Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Электрофоретические и флуоресцентные свойства гуминовых веществ почв различных экосистем

ВАК РФ 03.00.27, Почвоведение

Автореферат диссертации по теме "Электрофоретические и флуоресцентные свойства гуминовых веществ почв различных экосистем"

На правах рукописи

ОД

Mi

- Хомугова -Татьяна Эдуардовна

ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЕ И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ СВОЙСТВА ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ ПОЧВ РАЗЛИЧНЫХ

ЭКОСИСТЕМ

Специальность 03.00.27 - почвоведение А ВТОР ЕФЕ PAT диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Институте Почвоведения и Фотосинтеза РАН

Научный" руководитель: кандидат биологических наук Л. Т. Ширшова

доктор биологических наук, профессор Д.С.Орлов

кандидат сельскохозяйственных наук Б. М. Когут

Ведущее учрежцение:Московская сельскохозяйственная академия

им. Тимирязева

Защита состоится 1996 года в час. на заседав

диссертационного совета К053.05.16 в МГУ им. М.В. Ломоносова

факультете почвоведения в аудитории М-2.

\ )

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ.

Автореферат разослан

1996 года.

Приглашаем Вас' принять участие в обсуждении диссертации на заседа! дисссертационного совета К053.05.16 в МГУ им. М.В Ломоносова, а отзь на автореферат в 2-х экземплярах просим направлять по адресу: 1198 Москва, Воробьевы горы, МГУ, факультет почвоведения, Ученый совет.

Официальные оппоненты:

Ученый секретарь диссертационного совета

Г.В.Мотузова

Актуальность исследования. Гуминовые вещества (ГВ) являются специфиче-ким и обязательным компонентом экосистемы, вдшнщцпм на основные физн-о-химические свойства почвы. К настоящему времени накоплен большой ма-ериал, касающийся закономерностей формирования ГВ и их трансформации в езультате хозяйственной деятельности человека. Однако насущной поблемой стается поиск показателей, отражающих состояние ГВ на ранних стадиях из-1енения экологической обстановки. В связи с этим представляет интерес гонение электрофоретических и флуоресцентных свойств ГВ как интегральных арактеристик их состава и строения.

Цель исследований: изучение электрофоретических и флуоресцентных войств ГВ и выявление характеристик для ранней диагностики изменений тушеного состояния почв при изменениях условий окружающей среды.

Задачи исследований; 1. Оптимизация условий проведения электрофореза в юлиакриламидном геле (ПААГ) и регистрации спектров флуоресценции починных ГВ.

2. Изучение электрофоретических и флуоресцентных характеристик ГВ почв ¡азличпых экосистем.

3. Электрофоретическая и флуоресцентная характеристика ГВ почв при ан-ропогенных воздействиях (внесение минеральных удобрений, подкисление).

Научная новизна. Оптимизированы условия проведения электрофореза ГВ в 7ААГ и регистрации спектров флуоресценции ГВ. Впервые получены спектры юзбуждения, эмиссии и синхронного сканирования возбуждения-эмиссии флуоресценции (ССкФ) ГВ почв различных экосистем. Изучены электрофоре-/ические свойства ГВ чернозема, серой лесной и дерново-подзолистой почв, а также флуоресцентные свойства ГВ тундровой, дерново-подзолистой и серой тесной почв. Для характеристики ГВ предложено использовать соотношение электрофоретических фракций различной подвижности, а также соотношение

интенсивности флуоресценции специфических максимумов ССкФ. Показано, что предложенные характеристики ГВ согласуются с групповым составом гумуса почв (С^/Сфк).

Практическая значимость. Предложенные способы получения электрофоре-тических и флуоресцентных характеристик ГВ позволяют проводить раннкж диагностику состояния почвенных ГВ при антропогенных воздействиях.

Апробация работы. Материалы работы доложены на конференциях: "Органо-минеральные взаимодействия в почвах" (Пугцино, 1990), "Эволюция почв i: почвенного покрова в связи с изменениями природной среды" (Пущино, 1992) "Физическая химия и процессы массопереноса в почвах" (Пущино, 1992), 1\ Северном Симпозиуме гуминовых веществ (Лоен, Норвегия, 1993); на семинарах Института Географии Рурского Университета (г. Бохум, Германия) и Института Географии и Геоэкологии Технического Университета (г. Брауншвейг Германия), лабораторий массо- и энергообмена в почвах, почвенной микробиологии ИПФС РАН, кафедры химии почв факультета почвоведения МГУ им М.ВЛомоносова.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ. Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, пя ти глав, заключения, выводов и приложения. Список литературы включав' источников, в том числе Ï.4.- иностранных. Работа изложена на^/..страница: машинописного текста, содержит^таблицги ^.рисунков. Глава 1. ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЕ И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ СВОЙСТВА ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ ПОЧВ: ВЛИЯНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ УСЛО ВИЙ.

В трудах Л.Н.Александровой, Л.А.Гришиной, М.М.Кононовой, Д.С.Орлова В.В.Пономаревой и других установлено, что состав и свойства почвенных Г1 определяются биоклиматическими условиями их формирования.

Для изучения свойств ГВ различных почв было предложено использовать ме тод электрофореза (Кононова, Титова, 1961; Кауричев и др., 1965; Дьяконова 1967; Степанов, Остроухова, 1970 и др.). Различные модификации метода при менялись для оценки молекулярных масс ГВ (Каспаров и др., 1985; Nobili Fornasier, 1993), а также изучения их физико-химических свойств (Castagnols 1979; Nobili et al., 1990; Trubetskoj et al., 1994 и др.). Результаты исследовани электрофоретического поведения ГВ в зависимости от типа почвы, характер растительности и хозяйственной деятельности немногочисленны и достаточн противоречивы (Eloff, Pauli, 1975; Castagnola, 1979; Gonzalez et al., 1981). Одна

I использование электрофоретических характеристик для анализа состояния 3 при изменении экологических условий представляется обоснованным, по-.ольку подвижность ГВ при электрофорезе определяется отношением суммарно заряда их поверхности к молекулярной массе, что отражает особенности мификашш ГВ в конкретных экологических условиях.

Широкие возможности спектральных методов для анализа почвенных ГВ поданы в работах Н.П.Бельчиковой, В.И.Касаточкина. М.М.Кононовой, С.Орлова и других. Метод флуоресцентной спектроскопии сравнительно нов, 1 используется для характеристики ГВ главным образом водных экосистем, |рфов, а также органических веществ компостов и метаболитов микроорга-ПЧОГ) (Ghosh, Schnitzer, 19S0, Miuuo et ul., ¡988; Senesi et al., («9! и др.). луоресцснтные свойства ГВ почв к настоящему времени остаются практиче-:и неизученными. Однако чувствительность метода и нетребовательность к адготовке препарата ГВ позволяют отнести его к перспективным методам ана-1за.

ива 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования были ГВ, выделенные из чернозема (Курская обл., эрснежская обл.), серой лесной почвы (Московская обл., Владимирская обл.), :рпово-подзолистой почвы (Вологодская обл., Ленинградская обл., Московия обл.), тундрового криозема (Колымо-Индигирская низменность). Исследовали также ГВ, выделенные- из толщи отложений археологической •оянки Усть-Каракол-1 (Горный Алтай); современная почва - чернозем выще-)чен ный.

ГВ были выделены катнонообменной смолой КБ-4 (экстракт ГВ-1), а также зеледовательными экстракциями кагионообменными смолами К.У-2-8 (ГВ-1а), Б-4 (ГВ-16) и 0.1 N NaOH (ГВ-2) [Ширшова,1991]. Разделение ГВ на гумпно-,ie (ПС) и фульиокислоты (ФК) проводили стандартными методами |Орлов, мшина, 198 ij.

Электрофорез ГВ, ГК и ФК проводили в камерах с водным и воздушным слаждением в вертикальных пластинах ПААГ, содержащем 7М мочевину, словия проведения электрофореза в ПАЛГ приведены в таблице 1. Денсито-етрированнс электрофоретических фракций ГВ вели в геле при длине волны 30 и 465 им на спектрофотометре Specord 4M (Carl Zeiss, Jena), расчеты по ;нситограммам вели на основании весового метода и обратывали статистиче-си [Дмитриев Е.Д. и др. 1980]. Эффективность электрофореза ГВ оценивали

по количеству разделяемых фракций ГВ, их подвижности и относительном) содержанию.

Спектры флуоресценции ГВ, ГК и ФК регистрировали в режимах возбуждения, эмиссии и синхронного сканирования возбуждения- эмиссии в диапазоне длин волн 200-600 нм на флуоресцентном спектрофотометре Hitachi 850 по методике Сенези [Senesi, et al., 1991]. Зависимость спектров флуоресценции от концентрации ГВ изучали в диапазоне 1-94 мг Сорг/л.

Электронные спектры ГВ регистрировали на спектрофотометре Specord 4M i вычисляли коэффициенты цветности Ejfö/Eßo (Е4/Е6).

Содержание углерода определяли по Тюрину [Орлов, Гришина, 1981].

Глава 3. ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ПОЛУЧЕНИЯ ЭЛЕКТРОФОРЕТИ ЧЕСКИХ И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ХАРАКТЕРИСТИК ПОЧВЕННЫХ ГУ МИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ. 3.1. Электрофоретические характеристики ГВ.

Исследовали влияние основных условий проведения электрофореза в ПАА на эффективность разделения ГВ (Табл.1).

Наиболее высокое качество разделения ГВ (максимальное число пиков н электрофореграмме и наилучшее их разрешение) при небольшой даительност эксперимента (0.5-1 час) наблюдали в 10% ПААГ.

Таблица

Оптимизация условий проведения электрофореза ГВ в ПААГ

Условия Варианты Выбрано, примечания

1. Концентрация ПААГ 5-20 % 10%

2. Количество

фракционируемых ГВ 5-160 мг Сорг 80 мг Сорг

3. Добавление денатурирующих 7М мочевина 7М мочевина+0.1%ДСН

агентов к препарату ГВ 50% формамид

1% ДСП

196 Тритон Х100

\% Na-ЭДТА

7М мочевина + 0.1% ДСН

4. Напряженность электрического 18-50 В/см максимально возможна?

поля (Н)) при данном охлаждении

5. Состав буферного раствора/ его фосфатный/ 5.5-9.4 фосфатный/ 8.0

рН боратный/ 7.0-9.4 трис-боратный/ 8.3

трие-боратный/ 5.5-8.3

трис-хлоридный/ 5.5-8.3

6. Охлаждение элекгрофоретической водное: разогрев пластины водное охлаждение по-

камеры 20°С, зволяет максимальнс

воздушное; 40°С увеличить Н

7. Предварительный прогрев ГВ с прогревом, 96°С сравнение позволяв'

без прогрева оценить нестабильны*

агрегаты ГВ

Линейная зависимость оптической плотности от количества фракционируе-ых ГВ установлена для области 20-80 мг Сорг, нанесение свыше 100 мг ГВ V) приводит к появлению на электрофореграммах дополнительных мало-

адвижных пиков ГВ.

Как правило, ГВ разделялись на неподвижные и мигрирующие в геле. Миг-

Фующие ГВ имели наиболее высокую электрофоретическую подвижность при Юаалении 7М мочевины или 50% формамида. Добавление детергента Тритона 100 )ши натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (Ка-ЭДТА) не учшало качества разделения ГВ. Применение сильного анионного детергента то л е п и л сул ьфата натрия (ДС.Н) вызывало разделение мигрирующих ГВ на ряд закдий, представленных на электрофореграммах в виде слаборазрешенных 1ков. Использование сочетания 7М мочевины с 0.1% ДСН приводило к наи-лее высокому разрешению пиков ГВ на электрофореграммах и разделению 5 на неподвижную и две мигрирующие фракции, что позволило выделить это четание как наиболее удобное для фракционирования ГВ. При увеличении напряженности электрического поля на электрофореграммах являлись дополнительные фракции ГВ в виде плеч на основном пике или ффузно распределенных ГВ. Однако исходя из различий электрофорети-ской подвижности мы выделяем три основные фракции ГВ, представляющие териал с близкими электрофоретическимн свойствами.

Электрофоретические фракции ГВ были обозначены нами согласно Нобили оЬШ е1 а!., 1991] как Н - фракция наиболее низкой подвижности, М - фрак-я средней и Ь - фракция наиболее высокой подвижности, которая появляется чько при добавлении ДСН (Рис.1).

280*

X

100

80 «О 40

20 О

11

я м

1

;. 1. Денслтограмма (А) и относительное содержание (Б) основных электрофоретичсскпх акций ГВ серой лесной почвы. Н, М, Ь - электрофоретические фракции низкой, средней и :окой подвижности, соответственно. (- -> +) - движение ГВ при электрофорезе; О280 -ическая плотность при длине волны 280 нм. Фракционирование в трис-боратной буферной теме (рН 8.3).

Изменения значений коэффициентов цветности ГВ различной электро-форетической подвижности указывают на разделение ГВ в соответствии с их молекулярными размерами (Табл. 2). Особенностью ГВ, формирующих наиболее подвижную часть' фракции Ь, является резкое уменьшение коэффициента цветности в щелочных условиях, что свидетельствует об ассоциации ГВ. Это согласуется с фактом появления фракции Ь только в присутствии детергента, способного разрушать агрегаты ГВ.

Таблица 2

Электрофоретическая подвижность (1)) и коэффициенты цветности (Е4/Е6) основных фракций ГВ (трис-боратная система, рН 8.3, 10% ПЛАТ)

Свойства Основные элекгрофоретические фракции ГВ Н М Ь

и, см2/В-ч Е4/Еб: элюция 0.1% ДСН элюция 0.Ш №ОН 0-0«4 0.18-0.34 0.60-0.70 3.1 3.6-3.7 4.7-8.0 15.0* 3.0 3.1-3.6 5.8-9.1 1.0*

Влияние состава буферной системы и ее рН на фракционирование ГВ изучали на четырех буферных системах: боратной, трис-боратной, трис-хлоридной и фосфатной. Эти системы различаются по электропроводности и реакционной способности ионов, составляющих буферный раствор. Установлено, что фракционирование ГВ в анализируемых буферных системах имеет однотипный характер: регистрируются три основные фракции ГВ, описанные ранее.

Увеличение величины рН буферной системы от 5.5 до 9.4 приводит, как правило, к увеличению подвижности и относительного содержания электрофо-ретических фракций М и Ь (Рис.2 А,Б), что указывает на возрастание величинь: заряда поверхности и уменьшение размеров ГВ. Причинами увеличения заряде поверхности ГВ могут быть рН зависимая ионизация функциональных групп появление заряженных функциональных групп вследствие изменения конфигурации молекул ГВ или разрушение непрочных связей (например, сложноэфир-ных). Наименьшие изменения электрофоретической подвижности ГВ отмечень в буферных системах, содержащих боратный ион; рН зависимые изменения - I буферных системах, содержащих трис-ион; наибольшие изменения подвижности фракций МиЬ отмечены в фосфатной буферной системе. Относительное постоянство величины подвижности ГВ в боратной и трис-боратной бу ферных системах при изменении рН свидетельствует о взаимодействии борат-

юго иона с вигинальными гидроксильнымн группами, стабилизации конфигу->ации ГВ и, следовательно, суммарного заряда поверхности.

см2/В-ч • L ■ м 1 А

I II III IV .

• ♦ ■

• ■ ■

■ ■ ♦ • » t " • ш ■ ■

Б £> -А -2 ОД

7.0 9.4 5.5 7.0 8.3 5.5 . 7.0 8.3 6.0 7.7 9.4 pH

100 80 60 • 40 20 Н О

111

IV

I I

0 7.7 9.4

7.0 9.4 5.5 7.0 8.3 5.5 7.0 8.3 pH ' 1=3 L BSE3 D

1 и

Рис. 2. Подвижность (А) н относительное содержание (Б) элсктрофорстичсскнх фракций ГВ чернозема в разлачных буферных системах при варьировании pH. Буферные системы I - Go-)атная; II - трис-боратная; III - трис-хлоридная; IV - фосфатная. II. М, L - электрофорстнчс-кне фракции, соответственно, низкой, средней и высокой подвижности.

X

100

I 2 3

4 5 6

чернозем дерново-подзолистая почва

'ис. 3. Влияние температуры на относительное содержание элсктрофорстнчсскнх фракции ГВ ернозема и дерново-подзолистой почвы. Контроль - 1,4; прогрев препарата (9б°С, 3 мин) -!,5; "горячий" гель (40°С) - 3,6. Фракционирование в трис-боратной буферной системе, рН 8.3. ^ М, Ь - фракции, соответственно, низкой, средней и высокой подвижности.

Прогревание препарата и/или геля способствует разрушению температурно-нестабильных связей ГВ, составляющих фракцию М, и увеличению относительного содержания наиболее подвижной электрофоретической фракции Ь (Рис. 3).

Таким образом, к оптимальным условиям проведения электрофореза ГВ следует отнести 10% ПААГ, добавление денатурирующих агентов - 7М мочевины с 1% ДСН, фракционирование около 80 мг Сорг на одном треке геля толщиной 2 мм с максимально возможной при конкретных условиях теплоотвода напряженностью электрического поля. Подвижность электрофоретических фракций ГВ возрастает с увеличением рН буферной системы. Боратный ион буферной системы стабилизирует суммарный заряд поверхности ГВ. Состав и рН буферного раствора, а также температурные условия электрофореза определяют "жесткость" условий фракционирования: предварительный прогрев ГВ и электрофорез в трис-боратной буферной системе с водным охлаждением представляет наиболее "жесткие" условия фракционирования, электрофорез в фосфатной буферной системе без прогревания ГВ - более "мягкие" условия.

При электрофорезе ГВ разделяются на три основные электрофоретичйские фракции: низкой (Н), средней (М) и высокой (Ь) подвижности. Фракция М наиболее гетерогенна и содержит в своем составе температурно-нестабильные агрегаты. Фракция Ь содержит ГВ, обладающие высокой способностью к ассоциации и проявляется только при добавлении в электрофоретическую систему детергента (ДСН).

В целом электрофоретическое поведение ГВ согласуется с данными об их вторичной полидисперсности, высокой гетерогенности и реакционной способности [Орлов, 1974; 1990; Варшал и др. 1975; Ширшова, 1991 и др.].

3.2. Флуоресцентные характеристики ГВ.

Зависимость флуоресцентных свойств ГВ от концентрации изучали по спектрам возбуждения (СВФ) и эмиссии (СЭФ) флуоресценции (Табл.3, Рис.4). СВФ и СЭФ имеют, как правило, один-два максимума, положение которых при возрастании концентрации ГВ сдвигается в сторону более длинных волн (батохромный сдвиг). Относительная интенсивность флуоресценции (ОИФ) при увеличении концентрации от 1 до 24 мг Сор1./л возрастает, а при более высоких концентрациях ГВ (24-94 мг Сорг/л) - снижается. Наиболее длинноволновый максимум возбуждения (462 нм) появляется при превышении некоторой кон-

ентрации ГВ и, вероятно, должен быть отнесен к флуоресценции ГВ в агреги-эванном состоянии

Таблица 3

Положение и относительная интенсивность максимумов возбуждения и эмис-ш флуоресценции ГВ в зависимости от их концентрации

.онцентрация ГВ, Г Сорг/л Положение максимума/Относительная интенсивность

Спектры возбуждения Спектры эмиссии

Основной максимум Побочный максимум

94 462/16 320/14 520/6

47 320/24 460/16 500/16

24 302/31 445/14 480/18

12 280/30 443/11 460/16

6 263/23 443/5 450/15

3 260/18 - 445/12

1.5 260/15 - ' 445/12

0.8 260/10 - 445/5

Спектры синхронного сканирования флуоресценции (ССкФ) содержат ;сколько максимумов (Рис.4) и менее зависимы от концентрации по сравнено с таковыми СВФ и СЭФ: меняется только интенсивность максимумов,

ССкФ

Л

\

ьоо

, нм

с. 4. Спектры возбуждения (СВФ), эмиссии (СЭФ), синхронного сканирования возбуяаде-я-эмиссии (ССкФ) флуоресценции ГВ серой лесной почвы (12 мг Сорг/л).

Сопоставление спектров возбуждения и эмиссии флуоресценции позволяет ;лать некоторые заключения о составе и свойствах ГВ: перемещение максимов при изменении длины волны эмиссии флуоресценции на СВФ и длины гшы возбуждения флуоресценции на СЭФ указывает на флуоресценцию раз-образных групп, а сглаженность спектров флуоресценции - на сложность со-1ва ГВ. Перекрывание длинноволнового максимума возбуждения (СВФ) мак-чумом эмиссии (СЭФ) указывает на участие водородных связей в структур-

гда как их положение сохраняется.

30

200 300 400 600 600

длина полны, нм

© О

И

300 400

длина волнь

.г

ной организации ГВ, а значительное расстояние между основным максимумом возбуждения и максимумом эмиссии флуоресценции (стоксов сдвиг 180-200 нм) свидетельствует о протекании реакций в возбужденном состоянии.

На основании полученных результатов для сравнительно- аналитического исследования ГВ почв различных экосистем ССкФ являются наиболее удобными и информативными характеристиками ГВ, при этом следует использовать концентрации 12-24 мг Сорг/л.

Глава 4. ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЕ И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ ПОЧВ, СФОРМИРОВАННЫХ В РАЗЛИЧНЫХ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ.

4.1. Электрофоретические характеристики ГВ, ГК и ФК почв различных экосистем. •

Специфической особенностью ГВ чернозема является наличие электрофоре-тической температурно нестабильной фракции М, доля которой варьирует в почвах различных биоценозов (47-80%) и при прогревании ГВ значительно снижается (20-30%). Соотношение электрофоретических фракций ГВ низкой и средней подвижности (Н:М) составляет 0.07-0.12. Для ГВ дерново-подзолистой почвы фракции Ни Ь составляют 75-85%, при соотношении Н:М близком 1 (Рис. 5,3). Для ГВ серой лесной почвы выявлено влияние биоценоза на формирование фракций различных электрофоретических свойств: при высоком содержании фракций Н (25-43%) и М (36-58%) их соотношение составляет 0.3-0.5 - для ГВ, выделенных из почв под лугом и черным паром, и 1.1 - для ГВ под лесом, что сближает характеристики первых двух - с таковыми ГВ чернозема, а последней - с таковыми ГВ дерново-подзолистой почвы («1<0.05). ФК серой лесной почвы представлены фракциями Н и Ь и практически не содержат фракцию М, тогда как ГК представлены их полным набором (Рис. 6). Особенностью ГК дерново-подзолистой почвы является преобладание фракции Н, тогда как фракции М и Ь не формируют четко обособленных пиков, что сближает ГК дерново-подзолистой почвы с фульватным материалом и подтверждает факт более высокой гетерогенности ГК по сравнению с таковыми ФК.

Исследование ГВ почв различного геологического возраста толщи отложений археологического памятника Усть-Каракол-1 (Горный Алтай) показало, что ГВ этих отложений, содержат электрофоретические фракции Н, М и Ь, соотношение которых различно (Рис. 7). ГВ, взятые на глубине 230-280 см, отличаются

остальных аномально высоким содержанием фракции Н (34%) и соотноше-1ем Н:М (1.4). По данным группового состава гумуса (С1К/СфК) [Феденева, '92], отложения на глубине 230-280 см имеют наиболее фульватный характер муса (С1К/СфК= 0.4-0.5). Отмечена обратная корреляция относительного со-ржания электрофоретической фракции Н и величины С1Х/Сфк (г=-0.67, :0.05).

г

12 3 4 5 6 7 8

О 1 111 11 1-1 11 11 1- 11

чернозем серая лесная дерново-

почва подзолистая; почва

ю. 5. Относительное содержание элсктрофоретнческих фракций ГВ чернозема, серой лесной дсрново-подзолистой почв под различными биоценозами. 1 -дубрава, 2 -степь, 3,5-черный |р, в,%-лес, Ц -луг, 7-залежь. (Фракционирование в трис-боратной буферной системе, рН

3)

ФК гк

ис. 6, Характерные денептограммы элсктрофорстнчсского разделения ФК и ГК серой лесной ) и дерново-подзолистой (2) почв. И, М, Ь - электрофоретичсские фракции ГВ, соответ-гвенно, низкой, средней и высокой подвижности. (—> +) - движение ГВ при электрофорс-

1?280 - оптическая плотность при длине волны 280 нм. Фракционирование в фосфатной уферной системе (рН 8.0).

N Глубина, 'СпУСфц см

1 10-20 1.25

2 20-30 1.15

3 70-85 0.90

4 85-92

5 110-120 0.82

6 195-200 0.70

7 210-220 0.64

8 230-240 0.42

9 250-260 0.49

10 270-180 0.51 И 450-460 1.76

12 460-470 1.52

13 470-480 0.92 * - [Феденева, 1992]

Рис. 7. Относительное содержание элекгрофоретических фракций ГВ многослойной толщи отложений археологической стоянки Усть-Каракол-1 (Горный Алтай). Н, М, Ь - электрофорс-тичсские фракции, соответственно, низкой, средней и высокой подвижности, (Фракционирование в трис-боратной буферной системе, рН 8.3).

Таким образом, электрофоретическая фракция М характерна для почв с гу-матным типом гумуса. ГВ содержит все основные фракции Н, М и Ь, тогда как ФК- преимущественно фракции Н и Ь. Соотношение электрофоретических фракций ГВ различной подвижности специфично для разных почв и может быть использовано для их характеристики'.

4.2. Флуоресцентные характеристики ГВ почв различных экосистем.

Спектры флуоресценции ГВ, ГК и ФК тундровой, дерново-подзолистой и серой лесной почв различаются положениями максимумов флуоресценции и их относительной интенсивностью (ОИФ) (Рис. 8, 9). Изучение ССкФ ГК и ФК различных типов почв позволило выделить область спектра, характерную для ФК (300-400 нм), и таковую, характерную для ГК (410-520 нм). Соотношение интенсивностей специфических максимумов флуоресценции, характерных для ГК и ФК, представленное в виде коэффициента интенсивности флуоресценции (КИф), было вычислено для тундровой, дерново-подзолистой и серой лесной почв. Установлена корреляция этого показателя и величины Сгк/Сфк (г=0:83, а< 0.01) (Табл. 5).

Показатель Киф позволяет интерпретировать ССкФ в терминах группового ;тава гумуса и может быть использован для характеристики ГВ различных

зсистем. ~ ______

ки:а 5. ИЗМЕНЕНИЕ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ И ФЛУОРЕСЦЕНГ-ЛХ ХАРАКТЕРИСТИК ГВ ПОЧВ ПРИ АНТРОПОГЕННЫХ ВОЗДЕЙ-ВИЯХ

Изменение электрофоретических и флуоресцентных характеристик ГВ при гропогенных воздействиях изучали е опыте по залуженшо пахотной серой :ной почвы и лабораторном эксперименте по подкислению почв. I. Зялужение пахотной серой лесной почвы.

Анализировали ГВ, выделенные из серой лесной почвы, с участков под лугом зличных режимов использования: с сенокошением и без него, со внесением шерального удобрения и без него, а также с контрольных участков под лесом черным паром (Табл. 4).

Таблица 4

¡рактеристики ГВ серой лесной почвы под сеяным лугом различных режимов пользования, лесом и черным паром

1ЮЦСЦОЗ, осжим Н.М ССкФ (положение максимума. нм)/ОИФ Киф*

,'Г. 1ПОВСДЛЫЙ 4.9 0.74 303/43.5 348-352/33 410/19 490/17.5 0.48

пепмыи 5.3 0.66 303/41 355/30 410/19 490/15.5 0.49

бО^ЬоКоО 5.7 1.59 303/39 350/30 410/26 490/19 0.65"

эсимьш N(,0К<_,(, 5.2 0.70 304/48 352/33 410/19 490/15.5 0.43

X 6.1 0.95 304/57 348-352/31.5 410/17 493/14 0.35

:рныи пар 4.7 0.47 299/34 353/29 410/19 490/15.5 0.55

'К^, --- ОИФ (490+410)/С)ИФ(350+303) [Ширшова, 1994]

Соотношение электрофоретических фракций Н:М минимально для ГВ под

:рным паром и значительно выше под лесом, варианты луга занимают проме-уточное положение. Наиболее высоко содержание электрофорегически мало-эдвижных ГВ в почве удобренного некосимого варианта луга.

Спектры флуоресценции ГВ имеют максимумы, положение которых практи-:скп одинаково для всех аначнзированных вариантов серой лесной почвы. Со-тсно ССкФ интенсивность коротковолнового максимума 299-304 им нараста-г в ряду: черный пар - луг - лес, тогда как интенсивность наиболее длинно-элновых максимумов - 410 и 490 нм выше для ГВ под вариантами луга и чер-ым паром по сравнению с таковой для ГВ под лесом. Вариант луга со внесе-ием минеральных удобрений отличается увеличением интенсивности специ-!ических гуматных максимумов 410 и 490 нм.

Рис. 8. Спектры синхронного сканирования возбуждения-эмиссии флуоресценции ФК (1-3) и ГК (4-6) дерново-подзолистой (А) и серой лесной (Б) почв. ОИФ - относительная интенсивность флуоресценции.

300 360 400 450 600 560 длина волны, нм

Рис. 9. Спектры синхронного сканирован!« возбуждения-эмиссии флуоресценции Г£ исходных и подкисленных образцов тундровой (А), дерново-подзолнетой (Б) и серо! лесной (В) почв трех последовательных экс трактов ГВ: ГВ-1а (1,2), ГВ-16 (3,4) и ГВ-: (5,6); 1,3,5 - подкисленные образцы, 2,4,6 ■ исходные образцы, соответственно. ОИФ • относительная интенсивность флуоресцен

ЦИ11.

Электрофоретические и флуоресцентные характеристики ГВ свидетельствуют накоплении ГК в почве сеяного луга при внесении минеральных удобрений. I. Лабораторный эксперимент по подкислению тундровой, дерново-

цзолистой и серой лесной почв,

Анализировали 113 трех последовательных экстрактов, полученных с по-

шшо кагиопообменных смол КУ-2-8 и КБ-4 (ГВ-1а, ГВ-16, соответственно) щелочи (ГВ-2) (Табл. 5).

Таблица 5

Характеристики ГВ тундровой, дерново-подзолистой и серой лесной почв сходные и подкисленные образцы почв)

О'ТТЛ, ■ризонт, глуша, см С„рг (%) рН0/рНк Экстракт (СгкА--фк)о (Е4/Е6)0 (КИф)о/(К„ф)к*

ндровая А, В 1.7 5.67/5.13 1а 0.7 13.0 С. 77/0.39

20 16 0.9 4.6 1.7 3/2,14

2 0.6 5.2 1.13/1.15

:рново- 2.32 5.81/5.14 1а 0.4 9.2 0.57/0.26

щзолнетая 16 0.9 5.4 1.75/1.56

|А2 10-20 2 0.6 7.8 о.&г/т

рая лесная 0.92 5.37/4.69 1а 1.7 6.7 2.13/1.66

,В 27-35 16 5.2 5.3 3.33/3.33

2 0.8 - -

о" - пс.чодп'ч!с. "к" - подкисленные образцы почв

В результате полкислення почвенных суспензий соляной кислого!! (рН 3) в юцслч.е молельнею эксперимента в течение месяца рН почв уменьшились па >4-0.68 ел. Отмечена тенденция к увеличению доли подвижных электрофоре-чеекпч фракции ПЗ.

На СВФ и СЭФ ГВ выявлены сдвиги максимумов и коротковолновую об-сть (до 20 им). ССкФ содержали наибольшие изменения интенсивности спе-•фических максимумов ССкФ (Рис. Я) первого из последовательных экстрак-» П5 (I 15-! а), содержащего элекгрофоретически мхтоиодиижнын материал, нгенсивность фульватного максимума ССкФ 340-360 им возрастала и более >ко проявлялась на спектрах тундровой и дерново-подзолистой почв, что выдало снижение величины К„ф (Табл. 5). Таким образом, подкисление почв в сдельном эксперименте приводило к возрастанию доли ФК в составе почиен-.ix ГВ.

Из результатов следует, что элсктрофорегические и флуоресцентные характе-|стики ГВ могут быть использованы для регистрации изменения их состояния >чв при антропогенных воздействиях.

16

выводы

1. Оптимальными условиями проведения электрофореза ГВ почв в ПААГ т ляются: 10% ПААГ, добавление 7М мочевины с 0.1% ДСН, фракционирован! около 80 мг ГВ (Сорг) на одном треке геля толщиной 2 мм с максимально во: можной при конкретных условиях теплоотвода напряженностью электрическо1 поля. Подвижность электрофоретических фракций ГВ возрастает с увеличение рН буферной системы. Боратный ион буферной системы стабилизирует суг> марный заряд поверхности ГВ. Молекулярные размеры электрофоретичсск! фракций ГВ уменьшаются при возрастании рН буферной системы и прогрев; нии препарата ГВ и/или ПААГ.

2. При электрофорезе ГВ разделяются на три основные электрофоретичсск! фракции низкой (Н), средней (М) и высокой (Ь) подвижности. Фракция 1 наиболее гетерогенна, содержит в своем составе температурно-нестабильш агрегаты ГВ и характерна для почв с гуматным типом гумуса. Фракция Л с держит ГВ, обладающие высокой способностью ассоциации, и проявляет! только в присутствии детергента ДСН в электрофоретической системе. ГК с держат полный набор электрофоретических фракций, ФК - только фракции и Ь.

3. Соотношение электрофоретических фракций ГВ различной подвижное специфично для разных почв. ГВ чернозема характеризуются преобладанш фракции М при низком соотношении Н:М, для ГВ дерново-подзолистой поч! характерны фракции Н и Ь, при равном соотношении Н:М. Для ГВ серой ле ной почвы выявлена зависимость соотношения электрофоретических фраки от типа биоценоза: под лугом и черным паром оно сближается с характерист ками ГВ чернозема, а под лесом - с таковыми ГВ дерново-подзолистой поче Соотношение электрофоретических фракций ГВ разновозрастных генетичес родственных погребенных почв различается и согласуется с групповым сосг вом гумуса.

4. Спектры флуоресценции указывают на сложность состава ГВ, влияние I дородных связей на структурно-молекулярную организацию ГВ и протека! реакций в возбужденном состоянии. Оптимальная концентрация ГВ для фл; ресцентного анализа составляет 12-24 мг Сор1./л.

5. Спектры синхронного сканирования флуоресценции (ССкФ) являю-наиболее информативными для характеристики ГВ почв различных экосист по сравнению со спектрами возбуждения и эмиссии флуоресценции. ССкФ и ФК характеризуются специфическими максимумами различной интена ности в области длин волн 410-500 и 300-400 нм, соответственно. Коэффицт

пгенсивности флуоресценции- - Киф (соотношение специфических максимумов -гуоресценции) коррелирует с групповым составом гумуса (Сгк/Сфк). 6. Электрофоретичёские' и флуоресцентные - характеристики- (соотношение-, М и показатель КИф) могут быть использованы для оценки влияния антропо-ннШх'воздействий' (внесение минеральных удобрений^- подкисление-почв). на . стояние ГВ почв различных экосистем.

Материалы диссертации отражены в публикациях:

1). Trubetskoj О.А., KJioimitova.T.E^Sliiibhova L,T. and Trubetskaja О.Е. 1991. Characterization soil humic substances by means of gel electrophoresis in presence of denaturating agents. Humus et inta. Prague. X- int.'Symp.:T8; ■ V4-;' ' ,V. */'"*"••'' n"' V' »T"* ~*яг'! —»-«">- ■

2). Shirshova L.T., Yermolayev A.M., Polubesova T.A., Khomutova Т.Е. 1991. Polydispersity of mic substances: the influence of ecological factors for grey forest soil and chernozem. Humus et inta. Prague. X Int. Symp.:87;

3). Shiishova L.T., Yermolayev A.M., Kliomutova Т.Е., Pachepski Y.A. 1992. Effect of grassing on :y forest soil humic substances: dynamics of fraction composition. Proc. 6 Int. Conf. of iHSS. Bari aly).: 243;

4). Хомутова Т.Э., Ширшова Л.Т., Трубецкой OA. 1992. Характеристика гумусовых веществ чв методом электрофореза в полиа»ф1Ь7амцдно.\Ггеде.'Известия РАН.' Серия-Биологическая 2: 300-303;

5). Трубецкой OA., Трубецкая О.Е., Хомутова Т.Э. 1992. Спектроскопическое исследование мусовых фракций, полученных фракционированием с помощью электрофореза в полиакри-мидном геле. Известия РАН: Серия Биологическая. N. 1: 134-137;

6). Trubetskoj О.А., Tmbetskaja О.Е., and Khomutova Т.Е. 1993. Isolation, purification, and some ysico-chemical properties of soil humic substances fractions obtained by polyacrylamide gel ictrophoicsis. Soil Biol. Biocliem. V.4, N. 9: 893-896;

•7): KlroiHutova-T.E0-Slursliova.L.T^I993..Electrophoi;etic study of soil humic substances. Proc. t. Conf. Pbys. Chem. and Mass-Exchange Proccesses in Soils. Pushchino ONTI NCBI (Ponizovski .) October, 12-16: 51-56;

8), KIioiuutova-T.E.,1993..Electroplioretic behaviorof humic substances in relation to the nditions of fractionation and sample treatment. Abstracts 4th Nordic Sympos. on Humic substances. >en, Norway, June, 7-9: 24;

9). Slurshova L.T., Kliomutova Т.Е. 1994. The. response of humic substances to soil acidification id freezing. Environment International, 20 (3): 405-410;

, 10): Shirehova- L.T.,- Yermolayev. A.M.,. Kliomutova T.E, . 1995. Application of cation-exchange sins for isolation-fractionation and characterization of soil huniic substances. Proc. Huniic" ibstances in Environment^New Challenges and Approaches, August, 27-September, 1, 1995, Janta, Georgia, USA: 51 ; '

11). Kliomutova, Т.Е., Shiishova L.T., Yermolayev A. M. 1996. Humic substances in grassing periment: electrophoretic and spectroscopic characterization. Abstracts 5-tli Nordic Symposium on ; umic substances, Sweden, Lund, 3-9 June, 1995 : 70.