Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экзополисахариды ксантомонад и клебсиелл: физико-химические, биологические свойства и перспективы применения

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Экзополисахариды ксантомонад и клебсиелл: физико-химические, биологические свойства и перспективы применения"

ЯНа правах рукописи

□03485747

Рысмухамбетова Гульсара Есенгильдиевна

ЭКЗОПОЛИСАХАРИДЫ КСАНТОМОНАД И КЛЕБСИЕЛЛ: ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ, БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ

03.00.07 - микробиология 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- з ДЕК 2009

САРАТОВ-2009

003485747

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова»

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Карпунина Лидия Владимировна кандидат биологических наук, доцент Бухарова Екатерина Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Тихомирова Елена Ивановна доктор биологических наук, профессор Бушов Александр Владимирович

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского»

Защита диссертации состоится «17» декабря 2009 г в 12.00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, Саратов, ул. Со-коловая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова».

Автореферат диссертации разослан 16 ноября 2009 г. и размещен на сайте: www.sgau.ru

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г.Саратов, Театральная пл., ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Полисахариды являются важнейшими компонентами клеток микроорганизмов. Многие физиологические, биохимические и иммунохимические особенности полисахаридов определяются их распределением в клетке: наружная и цитоплазматическая мембрана, цитоплазма, выделение в виде внеклеточных слизей в окружающую среду (экзополисахариды) (Захарова, 1982; Мальцева, 1981; Sutherland, 1979; Гринберг, 1992). Экзополисахариды (ЭПС) выполняют ряд важных биологических функций: защитную, резервную и др. В настоящее время экзополисахариды широко применяются во многих отраслях промышленности, благодаря своим уникальным свойствам -загущения, студнеобразования, эмульгирования, влагоудержания и стабилизации. В нашей стране в основном применяются полисахариды растительного происхождения - крахмал, пектин, агар. Индустриальные потребности в биополимерах данного класса все более возрастают. Полисахариды, полученные из микроорганизмов, обладают рядом преимуществ (климатическая независимость, простота и экономичность производства, регулирование свойств) и занимают все более лидирующие позиции. Поэтому во многих развитых странах производству полисахаридов микробного происхождения, а среди них и бактериальным, уделяют большое внимание. При получении ЭПС используют разные способы, как традиционные, так и принципиально новые. Сфера применения полисахаридов определяется с учетом их свойств, как функциональных - способность растворяться в воде, создавать высоковязкие растворы, студни, гели, так и биологических. В настоящее время получение и применение бактериальных полисахаридов очень развито за рубежом, выпускаются такие полисахариды как ксантан, геллан, курдлан и другие.

В нашей стране разные отрасли индустрии нуждаются в полисахаридах и их в большом количестве закупают в таких странах, как Великобритания, США, Франция и Китай. В силу этого изучение экзополисахаридов бактериального происхождения и разработка их получения имеет важное научное и практическое значение.

Цель работы - выделение ЭПС Xanthomonas campestris и Klebsiella pneumoniae, изучение их физико-химических и биологических свойств.

Задачи исследования:

1. Подобрать оптимальные условия культивирования (состав питательной среды, температура, время культивирования) для повышения продукции ЭПС X. сат-pestris В - 610, X. campestris В - 611 и К. pneumoniae К - 2 в лабораторных условиях.

2. Получить варианты X. campestris В - 610 с повышенной продукцией экзопо-лисахаридов.

3. Выделить и очистить экзополисахариды X. campestris В - 610/1, В - 610/4, В - 610/11, В - 610/16, В - 610/23 и К. pneumoniae К - 2 из культуральной жидкости.

4. Определить молекулярную массу, моносахаридный состав и вязкость растворов полученных экзополисахаридов X. campestris В - 610/1, В - 610/4, В- 610/11, В-610/16, В-610/23 и К. pneumoniae К -2.

5. Исследовать острую токсичность ЭПС ксаитомонад и клебсиелл методом биопроб на инфузориях и лабораторных животных (мыши, крысы, кролики).

6. Изучить влияние ЭПС ксаитомонад на качество хлебобулочных изделий и возможность создания пищевых пленочных покрытий на их основе.

Научная новизна

Впервые получены варианты X. campestris В - 610: X. campestris В - 610/1, В - 610/4, В - 610/11, В - 610/16, В - 610/23, продуцирующие в 3 - 3,5 раза больше экзополисахаридов, чем исходный штамм, изучены их молекулярная масса, моносахаридный состав и вязкость растворов.

Подобраны оптимальные условия культивирования Л', campestris В - 610 и его вариантов, X. campestris В - 611 и К. pneumoniae К - 2 для продуцирования ими максимального количества экзополисахаридов (время культивирования 44 - 50 ч, температура 27 "С, встряхивание на шуттсль-аппарате при 200 об/мин, в качестве источника углерода — сахароза).

На биотест - объектах (инфузории, лабораторные животные) показано отсутствие токсичности ЭПС X. campestris В —610/1, В — 610/4 и слабая токсичность ЭПС К. pneumoniae К - 2 в концентрации 0,05 % для инфузорий и в дозировках 0,06 - 3 г/кг живой массы для лабораторных животных.

Установлено, что добавление ЭПСХ campestris В - 610/1 в хлебобулочные изделия способствует улучшению их качества. Впервые показана возможность применения данного биополимера в качестве основы для пищевых пленочных покрытий.

Практическая значимость работы

Способность нетоксичных ЭПС ксантомонад улучшать органолептические и физико-химические показатели хлебобулочных изделий и создавать пищевые пленочные покрытия открывает перспективы их дальнейшего изучения для использования в пищевой промышленности.

По материалам диссертационной работы опубликованы «Методические рекомендации по выделению и очистке экзополисахаридов бактериального происхождения» (в соавторстве с Е.В. Полукаровым, Е.Н. Бухаровой, Д.А. Жемеричкиным, Л.В. Карпуниной) для студентов старших курсов, аспирантов, специалистов микробиологических, биотехнологических лабораторий, рекомендованные Учебно-методической комиссией и одобреные Ученым советом факультета ветеринарной медицины и биотехнологии Саратовского государственного аграрного университета им. Н.И. Вавилова (протокол Л® 58 от 23 июня 2009 г). Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по микробиологии, биотехнологии, проведении лабораторно-практических занятий и написании курсовых и дипломных работ в Саратовском государственном аграрном университете им. Н.И. Вавилова.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Полученные варианты X. campestris В-610: X. campestris В-610/1, В - 610/4, В --610/11, В - 610/16, В - 610/23 с повышенной продукцией ЭПС и ЭПС К. pneumoniae К - 2 имеют молекулярные массы в пределах 1'10б— 10-106 Да, вязкость растворов в пределах 160 - 490 мПа-с и 150 мПа с соответственно. ЭПС ксантомонад содержат в составе глюкозу, маннозу, галактуроновую кислоту, а ЭПС клебсиелл -маннозу, глюкозу, галактозу, глюкуроновую и галактуроновую кислоты, следы фуко-зы, арабинозы.

2. Оптимальными условиями культивирования ксантомонад и клебсиелл для большей продукции ЭПС являются: время культивирования 44 - 50 ч, температура 27 °С, встряхивание на шуттель-аппарате при 200 об/мин, среда с сахарозой.

3. ЭПС X. campestris В - 610/1, В - 610/4 не являются токсичными в концентрации 0,05 % для инфузорий и в дозировках 0,06 - 3 г/кг живой массы для лабораторных животных, а ЭПС К. pneumoniae К - 2 - слаботоксичен в тех же концентрациях.

4. Введение ЭПС X. сатрм1г1з В - 610/1 в хлебобулочные изделия улучшают органолептические и физико-химические показатели выпеченных изделий. ЭПС X. сатреяМз В - 610/1 могут являться основой для пищевых пленочных покрытий.

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова».

Апробация работы:

Материалы диссертации были представлены на: международной научной конференции «Пути повышения качества услуг общественного питания» (Саратов, Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова, 2005); научно-практических конференциях профес-сорско-реподавательского состава и аспирантов Саратовского ГАУ им. Н.И. Вавилова (Саратов, 2005; 2006; 2007); международных научно-практических конференциях «Вавиловские чтения - 2005, 2006, 2007» (Саратов, 2005; 2006; 2007); 10-й международной Путинской школе - конференции молодых ученых (Пущино, 2006); всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной патологии, физиологии, биотехнологии, селекции животных» (Саратов, 2007); 4 Московском международном конгрессе «Биотехнология: перспективы, состояние, развитие» (Москва, 2007); X международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2008); международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Москва, 2008); 5 Московском международном конгрессе «Биотехнология: перспективы, состояние, развитие» (Москва, 2009); конкурсе научных проектов молодых ученых Саратовского ГАУ им. Н.И. Вавилова "Инновационная наука - молодой взгляд в будущее" (Саратов, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 17 работ, из них 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, двух глав: обзора литературы и экспериментальной части, включающей объект и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 151 странице, содержит 15 таблиц и 22 рисунка. Список использованных литературных источников включает 290 наименований, в том числе 153 зарубежных.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Объект, материалы и методы исследований

В работе использовали культуры: Xanthomonas campestris В-610 и В - 611, полученные из коллекции культур микроорганизмов Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН и Klebsiella pneumoniae К - 2, полученная из коллекции микроорганизмов Саратовского государственного медицинского университета им. В.И. Разумовского.

Ксантомопады и клебсиеллы для продуцирования ЭПС выращивали на жидких и твердых питательных средах (Берджи, 1997): среда 1 - глюкоза или сахароза - 10 г, дрожжевой экстракт - 2 г, углекислый кальций - 3 г, агар - 20 г, дистиллированная вода - 1000 мл; среда 2 - триптон - 5 г, хлорид натрия - 5 г, дрожжевой экстракт -2,5 г, агар - 20 г, дистиллированная вода - 1000 мл, при встряхивании на шутгель -аппарате в течение трех суток при 200 об/мин и температуре 27 °С.

Для получения вариантов ксантомонад - продуцентов ЭПС 1 мл бактериальной взвеси X. campestris В - 610 в концентрации 510б кл/мл подвергли облучению в высокочастотном электромагнитном поле (Samsung CE101KR, Корея) с экспозицией от 1 до 14 с при постоянном увеличении мощности от 90 до 900 Вт для каждого изменения параметра времени (Глухова, 1988; Оганесян, 1985). Морфологию бактерий изучали, используя микроскопию и окрашивание по методу Грама (Розанов, 1952). Наличие капсул определяли по методам Ольта, Михина, Гисса (Розанов, 1952).

Выделение ЭПС проводили по методу (Захарова, 1982; Глухова, 1988) в нашей модификации. Количество полисахаридов в культуральной жидкости определяли с помощью фенол-серного метода (Dubois et al., 1956). Содержание белка определяли по методу М. Bradford (1976). Динамическую вязкость 1 % растворов экзополисаха-ридов определяли на ротационном вискозиметре Themo Haake Viskoteter R-7 (Нидерланды). Относительную вязкость - при помощи капиллярного вискозиметра Оствальда (Мет. указания..., 1995). Молекулярную массу выделенных экзополисахаридов определяли методом гель-хроматографии, используя гелевый носитель TSK 6000 G PWXL (Япония). ЭПС детектировали на автоматическом анализаторе 2690 Alliance Waters. Аналитическую колонку калибровали декстранами («Fluka», Швейцария) и коммерческим ксантаном (Родижель, Франция). Определение рН 1 % растворов экзополисахаридов проводили на рН-метре Mettler TOLEDO (Щвейцария). Химическую

природу ЭПС определили методом ионообменной хроматографии, используя анионо-обменный носитель DEAE - С Toyopearl 650 М (Захарова, 1982). Определение моно-сахаридного состава экзополисахаридов проводили методом тонкослойной хроматографии (Захарова, 1982) и с помощью жидкостного хроматографического углеводного анализатора1, используя колонку Carbopac PA (Dionex, США), хроматограф SMART LINE 5000 (KNAUER, Германия) и детектор DECADE II Anthec Leyden (Нидерланды). Анализ проводили в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя колонки (Dionex, США). Проверку ЭПС X. campestris В- 610/1, В - 610/4, В - 610/11, В - 610/16 и В - 610/23 на идентичность ксантану проводили по методу (European pharmacopoeia, 2004).

Токсичность ЭПС определяли согласно методам (Гос. фармокопея..., 1989; Мет. указания..., 2003; ГОСТ 13496.7 - 97) на инфузориях, полученных из Пензенской областной ветеринарной лаборатории и лабораторных животных: белых мышах, крысах и кроликах. Проведение эксперимента и подготовку ЭПС ксантомонад и клебси-елл проводили в соответствии с «Правилами производства и контроля качества лекарственных средств» (ГОСТ Р 52249 - 2004). Экспериментальные исследования выполнены в соответствии с требованиями Федерального закона от 01.01.1997 г. «О защите животных от жестокого обращения» и положениями Европейской конвенции по защите позвоночных животных (Страсбург, 18.03.1986 г.). Лабораторных животных содержали по общепринятым методикам (Башенина, 1975) и выдерживали карантин - 21 день. Вскрытие и патоморфологическую диагностику внутренних органов и тканей проводили согласно общепринятым методам (Меркулова, 1956; Карпуть, 1986; Мет. указания...,1999). Гистологические исследования проводили по методу Г.А. Меркулова (1956) и окрашивали гемотоксилином и эозином.

Количество и качество клейковины в муке определяли с помощью способа, рекомендованного ГОСТ 27839 - 88. Отбор проб для органолептических показателей и физико - химических исследований проводили по ГОСТ 5667 - 65. Влажность готовых булочных изделий определяли по ГОСТ 21094 - 95. Кислотность измеряли по ГОСТ 5670 - 96. Пористость измеряли с помощью пробника Журавлева по ГОСТ 5669 - 96. Пленочные покрытия создавали по методам (Пассаглиа, 1967; Бухарова, 2004).

1 Выражаем глубокую благодарность с.н.с., к.б.н. ИБФРМ РАН (г.Саратов) Селиванову Николаю Юльевнчу за практическую помогць при определении углеводного состава клебсилана.

Результаты экспериментов обрабатывали методами статистики с оценкой достоверности по критерию Стьюдента-Фишера (Боресков, 1975).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Выбор штамма и оптимальных условий культивирования X. campestris для продуцирования экзополисахаридов

При выращивании X. campestris В-610иВ-611 на среде 1, содержащей в качестве источника углерода глюкозу или сахарозу, при встряхивании на шуттель-аппарате при 130 об/мин, количество ЭПС X. campestris В - 610 превышало продукцию ЭПС X. campestris В-611 в 2,7 и 2,1 раза соответственно. В связи с этим в дальнейшей работе для выделения ЭПС был использован штамм X. campestris В - 610, а в качестве источника углерода для выращивания бактерий была взята сахароза (табл. 1).

Таблица 1 - Продукция экзополисахаридов X. campestris

Штаммы X. campestris Количество ЭПС, г/л

глюкоза сахароза

М±т М±т

В-610 2,50 ±0,27 2,70 ±0,10

В-611 0,93 ±0,09 1,30 ±0,23

Выделение ЭПС ксантомонад проводили по методу (Захарова, 1982; Глухова, 1988) в нашей модификации. Для этого культуральную жидкость, полученную после выращивания бактерий в течение 3 суток, разбавляли дистиллированной водой в 3 раза, интенсивно перемешивали при нагревании до 50 °С в течение 1 часа для смыва ЭПС с клеток. Затем центрифугировали при 2000 g в течение 20 минут для удаления клеток и надосадочную жидкость концентрировали методом упаривания при 50 - 60 °С до 1/2 объема от первоначального. ЭПС осаждали из раствора тремя объемами этанола, сушили при температуре 25 - 30 °С и измельчали на мельнице до частиц не более 0,5 мм. Полученные после выделения ЭПС ксантомонад представляли собой порошки белого цвета. Все порошки не имели запаха, не содержали белок и клеток продуцента. Растворы очищенных ЭПС были бесцветны.

На процесс выхода ЭПС существенное влияние оказывало и встряхивание культуралыюй жидкости X. сатре$Нч5 В - 610 на шуттель-аппарате. При встряхивании при 200 об/мин продукция ЭПС X. сатре$(гм В-610 повышалась с 2,70

до 5,99 г/л. Дальнейшее культивирование ксантомонад проводили при перемешивании 200 об/мин.

Как видно из кривой роста Л'. сатревШэ В - 610 (рис. 1), продукция ЭПС достигала максимума к 32 ч и практически не изменялась до 66 ч.

Рис. 1. Кривая роста (—425 нм) и продукции ЭПС (■+• 490 нм) X. campestris В-610

Получение вариантов X. campestris В-610 с высокой продукцией ЭПС

С помощью облучения в высокочастотном электромагнитном поле при разных режимах воздействия на клетки X. campestris В — 610 — 1, 3, 5 с и 90 — 180 Вт, были получены варианты, продуцирующие ЭПС различной вязкости и условно обозначенные как: X.campestris В - 610/1 (3 с, 90 Вт), В - 610/4 (1 с, 180 Вт), В - 610/11 (5 с, 720 Вт), В - 610/16 (9 с, 720 Вт), В -610/23 (двукратное облучение при 9 с, 720 Вт). Отбор клеток проводили визуально по признаку изменения морфологии колоний и их повышенной ослизненности.

Культуру X. campestris В - 610 и полученные варианты X. campestris В - 610/1, В - 610/4, В - 610/11, В - 610/16 и В - 610/23 далее выращивали при разных температурных режимах: 1 - двое суток при 27 °С; 2 - одни сутки при 27 °С и сутки при 5 °С; 3 - одни сутки при 5 °С и сутки при 27 °С. При этом было замечено, что рост и слизистость колоний были лучшими у исходной культуры при первом режиме выращивания, а для вариантов X. campestris В-610/1, В-610/4, В-610/11, В-610/16 и В-610/23-при третьем. Количество ЭПС, как видно из таблицы 2, у X. campestris В - 610 составило 5,8 г/и, а для вариантов ксантомонад в пределах 8,96 - 9,40 г/л. Выделенные ЭПС X. campestris В - 610/1, В - 610/4, В - 610/11, В - 610/16 и В - 610/23 были условно нами названы ксантомонанами 610/1, 610/4, 610/11, 610/16, 610/23.

X. campestris Режим выращивания Продукция ЭПС, г/л

М±т

В-610 1 2 3 5,80±0,18 4,20±0,14 4,80±0,13

В - 610/1 1 2 3 3,80±0,12 6,00±0,11 9,17±0,34

В-610/4 1 2 3 6,38±0,35 4,20±0,21 9,29±0,45

В-610/11 1 2 3 8,30±0,43 5,50±0,32 9,24±0,52

В-610/16 1 2 3 6,90±0,35 5,30±0,29 9,40±0,42

В-610/23 3 8,96±0,68

Примечание: 1 - двое суток при 27 °С; 2 - одни сутки при 27 "С и сутки при 5 "С; 3 - одни сутки при 5 "С и сутки при 27 °С.

Подбор оптимальных условий выращивания Klebsiella pneumoniae К - 2 для продуцирования экзонолнсахаридов

Для определения оптимальной температуры биосинтеза ЭПС культуру К. pneumoniae К - 2 выращивали на твердой питательной среде 2 при различных температурах: 25 °С, 27 °С, 36 °С. Было замечено, что при температуре 27 °С на чашках Петри вырастали более слизистые колонии, чем при температурах 25 0 и 36 °С. Известно, что повышешш скорости перемешивания оказывает существенное влияние на продукцию ЭПС бактерий. Экспериментально было установлено, что при выращивании клебсиелл на среде 2 при скорости перемешивания культуральной жидкости 150 и 200 об/мин на шуттсль-аппарате продукция ЭПС на среде с глюкозой составила 1,8 и 3,1 г/л; на среде с сахарозой - 2,2 и 3,8 г/л соответственно. В дальнейшем для получения ЭПС К. pneumoniae К - 2 использовали скорость перемешивания 200 об/мин. Выделение ЭПС клебсиелл проводили по методу выделения ксантомонад, как было описано нами выше. ЭПС К. pneumoniae К - 2 был назван нами клебсилан. Продукцию клебсилана сравнивали, выращивая бактерии на среде 2 и среде 1, подобранную нами для получения ЭПС ксантомонад, как было описано выше. Как видно из таблицы 3, при выращивании клебсиелл на среде 2, как с сахарозой, так и глюкозой в разных концентрациях, продукция ЭПС была значительно меньше в 2,7 - 4, 4 раза, чем на среде 1.

Таблица 3 - Влияние состава среды на продукцию клебсилана

Среды Продукция экзополисахаридов, г/л

М±ш

Среда 2 Сахароза 0,5 % 3,60 ±0,13

1 % 3,80 ±0,17

Глюкоза 0,5 % 2,20 ±0,10

1 % 2,20 ±0,01

Среда 1 9,70 ± 0,72

Как видно из кривой роста (рис. 2), максимальная продукция клебсилана на среде 1 приходится на 44 - 50 ч.

О Ы % <V sb rj. rfr ^ # ¿ь ^

время, ч

Рис. 2. Кривая роста (— 425 нм) и продукции ЭПС (-♦-490 нм) К. pneumoniae К - 2

Определение химической природы ЭПС ксантомонад и клебсиелл

Определение химической природы ЭПСХ са/ирея/га В - 610 и его вариантов: ксантомонанов 610/1, 610/4, 610/11, 610/16, 610/23 и клебсилана проводили методом ионообменной хроматографии. Как видно из рисунка 3, ЭПС ксантомонад состоят из разных фракций: X. сатрез1г15 В - 610 - из 1 нейтральной и 1 кислой фракций; ксан-томонан 610/1 - 1 нейтральной; ксантомонан 610/4 - 2 нейтральных и 1 кислой; ксан-томонан 610/11 - 1 нейтральной и 2 кислых; ксантомонан 610/16 - 1 кислой; ксантомонан 610/23 - 1 нейтральной и 1 кислой. Клебсилан представлен только 1 нейтральной фракцией.

Физико-химические свойства и моносахариднын состав экзополисахаридов ксантомонад и клебсиелл

Для определения молекулярной массы ЭПС изучаемых бактерий использовали гель-хроматографию 26 90 Alliance, Photogiode array Detector 996 и Waters Refractive Index Detector 2414. Было установлено, что молекулярная масса всех ЭПС ксантомонад и клебсиелл составила 1-Ю6 - 10-Ю6 Да (рис. 4).

в „

объем, мл

в)

Рис. 3. Профили элюции ЭПС X. сатрезЫв В - 610 (а); ксантомо-нана 610/1 (б); ксантомонана 610/4 (в); ксантомонана 610/11 (г); ксантомонана 610/16 (д); ксантомонана 610/23 (е); клебсилана (ж) при ионообменной хроматографии на колонке Г)НЛН - С ТоуореаН 650 М (детекция по углеводам)

1М №С1

ооъем, мл

объем, мл

ж)

Динамическая вязкость 1 % растворов ЭПС X. сатрез&я В - 610 и его вариантов: ксантомонана 610/1, 610/4, 610/11, 610/16 и 610/23, определяемая с помощью ротационного вискозиметра, была различна и составляла 270, 160, 490,480,340 и 480 мПа-с соответственно. Значения рН растворов ЭПС всех исследованных бактерий были в пределах 7,4 - 7,53. Добавление хлорида калия в количестве 1 г на 100 мл 1% раствора ЭПС ксантомонад понижала их вязкость на 30 - 40 %, дальнейшее увеличение хлорида калия до 2 г уже не влияло на значение динамической вязкости.

Растворы ЭПС К. pneumoniae К - 2 (1 %) обладали динамической вязкостью 150 мПа-с и значением pH 7,5.

Рис.8. Хроматограммы определения молекулярных масс ксантомонанов и клебсилана на колонке с TSK 6000G PWXL. Буфер 0,1 М NaNOj, 0,04 % NaN3. Скорость элюции 0,5 мл/мин

Примечание: а - время выхода декстрана М.м. 2-106 Да - 11,670 мин; б - время выхода декстранаМ.м. ИОкДа-13,115 мин; в-ксантана марки Родижель (Франция) М.м. 2-Ю6-10106 Да-14,807 мин; г- клебсилана - 16,140 мин;д-ксан-томонана 610/4 -15,125 мин; е - ксантомонана 610/1 -(4,390 мин; ж - ксантомона-на 610/16 - 14,110 мин; з - ксантомонана 610/23 -14,090 мин; и - ксантомонана 610/11 - 14,597 мин.

Определение моносахаридного состава ЭПС проводили методом тонкослойной хроматографии и с помощью жидкостного хроматографического углеводного анализатора (Dionex). Оказалось, что в состав всех ЭПС ксантомонад входят манноза, глюкоза и галактуроковая кислота (рис. 5), а ЭПС К. pneumoniae К - 2 (клебсилан) состоит из маннозы, глюкозы, галактозы, галактуроновой и глюкуроновой кислот и следы фукозы, арабинозы (рис. 6, 7, 8).

галакту-роновая кислота

фукоза

рибоза

глюкоза

манноза

Рис. 5. Определение моносаха-ридного состава ЭПС ксанто-монад методом тонкослойной хроматографии

Примечание: 1. 2,9 - углеводы-свидетели, 3 - ЭПС X. сат-ре$1п.<; В - 610, 4 - ксантомонан 610/1, 5 -ксантомонан 610/4; 6 - ксантомонан 610/11; 7 -ксантоманан В - 610/16, 8 -ксантомонан 610/23.

глюкуроно-3.6 - лактон ■

рамноза " манноза

МИНН

галактуроновая кислота

Рис. 6. Определение моносаха-ридного состава клебсилана методом тонкослойной хроматографии

Примечание: 1,4- углеводы -свидетели; 2, 3 - клебсилан.

> £

> Е

-11

время, мин

Рис. 7. Хроматограмма выхода фукозы (1), арабинозы (2), галактозы (3), глюкозы (4), маннозы (5) на колонке СагЬорас РА (Оюпех, США).

Буфер 20 шМ ЫаОН. Скорость элюции 0,7 мл/мин

Рис. 8. Хроматограмма определения моносахаридного состава клебсилана Примечание: 1 - фукоза; 2 - арабиноза; 3 - галактоза; 4 - глюкоза; 5 - манноза

Изучение биологических свойств ксантомонанов и клебсилана

Определение токсичности ксантомонанов и клебсилана методом биопроб на инфузориях Определение токсичности ксантомонанов 610/1, 610/4, 610/11, 610/16, 610/23 и клебсилана проводили по стандартному ускоренному методу биопробой (ГОСТ 13496.7-97) на инфузории колподы (Colpoda steinii) и инфузории туфельки {Paramecium caudatum) (Метод, указания..., 2003). Метод основан на воздействии препаратов на культуру инфузорий и наблюдении за их подвижностью и жизнеспособностью. При добавлении к взвеси инфузорий 0,05 % водного раствора ксантомонана 610/1 через 30 с движение инфузорий замедлялось, они практически не двигались или вращались вокруг своей оси (возможно, это было связано с механическими трудностями из-за высокой вязкости раствора). Жизнеспособность инфузорий сохранялась. Сходное воздействие на инфузории оказали и препараты ксантомонанов 610/4, 610/11, 610/16 и 610/23 в этой же концентрации, однако движение инфузорий было еще более замедлено, так как растворы этик препаратов обладали еще большей вязкостью, чем ксантомонан 610/1. При введении препарата клебсилана к взвеси инфузорий через 30 с происходило нарушение координации их движения, они двигались хаотично, однако через 3 мин движение инфузорий приходило в норму и в дальнейшем поведение инфузорий не отличалось от описанного выше. В ходе исследований было нами отмечено, что инфузории не изменялись в размере, сохраняли свою форму и физиологические характеристики. Таким образом, так как гибели инфузорий по истечении 3 ч не происходило, и они сохраняли свою подвижность, все исследуемые ксантомонаны, согласно ГОСТ Р 13496.7 - 97, можно отнести к нетоксичным веществам, а клебсилан - к слаботоксичным.

Влияние ЭПС на организм лабораторных животных при пероральном введении

и на несении на кожу Было изучено влияние ксантомонанов 610/1, 610/4 и клебсилана на организм лабораторных животных (мыши, крысы, кролики) согласно стандартам (Гос. фармакопея..., 1989; Метод, указания..., 2003; ГОСТ 13496.7 - 97) в дозировках 0,06 г и 3 г/1 кг массы тела. В опыте участвовало 40 белых мышей - самцов, 20 белых крыс -самцов, 24 кролика - самца. Животные были разбиты соответственно на 4 группы:

1 группа — контрольная, 2 группа получала клебсилан, 3 группа - ксантомонан 610/1 и 4 группа - ксантомонан 610/4. ЭПС разводили в физиологическом растворе и вводили натощак перорально через катетер мышам в количестве 1 мл в дозировке 3 г/1 кг массы тела; крысам - 2 мл в дозировке 0,06 г/1 кг массы тела; контрольной группе вводили физиологический раствор в том же количестве каждой группе животных соответственно. Кроликам однократно натощак давали препарат ЭПС, разведенный в воде в дозировке 0,06 г на 1кг живой массы (100 мл), а контрольной группе в том же количестве давали воду. Наблюдения за лабораторными мышами и крысами проводили в течение 3 суток, за кроликами 14 суток. По окончании периода наблюдений всех животных контрольной и опытных групп подвергли эвтаназии, проводили вскрытие и оценку состояния внутренних органов, системы пищеварения. Гибели экспериментальных животных ни в одной группе отмечено не было. Были отмечены отклонения в поведении в группе животных, получивших клебсилан: повышенная жажда, беспокойство. Поведение других опытных животных не отличалось от поведения животных контрольной группы. У животных, получавших дозировку 0,06 г/1 кг массы тела ксанто-монана 610/1 и 610/4, не было отмечено отклонений в функциональном состоянии организма, клинических симптомах, макроскопических и патологических изменений органов и тканей от состояния животных контрольной группы, что позволяет сделать вывод о нетоксичности препарата. У животных, которым вводили клебсилан, отмечались изменения в состоянии внутренних органов (селезенка и почки были увеличены, в кишечнике наблюдали скопление газов), что позволяет отнести данный препарат к слаботоксичным. Гистоморфологическая картина внутренних органов животных, получавших ксантомонаны, сохранена; каких-либо изменений в структуре исследуемых органов не наблюдалось. Гистоморфологическая картина внутренних органов животных, получавших клебсилан, была несколько изменена, наблюдалась десквамация эпителия слоистых органов, а также нарушения в паренхимных органах.

При изучении кожно-раздражающего действия исследуемые вещества: ксантомонаны 610/1, 610/4 и клебсилан в виде мази на глицериновой основе наносили на депилированный участок кожи кроликов, в качестве контроля - чистый глицерин. Наблюдения за состоянием кожи кроликов проводили в течение 36 дней. Было отмечено, что мази на основе ксантомопанов 610/1 и 610/4 в их составе не вызывали покраснения кожи и не затормаживали рост волос по сравнению с контролем. Рост во-

лос у кроликов на участке кожи с ксантомонаном 610/1 был отмечен через 6 дней, с ксантомонаном 610/4 - 8 дней. В то же время мазь с клебсиланом вызывала покраснение кожи, которое проходило через 2 часа, и замедление роста волос на 34 дня. Согласно ГОСТ 13496.7 - 97, токсичность исследуемых препаратов определяют по наличию воспалительного процесса на участке нанесения мази. Ксантомонаны 610/1 и 610/4 считаются нетоксичными из-за отсутствия воспалительных реакций, а клебси-лан - слаботоксичным из-за их наличия.

Изучение влшшия бактериальных экзополисахарндов па качество хлебобулочных изделий и создание пищевых пленочных покрытий на их основе

Известно, что добавление бактериальных полисахаридов в тесто в количестве 0,05 - 0,5 % к массе муки улучшает его физические характеристики: увеличивает во-допоглотительную способность, повышает формоустойчивоеть, улучшает газоудер-живаюхцие свойства (Morris, 2005; Самохвалова, 1990; Бухарова, 2004). Проведены исследования по изучению влияния ксантомонанов 610/1 и 610/16 на качество хлебобулочных изделий на примере булочки «Октябренок». Ксантомонаны добавляли не-пос-редственно в муку в сухом виде в разных концентрациях 0,2; 0,3 и 0,45 % к массе муки. Для сравнения качества хлебобулочных изделий в опытные образцы наряду с ксантомонанами добавляли коммерческий ксантан Родижель (Франция) и хлебо-улучшитель «Пышка» в количестве 0,3 % к массе муки.

Было отмечено, что консистенция теста образцов с добавлением «Пышки» была более плотная и жесткая, чем у булочек с ксантомонанами и ксантаном, у которых консистенция нежная, пористая структура ровная, без крупных разрывов. Добавление ксантомонана 610/1 и ксантана способствовало приданию более круглой формы всем выпеченным изделиям, а образцы с добавлением ксантомонана 610/16 имели неровную поверхность. Булочки с добавлением ксантомонанов и ксантана обладали более ярким, выраженным ароматом сдобы (особенно с добавлением ксантомонана 610/1), с «Пышкой» - аромат сдобы был не выражен. Булочки, с добавленными ЭПС при нажатии на них восстанавливались быстрее, чем образцы контрольные и с «Пышкой». При сравнении изделий разрез у булочек с ксантомонанами был ровный, в то время как, у булочек с ксантаном - шероховатый. При органолептической оценке отметили,

что при добавлении к образцам ксантомонанов и кеантана на поверхности появлялся глянец, у остальных образцов этого не отмечалось. Установлено, что булочные изделия с добавленными ксантомонанами обладали лучшими физико-химическими показателями (пористость, объем, кислотность) по сравнению с контрольными образцами. Добавление ксантомонанов существенно не повлияло на влажность выпеченных изделий и не превышало установленную ГОСТом величину (не более 39 %). Было также замечено, что введение ксантомонана 610/1 в булочки из муки со слабой клейковиной улучшало структуру их пористости и состояние мякиша (сжимаемость), делая его более эластичным н упругим. На основании оценки органолептических и физико-химических показателей хлебобулочных изделий показано, что ксантомонан 610/1 в количестве 0,45 % к массе муки улучшает их качество.

Кроме того, экспериментально было показано, что ксантомонан 610/1 можно использовать и для изготовления пищевых пленочных покрытий. Было обнаружено, что пленки, созданные на основе этого ЭПС (0,05 %), имели эластичную, гладкую поверхность, легко и равномерно наносились на булочки «Октябренок» и были неотделимы от поверхности булочек. Результаты проведенных исследований показывают целесообразность изучения возможности применения ЭПС ксантомонад в пищевой промышленности.

Выводы

1. Подобраны оптимальные условия культивирования X. campestris В -610, X. campestris В - 611 и К. pneumoniae К - 2 (время культивирования 44 - 50 ч, температура 27 °С, встряхивание на шуттель-аппарате при 200 об/мин, в качестве источника углерода - сахароза) для повышения продукции ЭПС.

2. Получены варианты X. campestris В - 610: X. campestris В - 610/ 1,В — 610/4, В - 610/11, В - 610/16, В - 610/23, производящие ЭПС в большем количестве, чем исходный штамм, отличающиеся по физико-химическим и биологическим свойствам.

3. Показано, что полученные ЭПС ксантомонад имеют молекулярные массы в пределах МО6- 10-106 Да и вязкость растворов в пределах 160 - 490 мПа-с, содержат в составе глюкозу, маннозу, галактуроновую кислоту. ЭПС К. pneumoniae К - 2 имеют молекулярную массу МО6 - 10-106 Да, вязкость растворов 150 мПа с, содержат в составе маннозу, глюкозу, галактозу, глюкуроновую и галактуроновую кислоты и следы фукозы, арабинозы.

4. Установлено что ЭПС X. campestris В - 610/1, В - 610/4 не являются токсичными в концентрации 0,05 % для инфузорий и в дозировках 0,06 - 3 г/кг живой массы для лабораторных животных. ЭПС К. pneumoniae К - 2 слаботоксичен в тех же концентрациях.

5. Показано, что добавление ЭПС X. campestris В - 610/1 в хлебобулочные изделия способствует улучшению их качества. Впервые показана возможность применения ЭПСХ. campestris В -610/1 в качестве основы пищевых пленочных покрытий.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Бухарова, Е.Н. Использование микробного полисахарида ксантана в общественном питании / Е.Н. Бухарова, Г.Е. Рысмухамбетова, JI.B. Карпунина // Актуальные проблемы современной науки: Тр. 1-го Международного форума (6-й Международной конференции) молодых ученых и студентов. Естественные науки. Химия. Нефтехимия. Химическая технология. Технология продуктов питания, 12 - 15 сентября 2005. - Самара, 2005. - Ч. 11. - С. 97-99.

2. Рысмухамбетова, Г.Е. Использование экзополисахарида микробной природы в диетическом питании / Г.Е. Рысмухамбетова, Е.Н. Бухарова, JI.B. Карпунина // Актуальные проблемы современной науки: Тр. 1-го Международного форума (6-й Международной конференции) молодых ученых и студентов. Естествегагые науки. Химия. Нефтехимия. Химическая технология. Технология продуктов питания, 12-15 сентября 2005,-Самара, 2005.-Ч. 11.-С. 114-116.

3. Рысмухамбетова, Г.Е. Выделение полисахарида из штаммов Xanthomonas campestris/ Г.Е. Рысмухамбетова, Е.Н. Бухарова, Л.В. Карпунина //Вавиловские чтения -2005: Материалы конференции, 23 - 25 ноября 2005. - Саратов, 2005. - С. 88-90.

4. Рысмухамбетова, Г.Е. Исследование продукции экзополисахаридов Xanthomonas campestris / Г.Е. Рысмухамбетова, Е.Н. Бухарова, JI.B. Карпунина // Пути повышения качества услуг общественного питания: Тезисы докладов Международной научной конференции, 23 - 24 декабря 2005. - Саратов, 2005. - С. 78-80.

5. Рысмухамбетова, Г.Е. Влияние различных факторов на продукцию экзополисахаридов культурой Xanthomonas campestris / Г.Е. Рысмухамбетова, Е.Н. Бухарова, JI.B. Карпунина // Биология - наука XXI века: Тезисы 10-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых, посвященная 50 - летию

Путинского научного центра РАН, 17-21 апреля 2006. - Пущино, 2006. - С. 392.

6. Рысмухамбетова, Г.Е. Получение полисахаридов из Klebsiella pneumoniae / Г.Е. Рысмухамбетова, И.А. Штыркова, E.H. Бухарова, JLB. Карпунина // Вавиловские чтения - 2006: Материалы конференции, посвященной 119-й годовщине со дня рождения академика Н.И. Вавилова, 4-8 декабря 2006. - Саратов, 2006. - С. 85-86.

7. Суркова, H.A. Использование микробных полисахаридов в блюдах диетического питания / H.A. Суркова, Г.Е. Рысмухамбетова, E.H. Бухарова, JI.B. Карпунина // Технология и продукты здорового питания: Материалы конференции, 28 - 29 мая 2007. - Саратов: Научная книга, 2007 - С. 114-116.

8. Рысмухамбетова, Г.Е. Экзополисахариды бактериального происхождения / Г.Е. Рысмухамбетова, E.H. Бухарова, J1.B. Карпунина // Актуальные проблемы ветеринарной патологии, физиологии, биотехнологии, селекции животных: Материалы всероссийской научно-практической конференции, 29 января - 2 февраля 2007. - Саратов, 2007. - С. 65-66.

9. Бухарова, E.H. Применение бактериальных экзополисахаридов при производстве продуктов питания / E.H. Бухарова, Г.Е. Рысмухамбетова, Е.В. Полукаров, J1.B. Карпунина // Биотехнология: перспективы, состояние, развитие: Материалы 4 международного конгресса, 12-16 марта 2007. - М., 2007 - С. 158.

10. Рысмухамбетова, Г.Е. Определение токсичности экзополисахаридов биопробой на инфузории колподы ! Г.Е. Рысмухамбетова, E.H. Бухарова, И.В. Суровцова, JI.B. Карпунина // Вавиловские чтения - 2007: Материалы конференции, посвященной 120-й годовщине со дня рождения академика Н.И. Вавилова, 26 - 30 ноября 2007. -Саратов, 2007. - С. 337.

11. Рысмухамбетова, Г.Е. Влияние бактериальных экзополисахаридов на качество булочных изделий / Г.Е. Рысмухамбетова, Е.В. Полукаров, H.A. Невесенко, Н.С. Ко-раблева, Н.Р. Суровцева, E.H. Бухарова, JI.B. Карпунина // Биотехнология. Вода и пищевые продукты: Материалы международной научно-практической конференции, 11-13 марта 2008. - M., 2008 - С, 163.

12. Кораблева, Н.С. Применение микробных полисахаридов в питании / Н.С. Кораб-лева, E.H. Бухарова, Г.Е. Рысмухамбетова, Л.В. Карпунина, O.A. Васюкович // Пищевые технологии и биотехнологии: Сборник тезисов докладов IX Международной конференции молодых ученых, 3-5 июня 2008. - Казань, 2008. -С. 291.

13. Кулешова, Ю.В Создание пищевых пленочных покрытий из полисахаридов микробного происхождения / Ю.В. Кулешова, О.Ю. Швецова, Е.Н. Бухарова, Г.Е. Рысму-хамбетова, Н.А. Невесенко, JI.B. Карпунина // Пищевые технологии и биотехнологии: Сборник тезисов докладов IX Международной конференции молодых ученых, 3-5 июня 2008. - Казань, 2008. - С. 332.

14.* Рысмухамбетова, Г.Е. Выделение и очистка экзополисахаридов из ксантомонад / Г.Е. Рысмухамбетова, JI.B. Карпунина, Е.Н. Бухарова, Д.А. Жемеричкин // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. - 2008. - № 4. - С. 42 - 45.

15. Кичемазова, Н.В. Изучение физико-химических и биологических свойств экзопо-лисахарида Klebsiella pneumoniae / Н.В. Кичемазова, Г.Е. Рысмухамбетова, JI.B. Карпунина // Материалы конференции по итогам научно-исследовательской и производственной работы студентов за 2008 год: Сборник научных статей, 6-10 апреля 2009. - Саратов, 2009. - С. 9-10.

16. Бухарова, Е.Н. Применение различных полисахаридов как улучшителей дрожжевого и заварного теста / Е.Н. Бухарова, Е.В. Полукаров, О.Ю. Швецова, А.Д. Москалева, Г.Е. Рысмухамбетова, Л.В. Карпунина // Биотехнология: перспективы, состояние, развитие: Материалы 5 международного конгресса, 16-20 марта 2009. -М., 2009.-С. 56.

17. Бухарова, Е.Н. Пищевые пленочные покрытия // Е.Н. Бухарова, Г.Е. Рысмухамбетова, Ю.В. Кулешова, И.А. Бухарова, А.В. Банникова, Л.В. Карпунина// Биотехнология: перспективы, состояние, развитие: Материалы 5 международного конгресса, 16-20 марта 2009. - М., 2009 - С. 55.

Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Подписано в печать 12.11.2009. Гарнитура Times. Печать Riso. Усл. печ. л. 1,00. Тираж 100 экз. Заказ 464.

Отпечатано с готового оригинал-макета в ООО «Мона Лиза» 410019, г. Саратов, ул. Крайняя, 129 тел. (8452) 64-93-23

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рысмухамбетова, Гульсара Есенгильдиевна

Введение.

1. Литературный обзор.

1.1. Полисахариды: классификация, общая характеристика, применение.

1.1.1. Полисахариды растений.

1.1.2. Полисахариды животных.

1.1.3. Экзополисахариды микроорганизмов.

1.2. Функции экзополисахаридов микроорганизмов.

2. Экспериментальная часть.

2.1. Объект, материалы и методы исследований.

2.1.1. Объект исследований.

2.1.2. Среды и условия культивирования.

2.1.3. Получение вариантов Xanthomonas campestris В по продукции экзополисахаридов.

2.1.4. Общие микробиологические методы.

2.1.5. Выделение и очистка экзополисахаридов.

2.1.6. Методы определения физико-химических свойств экзополисахаридов.

2.1.7. Определение биологических свойств экзополисахаридов.

2.1.8. Методы определения качества продуктов питания.

2.1.9. Методы создания пленочных покрытий и нанесение их на поверхность продуктов питания.

2.1.10. Методы статистической обработки результатов.

2.2. Результаты исследований и их обсуждение.

2.2.1. Выбор штамма и оптимальных условий культивирования

X. campestris для продуцирования экзополисахаридов.

2.2.2. Подбор оптимальных условий для выращивания Klebsiella pneumoniae К - 2 для продуцирования экзополисахаридов.

2.2.3. Физико-химические свойства и моносахаридный состав экзополисахаридов ксантомонад и клебсиелл.

2.2.4. Изучение биологических свойств экзополисахаридов

X. campestris В — 610/1, В — 610/4 и A*, pneumoniae К -2.

2.2.5. Изучение влияния бактериальных экзополисахаридов на качество хлебобулочных изделий и создание пищевых пленочных покрытий на их основе.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экзополисахариды ксантомонад и клебсиелл: физико-химические, биологические свойства и перспективы применения"

Полисахариды являются важнейшими компонентами клеток микроорганизмов. Многие физиологические, биохимические и иммунохимические особенности полисахаридов определяются их распределением в клетке: наружная и цитоплазматическая мембрана, цитоплазма, выделение в виде внеклеточных слизей в окружающую среду (экзополисахариды) [45, 57, 76, 273]. Экзополисахариды (ЭПС) выполняют ряд важных биологических функций: защитную, резервную и др. С другой стороны, в настоящее время экзополисахариды широко применяются во многих отраслях промышленности, благодаря своим уникальным свойствам - загущения, студнеобразования, эмульгирования, влагоудержания и стабилизации. В нашей стране в основном применяются полисахариды растительного происхождения - крахмал, пектин, агар. Индустриальные потребности в биополимерах данного класса все более возрастают. Полисахариды, полученные из микроорганизмов, обладают рядом преимуществ (климатическая независимость, простота и экономичность производства, регулирование свойств) и занимают все более лидирующие позиции. Поэтому во многих развитых странах производству полисахаридов микробного происхождения, а среди них и бактериальным, уделяют большое внимание. При получении ЭПС используют разные способы, как традиционные, так и принципиально новые. Сфера применения полисахаридов определяется с учетом их свойств, как функциональных - способность растворяться в воде, создавать высоковязкие растворы, студни, гели, так и биологических. В настоящее время получение и применение бактериальных полисахаридов очень развито за рубежом, выпускаются такие полисахариды как ксантан, геллан, курдлан и другие.

В нашей стране разные отрасли индустрии нуждаются в полисахаридах и их в большом количестве закупают в таких странах, как Великобритания, США, Франция и Китай. В силу этого изучение экзополисахаридов бактериального происхождения и разработка их получения имеет важное теоретическое и практическое значение.

Цель работы — выделение ЭПС Xanthomonas campestris и Klebsiella pneumoniae, изучение их физико-химических и биологических свойств.

Задачи исследования:

1. Подобрать оптимальные условия культивирования (состав питательной среды, температура, время культивирования) для повышения продукции ЭПС X. campestris В — 610, X. campestris В - 611 и К. pneumoniae К — 2 в лабораторных условиях.

2. Получить варианты X. campestris В - 610 с повышенной продукцией экзополисахаридов.

3. Выделить и очистить экзополисахариды X. campestris В-610/1, В - 610/4, В - 610/11, В - 610/16, В - 610/23 и К. pneumoniae К - 2 из культу-ральной жидкости.

4. Определить молекулярную массу, моносахаридный состав и вязкость растворов полученных экзополисахаридов X. campestris В - 610/1, В - 610/4, В - 610/11, В - 610/16, В - 610/23 и К. pneumoniae К - 2.

5. Исследовать острую токсичность ЭПС ксантомонад и клебсиелл методом биопроб на инфузориях и лабораторных животных (мыши, крысы, кролики).

6. Изучить влияние ЭПС ксантомонад на качество хлебобулочных изделий и возможность создания пищевых пленочных покрытий на их основе.

Научная новизна

Впервые получены варианты X. campestris В — 610: X campestris В-610/1, В-610/4, В-610/11, В -610/16, В-610/23, продуцирующие в 3-3,5 раза больше экзополисахаридов, чем исходный штамм, изучены их молекулярная масса, моносахаридный состав и вязкость растворов.

Подобраны оптимальные условия культивирования X. campestris

В — 610 и его вариантов, X. campestris В - 611 и К. pneumoniae К — 2 для продуцирования ими максимального количества экзополисахаридов (время культивирования 44 - 50 ч, температура 27 °С, встряхивание на шут-тель — аппарате при 200 об/мин, в качестве источника углерода — сахароза).

На биотест - объектах (инфузории, лабораторные животные) показано отсутствие токсичности ЭПС X. campestris В-610/1,В — 610/4 и слабая токсичность ЭПС К. pneumoniae К - 2 в концентрации 0,05 % для инфузорий и в дозировках 0,06 - 3 г/кг живой массы для лабораторных животных.

Установлено, что добавление ЭПС X. campestris В - 610/1 в хлебобулочные изделия способствует улучшению их качества. Впервые показана возможность применения данного биополимера в качестве основы для пищевых пленочных покрытий.

Практическая значимость работы

Способность нетоксичных ЭПС ксантомонад улучшать органолептиче-ские и физико-химические показатели хлебобулочных изделий и создавать пищевые пленочные покрытия открывает перспективы их дальнейшего изучения для использования в пищевой промышленности.

По материалам диссертационной работы опубликованы «Методические рекомендации по выделению и очистке экзополисахаридов бактериального происхождения» (в соавторстве с Е.В. Полукаровым, Е.Н. Бухаровой,

Д.А. Жемеричкиным, JT.B. Карпуниной) для студентов старших курсов, аспирантов, специалистов микробиологических, биотехнологических лабораторий, рекомендованные Учебно-методической комиссией и одобреные Ученым советом факультета ветеринарной медицины и биотехнологии Саратовского государственного аграрного университета им. Н.И. Вавилова (протокол № 58 от 23 июня 2009 г). Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по микробиологии, биотехнологии, проведении лабораторно-практических занятий и написании курсовых и дипломных работ в Саратовском государственном аграрном университете им. Н.И. Вавилова.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Полученные варианты X. campestris В - 610: X. campestris В - 610/1, В - 610/4, В - 610/11, В - 610/16, В - 610/23 с повышенной продукцией ЭПС и ЭПС К. pneumoniae К — 2 имеют молекулярные массы в пределах

1 -106 — 10-106 Да, вязкость растворов в пределах 160 - 490 мПа-с и 150 мПа-с соответственно. ЭПС ксантомонад содержат в составе глюкозу, маннозу, га-лактуроновую кислоту, а ЭПС клебсиелл — маннозу, глюкозу, галактозу, глюкуроновую и галактуроновую кислоты, следы фукозы, арабинозы.

2. Оптимальными условиями культивирования ксантомонад и клебсиелл для большей продукции ЭПС являются: время культивирования 44 - 50 ч, .температура 27 °С, встряхивание на шуттель-аппарате при 200 об/мин, среда с сахарозой.

3. ЭПС X. campestris В - 610/1, В - 610/4 не являются токсичными в концентрации 0,05 % для инфузорий и в дозировках 0,06 — 3 г/кг живой массы для лабораторных животных, а ЭПС К. pneumoniae К - 2 - слаботоксичен в тех же концентрациях.

4. Введение ЭПС X. campestris В - 610/1 в хлебобулочные изделия улучшают органолептические и физико-химические показатели выпеченных изделий. ЭПС X. campestris В - 610/1 могут являться основой для пищевых пленочных покрытий.

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова».

Апробация работы:

Материалы диссертации были представлены на: международной научной конференции «Пути повышения качества услуг общественного питания» (Саратов, Саратовского ГАУ им. Н.И. Вавилова, 2005); научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов Саратовского ГАУ им. Н.И. Вавилова (Саратов, 2005; 2006; 2007); международных научно-практических конференциях «Вавиловские чтения — 2005, 2006, 2007» (Саратов, 2005; 2006; 2007); 10-й международной Пущинской школе -конференции молодых ученых (Пущино, 2006); всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной патологии, физиологии, биотехнологии, селекции животных» (Саратов, 2007); 4 Московском международном конгрессе «Биотехнология: перспективы, состояние, развитие» (Москва, 2007); X международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2008); международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Москва, 2008); 5 Московском международном конгрессе «Биотехнология: перспективы, состояние, развитие» (Москва, 2009); конкурсе научных проектов молодых ученых Саратовского ГАУ им. Н.И. Вавилова "Инновационная наука — молодой взгляд в будущее" (Саратов, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 17 работ, из них 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, двух глав: обзора литературы и экспериментальной части, включающей объект и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 151 странице, содержит 15 таблиц и 22 рисунка. Список использованных литературных источников включает 290 наименований, в том числе 153 зарубежных.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Рысмухамбетова, Гульсара Есенгильдиевна

122 Выводы

1. Подобраны оптимальные условия культивирования X. campestris В — 610, X campestris В — 611 и К. pneumoniae К — 2 (время культивирования 44 — 50 ч, температура 27 °С, встряхивание на шуттель-аппарате при 200 об/мин, в качестве источника углерода - сахароза) для повышения продукции ЭПС.

2. Получены варианты X campestris В - 610: X. campestris В — 610/1, В - 610/4, В - 610/11, В - 610/16, В - 610/23, производящие ЭПС в большем количестве, чем исходный штамм, отличающиеся по физико-химическим и биологическим свойствам.

3. Показано, что полученные ЭПС ксантомонад имеют молекулярные массы в пределах 1 -10б - 10-106 Да и вязкость растворов в пределах 160 - 490 мПа-с, содержат в составе глюкозу, маннозу, галактуроновую кислоту. ЭПС К. pneumoniae К - 2 имеют молекулярную массу 1 -10б - 1 ОТ О6 Да, вязкость растворов 150 мПа-с, содержат в составе маннозу, глюкозу, галактозу, глюкуроновую и галактуроновую кислоты, следы фукозы, арабинозы.

4. Установлено что ЭПС X. campestris В — 610/1, В — 610/4 не являются токсичными в концентрации 0,05 % для инфузорий и в дозировках 0,06 - 3 г/кг живой массы для лабораторных животных. ЭПС К. pneumoniae К - 2 слаботоксичен в тех же концентрациях.

5. Показано, что добавление ЭПС X. campestris В — 610/1 в хлебобулочные изделия способствует улучшению их качества. Впервые показана возможность применения ЭПС X. campestris В - 610/1 в качестве основы пищевых пленочных покрытий.

Заключение

В последние десятилетия все большее внимание уделяется экзополи-сахаридам микроорганизмов, которые выделяются в среду различными видами бактерий, микроскопических грибов и их ассоциаций. Появились публикации о защитной, резервной роли микробных ЭПС, об их значении в образовании среды и во взаимодействии микроорганизмов одного и разных видов. Однако многие аспекты этой проблемы и по сей день остаются малоизученными.

В то же время ЭПС микроорганизмов представляют интерес как продукты микробного синтеза, необходимые для применения в различных отраслях промышленности: в нефтедобыче, при производстве бытовой химии и косметики, в пищевой промышленности, в медицине и ветеринарии. ЭПС используют при создании лечебных и косметических мазей и гелей, «нека-пающих» красок, пищевых добавок и пищевых пленочных покрытий, кровезаменителей и т.д. Эти биополимеры превосходят аналоги растительного происхождения по удобству применения, так как сравнительно дешевы, не зависят от климатических условий, обладают очень широким диапазоном свойств и возможностью влиять на эти свойства.

Производимые в России ЭПС обладают ограниченным спектром действия, в основном применяются в технических отраслях народного хозяйства [71, 99]. Микробные ЭПС, необходимые при производстве пищевых продуктов и лекарственных средств, закупаются за рубежом (Франция, США, Китай).

Российскими учеными [18, 30, 78] было получено несколько штаммов Paenibacillus polymyxa и Beijerinckia sp. с повышенной продукцией ЭПС, обладающих высокой вязкостью, солеустойчивостью и другими потенциально полезными для применения свойствами.

В настоящее время ведется поиск микроорганизмов, в частности бактерий, перспективных с точки зрения продукции ЭПС, а также разрабатываются методы получения штаммов с повышенной продуктивностью по данному признаку и методы культивирования микроорганизмов-продуцентов ЭПС.

Целью настоящего исследования явилось выделение ЭПС Xanthomonas campestris В — 610иВ - 611 и Klebsiella pneumoniae К - 2, изучение их физико-химических и биологических свойств. Одной из первостепенных задач было получение вариантов ксантомонад, ЭПС которых могут найти приме-нениие в пищевой отрасли и ветеринарной медицине.

Для получения вариантов бактерий использовали метод облучения в высокочастотном электромагнитном поле и дальнейшего отбора наиболее слизистых колоний; дополнительно воздействовали низкими температурами. Из полученных 50 вариантов отобрано 5, дающих наиболее слизистые колонии: X campestris В - 610/1, В - 610/4, В - 610/11, В - 610/16, В - 610/23. Производимые ими ЭПС были названы ксантомонаны 610/1, 610/4, 610/11, 61016, 610/23. ЭПС Klebsiella pneumoniae К-2 получил название клебсилан.

Известно, что условия культивирования бактерий оказывают значительное влияние на биосинтез ими ЭПС. Были подобраны оптимальные условия для производства ксантомонадами и клебсиеллой экзополисахаридов. Сахароза оказалась лучшим источником углерода, чем глюкоза, как для клебсиелл, так и для ксантомонад; температура - 27 °С была определена как оптимальная для продукции наибольшего количества ЭПС исследуемых бактерий; увеличение скорости встряхивания на шуттель-аппарате от 130 до 200 об/мин. положительно влияло на выход ЭПС; время культивирования, необходимое для достижения максимального количества ЭПС, составляло 44-50 ч. Следует отметить, что на среде 1, рекомендуемой для вы> ращивания клебсиелл, продукция полисахаридов была меньшей, чем при выращивании их на среде 2 (рекомендуемой для ксантомонад). Далее среда 2 применялась с целью производства как ксантомонанов, так и клебсилана.

Следующим этапом исследований явилось изучение физико-химических и биологических свойств полученных нами полимеров с целью поиска путей возможного применения. С помощью ионообменной хроматографии была проведена дополнительная очистка ЭПС и разделение их на фракции. ЭПС ксантомонад были представлены следующими фракциями: X campestris В - 610 - 1 нейтральной и 1 кислой фракций; ксантомонан 610/1 - 1 нейтральной; ксантомонан 610/4 - 2 нейтральными и 1 кислой; ксантомонан 610/11 - 1 нейтральной и 2 кислыми; ксантомонан 610/16 — 1 кислой; ксантомонан 610/23 - 1 нейтральной и 1 кислой. ЭПС. Клебсилан был представлен только 1 нейтральной фракцией. Таким образом, нами было выделено 7 экзополисахаридов, состоящих из разных фракций. Как показали дальнейшие исследования, они обладали широким спектром физико-химических и биологических свойств.

Были изучены молекулярные массы, моносахаридный состав и динамическая вязкость растворов ЭПС. Молекулярная масса всех ЭПС ксантомонад и клебсиелл составила от 1 * 106— 10-106 Да. Динамическая вязкость 1 % растворов ЭПС X. campestris В — 610 и его вариантов: ксантомонана 610/1, 610/4, 610/11, 610/16 и 610/23, определяемая с помощью ротационного вискозиметра, была различна и составляла 270, 160, 490, 480, 340 и 480 мПа-с соответственно. Значения рН растворов ЭПС всех исследованных бактерий были в пределах 7,40 - 7,53. Растворы ЭПС К. pneumoniae К — 2 (1 %) обладали динамической вязкостью 150 мПа-с и значением рН 7,5. В состав всех ЭПС ксантомонад входят манноза, глюкоза и галактуроновая кислота, что согласуется с литературными данными [23, 27, 41, 170, 183, 222, 235, 245, 288]; ЭПС К. pneumoniae К — 2 состоит из маннозы, глюкозы, галактозы, галакту-роновой, глюкуроновой кислот и имеются следы фукозы и арабинозы. Интересно отметить, что проверка ЭПС вариантов ксантомонад на идентичность ксантану, принятому в Европейской фармакопее (ссылка), дала отрицательные результаты во всех случаях, то есть новые биополимеры близки к ксантану по свойствам и составу, но не идентичны.

Известно, что вещества, предлагаемые для использования в пищевой, медицинской и ветеринарной отраслях, должны проходить обязательную гигиеническую экспертизу, включающую ряд обязательных исследований в зависимости от предполагаемого направления применения. Первым этапом исследований является изучение возможного общетоксического действия препарата.

С этой целью нами были исследованы клинически здоровые лабораторные животные: мыши, крысы и кролики. Каждый препарат испытывали на группе животных (не менее 5), подобранных по полу и по массе. Изучали влияние «минимальной» (0,06 г/1 кг массы тела животного) и «максимальной» (3 г/1 кг массы тела) дозировок исследуемых бактериальных ЭПС. Перорально ЭПС вводили через катетер в количестве, соответствующем массе тела животного; контрольной группе вводили физиологический раствор в том же количестве. При наблюдении за животными после введения им данных препаратов были отмечены отклонения в поведении в группе животных, получивших ЭПС К. pneumoniae К — 2: повышенная жажда, беспокойство. Поведение других опытных животных не отличалось от поведения животных контрольной группы. Гибели экспериментальных животных ни в одной группе отмечено не было. На третий день животных подвергали эвтаназии, проводили морфофизиологическое исследование внутренних органов и их гистологических срезов, биологических жидкостей, мазков содержимого кишечника. У животных, получивших «минимальную» дозировку ЭПС X. campestris В - 610/1 и В — 610/4, не было отмечено отклонений в вышеуказанных параметрах от состояния животных контрольной группы, что позволяет сделать вывод о нетоксичности препарата. У животных, которым вводили ЭПС К. pneumoniae К - 2, отмечались изменения в состоянии внутренних органов (селезенка и почки были увеличены, в кишечнике наблюдали скопление газов), что позволяет отнести данный препарат к слаботоксичным. При исследовании кожных проб на животных (кролики) было обнаружено (наблюдения проводили в течение 5 дней), что ЭПС X. campestris В - 610/1 и В - 610/4 не вызывали покраснения кожи и не затормаживали рост волос, в то время как ЭПС К. pneumoniae К — 2 вызывал покраснение кожи, проходящее через 2 часа, и замедление роста волос.

Целесообразность использования новых биополимеров в пищевых технологиях вначале оценивается в лабораторных условиях. Экспериментальными исследованиями было показано, что добавление ЭПС X. campestris В - 610/1 в хлебобулочные изделия способствует улучшению их качества, а также показана возможность применения ЭПС X. campestris В - 610/1 в качестве основы пищевых пленочных покрытий.

Полученные и охарактеризованные нами бактериальные экзополисахариды важны как с научной точки зрения, а также, возможно, вызовут интерес медиков, фармакологов и специалистов пищевой промышленности. Продолжение исследований в этом направлении в перспективе может привести к созданию технологий и препаратов для использования их на практике.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рысмухамбетова, Гульсара Есенгильдиевна, Саратов

1. Антибактериальная активность водорастворимых низкомолекулярных хитозанов в отношении различных микроорганизмов / Д.В. Герасименко и др.//Прикладная биохимия и микробиология. 2004. - Т. 40, № 3. — С. 301-306.

2. Артамонова, М.В. Разработка технологии желированой продукции с использованием микробных полисахаридов: дисс. . канд. техн. наук / Артамонова М.В. Харьков, 2000. - 293 с.

3. А.С. 877939 СССР, МКЛ С 12 Р 19/04. Штамм гриба Aureobasidium pullu-lans — продуцент экзополисахарида / Н.А. Орлова, Н.П. Блинов, Т.Л. Рус-сих (СССР). № 4360607/13; заявл. 08.01.88; опубл. 15.12.94, Бюл. №23.-10 с.

4. А.С. 877989 СССР, МКЛ С 12 Р 19/04. Способ получения аубазидана / Н.П. Блинов и др. (СССР).-№4017785/28- 13; заявл. 22.01.86; опубл. 23.09.87, Бюл. №35.-6 с.

5. А.С. 1158144 СССР, МКИ A 21D 8/04. Способ приготовления теста/ Ю.Р. Малашенко и др. (СССР). № 3647879/28 - 13; заявл. 30.09.83; опубл. 30.05.85, Бюл. № 20. - 2 с.

6. А.С. 1171523 СССР. МКЛ С 12 N 15/00. Способ получения мутантов бактерий продуцентов полисахаридов / Г.Г. Оганесян, Г.Р. Паглеванян (СССР). - № 3603664/28 - 13; заявл. 10.06.82; опубл. 07.08.85, Бюл. № 29. - 2 с.

7. А.С. 1339129 СССР, МКЛ С 12 Р 19/04. Питательная среда для культивирования гриба Aureobasidium pullulans штамм 8 — продуцент аубазидана/ Е.Ф. Григорьев и др. (СССР). № 4641651/13; заявл. 25.01.89; опубл.3006.91, Бюл. № 24. — 8 с.

8. А.С. 1522750 СССР, MKJT С 12 Р 19/04. Способ получения экзополиса-харида / Т.П. Пирог и др. (СССР). № 4434462/13; заявл. 30.05.88; опубл. 23.04.92, Бюл. № 15. - 8 с.

9. Базарнова, Ю.Г. Применение натуральных гидроколлоидов для стабилизации пищевых продуктов (обзор) / Ю.Г. Базарнова, Т.Е. Шкотова, В.М. Зюканов // Пищевые ингредиенты: сырье и добавки. 2005. — № 2. - С. 84-87.

10. Бактериальные экзополисахариды и возможность их применения в пищевой промышленности / Т.А. Гринберг и др. // Тезисы доклодов VI съезда Всесоюзного микробиологического общества, 25 — 29 марта 1980. Рига, 1980.-Т. 4.-С. 29

11. Башенина, Н.В. Руководство по содержанию и разведению новых в лабораторной практике видов мелких грызунов / Н.В. Башенина. М.: Изд-во Московского ун-та, 1975. - 166 с.

12. Биопрепараты на основе иммобилизованных дрожжевых маннанов / М.Ю. Волков и др. // Биотехнология. Вода и пищевые продукты: Материалы международной научно-практической конференции, 11 — 13 марта 2008.-М., 2008.-С. 35.

13. Биоразлагаемая упаковка в пищевой промышленности / Г.Х. Кудрякова и др. // Пищевая промышленность. — 2006. Вып.7. — С. 52-54.

14. Биохимия и иммунология микробных полисахаридов / Н.В.Васильев и др. // Томск: Изд-во Томск, ун-та, 1984. 304 с.

15. Булдаков, А.С. Пищевые добавки: Справочник / А.С. Булдаков. С.Пб.: Ut, 1996.-240 с.

16. Бутова, С.Н. «Биопектин» биологическая добавка к пище / С.Н. Бутова, Д.А. Золотько // Биотехнология. Вода и пищевые продукты: Материалы международной научно-практической конференции, 11-13 марта 2008. -М., 2008.-С. 60.

17. Бухарова, Е.Н. Экзополисахарид Paenibacillus polymyxa 88А: получение,характеристика и перспектива использования в хлебопекарной промышленности: дисс. . канд. биол. наук / Бухарова Е.Н. — Саратов, 2004. -189 с.

18. Вайнштейн, С.Г Влияние пшеничных отрубей на показатели глюкозо-толерантного теста у здоровых лиц / С.Г. Вайнштейн, A.M. Масик // Казанский медицинский журнал. 1984. — № 4 — С. 13-14.

19. Вайнштейн, С.Г. Пищевые волокна и усвояемость нутриентов / С.Г. Вайнштейн, A.M. Масик / Вопросы питания. — 1984. — № 3 С. 6-12.

20. Влияние биоцидов на антимикробную активность пленочных материалов / A.JT. Пешехонова и др. // Биотехнология. Вода и пищевые продукты: Материалы международной научно-практической конференции, 11 — 13 марта 2008. М., 2008. - С. 147.

21. Влияние условий культивирования Xanthomonas campestris на образование ксантана / Е.В. Лияськина и др. // Материалы Второго съезда Общества биотехнологов России, 13-15 октября 2004. М.: МАКС Пресс, 2004.-С.131.

22. Внеклеточные углеродсодержащие продукты Methylococcus thermophillus / Ю.Р. Малашенко и др. // Прикладная биохимия и микробиология. -1985.-Т. 44, №4.-С. 33-36.

23. Вудсайд, Е. Полисахариды микроорганизмов / Е. Вудсайд, Е. Ква-пинский // Молекулярная биология. М.: Мир, 1977. - С. 145-200.

24. Гарейшина, А.З. Технология повышения нефтеотдачи путем внугрипла-стового синтеза нефтевытесняющих агентов / А.З. Гарейшина, Т.А. Кузнецова // Нефтяное хозяйство. 1998. - № 2. - С. 17-18.

25. Гвоздяк, Р.И. Микробный полисахарид ксантан / Р.И. Гвоздяк, М.С. Матышевская. — Киев: Наукова думка, 1989. — 195 с.

26. Гемицеллюлозы / М.С. Дудкин и др.. Рига: Зинатне, 1991. - 448 с.

27. Глухова, Е.В. Bacilluspolymyxa — продуцент внеклеточного полисахарида: дисс. . канд. биол. наук / Глухова Е.В. — М., 1988. 193 с.

28. Горин, С.Е. Перспективы изучения внеклеточных полисахаридов дрожжей / Горин С.Е. и др. // Микробные метаболиты. — М., 1979. — 347 с.

29. Горячий, Н.В. Бескислотно — бесспиртовая технология производства пектина / Н.В. Горячий и др. // Материалы Второго съезда Общества био-техпологов России, 13-15 октября 2004.- М.: МАКС Пресс, 2004.-С. 90-91.

30. ГОСТ 5667 65. Хлеб и хлебобулочные изделия. Правила приемки, методы отбора образцов, методы определения органолептических показателей и массы изделий.

31. ГОСТ 5669 96. Хлебобулочные изделия. Определение пористости.

32. ГОСТ 5670-96. Хлебобулочные изделия. Определение кислотности.

33. ГОСТ 21094 95. Хлеб и хлебобулочные изделия. Определение влажности.

34. ГОСТ 27839 88. Мука пшеничная. Методы определения количества и качества клейковины.

35. ГОСТ 13496.7-97. Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма. Методы определения токсичности.

36. ГОСТ Р 52249 2004. Правила производства и контроля качества лекарственных средств.

37. Государственная фармакопея СССР. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. 11-е изд., доп. - М.: Медицина,1989.-Вып. 2.-400 с.

38. Гринберг, Т.А. Микробный синтез экзополисахаридов на СГС2 соединениях / Т.А. Гринберг, Т.П. Пирог, Ю.Р. Малашенко. — Киев.: Наукова думка, 1992.-211 с.

39. Гринченко, О.А. Научное обоснование и разработка технологии кулинарной продукции с использованием полуфабрикатов функциональных композиций на основе полисахаридов: дисс. . докт. техн. наук / Гринченко О.А. Харьков, 2005. - 380 с.

40. Громов, Б.В. Строение бактерий: учеб. пособие / Б.В. Громов. — JL: Изд-во Ленингр. ун-та, 1985. 192 с.

41. Гюнтер, Е.А. Культуры клеток растений как продуценты полисахаридов / Е.А. Гюнтер // Материалы Второго съезда Общества биотехнологов России, 13-15 октября 2004.-М.: МАКС Пресс, 2004. С. 61-62.

42. Дробот, В.И. Влияние микробных экзополисахаридов на структурно-механические свойства теста / В.И. Дробот, Т.А. Гринберг // Тезисы докладов 3-го симпозиума соцстран по биотехнологии — Братислава, 1983.-С. 5-6.

43. Дробот, В.И. Использование нетрадиционного сырья в хлебопекарной промышленности / В.И. Дробот. — Киев: Урожай, 1988. — 148 с.

44. Дробот, В.И. Структурно-механические свойства пшеничного теста и клейковины при использовании микробных полисахаридов / В.И. Дробот, Л.Ю. Арсеньева // Изв. вузов. Пищевые технологии: Кубан. ГТУ, 1987. -№5.-С. 53-56.

45. Дубцова, Г.Н. Липид — белковое взаимодействие в технологии хлебопечения / Г.Н. Дубцова, И.В. Нечаев, У.Т. Жуманова // Агробиология. -1986. Сер.27, № 16. - С.20.

46. Дудкин, М.С. Новые продукты питания / М.С. Дудкин, Л. Ф. Щелкунов. -М.: МАИК "Наука", 1998. 304 с.

47. Дудкин, М.С. Перспективы использования гемицеллюлоз в пищевых и кормовых целях / М.С. Дудкин. Рига: Зинатне, 1982. - 236 с.

48. Дудкин, М.С. Пищевые волокна / М.С. Дудкин, И.С. Казанская, А.С. Ба-зилевский // Химия древесины. — 1984. — № 2. — С. 3-14.

49. Дятлова, К.Д. Микробные препараты в растениеводстве / К.Д. Дятлова // Соросовский Образовательный журнал. — 2001. — №5. — С. 17-22.

50. Егоров, А.В. Состав и структура макромолекулы галактоманнана семян Gleditsia ferox / А.В. Егоров, Н.М. Местечкина, В.Д. Щербухип // Прикладная биохимия и микробиология. — 2004. — Т. 40, № 3. — С. 370-375.

51. Елинов, Н. П. Некоторые микробные полисахариды и их практическое применение / Н. П. Елинов // Успехи микробиологии. — М.: Наука, 1982.-С. 158-177.

52. Елинов, Н.П. Химия микробных полисахаридов / Н.П. Елинов. М.: Высшая школа, 1984. — 156 с.

53. Захарова, И.Я. Методы изучения микробных полисахаридов / И .Я. Захарова, JI.B. Косенко. Киев: Наукова думка, 1982. - 192 с.

54. Златкина, А.Р. Лечение хронических болезней органов пищеварения / А.Р. Златкина. -М.: Медицина, 1994.-336 с.

55. Иванова, Е.А. Полисахариды — компоненты новых продуктов / Е.А. Иванова //Пищевая промышленность. — 1991. — № 1. С.86-88.

56. Иммунология и иммунотерапия опухолей молочной железы / Ю.А. Гри-невич и др.. Киев, 1990. - 183 с.

57. Ионные хроматографы фирмы Dionex. — Режим доступа: http://www.lb.pdo.ru/category42.html

58. Карпуть, И.М. Гематологический атлас сельскохозяйственных животных / И.М. Карпуть. -Мн.: Ураджай, 1986. 183 е., ил.

59. Кашталапова, Е.Н. Контроль качества продукции и услуг общественного питания / Е.Н. Кашталапова. М.: ОЦПРКТ, 2007. - 121 с.

60. Квасников, Е.И. Молочнокислые бактерии и пути их использования / Е.И. Квасников, О.А. Нестеренко. — М.: Наука, 1975. —390 с.

61. Козлова, С.Г. Разработка ускоренной технологии дрожжевого теста с использованием микробного экзополисахарида ксампана: дисс. .канд. техн. наук / Козлова С.Г.- Харьков, 2001. 281 с.

62. Колесникова, М.Б. Разработка технологии смесей сухих функциональных для производства эмульсионных соусов: дисс. . канд. техн. наук / Колесникова М.Б. Харьков, 2002. - С. 41.

63. Комов, В.П. Биохимия: учеб. для вузов / В.П. Комов, В.Н. Шведова.- М.: Дрофа, 2004.-638 с.

64. Консалтииг-Центр "ШАГ". Обзор рынка упаковки / Лица бизнеса. — 2006. Вып. 2/1. (112). — Режим доступа: http://www.stepconsulting.ru/publ/cover. shtml.

65. Краснопевцева, Н.В. Бактериальный экзополисахарид для увеличения нефтеотдачи / Н.В. Краснопевцева. Режим доступа: htth://biohim.com.ua/data/ newsru.xml.

66. Лабинская, А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований / А.С. Лабинская. М.: Медицина, 1978. - 394 с.

67. Ловачева, Г.Н. Стандартизация и контроль качества продукции. Общественное питание / Г.Н. Ловачева, А.И. Мглинец, Н.Р. Успенская. — М.: Экономика, 1990. 239 с.

68. Любешкина, Е. Упаковка с дополнительными функциями / Е. Любешкина // Пакет. — М.: Изд-во «Курсив». — 2000. — Вып.4 (5). Режим доступа: http:// www.kursiv.ru/paket/archive/05/specia 13.html.

69. Мальцева, Н.Н. Экзополисахариды олигонитрофильных бактерий как фактор, обуславливающий образование микробных сообществ почвы / Н.Н. Мальцева. — Киев: Наукова думка, 1981. 242 с.

70. Малютенкова, С.М. Товароведение и экспертиза кондитерских товаров / С. М. Малютенкова. СПб.: Питер, 2004. - 480 е.: ил.

71. Матора, А.В. Получение и исследование промышленно-важных штаммов-продуцентов экзополисахаридов: автореф. дисс. . канд. биол. наук. / Матора А.В. Саратов, 1993. - 172 с.

72. Матышевская, М.С. Образование экзополисахаридов бактериями рода Xanthomoncis / М.С. Матышевская, И.И. Майко, С.С. Сидоренко // Мик-робиолол. журн. 1985. - № 6. - С.27-32.

73. Меркулов, Г.А. Курс патологогистологической техники / Г.А. Меркулов.- Л.: Медгиз., 1956. 263 с.

74. Методические указания к выполнению работ по курсу основы метрологии, стандартизации и сертификации качества / сост. С.В. Потапов, Н.А. Коробочкипа. -М.: Изд — во Рос. экон. акад. — 1995. — 31 с.

75. Методические указания к работам, выполняемым по системе УИРС и НИРС. Статистические методы обработки экспериментальных результатов / сост. В.Г. Боресков. М.: МТИММП, 1979. - 26 с.

76. Микробиологические исследования карбонатного коллектора Ромашкин-ского нефтяного месторождения в связи с испытанием биотехнологии повышения нефтеотдачи / Т.Н. Назина и др. // Микробиология. — 1998. — Т.67, № 5. С. 701-709.

77. Микробный экзополисахарид аубазидан — основа для создания готовых лекарственный средств / Л.А. Коссиор и др. // Материалы Второго съезда Общества биотехнологов России, 13-15 октября 2004. — М.: МАКС Пресс, 2004.-С. 35.

78. Митина, Л.Л. О получении агара из грациллярии / Л.Л. Митина // Проблемы производства продукции из красных и бурых водорослей: Труды Всесоюз. семинара. Владивосток, 1987. — С. 9-10.

79. Наумов, Г.Н. Разработка технологии получения микробных полисахаридов технического, пищевого и медицинского назначения / Г.Н. Наумов,

80. B.И. Дмитриев, А.Г. Пенкин // Материалы Второго съезда Общества биотехнологов России, 13-15 октября 2004. М.: МАКС Пресс, 2004.1. C.93-94.

81. Нечаев, А.П. Пищевые добавки / А.П. Нечаев, А.А. Кочеткова, А.Н. Зайцев М.: Колос, 2001. - 256 с.

82. Новая упаковка для овощей и фруктов. Новости сельского хозяйства и пищевой промышленности. — Сельское хозяйство России, 2007. — Режим доступа: http://www.agroru.eom/news/l 18202.htm.

83. О возможности использования полисахарида «ксантан К» в пищевой промышленности / М.М. Калакура и др. // Химия пищевых добавок: Тезисы докладов Всесоюзной конференции, 25 — 27 апреля 1989. — Черновцы, 1989.-С. 152.

84. Одарченко, А.Н. Влияние микробного полисахарида «ксантан» на качество замороженных плодоовощных паст в процессе их хранения в замороженном состоянии: автореф. дисс. .канд. техн. наук / Одарченко А.Н. — Харьков, 2003.- 18 с.

85. Определитель бактерий Берджи. В 2 т. Т. 1: пер. с англ. / Дж. Хоулта и др.. М.: Мир, 1997. - 432 с.

86. Пассаглиа, Э. Приготовление и исследование пленок / Э. Пассаглиа, Р. Маршессо // Методы исследования углеводов. М.: Мир, 1975.— С. 413-428.

87. Пат. 923374 Великобритания, МКЛ С 12 Р 19/04. Способ получения биомассы микроорганизмов / Ф.А. Майерс, Д.Д. Вестл; заявитель Дзе Бритиш Петролеум Компани Лимитед (Великобритания). № 251060/28 - 13; заявл. 29.07.77; опубл. 23.04.82. Бюл. № 15.-18 с.

88. Пат. 2012420 Российская Федерация, МПК 5 В 03 D 1/018. Способ пенной флотации руд металлов / Д.Р. Шоу, Р.С. Стефенс; заявитель и патентообладатель Вейерхойзер Компании. — № 4894966/03; заявл. 04.03.1991; опубл. 15.05.94. Бюл. №9.-6 с.

89. Перепелкин, К.Е. Полимерные материалы будущего на основе возобновляемых растительных ресурсов и биотехнологий: волокна, пленки, пластики / К.Е. Перепелкин // Химические волокна. — 2005 — № 6. С. 5-16.

90. Перспективы развития микробиологических технологий в XXI веке / Н.А. Лебедев и др. // Нефтяное хозяйство, 2000. № 11. - С. 7 - 10.

91. Пищевые волокна / М.С. Дудкин и др.. Киев: Урожай, 1988. - 152 с.

92. Пищевые волокна и литогенный потенциал желчи / С.Г. Вайнштейн и др. // Терапевтический архив. 1986. -Т. 58, № 2 - С.83-86.

93. Пищевая химия / А.П. Нечаев и др.. СПб.: ГИОРД, 2003. - 640 с.

94. Полифункциональные съедобные покрытия на основе природных полимеров / Л.Г. Самойлова и др. // Биотехнология. Вода и пищевые продукты: Материалы международной научно-практической конференции, 11-13 марта2008.-М., 2008-С. 165.

95. Получение биодеградируемых пористых пленок для использования в качестве раневых покрытий / Н.Р. Кильдеева и др. // Прикладная биохимия и микробиология. — 2006. — Т. 42, № 6. С. 716-720.

96. Получение из мицелиальных грибов полисахаридных комплексов и определение степени их деацетилирования // В.М Терешина и др. // Микробиология. 1997. - Т. 66, № 1. - С. 84-89.

97. Получение хитина и хитозана из медоносных пчел / С.В. Немцев и др. // Прикладная биохимия и микробиология. — 2004. — Т. 40, № 1. С. 46-50.

98. Попова, О.Г. Разработка новых видов кондитерских изделий по критерию качества / О.Г. Попова. М.: Дели принт, 2009. - 103 с.

99. Рига, Я. Роль пищевых волокон в питании / Я. Рига // Вопросы питания. — 1982,-№4.-С. 26-29.

100. Ритизан новый биополимер для нефтедобывающей промышленности / Винокуров В.А. и др. // РГУ нефти и газа им. И.М. Губкина. - Режим доступа: http://nich.gubkin.ru/cat2005/himc.htm

101. Розанов, Н.И. Микробиологическая диагностика заболеваний сельскохозяйственных животных. Руководство для ветеринарных врачей диагностических лабораторий / Н.И. Розанов. — М.: Гос. изд-во с.-х. литературы, 1952.-508 с.

102. Самохвалова, О.В. Разработка научно обоснованной технологии булочных изделий с использованием экзополисахарида ксантан: дисс. . канд. тех. наук / Самохвалова О.В. — Харьков, 1990 — 264 с.

103. Сарафанов, J1.A. Пищевые добавки: энциклопедия / JI.A. Сарафанов. -С.Пб.: ГИОРД, 2003. 688 с.

104. Сборник мучных кондитерских и булочных изделий для предприятий общественного питания. — СПб.: Профикс, 2006. 296 с.

105. Скуратовская, О.Д. Контроль качества продукции физико-химическими методами. 1. Хлебобулочные изделия. — М.: ДеЛи принт, 2002. 102 с.

106. Скурихин, И.М. Расчетный метод определения пищевых волокон в продуктах питания / И.М. Скурихин, И.И. Паносян, Д.Ю. Жилинскайте // Вопросы питания. 1995. - № 1. - С. 20 - 23.

107. Смоляр, В.И. Рациональное питание / В.И. Смоляр. Киев: Наукова думка, 1991.-368 с.

108. Создана съедобная упаковка. Кулинарные новости. Кулинарные рецепты, 2004. Режим доступа: http://www.kuking.net/19375.htm.

109. Создана съедобная упаковка для молочных продуктов. Отраслевой портал Unipack. Ru, 2002. Режим доступа: http:// news, unipack.ru/1818.

110. Съедобная упаковка: состояние и перспективы / Г.Х. Кудрякова и др. // Пищевая промышленность. 2007. — Вып.6. - С. 24-25.

111. Съедобная упаковка для биотехнологии мясных и молочных продуктов питания / JT.C. Кузнецова и др. // Биотехнология. Вода и пищевые продукты: Материалы международной научно-практической конференции, 3-5 июня 2008. М., 2008. - С. 110.

112. Технологическая новинка «умные» упаковки. Наука и техника. Информационное агентство «Комментатор», 2007. — Режим доступа: http://www.kommentator.ru/tech/2007/t0813-l.html.

113. Тихомирова, О.М. Полисахариды клеток Cryptococcus laurentii (kaufferath) skinner — продуцента внеклеточного гетерогликапа / О.М. Тихомирова, Г.А. Витовская, И.А. Синицкая / Микробиология. 1998.-Т. 67, № 1.-С. 73-78.

114. Тихонов, В.К. Статистический анализ и нормальность выборок в токси-колого- гигиенических исследованиях / В.К.Тихонов, С.Т. Быков,

115. А.Ф. Ковалев // Гигиена и санитария. — 1985. — № 3. — С. 61-62.

116. Упаковка от DuPont. Новинки. Полимеры, 2007. — Режимы доступа: http:// www.poly mery.ru/letter.php?nid=724&catid=2.

117. Функциональные пищевые продукты, их лечебное и профилактическое действие / Н.А. Бугаец и др. // Кубан. ГТУ. Изв. вузов. Пищ. техпол. -2004.-№2.-С. 48-51.

118. Функциональные продукты питания: учеб. пос. / под. ред. В.И. Теплова. -М.: А Приор, 2008. - 240 с.

119. Черно, Н.К. Пищевые волокна: состав, свойства, технология производства: дисс. .докт. техн. наук / Черно. Н.К. Одесса, 1990. — 502 с.

120. Шарковский, Е.К. Гигиена продовольственных товаров: учеб. пос. / Е.К. Шарковский. М.: Новое знание, 2003. - 263 с.

121. Шмидт, Е.В. Возможность получения пищевого хитозана путем твердофазной трансформации крошки панциря краба кишечным штаммом

122. Bacillus subtilis / E.B. Шмидт, А.И. Албулов, H.A. Ушакова // Биотехнология. Вода и пищевые продукты: Материалы международной научно-практической конференции, 11-13 марта 2008. М., 2008 -С. 212.

123. Agar — like polysaccharide produced by a Pseudomonas species: production and basic properties / K.S Kang et al. // Appl. Environ. Microbiol. -1982.- №43.-P. 1086.

124. Alginate production by clinical nonmucoid Pseudomonas aeruginosa strains / E.D. Anastassiou et al. // J. Clin. Microbil. 1987. - V. 25, N. 4. -P. 656-659.

125. Alginates / S.T. Мое et al. // Food polysaccharides and their applications. — N.Y.: Marcel Dekker, Inc, 1995. P. 245.

126. Anastassiou, E.D. Nonfatal bacteria caused by mucoid, alginate production strain of Pseudomonas aeruginosa / E.D. Anastassiou, C. Frangides, G. Dimi-tracopoulos // Diagn. Microbil. Infect. Dis. 1986. - N. 5. - P. 277-283.

127. Anti-tumour effects of polysaccharides of Ganoderma lucidium./ Sh.-Sh. Lee et al. // Auckland: Proc Int Symposium Ganoderma Sci., 2001. P. 41-46.

128. Atomic force microscopy as a tool for interpreting the rheology of food bio-polymers at the molecular level / V.J. Morris et al. // Food Sci. Technol. -2001.-N. 34. P. 3.

129. A soluble p 1,3 - glucan derivave potentials the cytostatic and cytolitic of mouse peritoneal macrofagen in vitro / R. Seljelid et al. // Immunofarmacol. — 1984.-V. 6, N. 1. - P. 7-10.

130. Bach, H. Engineering bacterial biopolymers for the biosorption of heavy metals / H. Bach, D.L. Gutnick // Handbook of carbohydrate engineering. N.W.: Taylor & Francis Group LLC, 2005. - P. 507-534.

131. Baird, J.K. Industrial applications of some new microbial polysaccharides /J.K. Baird, P.A. Sandford, I.W. Cottrell//Bio Technol. 1983.-N. 1. -P. 778.

132. Bradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding /

133. M. Bradford // Anal. Biochem. 1976. -V.72, N. 1. - P. 248-254.

134. Brummer, Y. Detection and determination of polysaccharides in foods/ Y. Brummer, S. W. Cui // Food polysaccharides and thei Applications. -2006.-P. 675-712.

135. Burchard, W. Light scattering from polysaccharides / W. Burchard // Polysaccharides: structural diversity and functional versatility. N.Y.: Marcel Dek-ker, 2005.-P. 189-236.

136. Cheng, H. N. Biotransformation of polysaccharides / H. N. Cheng, Q.-M. Gu // Glycochemistry. Principles, synthesis and applications. — N.Y., 2001.—1. P. 567-579.

137. Clegg, S. Klebsiella pneumoniae / S. Clegg, T.A.S. Sebghati // Molecular medical microbiology. — Acad. Press., 2001. — P. 1655-1680.

138. Complete NMR structural elucidation of the capsular polysaccharide adjuvant from Klebsiella I 714 / O. Adam et al. // Eur. J. Biochem. - 1996. - N. 241. -P. 602-610.

139. Conformational structure of bacterial polysaccharides: II. Optical activity of some bacterial capsular polysaccharides / Gh. Wolf et al. // Biopolymers. — 1978. -N. 17. P. 731.

140. Covalent structure of the exstracellular polysaccharide from Xanhtomonas campestris: evidence from partial hydrolysis studies / L.D. Melton et al. // Carbohydr.Res. 1976. - V. 46, N. 4. - P. 245.

141. Daba, A.S. Anti-cancer effect of polysaccharides isolated from higher basidio-mycetes mushrooms / A.S. Daba, O.U. Ezeronye // African Journal of Biotechnology. 2003, V. 2, N. 12. - P. 672-678.

142. Dictionary of microbiology and molecular biology third / Ed. P. Singleton, D. Sainsbury. Chichester: John Wiley & Sons Ltd, 2006. - P. 895.

143. Dierckx, S. In Biopolymers / S. Dierckx, K. Dewettinck // Polysaccharides II. -Weinheim: Wiley-VCH, 2002. V. 6. - P. 323.

144. Dubois, M. Colorimetris method for determination of sugars and related substances / M. Dubois et al. // Anal. Chem. 1956. - V. 28, N. 3.1. P. 350-356.

145. Dunne, W.M. Effect of divalent cations on the synthesis of alginic acidlike exopolysaccharide from mucoid strain Pseudomonas aeruginosa / W.M. Dunne // Microbios. 1985. - V.43. - P. 193-216.

146. Dutton, G.G.S. The capsular polysaccharide from Klebsiella serotype K-54; location of the О acetyl groups and a revised structure /G.G.S. Dutton, E.H. Merrifield // Carbohydr. Res. - 1982. - N. 105. - P. 189-203.

147. Ebringerova, A. Hemicellulose / A. Ebringerova, Z. Hromadkova, T. Heinze. — Berlin: Adv Polym Sci., 2005.-N. 186.-P. 1-67.

148. Effect of dose and modification of viscous properties of oat gum on plasma glucose and insulin following an oral glucose load / P.J. Wood et al. // Br. J. Nutr. 1994. - N. 72. - P. 731.

149. Effects of polisaharides of seeds on the intestial microflora of piglets/ Z. Deng et al.// Asia Рас О Clin Nutr.- 2007. -N. 16.-P. 143-147.

150. El Seoud, O.A. Organic esters of cellulose: new perspectives for old polymers / O. A. El Seoud, T. Heinze // Berlin: Adv Polym Sci., 2005.-N. 186.-P. 103-149.

151. Evans, C.G.T. Continuous culture studies on the production of extracellular polysaccharides by Xanthomonas juglandis / C.G.T. Evans, R.G. Yeo, D.C. Ellwood // Microbial Polysaccharides. London: Academic Press, 1979. -P. 51.

152. Evans, R.L. Relationship between structure and function of dietary fibre: a comparative study of the effects of three galactomannans on cholesterol metabolism in the rat / R.L. Evans // Br. J. Nutr. 1992. -N. 68. - P. 217.

153. Fiber diffraction studies of bacterial polysaccharides / K. Okuyama et al. // Fiber Diffraction Methods. American Chemical Society. Washington: D.C., 1980.-P.411.

154. Functional polymers based on dextran / T. Heinze et al. // Polysaccharides II. -Berlin: Adv Polym Sci., 2006. -V. 205. P. 199-291.

155. Fyfe, J.A.M. Sysnthesis, regulation and biological unction of bacterialalginate / J.A.M. Fyfe, J.R.W Govan// Progr. Ind. Microbiol. 1983. -N. 18.-P. 45-83.

156. Gelation of xanthan with trivalent metal ions / H. Nolte et al.//Carbo-hydr. Polym. 1992. -N. 18.-P. 243.

157. Genetically engineered polymers: manipulation of xanthan biosynthesis / M.R. Betlach et al. // Industrial Polysaccharides: Genetic Engineering, Structure. Property Relations and Applications. Elsevier: Progress Biotechnology, 1987.-N. 3.-P. 35.

158. Geremia, R. Biosynthesis, structure, and physical properties of some bacterial polysaccharides / R. Geremia, M. Rinaudo // Polysaccharides: structural diversity and functional versatility. N.Y.: Marcel Dekker, Inc, 2005.-P. 411-430.

159. Govan, J.R. Isolation of alginate-producing mutans of Pseudomonas fluores-cens, Pseudomonas putida and Pseudomonas / J.R. Govan, J.A.M Fyfe // Mi-crobil. 1981, Vol.125.-N. 1.-P. 217-220.

160. Gretz, M.R. Analysis of red algal extracellular matrix polysaccharides cellulose and carrageenan / M. R. Gretz, J.C. Mollet // Techniques in glycobiology. — N.Y.: Marcel Dekker, Inc, 1997. P. 613- 628.

161. Guar, locust bean, tara, and fenugreek gums. / H. Maier et al. // Industrial Gums. Polysaccharides and their derivatives. San Diego: Academic Press, 1983.-V. 3.-P. 181.

162. Guetta, O. Structure and properties of a bacterial polysaccharide named/ O. Guetta, K. Mazeau, R. Auzerly// Fucogel©. Biomacromolecules. 2003.-N. 4.-P. 1362-1371.

163. Gunning, A.P. Light scattering studies of tetramethylammonium gellan / A.P. Gunning, V.J. Morris // Int. J. Biol. Macromol. 1990. - N. 12. - P. 338.

164. Guvelier, C. Concentration regimes in xanthan gum solutions deduced from flow and viscoelastic properties / G. Cuvelier, B. Launay // Carbohydr. Polym.- 1986. -N. 6.-P. 321.

165. Hanson, C.F Dietary fiber e ffects on passage rate and breath hydrogen /

166. C.F. Hanson, Е.А. Winterfeldt // Amer. J. Clin. Nutr. 1985. - V. 42. -P. 44-48.

167. Harada, A. The story of research into curdlan and the bacteria producing it / A. Harada // Trends Glyco Sci. Glyco Technol. 1992. - N. 4. - P. 309.

168. Harding, S.E. Analysis of Polysaccharides by Ultracentrifugation. Size, Conformation and Interactions in Solution / S. E. Harding // Adv Polym Sci. — 2005. -N.186.-P. 211-254.

169. Harris, P. A practical approach to polysaccharide analysis / P. Harris, A. Morrison, C. Dacombe // Food Polysaccharides and their Application. N.Y.: Marcel Dekker, 1995. - P. 463.

170. Hassler, R.A. Genetic-engineering of polysaccharide structure-production of variants of xanthan gum in of Xanthomonas campestris / R.A. Hassler,

171. D.H. Doherty //Biotechnol. Progr. 1990. - N. 6. - P. 182.

172. Heinze, T. Esterification of polysaccharides / T. Heinze, T. Liebert, A. Ko-schella. -Berlin: Springer-Verlag, 2006. 232 p.

173. Heterodyne and nonergodic approach to dynamic light scattering of polymer gels: aqueous xanthan in the presence of metal ions (aluminum (III)) / A.B. Rodd et al. // Macromolecules. 2001. - N. 34. - P.33-39.

174. Hutmacher, D.W. Polysaccharides in tissue engineering applications / D.W. Hutmacher, D.T.W. Leong, F. Chen // Handbook of carbohydrate engineering. N.W.: Taylor & Francis Group LLC, 2005. - P. 837-893.

175. Immobilization of cells in carrageenan / I. Chibata et al. // Methods Enzymol. 1987.-N. 135. -P.189-198.

176. Influence of the pyruvate content on macromolecular association in solution / I.H. Smith et al. // Int. J. Biol. Macromol. 1981. - N. 3. - P. -129.

177. Investigation of gellan networks and gels by atomic force microscopy / A.P. Gunning et al. // Macromolecules. 1996. -N. 29. - P. 67-91.

178. Jann, K. Capsular polysaccharides / K. Jann, B. Jann // Molecular medical microbiology. Acad. Press., 2001. - P. 47-77.

179. Jansson, P.E. Structural studies of polysaccharide (S-88) elaborated by Pseudomonas АТСС 31554 / P.E. Jansson, N.S. Kumar, B. Lindberg // Carbo-hudr.Res. — 1986. -N. 156.-P. 165-172.

180. Jansson, P.E. Structure of the extracellular polysaccharide from Xanhtomonas campestris / P.E. Jansson, L. Kenne, B. Lindberg // Biosynthesis, structure and physical properties. Carbohydr. Res. 1975. - Vol. 45. - № 4. - P. 275 - 282.

181. Jeanes, A. Extractllular microbial pjlysaccharides / A. Jeanes // Food Technol. 1974. - V. 28, N. 5. - P. 34-38.

182. Jeanes, A. Polysaccharide В 1459: A new hydrocolloid polyelectrolyte produced from glucose by a bacterial fermentation / A. Jeanes, J.E. Pittsley, F.R. Senti // J. Appl. Polym. Sci. - 1961.-N. 5.-P. 519.

183. Johansson, A. Structure of the polysaccharide S-156 elaborated by Klebsiella pneumoniae ATCC 316 46 / A. Johansson, P.E. Jansson, G. Wildmalm // Biosynthesis, structure and physical propertie Carbohydr. Res. — 1994. —1. N. 253.-P. 317-322.

184. Joseleau, J.P. Structure of the capsular polysaccharide of Klebsiella К type 63 / J.P. Joseleau, M.F. Marais // Biosynthesis, structure and physical properties. Carbohydr. Res. - 1979. -N. 77. - P. 183-190.

185. Kajiwara, K. Progress in structural characterization of functional polysaccharides / K. Kajiwara, T. Miyamoto // Polysaccharides: structural diversity and functional Versatility. -N.Y.: Marcel Dekker. Inc., 2005. P. 1-40.

186. Katzbauer, B. Properties and applications of xanthan gum / B. Katzbauer // Polym. Degrad. Stab. 1998. -N. 59. - P. 81.

187. Kelco-AIL Ltd, Xanthan Gum, 2nd ed., San Diego.

188. Kenne, L. Bacterial polysaccharides / L. Kenne, B. Lindberg // Polysaccharides. London: Asad. Press Inc., 1983. - V. 2. - P. 287-363.

189. Kennedy, J.F. Structural data for the carbohydrate of ispaghula husk ex plantago ovata forsk / J.F. Kennedy, J.S. Sandhu, D.A. Southgate // Carbohydr. Res. 1979.-N. 75.-P. 265.

190. Klemm, D. Cellulose. In. Biopolymers / D. Klemm, H.- P. Schmauder, T. Heinze // Polysaccharides II. Weinheim: Wiley - VCH, 2002. - V. 6.1. P. 275. •

191. Kondo, Т. Hydrogen bonds in cellulose and cellulose derivatives / T. Kondo // Polysaccharides: structural diversity and functional Versatility. — N.Y.: Marcel Dekker, Inc., 2005. -P.69-98.

192. Kong, H. Polysaccharide-based hydrogels in tissue engineering / H. Kong,

193. D. J. Mooney // Polysaccharides: structural diversity and functional Versatility. -N.Y.: Marcel Dekker, Inc., 2005. P. 817-837.

194. Kritchevsky, D. Effect of pectin and cellulose on formation and regression of gallstones in hamsters / D. Kritchevsky, S.A. Tepper, DM. Klurfeld // Experi-entia. 1984. - V. 40. - P. 350-352.

195. Lenz, Y. Neul wege zur verwertung von hemicellulosen / Y. Lenz, J. Schurz // Osterr. Chem. Ztschr. — 1986. V. 87, N. 11.-P. 318-321.

196. Liu, W.G. Chitosan based nonviral vectors for gene delivery / W.G. Liu, W.W. Lu, K. D. Yao // Handbook of carbohydrate engineering. - N.W.: Taylor & Francis Group LLC, 2005. - P. 817-836.

197. Lonnberg, B. New development in cellulose technology / B. Lonnberg // Polysaccharides: structural diversity and functional versatility. N.Y.: Marcel Dekker, Inc., 2005. - P. 1035-1054.

198. Magnin, D. Interactions between polysaccharides and polypeptides / D. Mag-nin, S. Dumitriu // Polysaccharides: structural diversity and functional versatility. -N.W.: Marcel Dekker, Inc., 2005. P. 305-356.

199. Matheson, H.B. Cholesterol 7-alpha-hydroxylase activity is increased by dietary modification with psyllium hydrocolloid, pectin, cholesterol and cholestyramine in rats / H.B. Matheson, I.S. Colon, J.A. Story. J. Nutr. - 1995. -№ 125.-P. 454.

200. Mclntire, T.M. Imaging carbohydrate polymers with noncontact mode atomic force microscopy / T.M. Mclntire, D.A. Brant // Techniques in glycobiology. -N.Y.: Marcel Dekker, Inc., 1997. P. 187-208.

201. Microbial polysaccharides, in novel materials from biological sources / J.D. Linton et al. // Basingstoke. 1991. - P. 215-262.

202. Milas, M. Conformational investigation on the bacterial polysaccharide xan-than / M. Milas, M. Rinaudo // Carbohydr. Res. 1979. - N. 76. - P. 189.

203. Milas, M On the existence of 2 different secondary structure for the xanthan in aqueous solutions / M. Milas, M. Rinaudo // Polym. Bull. 1984. -N. 12.-P. 507.

204. Milas, M. Structure and properties of xanthan versus fermentation time in emulsion system / M. Milas, H. Viehweg, A Weiss // Carbohydr. Polym. -1990. -N. 13.-P. 119.

205. Millane, R.P. Molecular structures of xanthan and related polysaccharides / R.P. Millane, B. Wang // Gums and stabilisers for the food industry. Oxford: IRL Press, 1992.-V. 6.-P. 541.

206. Millane, R.P. X ray diffraction studies of a variant of xanthan gum in which the side chain terminal mannose unit is absent / R.P. Millane, T.V. Narasaiah // Carbohydr. Polym. - 1990. - N. 12. - P. 315.

207. Mironescu, M. Microbial polisaharides production, characterisation and properties / M. Mironescu // Acta Universitatis Cibiniensis Series E: Food Technolodgy. 2003. - V. VII, N. 2. - P. 26-38.

208. Moorhouse, R. Xanthan gum molecular conformation and interactions/ R. Moorhouse, M.D. Walkinshaw, S. Arnott // Extracellular microbial poly-caccharides. - Washington.: D.C., 1977. — P. 90.

209. Morris, E.R. Molecular interaction in polysaccharide gelation / E.R. Morris // Brit. Pjlym. J. 1986. -V. 18, N.l.-P. 14-21.

210. Moms, V.J. Bacterial Polysaccharides / V.J. Morris // Food polysaccharides and thei Applications. 2006. - P. 413-454.

211. Morris, V.J. Rheology and microstructure of dispersions and solutions of the microbial polysaccharide from Xanthamonas campestris (xanthan gum) / V.J. Morris, D. Franklin, K. Anson // Carbohydr. Res. 1983. — N. 121.-P. 12-30.

212. Mucoid strains of Pseudomonas aeruginosa are devoid of man-nuronan С % - epimerasa /S. Singh et al. //Microbios. - 1987.1. V. 51,N. 206.-P. 7-13.

213. Nanocelluloses as innovative polymers in research and application / D. Klemm et al. // Polysaccharides II. — Berlin.: Adv Polym Sci., 2006. V. 205. - P. 49-96.

214. Nishio, Y. Material functionalization of cellulose and related polysaccharides via diverse microcompositions / Y. Nishio // Polysaccharides II. Berlin.: Adv Polym Sci., 2006. - V. 205. -P. 97-151.

215. No, H.K. Treatment of wastewaters with the biopolymer chitosan / H.K. No, W. Prinyawiwatkul, S.P. Meyers // Handbook of carbohydrate engineering. — N.W.: Taylor & Francis Group LLC, 2005. P. 535-562.

216. Oat b — glucan reduces blood cholesterol concentration in hypercholesterolemic subjects / J.T. Braaten et al. // Eur. J. Clin. Nutr. 1994.-N. 48.-P.465.

217. Obayashi, T. Clinical utilization of the measurement of (1 —» 3) (3 - D - glucan in blood / T. Obayashi // Toxicology of 1 —> 3 — beta — glucans: glucans as a marker for fungal exposure. - N.W.: Taylor & Francis Group, LLC, 2005.-P. 199-207.

218. Order disorder transition for a bacterial polysaccharides in solution. A role for polysaccharide conformation in recognition between Xanthomonas pathogen and its plant host / E.R. Morris et al.. - Mol. Biol. — 1977. -N. 110.-P.1.

219. Paulsen, B.S. Bioactive pectic polysaccharides / B.S. Paulsen, H. Barsett // Berlin: Adv Polym Sci., 2005.-N. 186.-P. 69-101.

220. Pazur, J.H. Properties and applications of anti-xanthan antibodies / J.H. Pa-zur, F.J. Miskiel, N.T. Marchetti // Carbohydr. Polym. 1995. -N. 27. - P. 85.

221. Perez, S. Conformations, structures and morphologies of celluloses /S. Perez, K. Mazeau // Polysaccharides: structural diversity and functional versatility. -N. Y.: Marcel Dekker, Inc., 2005. P. 41-68.

222. Physiologic effects of three microbial polysaccharides on rats / A.N. Boothet al. // Toxicol. Appl. Pharmacol. 1963. -N. 5. - P. 478.

223. Polysaccharide applications, cosmetics and pharmaceuticals / S. Fischer et al. // ACS Symposium Series. Washington: DC., 2000. - P. 143.

224. Polysaccharide (xanthan) of Xanthomonas campestris NRRL В — 1459 / A. Jeanes et al. // Procedure for culture maintenance and polysaccharide pro-ductin, and analysis. USDA Report, ARS-NC-51. - 1974. - P.l.

225. Potthast, A. Analysis of oxidized functionalities in cellulose / A. Potthast, T. Rosenau, P. Kosma // Polysaccharides II. Berlin: Adv Polym Sci., 2006. -V. 205.-P. 3-48.

226. Prescott, J.H. New molecular weight forms of arabinogalactan from Larix oc-cidentalis / J.H. Prescott, E.V. Groman, G. Gulyas // Carbohydr. Res. 1997. — N. 301. -P. 89.

227. Primary structure of Escherichia coli serotype K-42 capsular polysaccharide and its serological identity with the Klebsiella К 63 polysaccharide /

228. H. Nieman et al. // J. Bacteriol. 1978. -N. 133. - P. 390-391.

229. Quantitative analysis of hydrocolloids in food systems by methanolysis coupled to reverse HPLC. Part 2. Pectins, alginates and xanthan / B. Quemener et al. // Food Hydrocolloids. 2000. - N. 14. - P. 19.

230. Reid, J.S.G. Galactomannans and other cell wall storage polysaccharides in seeds / J.S.G. Reid, M.E. Edwards // Food polysaccharides and their applications. -N.Y.: Marcel Dekker, 1995. P. 155.

231. Renard, C.M.G.C. Structure of the repeating units in the rhamnogalacturonic backbone of apple, beet and citrus pectin / C.M.G.C. Renard, M.J. Crepeau, J.F. Thibault // Carbohydr. Res. 1995. -N. 275. - P. 155.

232. Rinaudo, M Advances in characterization of polysaccharides in aqueous solution and gel state / M. Rinaudo // Polysaccharides: structural diversity and functional versatility. -N.Y.: Marcel Dekker, Inc., 2005. P. 237-252.

233. Rochefort, W.E. Rheology of xanthan gum: salt, temperature, and strain effects in oscillatory and steady shear experiments / W.E. Rochefort, S. Middleman // J. Rheol. —1987. — N. 31.-P. 337.

234. Rodriguez, H. Detection of Xanthomonas campestris mutants with increased xanthan production / H. Rodriguez, L. Aguilar // J. Ind. Microbiol. 1997. -N. 18.-P. 232-234.

235. Ros, J.M. Extraction, characterisation, and enzymatic degradation of lemon peel pectins / J.M. Ros, H.A. Schols, A.G.J. Voragen // Carbohydr. Res. -1996.-N. 282.-P. 271.

236. Rosenau, T. Trapping of reactive intermediates to study reaction mechanisms in cellulose chemistry / T. Rosenau, A. Potthast, A. Kosma // Polysaccharides II. Berlin.: Adv Polym Sci., 2006. - V. 205. - P. 153-197.

237. Safety evaluation by two year feeding studies in rats and dogs and a three-generation reproduction study in rats / G. Woodward et al. // Toxicol. Appl. Pharmacol. 1973. -N. 24. - P.30.

238. Salt dependence of the conformation of a singlestranded xanthan / G. Muller et al. // Int. J. Biol. Macromol. 1986. -N. 8. - P. 167.

239. Sanderson, G.R Applications of xanthan gum / G.R. Sanderson // Brit. Polym. J.-1981.-N. 13.-P.71.

240. Sandford, P.A. In Molecular Biology / P.A. Sandford, J. Baird. N.Y.: Academic Press, 1983. - V. 2. - P. 458-459.

241. Sandford, P.A. Microbial polysaccharides: new products and their commercial applications / P.A. Sandford, I.W. Cotterell, D.J. Pettitt // Pure and Appl. Chem. 1984. - N. 56. - P. 895-897.

242. Sandford, P.A. Separation of xanthan gum s of differing pyruvate content by fractional precipitation / P.A. Sandford, P.R. Watson, C.A. Knutson // Carbohydr. Res. 1978. -N. 63. - P. 253.

243. Selby, H.H. Agar / H.H. Selby, W.H. Wynne // Industrial Gums. N.Y.: Academic Press, 1973.-P. 29.

244. Separation of high — molecular mass carrageenan polysaccharide by capillary electrophoresis with laser — induced fluorescence detection / M.A. Roberts et al. // J. Chromatogr. - 1998. -N. 817. - P. 353.

245. Sharma, R.D. Effect of fenugreek seeds and leaves on blood glucose and serum insulin responses in human subjects / R.D. Sharma // Nutr. Res. — 1986.-N. 6.-P. 1353.

246. Sikyta, B. Progress in industrial microbiology / B. Sikyta // Techniques in applied microbiology. Amsterdam, 1995.-V. 31.-P. 138-140.

247. Skjak-Brack, G. The role of О acetyl groups in the biosynthesis of alginate by Azotobacter vinelandii / G. Skjak-Brack, B. Larsen, H. Grashdalen// Carbohydr. Res. - 1985.-N. 145.-P. 169-174.

248. Soedjak, H.S. Colorimetric determination of carrageenans and other anionic hydrocolloids with methylene blue / H.S. Soedjak // Anal. Chem. 1994. -N. 66.-P. 4514.

249. Soldi, V.-Stability and degradation of polysaccharides / V. Soldi //'Polysaccharides: structural diversity and functional versatility. — N.Y.: Marcel Dek-ker, Inc., 2005.-P. 395-409.

250. Soderqvist Lindblad, M Chemical modification of hemicelluloses and gums / M. Soderqvist Lindblad, A-Ch. Albertsson // Polysaccharides: structural diversity and functional versatility. N.Y.: Marcel Dekker, Inc., 2005.-P. 491-508.

251. Spiridon, I Hemicelluloses: structure and properties / I. Spiridon, V .1. Popa // Polysaccharides: structural diversity and functional versatility. — N.Y.: Marcel Dekker, Inc., 2005. P. 475-489.

252. Stacey, M. Polysaccharides of microorganisms / M. Stacey, S.A. Barker // London: Oxford Axiv., 1960. 312 p.

253. Stokke, B.T. Release of disordered xanthan oligomers upon partial acid hydrolysis of doublestranded xanthan / B.T. Stokke, B.E. Christensen // Food Hy-drocoll. 1996. -V. 10, N. 1. -P. 83.

254. Structure of the dextran of Leuconostoc mesenteroides N— 1355 /A. Misaid // Carbohydr. Res. 1980. -N. 84. - P. 273.

255. Structure of the extracellular gelling polysaccharide produced by Entero-bacter (NCIB 11870) species / M.A. O'Neil et al. // Carbohydr. Res. 1986. -N. 148.-P. 63-69.

256. Sutherland, J.W. A yellow polysaccharide-producing bacterium with unusual characteristics / J.W. Sutherland, T. Williamson // Eur. 1. Appl. Microbiol, and Biotechnol. 1972. - V. 6, N. 3. - P. 233-240.

257. Surherland, J.W. Biosynthesis of microbial exopolisaccharides / J.W. Sur-herland // Adv. Microbial. Physik. 1982. - V. 23. - P. 79-150.

258. Sutherland, J.W. Extracellular polysaccharides / J.W. Sutherland // Biotechnology. 1983.-V. 3.-P. 531-575.

259. Sutherland, J.W. How a jelly bean is born / J.W. Sutherland // Confect. Ma-nuf. and Market. 1991. - V. 28, N.3. - P. 22.

260. Sutherland, J .W. Industrially useful microbial polysaccharides / J.W. Sutherland//Microbiol. Sci. 1986. -V. 3, N. 1. - P. 5-9.

261. Sutherland, J.W. Microbial exopolysaccharides. Industrial polymers patent and future potential / J.W. Sutherland, D.C. Ellwood // Microbial. Technol. Curr. State Future Prospects: 29 Soc. Gen. Microbial. Cambridge etc., 1979. -P. 107-150.

262. Sutherland, J.W. Microbial exopolysaccharides / J.W. Sutherland // Polysaccharides: structural diversity and functional versatility. -N.Y.: Marcel Dekker, Inc., 2005.-P. 431-457.

263. Sutherland, J.W. Microbial exopolysaccharides / J.W. Sutherland // Trends Biochem. Sci. 1979. - N. 3. - P. 55-59.

264. Sutherland, J.W. The exopolysaccharide of Klebsiella aerogenes A3 (SI) (Type 54) / J.W. Sutherland, J.F. Wilkinson // Biochem. J. 1968. - N. 110. -P. 749-754.

265. Taravel, F.R. Computer modeling of polysaccharide-polysaccharide interactions / F.R. Taravel, K. Mazeau // Polysaccharides: structural diversity and functional versatility. -N.Y.: Marcel Dekker, Inc., 2005. P. 281-304.

266. Taylor, C.M. Bacterial capsules: a route for polysaccharide engineering /С.М. Taylor, I.S. Roberts// Handbook of carbohydrate engineering. N.W.: Taylor & Francis Group LLC, 2005. - P. 479-494.

267. Tompkin, R.B. Nitrite / R. B. Tompkin // Antimicrobials in food. III. N.W.: Taylor & Francis Group, LLC, 2005. - P. 169-236.

268. Use of fenugreek seed powder in the management of non-insulin dependent diabetes mellitus / R.D. Sharma and ed. // Nutr. Res. 1996, N. 16. - P. 1331.

269. Variationin Xanthomonas campestris NRRL B-1459: characterisation of xanthan products of differing pyruvic acid content / P.A. Sandford ct al. // Extracellular Microbial Polysaccharides. American Chemical Society. -Washington.: D.C., 1977. P. 192.

270. Viebke, Ch. Order-Disorder Conformational Transition of Xanthan Gum / Ch. Viebke // Polysaccharides: structural diversity and functional versatility. — N.Y.: Marcel Dekker, Inc., 2005. P. 459-474.

271. Viscometric studies on xanthan and galactomannan systems / T.M.B. Bresolin et al. // Carbohydr. Polym. 1997. - N. 33 - P. 131.

272. Wang, Q. Pectin from fruits / Q. Wang, J. Pagan, J. Shi // Functional Foods. -Boca Raton: CRC Press, 2002. P.263.

273. West, T.P. Improved polysaccharide production using strain improvement / T. P. West // Microbial processes and products / ed. J. L. Barredo. - N.J.: Humana Press Inc. - 2005. - P. 301-311.

274. Willats, W.G.T. Immunoproflling of pectic polysaccharides / W.G.T. Willats, J.P. Knox // Anal. Biochem. 1990. -N. 268. - P. 143.

275. Wong, J.L. Cancer and chemicals . and vegetables / J.L. Wong // Chemtech. 1986.-V. 16, N. 2.-P. 100-107.

276. Xantan gum / European pharmacopoeia // Council of Europe France.2004. V. 2 - P. 2715-2716.

277. Yi, Y. Immobilization of cells in polysaccharide gels / Y. Yi, R.J. Neufeld, D. Poncelet // Polysaccharides: structural diversity and functional versatility. — N.Y.: Marcel Dekker, Inc., 2005. P. 867-891.

278. Yui, Т. X ray diffraction study of polysaccharides / T. Yui, K. Ogawa // Polysaccharides: structural diversity and functional versatility. - N.Y.: -Marcel Dekker, Inc., 2005. - P. 99-122.i