта, является актуальной задачей биотехнологии. Расширение спектра пребиотических препаратов имеет значение не только для медицинской практики, но и для пищевой промышленности.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы явилось получение высокоактивного ферментного препарата эндо-инулиназы, исследование его некоторых физико-химических свойств и субстратной специфичности, а также получение фруктоолигосахаридов и определение их пребиотической способности.

Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих задач:

- изучение некоторых культуральных, морфологических признаков и биосинтетической способности дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВГШ-2;

- оптимизация условий биосинтеза эндо-инулиназы дрожжами S. cerevisiae ВГШ-2;

- разработка эффективного способа выделения и очистки ферментного препарата;

- определение физико-химических свойств, субстратной специфичности и кинетических закономерностей процесса кислотной и термической инактивации эндо-инулиназы;

- получение фруктоолигосахаридов путем ферментативного гидролиза инулинсодержащего сырья;

- исследование пребиотических свойств олигофруктозидов в опытах in vitro и in vivo;

- обоснование целесообразности использования эндо-инулиназы для получения пребиотиков.

Проведены комплексные исследования физико-химических свойств фермента, его субстратной специфичности. Выявлены закономерности процесса термической и кислотной инактивации фермента. Установлено, что эндо-инулиназа гидролизует как (3-2,1-, так и (3-2,6-фруктозидные связи в субстратах.

Установлены способность фруктоолигосахаридов увеличивать резистентность бифидобактерий в присутствии антибиотика и проявление мутуализма к нормальной микрофлоре ЖКТ, в частности у Е. coli, что указывает на положительное воздействие этого углевода на нормобиоз кишечника.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены на отчетных научных конференциях ВГТА за 2005-2008 г, на 3 и 4-м Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005, 2007), международной научно-технической конференции «Инновационные технологии переработки сельскохозяйственного сырья в обеспечении качества жизни: наука, образование и производство» (Воронеж, 2008), III международной научно-технической конференции «Инновационные технологии и оборудование для пищевой промышленности (приоритеты развития)» (Воронеж, 2009), международном симпозиуме «Ökologische, technologische und rechtliche aspekte der ledtnsversorgung» (Ганновер, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 2 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Рутковская, Татьяна Ростиславовна

выводы

1. Дрожжи S.cerevisiae ВГШ-2 синтезируют внутриклеточную эндо-инулиназу. Оптимальными параметрами культивирования дрожжей, обеспечивающими максимальный синтез фермента, являются: состав питательной среды, %: дрожжевой экстракт - 2; NH4H2PO4 - 0,8, фруктоза -3; начальное значение pH среды 5,0; температура 30°С, продолжительность культивирования 30 ч.

2. Оптимальными параметрами каталитической активности инулиназы следует считать: pH 4,5-4,7; температуру 45-47°С.

3. Анализ кинетических параметров Кт и Vmax показал, что эндо-инулиназа проявляла химическое сродство как к ß-2,1-, так и к Р-2,6-фруктозидной связи в представленных субстратах, однако наибольшее сродство фермента проявлялось к инулину.

4. Оптимизация условий ферментативного гидролиза инулина позволила установить, что рациональными параметрами процесса гидролиза являются: дозировка эндо-инулиназы 10 ед/г субстрата, температура 45 °С, продолжительность 3-3,5 часа. При таких условиях степень гидролиза инулина достигала 78-80 %;

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Преобладание фруктоолигосахаридов в продуктах гидролиза инулина эндо-инулиназой S. cerevisiae ВГШ-2, определенное хроматографическими методами анализа и методом ЯМР спектроскопии, свидетельствуют о том, что исследуемая инулиназа является ферментом эндо-действия.

Максимальная степень гидролиза инулина (78-80 %) эндо-инулиназой S. cerevisiae обеспечивается при следующих условиях: концентрации субстрата 10 %, дозировке ферментного препарата 10 ед/г субстрата, температуре 45 °С, pH 6,0-7,0, продолжительности 3-3,5 часа.

Результаты проведенных исследований по коррекции экспериментального дисбиоза, индуцированного введением антибиотика доксициклина, с помощью фруктоолигосахаридов свидетельствуют о том, что фруктоолигосахариды способствуют восстановлению состава и численности индигенной кишечной микрофлоры мышей, проявляя тем самым пребиотическую активность.

Установлена бифидогенная и лактогенная активность фруктоолигосахаридов в опытах in vivo. Показано, что эффект применения фруктоолигосахаридов аналогичен лечебным препаратам «Лактобактерин» и

Бифидумбактерин». Сочетанное использование пробиотиков с ФОС не усиливало их лечебного эффекта.

В результате изучения влияния различных доз фруктоолигосахаридов в качестве монопрепарата на коррекцию экспериментального дисбиоза определена оптимальная концентрация фруктоолигосахаридов (2 мг/мышь), достаточная для коррекции дисбиоза.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Рутковская, Татьяна Ростиславовна, Воронеж

1. Marcel В. Roberfroid Caloric Value of Inulin and Oligofructose //Journal Nutr. 1999. - №129. - P.1436-1437.

2. Pandey A. Recent developments in microbial inulinases. Its production, properties, and industrial applications/ A. Pandey, C.R. Soccol, P. Selvakumar, V.T. Soccol, N. Krieger, J.D. Fontana //Appl. Biochem. Biotechnol.- 1999. №81. - P.35-52.

3. Kelly G. Inulin-type prebiotics~a review: part 1//Altem Med Rev. 2008 Dec. -13(4). - P. 315-29.

4. Akimoto Hidetoshi Molecular Cloning and Sequence Analysis of an Endoinulinase Gene from Penicillium sp.Strain TN-88 / Akimoto Hidetoshi,

5. Kiyota Naoyuki, Kushima Takayuki, Nakamura Toyohiko and Ohta Kazuyoshi. //Biosci. Biotechnol. Biochem. 2000. - №64.- P. 2328-2335.

6. Rouwenhorst R.J. Localization of inulinase and invertase in Kluyveromyces species/ RJ Rouwenhorst, WS Ritmeester, WA Scheffers, JP Van Dijken II Appl Environ Microbiol. 1990 Nov. - 56(11). - P. 3329-36.

7. Workman W.E. The cell wall-associated inulinase of Kluyveromyces fragilis/ WE Workman,DF Day // Antonie Van Leeuwenhoek. 1984. -50(4).-P. 349-53.

8. Kim K.Y. Catalytic mechanism of inulinase from Arthrobacter sp. S37 / KY Kim , AS Nascimento, AM Golubev, I Polikarpov, CS Kim ,SI Kang , SI Kim //Biochem Biophys Res Commun.- 2008 Jul 11. 371(4). - P. 600-5.

9. Viswanathan P. Enhancement of inulinase production by Aspergillus niger / P Viswanathan , PR Kulkarni // J Appl Bacteriol.- 1995 Apr. 78(4). - P .384-6.

10. Mutanda T. Controlled production of fructose by an exoinulinase from Aspergillus ficuum/ T. Mutanda, B. Wilhelmi, C.G. Whiteley // Appl Biochem Biotechnol. 2009 Oct. - 159(1). - P. 5-77.

11. Jing W. Separation and dentification of exo- and endoinulinase from Aspergillus fucuum.Xueming XIW Jing, J Zhengyu, J Bo //Curr Microbiol. 2003 Aug. -47(2). -P. 109-12.

12. Gill P.K. Comparative"analysis of thermostability of extracellular inulinase activity from Aspergillus fumigatus with commercially available (Novozyme) inulinase/ PK Gill , RK Manhas , P Singh // Bioresour Technol.- 2006 Jan. 97(2). - P . 355-8.

13. Chi Z . Inulinase-expressing microorganisms and applications of inulinases/ Z Chi, T Zhang ,G Liu, L Yue //J Appl Microbiol Biotechnol. 2009 Feb. -82(2).-P. 211-20.

14. Gupta A.K. Production, thermal stability and immobilisation of inulinase from Fusarium oxysporum/ AK Gupta, P. Rathore, N Kaur, R Singh // Chem Technol Biotechnol.- 1990. 47(3). - P. 245-57.

15. Brevnova E.E. Inulase-secreting strain of Saccharomyces cerevisiae produces fructose/ E.E. Brevnova, D.G. Kozlov, B.D. Efremov , S.V Benevolensky // Biotechnol Bioeng. 1998 Nov 20. - 60(4). - P. 492-7

16. Rouwenhorst R.J. Localization of inulinase and invertase in Kluyveromyces species/ RJ Rouwenhorst, WS Ritmeester, WA Scheffers, JP Van Dijken // Appl Environ Microbiol.- 1990 Nov. 56(11). - P. 3329-36.

17. Workman W.E. The cell wall-associated inulinase of Kluyveromyces fragilis/ WE Workman , DF Day // Antonie Van Leeuwenhoek.- 1984. -50(4).-P. 349-53.

18. Guiraud J.P. Inulinase of Debaryomyces cantarellii/ JP Guiraud ,C Bernit ,P Galzy // Folia Microbiol (Praha).- 1982. 27(1). - P. 19-24.

19. Bender J.P. Inulinase production by Kluyveromyces marxianus NRRL Y-7571 using solid state fermentation/ JP Bender, MA Mazutti, D Oliveira, H Treichel, M Di Luccio //Appl Biochem Biotech. 2006. - 32. - P. 951-958

20. Cazetta M.L. Polymnia sanchifolia extract as a substrate to produce inulinase by Kluyveromyces marxianus var. Bulgaricus / ML Cazetta , PMM Martins, R Monti, Contiero J Yacon.//J. Food Eng. 2005. - №66. - P. 301-305.

21. Santisteban-Silva BOY Agitation, aeration and shear stress as key factors in inulinase production by Kluyveromyces marxianus/ BOY Santisteban-Silva, F. Maugeri //Enzyme Microb Tech. 2005. - №36. - P. 717-724.

22. Workman W.E. The cell wall-associated inulinase of Kluyveromyces fragilis/ W.E. Workman , D.F. Day// Van Leeuwenhoek.- 1984. 50(4).' - P. 349-53.

23. Guiraud J.P. Isolation of a respiratory-deficient Kluyveromyces fragilis mutant for the production of ethanol from Jerusalem artichoke/ J.P. Guiraud, J. Bourgi, M. Stervinou , M. Claisse , Galzy //Biotechnol Bioeng. 1987 May.-29(7).-P. 850-8.

24. Allais J.J. Isolation and characterization of thermophilic bacterial strainswith inulinase activity/ J.J. Allais, G. Hoyos-Lopez, S. Kammoun, J.C.

25. Baratti // Appl Environ Microbiol. 1987 May. - 53(5). - P. 942-5.t

26. Allais J.J. Isolation and characterization of bacterial strains with inulinase activity/ J.J. Allais, S. Kammoun, P. Blanc, C. Girard, J.C. Baratti // Appl

27. Environ Microbiol. 1986 Nov. - 52(5). - P. 1086-90.

28. Kawamura M. Formation of a cycloinulo-oligosaccharide from inulin by an extracellular enzyme of Bacillus circulans OKUMZ 31B/ M. Kawamura , T. Uchiyama, T. Kuramoto,Y. Tamura, K. Mizutani// Carbohydr Res. 1989 Oct23.-192.-P. 83-90.

29. Yun J.W. Continuous production of inulo-oligosaccharides from chicory juice by immobilized endoinulinase / J.W. Yun, J.P. Park, C.Y. Song, C.Y.1.e, J.H. Kim, and S.K. Song //Bioprocess Engineering. 2000. - №22. -P. 189-194.

30. Vullo D.L. Characteristics of an inulinase produced by Bacillus subtilis 430A, a strain isolated from the rhizosphere of Vernonia herbacea (Veil Rusby)/ D.L. Vullo , C.E. Coto, F. Siñeriz // Appl Environ Microbiol. -1991 Aug. 57(8). - P. 2392-4.

31. Haraguchi K. Purification and properties of a heat-stable inulin fructotransferase from Arthrobacter ureafaciens / K. Haraguchi, M. Yoshida , K. Ohtsubo //Biotechnol Lett. 2003. - №53. - P. 1049.

32. Gill P.K. Effect of media supplements and culture conditions on inulinase production by an actinomycete strain/ P.K. Gill, A.D. Sharma, R.K. Harchand , P. Singh // Bioresour Technol. 2003 May. - 87(3). - P. 359-62.

33. Kalil S.J. Optimization of inulinase production by Kluyveromyces marxianus using factorial design/ S.J. Kalil, R. Suzan, F. Maugeri, M.I. Rodrigues//Appl Biochem Biotechnol. 2001 Jun. - 94(3).- P. 257-64.

34. Stevens C.V. Chemical modification of inulin, a valuable renewable resource, and its industrial applications / C.V. Stevens, A. Meriggi, K. Booten //Biomacromolecules. 2001, Spring. - №2(1).-P. 1-16.

35. Santisteban-Silva B.O.Y. Agitation, aeration andshear stress as key factors in inulinase production by Kluyveromyces marxianus / BOY Santisteban-Silva, F. Maugeri //Enzyme Microb Tech. 2005. - №36. - P. 717-724.

36. Rouwenhorst R.J, Production and localization of beta-fructosidase in asynchronous and synchronous chemostat cultures of yeasts/ R.J. Rouwenhorst, A.A van der Baan, W.A. Scheffers, J.P. Van Dijken // Appl

37. Environ Microbiol. 1991 Feb. - 57(2). - P. 557-62.

38. Skowronek M. Purification and properties of extracellular endoinulinase from Aspergillus niger 20 OSM Food / M. Skowronek, J. Fiedurek //Technology and Biotechnology. 2006. - №44. - P .53-58.

39. Ohta K. Purification and properties of an extracellular inulinase from Rhizopus sp. strain TN-96/ K. Ohta, N. Suetsugu, T. Nakamura // J Biosci Bioeng. -2002. 94(1). - P. 78-80.

40. Gill P.K. Comparative analysis of thermostability of extracellular inulinase activity from Aspergillus fumigatus with commercially available (Novozyme) inulinase/ P.K. Gill, R.K. Manhas , P. Singh // Bioresour Technol. 2006 Jan. - 97(2). - P.355-8.

41. Finkelman M.A. Yeast strain development for extracellular enzyme production/ Bioprocess Technol. 1990. - 8. - P. 185-223.

42. Park J.P. Utilization of chicory roots for microbial endoinulinase production/ J.P. Park, J.W. Yun//Lett ApplMicrobiol. 2001 Sep. - №33. -P. 183-7

43. Wang Jing Separation and Identification of Exo- and Endoinulinase from Aspergillus ficuum / Wang Jing, Jin Zhengvu. Jiang B. and Xu Xueming. //Current Microbiology. 2003. - №2. - P. 109-112.

44. Zhang L. Purification and characterization of inulinase from Aspergillus niger AF10 expressed in Pichia pastoris / L. Zhang, C. Zhao, D. Zhu, Y.

45. Ohta, Y. Wanga //Protein Expr Purif. 2004. - №35. - P. 272-275.

46. Finkelman M.A. Yeast strain development for extracellular enzyme production//Bioprocess Technol. 1990. - 8. - P. 185-223.

47. Johnson R. Production of High Fructose Syrup from Cassava and Sweet Potato Flours and their Blends with Cereal Flours/ R. Johnson, S.N. Moorthy, G. Padmaja // Ann N Y Food Sci Technol Int. 2010 Jun. - 16(3). -P. 251-8.

48. Stanhope K.L. Fructose consumption: recent results and their potential implications/ K.L. Stanhope, P.J. Havel // Acad Sci. 2010 Mar. - 1190. -P. 15-24.

49. Singh R.S. Production of high fructose syrup from Asparagus inulin using immobilized exoinulinase from Kluyveromyces marxianus YS-1/ R.S. Singh, R. Dhaliwal, M. Puri // J Ind Microbiol Biotechnol. 2007 Oct. -34(10). -P. 649-55.

50. Bajón A.M. Isolation of an inulinase derepressed mutant of Pichia polymorpha for the production of fructose/ A.M. Bajón, J.P. Guiraud, P. Galzy II Biotechnol Bioeng. 1984 Feb. - 26(2). - P. 128-33.

51. Zhang T. Bioethanol production from hydrolysates of inulin and the tuber meal of Jerusalem artichoke by Saccharomyces sp. WO / T. Zhang, Z. Chi, C.H. Zhao, Z. M. Chi, F. Gong // Bioresour Technol. 2010 Nov. -101(21). -P. 8166-70.

52. Guío F. Recent trends in fructooligosaccharides production/ F. Guío, M.A. Rodríguez, C.J. Alméciga-Diaz, O.F. Sánchez// Recent Pat Food Nutr Agrie. 2009 Nov. - 1(3). -P.221-30.

53. Chien C.S. Immobilization of A. japonicus byentrapping cells in gluten for production of fructooligosaccharides / C.S. Chien, W.S. Lee, T.J. Lin//Enzyme Microb Technol; 200L - № 29; - P.252^-257- :

54. Cho Y.J. Production of inu-looligosaccharides from inulin by a dual endoinulinases system / YJ. Clio, J. Sinha, J.P. Park, J.W. Yun //Enzyme Microb Technol. 2001. - №29. - P. 428-133.

55. Cho Y.J. Production of inulo-oligosaccharides from chicory extract by endoinulinase from Xanthomonas oryzae No.5 / Y.J.Cho, J. Sinha, J.P. Park, J.W. Yun//Enzyme Microb Technol. 2001. - №8.-28(4-5). - P. 439-445.

56. Cuervo R. Production of fractooligosaccharidës by P-fructofuranosidase from Aspergillus sp 27H / R. Cuervo, B. Guilarte, A. Juarez, J. Martinez //J.Chem Technol Biotechnol: 2004. - №79. - P. 268-272.

57. Kim D.M. Continuous production of gluconic acid and sorbitol from Jerusalem artichoke and glucose using an oxidoreductase of Zymomonas mobilis and inulinase/ D.M. Kim, H.S. Kim // Bio technol Bioeng. 1992 Feb 5.-39(3).-P. 336-42. •

58. Singh R-S. Production of high fructose syrup from Asparagus inulin using immobilized exoinulinase from Kluyveromyces marxianus YS-1/ R.S. Singh, R. Dhaliwal, M. Puri // J Ind Microbiol BiotechnoL 2007 Oct. -34(10). - P. 649-55. Epub 2007 Jul 31.

59. Bajon A.M. Isolation of an inulinase derepressed mutant of Pichia polymorpha for the production of fructose / A.M. Bajon', J.P. Guiraud, P. Galzy// BiotechnolfBioeng. 1984 Feb. - 26(2). - P. 128-33.

60. Stanhope K.L. Fructose consumption: recent results and their potential implications/ K.L. Stanhope, P.J. Havel // Ann N Y Acad Sci. 2010 Mar. -1190.-P. 15-24.

61. Figueroa-Gonzâlez L Probiotics and prebiotics-perspectives and challenges/ I. Figueroa-Gonzâlez, G. Quijano, G. Ramirez, A. Cruz-Guerrero // J Sci

62. Food Agric. 2011 Mar 28. - doi: 10.1002/jsfa.4367.

63. Grizard D. Non-digestible oligosaccharides used as prebiotic agents: mode of production and beneficial effects on animal and human health / D. Grizard, G. Barthomeuf //Reprod. Nutr. 1999. - dev.39. - P.563-588.

64. Gourbeyre P. Probiotics, prebiotics, and synbiotics: impact on the gut immune system and allergic reactions / P. Gourbeyre, S. Denery, M. Bodinier // J Leukoc Biol. 2011 Jan 13.

65. Delzenne N.M. Effects of fractans-type prebiotics on lipid' metabolism / N.M. Delzenne, N. Kok //Am J Clin Nutr/ 2001/ - №73/ - P. 456-458.

66. Kelly Inulin-type prebiotics: a review. (Part 2) // Altern Med Rev. 2009 Mar.-14(1).-P. 36-55.

67. Meyer D. The bifidogenic effect of inulin and oligofructose and its consequences for gut health / D. Meyer, M. Stasse-Wolthuis // Eur J Clin Nutr. 2009 Nov. - 63(11). - P. 1277-89. Epub 2009 Aug 19.

68. Martin B.R. Fructo-oligosaccharides and calcium absorption and retention in adolescent girls/ B.R. Martin, M.M. Braun, K. Wigertz, R. Bryant, Y. Zhao, W. Lee , A. Kempa-Steczko, C. M. Weaver // J Am Coll Nutr.- 2010 Aug. -29(4).-P. 382-6.

69. Stoyano va. S. The food additives inulin; and stevioside counteract oxidative stress/ S. Stoyanova, J. Geuns, E. Hideg, W. Van Den Ende // Int J Food Sci Nutr. 2011 May. - V. 62(3). - P. 207-14. Epub 2010 Nov 2.

70. Venuto C. Alternative therapies for Clostridium difficile infections / C. Venuto, M; Butler, E.D. Ashley // Brown Pharmacotherapy.- 2010 Dec. -V. 30(12).-P. 1266-78.

71. Hummelen R J. Altered host-microbe interaction in HIV: a target for intervention with pro- and prebiotics / R. Hummelen , A. P.Vos, van!t Land B, van Norren K, G: Reid //Int Rev Immunol. 2010 Oct. - 29(5). - P. 485513.

72. Menne E., Guggenbuhl N., Roberfroid M. 2000: Fn-type chicory inulin hydrolysate has a prebiotic effect in humans / J. Nutr. V. 130 - P. 11971199.

73. Трушина Э;Н. Иммуностимулирующее влияние перорального. введения бифидобактерий различных штаммов в эксперименте / Э.Н. Трушина и др. // Вопросы питания. 2006. - Т. 75. - № 5. - С. 70 - 74.

74. Somogyi M.J. Determination of reducing sugar// J. Biol. Chem. 1952. -V.195, №1-P. 19-28.

75. Williams R.S. Comparative properties of amplified external and internal invertase from the yeast SUC2 gene / R.S.Williams, R.J. Trumble, R. MacColl, R.B. Trimble, F. Maley // J. Biol.Chem. 1985. - V. 260. - P. 13334-13341.

76. Диксон M. Ферменты: В 3 т. / Диксон М., Уэбб Э. // Мир. 1982. - Т. 1, 2. -1118с.

77. Слюсаренко Т.П. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых производств // Легкая пром-ть. 1984. — 208 с.

78. Грачев Ю.П. Математические методы планирования экспериментов // Пищ. пром-ть. -1979. 192 с.

79. Рузинов Л.П. Статистические методы оптимизации химико-технологических процессов // Химия. 1972. - 199 с.

80. Draper N.R. "Ridge analysis" of Response Surfaces // "Technometrics".100. 101. 102.103.104.105.106. 107.1963.-№4,5.-Р. 3-18.

81. Квасников Е.И. Дрожжи. Биология. Пути использования / Е.И. Квасников, И.Ф. Щелокова // Наукова думка. 1991. - 328 с. С. 25 Грачев Ю.П. Математические методы планирования экспериментов // Пищ. пром-ть. - 1979. - 192 с.

82. Рухлядева А.П. Методы определения активности гидролитических ферментов / А.П. Рухлядева, Г.В. Полыгина // Легкая и пищеваяпромышленность. 1981. - 288 с.

83. Draper N.R. "Ridge analysis" of Response Surfaces // "Technometrics". -1963.-№4,5.-P. 3-18.

84. Пищеков Г.Б. К оптимизации процесса роста и размножения дрожжевых клеток // Хранение и переработка сельхозсырья. 1999. -№ 12. - С.66-68.

85. Пищеков Г.Б. К методу математического моделирования процесса роста и размножения дрожжевых клеток в аппаратах периодического и непрерывного действия // Хранение и переработка сельхозсырья. -1999.-№8.-С.66-68.

86. Vitolo М. Effect of рН, aeration and sucrose feeding on the invertase activity of intact S. cerevisiae cells grown in sugarcane blackstrap molasses / M. Vitolo, M.A. Duranti, M.B. Pellegrini // J. Ind Microbiol. 1995 Aug. -V. 15, №2.-P. 75-79.

87. Шуваева Г.П. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae ВПИ-2 для бродильных производств /Т.П. Шуваева, Е.Л. Гармонова, О.Ю. Мальцева // Патент на изобретение №21470034, 2000.У

Информация о работе

Рутковская, Татьяна Ростиславовна
кандидата технических наук
Воронеж, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Эндо-инулиназа дрожжей: биосинтез, физико-химические свойства и использование в получении пребиотиков - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы