Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Электроиндуцируемая трансформация грамотрицательных бактерий

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Электроиндуцируемая трансформация грамотрицательных бактерий"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи УДК 577.352.336

ЦЫМБАЛЮК Евгений Сергеевич

ЭЛЕКТРОИНДУЦИРУЕМАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ

03.00.02 — биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва —1992

Работа виполнена в отдела биоэлектрохимии Института электрохимии игл. А.Н.2рушаша, А11 СССР

Научный руководитель: доктор биологических наук НаучшШ консультант: член-корреспондент АН СССР

Ю.А.ЧизмадкеЕ

А.Г.Сабельников

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор кандидат биологических нале

А.А.Булычев

И.А.Василенко

Ведущая организация: Институт биологической физики АН СССР.

Защита состоится 20 февраля 1992 г. в 15.30 часов на заседании Специализированного совета К. 05о.05.68 в Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленгори, МГУ, Биологический факультет, ауд. ЛИК-5

С диссертацией иоано ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 19 января 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, . у

доктор биологических наук -''.¿-¿^ Б.А.Гуляев

- 1 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

. Актуальность проблемы. Интенсивное развитие биотехнологии н последние десять лет требует эффективных методов введения чугеродной ДНК й клетку. Эти метода обеспечивают связь мецщг исследованиями по клонированию генов, проводимыми с ДНК In vitro, и ее функцией in vivo; следовательно, имеют существенное значение для ресения многих проблем молекулярной биологии. В последнее' время большой интерес в мнро вызывает электроиндуцируемая трансформация, как наиболее перспективный способ введения эрогенной генетической информации в самые разнообразные про- и эукариотические клетки. Особое значение . тлеет электротрансформация для микробиологов, т.к. известные методы не обеспечивают достаточно эффективную трансформацию всех бактериальных штаммов, интересных с точки зрения биотехнологии и молекулярной биологии.

Для биофизики мембран несомненный интерес представляет вопрос о механизме транслокации под действием электрического поля внутрь клетки молекулы ДНК. В последнее время появляются данные, указывающие па важную роль электрофоретического движения ДНК в процессе электроиндуцируекой трансформации и становится ясно, что происходящие при этом события не ограничиваются электропорацией.

Целью работы является исследование механизма электротрансформации . на самом изученном и доступном прокариотическом объекте: клетках Escherichia, coll.

С учетом состояния проблемы на момент начала работы и исходя из поставленной;. цели, в работе решаются следувдие основные задачи:

- разработать ызтод электротргпсфсругцга E.colti

- оценить изменения, происходящие с иекбранами рзципиентных клеток в условиях электротравсформзцшц

- оценить возможные изменения, происходящие с доноркой ДНК в условиях обработки импульсами поля высокой напряженности;

- выяснить, какую роль играют в механизме электротрансфориациа возможные адсорбция донорной ДНК на клетках и ее электрофорез во время налокения трансформируадего импульса.

Научная новизна. В процессе работы над поставленными задачами был получен ряд приоритетных результатов.

Показана возможность эффективной олектротрансформации клеток Е.соИ и разработана оригинальная методика электротрансформации.

Впервые для бактерий показано образование больших пор и "блебов" (ьезикулярных выпячиваний мембраны) и их важная роль в процессе электротрансформации.

Впервые обнаружен вф$ект образования во время электротрансформацик клубка денатурированной донсряй ДНК, названного "клотом". Показано, что аффект "клотировашя" приводит к редуцированию биологической активности ДНК, усиливающемуся при повышении температуры электрообрабатываемой суспензии.

Разработана гелевая методика для изучения роли электрофореза ДНК в процессе алектротрансформации. С ее помощью доказано, что электротрансформацшо вызывает только та донорная ДНК, которая до контакта с реципиентной плеткой двигалась электрофоретическы.

Предложено теоретическое описание процесса

электротрансформации, основанное на электрофоретическом механизме доставки донорных молекул ДНК к порированой реципиентной клетке.

Представленная работа отражает вклад автора в разработку проблем, связанных с электротрансформацией. Совместно с Б.Л.Боровягиным и Г.Гонгадзе выполнены эксперименты по. влектронной-микроскопии клеток Е.соИ. В сотрудничестве с В.В.Чуияым осуществлена Р31-ЯМР спектроскопия бактериальных клеток. Штамм Enteroi)aateг сХоасеа получен от И.В.Ряпис

(лаборатория А.А.Луштаксва, ВНИИ сингезбелок), итамш Agrobácterlm tvmefaclens любезно предоставлены Л.С.Чернишш.

Практическая ценность работы. Предлокенные в работе метода к получение результаты вносят определенный вклад в развитие мотодп электротрансформации бактерий, уже сейчас играющего важнейшую роль в получении нукннх для биотехнологий бактериальных штаммов. Обнаруженное в работе явление "клотирования" ДНК мотет использоваться для развития новых методов гибридизации ДНК. •

Аппробация работы. Основные результаты работы докладывались на 4-м меадународном Фрумкннсксм симпозиуме (Суздаль 1988 г.), на Всесоюзных совещаниях по биоэлектрохшяш мембран (Рига 1988 г., Рига 1990 г.), па конференциях молодых ученых ГОЛ АН СССР им. А.Н.Фрумкина (1988-1990 гг.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ, список которых приведен в конце автореферата.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсувдения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 150 страницах мапинописного текста, включая 2 таблицы и 24 рисунка. Список цитируемой литературы включает 1S5 ссылок.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Электротраисфориащш птошов Escherichia coll, Axrobacterium ttnefaciens, Enterobacter cloacea.

До начала наших работ с E.coll, сообщений в печати об успешной электротрансформацки грамотрпцателдшх бактерий не было. Первая публикация появилась уже после того, как наша статья посвященная электротраясформацки E.coll была в печати.

Разработанная методика подготовю! клеток к индуцируемой электрическим полем трансформации . шспвчала в себя несколько

стадий. Штамм МН-1 выращивал! в ВОВ среде до А5б0=0.Б-0,6 ОЕ и центрифулдювали. Осадок суспендировав в 0.6 V (от исходного объема культуры) раствора содержащего 10 мМ ЭДГА, 10 мЫ трис-нс1 рН 8.0 и 1096 сахарозы (раствор А) при комнатной температуре. Затем спять центрифугировали и осадок обрабатывали в теш ке объеме холодного (0*0) буфера для влектрообработки: 10 (¿У н^зо^, 10 мЫ трио-Н01 рН 8.0, 10 $ сахарозы (раствор В). Клэтки собирали центрифугированием н суспендировали в 0.02 V, объеме раствора В. Посла добавления ДНК и влектрообработки, клерки подращивали в 10 объемах (от объема суспензии) 18 среды с 10% сахарозой в течениа 2 часов при 37*0. Затем культуру высевали на ьв-агар, содержаний 13 ¡ясг/ил ¡я тряцшшшэ = Евктерни-трннсфорнакты, Експре ссирущиз плазмиду рВЯ322, несущую ген устойчивости к тетрациклину, выживали на этой среда н через 12 ч образовывала колонии.

Предварительные експерименты показали, что обработка сусшзии клеток импульсом электрической поля длительность!) 1.6 кс й напряженностью до 12 кв/см, без обработки ЭДГА, не приводила к появлению трансформантов. Эффективность трансформации резко возрастала при увеличении концентрации ЭДГА в растворе А от 0 до 10 мЫ, затем начиналось медленное ее уменьшение, связанное, вероятно, со снижением жизнеспособности клеток. Контрольные эксперименты показали, что на стадии обработки раствором А газнеспособность клеток снижалась в 2 раза и они становились чувствительными к изменению «личности среды. НгоОходяш отметить, что аффекты связанные с физиологическим состоянием внешней мембраны в електротрансфорыации плохо воспроизводились (сюда, кроме аффекта ЭДГА обработки, также относились эффекты связанные с влиянием двухвалентных катионов и тоничности среды).

Крлвые эффективности трансформации и жизнеспособности от напряженности приложенного к суспензии поля представлены в

полулогариф,отческом масштабе па рис. . 1. Эффективность трансформации резко возрастала с увеличением напряженности. приложенного поля Е в диапазоне 5-13 кВ/см. Умэньтаио аМйктгшости трансформащш при более высоких напряяеккастгсс поля, возмояноt было связано с уменьиением гшзнеспособностя клеток E.coll поело элэктрообработки полем с Е>1Б кВ/см.

эффзкпгаиость, клепш/кяг 1000000

100000 :

10000

1000

зязивспособаоси, клэтки/ил 1.000Е*10

1.соое«оэ

1.0005*03

14 10 В, кВ/сн

Рис. 1. Зависимость эффективности трансформации (а) и жизнеспособности реципиентных клеток (ь) от напряженности приложенного электрического поля Е. Концентрация плазмиды pBR322 в суспензии клеток E.coll ита»ма Ш-1 0.01 мкг/мл. Постоянная времени импульса т=1.5 мс.

На эффективность трансформации существенно влияла температура суспензии в момент электрообработки. В полулогарифмическом масштабе эта саЬисгпгость имела вид прямой (Рис. 2), охлазденке суспензии от 37° до 0°С почти на два порядка увеличивало эффективность электротрансформацни.

эффективность, клопыЛш-1000000 --

100000

10000

1000

О S 10 15 ¿о 26 SO 33 40

теыпс-ратура, °С

Рис. 2. Зависимость эффективности электротрансформациг от начальной тешературы суспензии в ячейке. Концентрация цлазшды рБй322 в суспензии клеток E.coll штампа МН-1 0.01 мкг/мл. Е=10 кВ/см, 4=1. Б мс.

Количество электротрал сформированных клеток линейно росло при увеличении концентрации донорной плазмида от 0.003 до 15 мкг/мл. Наклон, прямой соответствовал эффективности трансформации 6.6«105 колоний/мкг ДНК. Частота трансформации достигала 0.4% при концентрации ДНК 15 мкг/мл.

Специальные опыты, проведенные на других штаммах E.coll СНВ101 и DU1).. показали, что они электротрансфордаруются о примерно той хе эффективностью, что и штамм Ш1.

В . дальнейшем эксперименты по изучению механизма электротрансформации проводились по методике W.J.Dower et al., где промывка и электрообработка клеток ведутся в холодном 1055 глицерине, что позволяет приготовленные клетки хранить в

I_' :_1_I_1_I

- 7 -

з г,мороке ином состоянии при температуре -70°С.

Эксперименты по электротрансформации Agrobacterlm tvnsfaclena проводили на штаммах с58, 1D1 и плазмздах pUD2001, рУА12-4. К началу данных экспериментов достоверных сведений о возможности электротрансформацпи Agrobacterlm tvxefaclena з литературе не было, к тому гэ известные методы трансформации давали эффективность порядка 102. Однако, в процессе работа появились новые публикации по данной теме и стало ясно, что наличие больших плазмид (Ti плазмиды) внутри клеток никак не влияет на электротрансформацию и методика, предлокевная W..T. Dower et al. без существенных модификаций пригодна для электротрансформации Agrobccterium tvnefaolena. Была получена трансформация штаммов С58 и 1D1. Эффективность трансформации

к

составляла %10 . Оптимальные условия электрообработки соответствовали таковым для E.coll. Контроль трансформации проводили выделением Ti плазмиды и введенной плазмиды из трансформированных клеток и контрольных клеток методом Кадо и Льюи.

Эксперименты по электротрансформации Enterobacter cloacea проводили на штамме несущем устойчивость к солям серебра плазмидами RSF1010, pUCl€ и pBR322. Клетки выращивали в ЬВ среде до Ag50=0.5-1.0 ОЕ при температуре 30*0 на качалке и в дальнейшем обрабатывали аналогично клеткам E.coll. Максимальная достигнутая эффективность трансформации при концентрации клеток в обрабатываемой суспензии 108 клеток/мл составляла 5»105 трансформ антов/мкг плазгяадной ДНК. Оптимальные параметры электрообработки Enterobacter cloacea не отличались от аналогичных параметров для E.coll и A.tinefaclens.

Образование бодьшх пор и вышгшваЕНЙ (баабов) га клетка! Е.соИ в условия! алвктротрансфовизции.

Для изучения процессов, происходящих во вреия влектротрансформации бактериальных клеток использовался

41

електронно-мшсроскошческиВ и Р-ЯМР анализ.

Структура поверхности скалов контрольных, необработанных клеток Б.ооЦ выявила классическую картину "аерохозатай" структур! на наружней мембране и гладкие (рез внутрвмембранных частиц) участки вместе с участками сегрегированных частиц. на поверхности сколов цетоплазматической мембраны (Рве. 3 а, Ъ).

. Рис. 3. Электронно-микроскопическЕа фотографии електрогорированных (£=>13 кВ/сы, т >=5 мс). клеток Е.оаи втахма ХЕ392. Образование участков с сегрегированными частицами (а, Ь) и больш пор (о, пора указана стрелкой).

Большая часть клеточных образцов влектропорированных в условщх 'Лптаалышх для переноса генов (ДНК) (Б электрического импульса ДЗ КВ/15М И 1=5 мсек) и замороженных через 40 с (в обычной ячейке)

послэ электрообрзботки выявила структуру поверхностей сколл близкую к контролю (данные не показаны). Однако, в ряде случаев удалось наблюдать большие клеточные дефекты в форда круглых пор (Рис. 3 о, пора указана стрелкой) и глобальные разрушения мэмбран. Присутствие илп отсутствие экзогенной ДНК в образцах не сказывалось на электронно-микроскопических фотографиях дата когда использовали очень высокую концентрацию (35 мкг на образец) ДНК.

На ультратснких срезах электропорированных клеток з ряде случаев мокно было наблюдать появление локальных сферических выпячиваний мембраны (блебов) (Рис. 4 а, указано стрелкой). Поскольку время, щхжэдеее между электрообработкой и химической фиксацией образца было вдвое меньше, чем в экспериментах с зачораживанием-скалаванием, образование блебов могло отражать более ранние стадии повреждения мембран в процессе электропорации. Использование для олектрообработки специальной ячейки, которая позволила существенно сократить время мевду электрообработкой и замораживанием ($ 1 с) подтверждало эту идею. На микрофотографиях при этом выявлено множественное образование блебов (Рис. 4 b, о, d). Чаще всего они были организованы в "грозди" и легко зачэткы на многих метках. Кроме того можно было увидеть начало слияния мембран соприкасающихся клеток (Рис. 4 е).

Типичный Р31-ЯМР-спектр клеток E.coli в \0% глицерине при 0°С приведен на рис. 5. а. Было обнаружено, что электрообработка клеток в оптимальных для электротрансформации условиях приводила (Рис. 5 b) к переходу' части фосфатов липидного матрикса (неизотропный сигнал) к другим формам организации (изотропный сигнал). Относительное увеличение изотропного сигнала (Рис. 5 с) соответствовало укспы: эпня липидного сигнала на 7-1055. Аналогичное изменение спектра давала гибель клеток, сопровождающаяся разрушением мембран. Известно, что возникающие

Рис. 4. Электронно-микроскопические фотографии влектропорированных (Е=13 кВ/см, 1=5 мс) клеток стаута ЬЕ392. Образование блебов (а, Ь, о, <1 указано стрелкой) и слияние клеток (е, указано стрелкой).

поры и блебы вносят вклад именно в изотропную часть спектра (при соответственном уменьшении лшщдаой части).

Важность результатов, полученных из р3*-ШР-сьектров заключается в возможности судить о тотальном состоянии липидйого матрккоа. На Р31-ШР-спектрах,'таюке не удалось обнаружить какое либо влияние донорной ДНК на клетки.

тт -

10»

ее fpu

Рис. 5. р -ЯМР-спектры клеток E.coll штамма LE3S2 до (а) и •после (Ь) электропорации (в=13 кВ/см, г=5 мс). Разностный спектр (о) получали вычитанием спектра (а) из спектра (ь) с последующим усилением.. '

Роль электропорации в электротрансформации моено было оценить и чисто функциональным экспериментом. Клетки сначала электропорировали, а затем к шел добавляли трансформирующую ДНК. Добавление к клеткам донорной ДНК через 10 с после их электрообработки приводило к снижению числа трансформантов больше чем на 4 порядка по сравнению с контролем, где клетки обрабатывали полем одновременно с ДНК. Дальнейшего уменьшения трансформантов при добавлении ДНК через 40 с после электропорации не наблюдалось. Отсюда следует: либо поры после электропорации залечивались до размеров недоступных для диффузии ДНК за время, меньшее чем 10 с, либо для электротрансформацпи необходимо

специфическое действие шля на ДНК в момент электрообработки. Электрошю-микроскошческий анализ показал, что мембранные дефекты, возникающие под действием поля наблюдались н через 2 мин. после електрообработкп. Это позволяет с известной долей уверенности говорить о том, что процесс транслокацки ДНК в клетку происходил в момент влектрообработки. >

"Юготированне" дозорной ДНК р условиях влектротраксфощапии.

При анализе результатов гельэлектрофороза ДИК, электрообраС танной в условиях, соответствующих

влектротрансфордгции бактерий, было обнаружено, что часть ДНК оставалась в стартовой лунке геля (в контроле вся ДНК входила в гель). Высокомолекулярная ДНК, образующаяся при обработке сильши электрическим полем (ЯО кВ/сы) была нами названа "кютом" (клубок). Начальная форма мзкромолекул ДНК, линейная или кольцевая, не имела большого значения1 для клотирования: эффект клотирования наблюдался как для линейной ДНК фага Я, так и для кольцевой плазмидной ДНК.

Количественный анализ аффекта клотирования осуществляли на меченой тритием плазмидной ДНК. Меченую ДНК . подвергали електрообработке, затем проводили гель-электрофорез. Получепный гель слайсировали и измеряли количество содержащейся в каждом кусочке геля метки. Результаты данного экспэримента представлены на рис. 6. Поскольку ник-транслированыую ДНК не лигировали после мечения, то она состояла в основном из фрагментов метшего размера, чем исходная молекула ДНК (Рис. 6 Ь; 20-23 фракции -начало ' пика радиоактивности в области низкомолекулярных фрагментов ДНК). После электрообработки картина электрофореза ДНК сильно менялась. Во-первых, большая часть метки оставалась в стартовой лунке теля (Рис. 6 а; фракция 3). Во-вторых, в

доля матки к внесенной

0.4 -

{ращии геля

Рис. 6. Слайсированиз гельэлектрофореза элзктрообработашюй (а) и контрольной (Ь) меченой тритием штзмздесЯ ДИН. Cop.\si плазмидц: ок - открытое кольцо; сс - суперскруче1шая; л -лилейная. Меченая .швзиида (П3рВП322, 2.2» 104 арш, 1 иг) обрабатывалась в 103 глицерине при Е=13 кВ/cu, т=5 ¡¿с.

противоположность необработанной ДНК, метка регпстрпровадэсь в местах соответствуицих всем трем формам интактнцх молекул ДНК (Рис. 6 а; фракции И, 10, 20). Этот &йект шхно объяснить тем, что после импульса маленькие фрагменты ^ДНК гибридизуэтся со dcgi.ra тремя (в том числе и немечепнш формами плазмидной ДНК). Следует от?'этить, что при обработке полем ^ДНИ количество кислоторастзоримой метки не возрастало. Это позволяет сделать вывод, что Н^ДНК не деградирует на маленькие фрагменты и нуклеотвды при дашшх параметрах электрической обработки.

Вероятно, формирование клота ило благодаря частотному разделении нитей ДНК (денатурации), индуцируемому полем. Поскольку энергии, необходимая для рззд.лешш цепей ДНК.

уменьшается с увеличением температуры, то сдвиг температуры, при которой ДНК обрабатывается шлем (начальная температура ячейки) от 0*С до более высокой температур!, скажем 30*С или 37*0, очевидно, привел бы к снижения напряженности поля, необходимого для получения того же аффекта. Данный эксперимент проводили на меченой ^ДНК. После гельзлектрофореза электрообработанной ДНК кусочек геля со стартовой лункой вырезали и измеряли количество оставшейся в нем метки. Экспериментальные данные приведены на рис. 7 (а и Ъ). Доля клоткрованной ДНК нелинейно возростала при увеличении напряженности приложенного поля от 7 кВ/см до 20 кВ/см. Начиная с 13 кВ/см происходит более быстрый рост клотирования ДНК. Оплатим, что сильное выделение

доля метки.к внесенной

Е. кВ/см

Рис. 7. Зависимость количества оставшейся на .старте гельзлектрофореза метки от напряженности квотирующего электрического поля при температуре 0*С (а) и 37*С (Ь) раствора ДНК во время электрообработки. Меченая плазмвда (1.4»104,орт, 0.6 нг) обрабатывалась в 1036 глицерине, 1=5 мс.'

дгоулева тепла в иокент импульса товэ могло бы приводить к денатурации ДНК. Однако, вычисления показали, что выделение тепла во время электрообрзботка не макет увеличить температуру суспензии более чем на 20'С.

Шли поставлены специальные акспергшентн по перевариванию ююта нуклеазой. Эта • нуклеаза специфически расщепляет одионитчатне участки па концах п во внутримолекулярных петлях двуштчатой ДНК. Фермент переваривал все одноштчатые участки в электрообработашюй ДНК и клот исчезал.

Предобработка влектричесгаи полем сильно действовала на биологическую активность как фаговой, так и плазмидной ДНК. После ш-лульса напрягевяостью 10 кВ/си и длительностью б кс биологическая активность ДИК уменьшалась в 10-20 раз (Таблица 1).

Таблица 1. Биологическая активность электрообработашой ДНК.

ДНК обработанная при Е (кВ/са)

Трансформация предобработанной ДНК

ДНК плазмадц рио18 (транфор-:анты/мкг ДНК)

ДНК фага \ (ИЦ* на 1, ккг ДНК)

О 6

7

8 10 13

5.0*105

,5

1.8«10 1.Э«Ю5

1.1*10 З.Э'10' 8.6*10'

2.9'Ю2

1.7'102 1

9.4»10 6.1 «101 1.2«101 2.О»10°

* "

1Щ - инфекционные центры. Отсюда следует, чго во время первого электрспорирущего импульса

- 16 -

90-9535 биологически активной ДНК в системе теряется.

Поскольку для влектропорации эукариотических клеток применяется более слабое поле, наблздаеше эффекты по существу относятся только к црокариотическим системам. Влиянием клотированкя можно объяснить необходимость вести влектрообработку бактериальных меток, в отличие от эукариотических, при О'С.

Электрофорез ДНК при электротранефориащш клеток.

Для экспериментального изучения электрофореза ДНК в сильных импульсных полях и роли электрофореза ДНК в електротрансфоркацш была разработана гелевая методика трансформации клеток Eeâfiericnia. coll. Основная идея данной методики заключается в пространственном разделении ДНК и клеток до влектрообрзботки. Наложив на систему трансформирующие импульсы поля разной полярности, можно оценить роль ■ электрофореза в элекгро трансформации•

Для электротраноформации в геле была сконструирована специальная ячейка с простым доступом к легко изменяемому рабочему зазору между электродами. 18 расплавленную легкоплавкую агарозу с реципиентными клетками при 37° С наносили между электродами с рабочим .зазором 0.5 юл. После застывания агарозы при 0°С рабочий зазор ыезду электродам! увеличивали до 1 ыы и вносили в образовавшуюся щель холодный буфер с ДНК. Полученный "сэндвич" обрабатывали полем разной полярности. Результаты по электротрансформации в геле представлены на Рис. 8. Клетки, заплавленные в агаровый гель, трансформировали плазмидой рис18, входившей в гель в момент импульса соответствующей полярности (рис. 8, о). Контролем служили результаты по электротрансформации суспензии клеток с ДНК без геля (а) и заплавленных в гель (Ь). Из представленных данных следует, что за время импульса ДНК успевает

травсфоршнти 1000000с

100000

10000

1000

100

10

160000

z 45000

1 1300

3

\ 28

■ i ■ 1

Рис. 8. Результаты эксперимента по олектротршо^орыации (е=13 кВ/см, х=5 мс) клеток E.aoll етеиь. le392 в геле. Реципиентше клетка заплавлеш в гель, донорная ДНК в прилегапцем слое буфера: а - трансформация в стандартна условиях¡ b - rosa, но клетки заплавлеш вместе с ДНК в гель; о - трансформация в пластинке геля при входе ДШС в гель с клеткаия во время" импульса; d - трансформация в пластинке геля при обратной нслтртости импульса.

пройти, внутрь геля и протрансфарнирозать часть клеток. Отиеткм,. что в случав, обратной полярности шшульса колзчестро, трансфоркантов было в 60 раз кеньив (Рис. 8 а), что указывает н^ отсутствие контахта кззду клетка>я а ДНК до приложения сшульса; для большей часта транофорхнрусцихся в эксперименте клоток. Грубая оценка показала, что при выбрзнннх параметрах ¡гстульсэ (3 »13 кВ/са, г«б мо) молекул! ДНК, облйдапцие олектрофоретичёскоЗ; подвижностью в гелэ П са?«о-1«В~1 (исходя из данных» для

обычного элзктрофзреза в геле), способны пройти расстояние ; порядка 30 ккм. £и более точной оценки расстоянии проюдшбго

молекулой ДНК во время икцульса, были поставлены эксперименты с меченой ДНК. На рис. 9 представлены результаты опыта по входу меченой тритием ДНК в гель под действием импульса электрического поля. Эти эксперименты осуществляли по процедуре, аналогичной электротрансформации в геле, но без клеток. Как видно, значительный процент' меченой ДНК входил в гель (фон составляет %2.6 % от всего внесенного количества меченой ДНК). Аналогичный эксперимент с обратной полярностью импульса давал величину включения метки в гелевую пластинку на уровне фона.

количество метки, х10 срт

В, кВ/си

Рис. 9. Результаты эксперимента по входу меченой ДНК в гель во время электрообработки. Вносимое количество метки 2.3*10* ора. Фоновое включение метки (без электрообработки) 6» 10^ орт.

Зная количество метки, вошедшей в гель за время импульса и предполагая однородность концентраций ДНК в содержащих её слоях геля и жидкости было показано, что при Е=13 кВ/см ДНК заполняла слой геля %20 мкм. Так как используемая меченая ДНК в среднем по

размеру меньше чем наганная ДНК, величину 20 мкм моим был:) принять за верхней границу расстояния проходимого во время импульса молекулой натязной ДНК. Оценка количества траисформантов в 20 мкм зоне для контрольных образцов давала величины от 1.6-102 (клетки с ДНК без геля) до Б'103 (клетки с ДНК в геле), что достаточно хорошо согласовывалось с экспериментально найденным значением - 1,3«103. Следует отметить, что до импульса ДНК не контактировала с клзтзекп, а во вреда шшульса ДНК приводилась в контакт с клетками за счет электрофореза. Так как трансформация в опыте шла практически столь се еффективно как и в стандартных условиях, мокно утверждать что адсорбция ДНК на клетках до электрообработки из является необходимой для реализации этого процесса. Отсюда внтексет, что а в стандартных условиях основная часть трансфордирущих молекул ДНК гриходит в контакт с клетками во время импульса благодаря влзктрофзрезу.

Использование пенятад ''траксформеционкая зопа" для опкепзяя электротр-чцсфорцакж!.

Как было показано ВЕпе, трансформации клеток осуществляют только те молекулы ДНК, которые были приведены в контакт с клетками электрофорезом во время электрического импульса. Основываясь на этом факте была найдена формула для зависимости числа траисформантов от концентрации реципиеатных клеток и донорной ДНК при оптимальных параметрах электрообработки.

Введем понятие "трансформационной зопы" как объема, прилегающего к рециппентной клетке, при попадании в который донорной молекулы ДНК до электрообработки происходит трансформация данной клетки ео время электрообработки. Донбрнсй назовем активную ДНК, способную трансформировать клетку. Рассмотрим вначале случай разреженной суитнзии клеток, где

отсутствует влияние соседних клеток друг на друга. В первом приближении электрическое поле вне клетки можно считать однородным. В этом случае трансформационную зону можно рассматривать как цилиндр с высотой трансформационной зоны и основанием, равным сечению клетки е. Объем трансформационной зоны южно представить как:

'тр.^эф/8 <*>

Тогда число молекул донорной ДНК вошедших в контакт с

клеткой пк> ео время электрообработки можно определить как

произведение концентрации молекул донорной ДНК Сд^ на объем

т^_трансформационной зоны:

"к.^ДНК^тр. " <2)

Отсюда обдзе число трансформантов П^. будет равно

произведению числа всех рецшшентшх меток Н^ на п^:

нтр. =пк. ,нкл.=сднк * ттр.' скл. * * (3)

где V - общий объем суспензии, а с.щ - концентрация молекул

донорпой ДНК.

В реальных условиях не каадая молекула ДНК и не каждая бактериальная клетка способны к электротрансформации. Поэтому введем коэффициент эффективности электротрансформации К:

®кл. едкк

где кдщ - коэффициент эффективности ДНК; трансформационный коэффициент эффективности клеток; С?дщ -реальная молекулярная концентрация ДНК; . - реальная

концентрация клёток. По своему ^нзическому смыслу к представляет собой вероятность электротрансформацни среднестатистической клетки при попадании в ее трансформационную зону одной среднестатистической молекулы ДНК.

Комбинируя две последние формулы получаем:

При высоких концентрациях клэток соседние клетки начинают ограничивать размеры трансформационной гоны. Следовательно, при концентрации клеток (1^, соответствующей началу участка шгода на насыщение зависимости аМектиЕностя трансформации, от концентрации клеток, среднее расстояние кезду клетками становится равным Еысоте трансформационной зоны:

Изложенные соображения позволяв» предсказать концентрата) ДНИ вдщ[. соответствугщую началу участка выхода на наоздэние заваскгюсти эффективности олектротрансфоргацаа от концентрации ДНК. В этом случае в трансформационную зону каждой клетка должна попасть минимум одна молекула доиоршЗ ДНК, т.е. п^-1. Тогда из формулы (2) получаем:

•кДНК 'тр.

Приведенные исе .формулн позволяют найти пз експэрпиэнта чнсленнов значение есох коястент, входящих в ату модель. Модна взять, например, даншз я.J.Dcwer ot al.. В атиг акспершзнтах. начало участка выхода на пес^зкие аагасгамстз оффектщшоста-трансформации от концентрации кязток приходится на' ]»: HJ.l®; клеток/Мл. Из формулы (6) находится 1^=4.6 ккм. С учетом того,, что 1 ыхг ш:азздно$ ДНК содержит примерно 1012 тлекул, сечепце клетки E.coll - cal (сэл2, а о®ектипность трансформации для этих эасперикзнтов 109 траноформантов на мкг ДНК, легко вычислить коэф|ицнент трансфорлации:. 1еь2»10_3. Для данных v?.j.Dc:?er^et al. могло предсказать начало участка шхода на насыщение зависимости эффективности трансформации от концентрации ДНК. Так как частота трансформация в этих экспериментах достигала 803, то .НщщйК» Тогда из (7) следует, что ыхг/мл.-

Таким образом для предложенной формулы можно из экспериментальных данных вычислить основные коэффициенты и предсказать факт существования перегиба на кривой зависимости эффективности електротрансформации от концентрации ДНК (с конкретным численным значением концентрации ДНК в этой точке).

ВЫВОДЫ

1. Осуществлена трансформация клеток Escherichia coll

посредством электрообработки. Разработана оригинальная методика

электротрансформации бактериальных клеток. Изучено влияние на

эффективность глектрсиндуцируемой трансформации напряженности

применяемого для электрообработки поля, температуры

обрабатываемой суспензии, концентрации донорной ДНК, что

позволило оптимизировать условия электрообработки. Обнаружено,

что все проанализированные штамш E.coll (LE392, iffll, НВ101,

DH5a, Ml), Agrobacterium tmefaclena Coi, 1D1), Enterobacter

i

el cacea трансформируются' в сходных условиях электрообработки.

2. С помощью электронной микроскопиии и Р31-ЯМР спектроскопии обнаружено появление специфических деформаций мембран бактериальных клеток електрообработанных в оптимальных для электротрансформации условиях. Электронно-микроскопичесшш методами показано, что в этих условиях на клетках Escherichia coll образуются локальные сферические выпячивания мембран, (блебы). р31 -ЯМР-спектроскопией подтверждавтся существенная роль в электротрансформации структурных дефектов мембраны с. большой кривизной поверхности.

3. Обнаружено, что в условиях злектрообрабоалн, приводящих к трансформации прокариотических клеток ДНК может оЗрсзовывать клубок (клот) и терять биологическую активность. Клонирование и>

потеря биологической активности ДНК сильно зависит от исходной температуры обрабатываемой суспензии.

4. Разработана специальная методика электротрансформацим клеток E.coli, иммобилизованных в агарознсм геле. С ее помощью показано, что электротрансформация бактерий эффективно происходит без предварительной (до электрообрабатки) адсорбции донорной ДНК на реципиентных клетках.

5. С помощью метода электротрзнсформации в агарозпом геле показано, что молекулы донорной ДНК, трансформирующие бактерии, входят в контакт с клетками электрофорзтически.

6. Исходя из гипотезы электрофоретического входа ДНК в клэтку во время электрообработки, введено понятие трансформационной зоны и предложена модель электротрансформяции. Основываясь на зависимости эффективности трансформации от концентрации клеток вычислены основные коэффициенты модели н предсказана область вихода на насыщение зависимости эффективности трансформации от концентрации ДНК.

Цитируемая литература: 1. Dower, W.J., ЫШег, J.P. and Ragsdale, С.Я. High effioienoy transformation of E.coli by high voltage eleotroporation. -Nuoleio Aoida Ree., 1988, v. 16, n. 13, p. 6127-6145.

Основное содорзашге диссертации опубликовано в работах:

1. Цымбалюк, 'Е.С., Черномордик, Л.В., Броуде, ILE. и Чизмадаев, Ю.А. Электростимулируемая трансформация клеток Bachertchta colt. - Биологические мембраны, 1988, т. б, " 3, с. 240-245.

2. СугЪг1;"^к, S.S., Ohemomordik, I.V., Broude, N.E. * and Chizcadzhev, Yu.A. Eleotro-atinulated tranaformation of E.coli cells pretreated Dy EDTA. solution. - PEBS Le-.,., 1983, v. 234, n.

1, p. 203-207.

3. Sabelnikov, Д.О. end Oymbalyuk, E.B. Clotting of donor UNA during oleotroporation of prokaryotes. - Bloeleotroohem. Bioenerg., 1990, т. 24, n. 3, p. 313-321.

4. Цымбалюк, E.G. и Сабельников, А.Г. Гелевая методика для изучения механизма ' электротрансформации Escherichia coll. -Биологические мембраны, 1991, т. В, № 4, о. 445-447.

5. Sabolnikov, А.О., Oymbalyuk, Б.8., Oongadze, О. and Borovyagln, V.L. Escherichia colt membranes during eleotrotranaformation: an electron miorosoopy etudy, Bioohlm. et Biophya. Aota, 1991, v. 1066, n. 1, p. 21-28.

Подл, в печ. 08.01.92 г. Тираж 100 экз. Заказ Р (085I

Централизованная типография ГА "Союэстройматериалов"