Углеводсодержащие биополимеры Xanthomonas campestris и их роль в фитопатогенных процессах

Козулин, Владимир Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Углеводсодержащие биополимеры Xanthomonas campestris и их роль в фитопатогенных процессах
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Углеводсодержащие биополимеры Xanthomonas campestris и их роль в фитопатогенных процессах"

На правах рукописи

Козулин Владимир Владимирович

УГЛЕВОДСОДЕРЖАЩИЕ БИОПОЛИМЕРЫ XANTHOMONAS САМРЕЪТШЬ И ИХ РОЛЬ В ФИТОПАТОГЕННЫХ ПРОЦЕССАХ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Саратов - 2009

1 4 2т

003469923

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет им. Н. И. Вавилова»

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Щербаков Анатолий Анисимович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Тихомирова Елена Ивановна

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник Заднова Светлана Петровна

Ведущая организация: Российский государственный аграрный университет -МСХА им. К. А. Тимирязева

Защита состоится в /У часов на заседании

диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н. И. Вавилова» по адресу." 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.

Автореферат диссертации разослан <<?$"¿'/¿/¿/.(2.009 г. и размещён на сайте университета www.sgau.ru.

Огзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ», учёному секретарю диссертационного совета.

Учёный секретарь

диссертационного совета _ Карпунина Л. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Микроорганизмы рода Xanthamonas являются фитопатогенами широкого спектра действия, охватывающего большинство семейств сельскохозяйственных' культур. Экономический ущерб, наносимый заболеваниями, вызываемыми бактериями этого рода, значителен. Потери урожая могут достигать до 30% - 50% (Самохвалов, 1996; Джалилов, 1999). В связи с этим изучение ксантомонад начато с периода их выделения и установления их вирулентных свойств (Wakker, 1883).

С целью поиска эффективных средств защиты для борьбы с болезнями, вызываемыми ксантомонадами, выявление механизмов фитопатогенеза становится одним из приоритетных направлений научных разработок в этой области (Tapp, 1975; Матышевская, 1975; Гвоздяк, 1989; Яковлева, 1992; Дьяков, 2001).

Важнейшей задачей в данной отрасли исследований является нахождение веществ микробного происхождения, ответственных за проявление тех или иных симптомов заболевания. Исходя из результатов, полученных другими исследователями, особую роль во взаимодействии растение-хозяин -микробная клетка играют микробные полисахариды, т.к. возможность различных вариаций моносахаридов практически беспредельна (Книрель, 1993). Обусловлено это также высокой реакционной способностью моносахаридов. Исследования в этой области начаты сравнительно недавно (Матышевская, 1975; Кирчова, 1988; Яковлева, 1992). Основной недостаток имеющейся информации заключается в её противоречивости. Большинство исследователей считает, что полисахариды ксантомонад биологически активны в отношении растения-хозяина, но этот вопрос остаётся не решённым окончательно (Гвоздяк, 1989).

Известно, что виды этого рода подразделяются на многочисленные патовары, которые отличаются друг от друга способностью вызывать заболевание только у определённых растений. Невыясненным остаётся вопрос, с чем связан механизм специфичности. Некоторые работы свидетельствуют, что внеклеточные полисахариды Xanthomonas campestris оказывают специфическое фитотоксичное действие (Rudolph, 1978; Яковлева, 1992). Результаты других не подтверждают этого (Матышевская, 1984; Akiyama, 1986). Если утверждение первых верно, то неясно, каким образом это происходит, т. к. не найдено существенных различий в моносахаридном составе полисахаридов этого вида (Гвоздяк, 1989; Яковлева, 1992). Данные по химическому составу и биологическому действию внеклеточных

липополисахаридов - экзолипополисахаридов (ЭЛПС) грамотрицательных бактерий немногочисленны (Здоровенко, 1988). До наших работ у бактерий рода Xanthomonas они выделены не были. Информация по физико-химическим и биологическим свойствам липополисахаридов (ЛПС) микроорганизмов данного рода носит ограниченный характер (Volk, 1966; Hickman, 1966; Volk, 1972; Bukharov, 1993). Комплексное, сравнительное изучение свойств углеводсодержащих биополимеров ксантомонад позволит более определённо ответить на вопрос об их участии в фитопатогенных процессах.

Цель исследования - выделение и изучение физико-химических и биологических свойств углеводсодержащих биополимеров из культуральной жидкости и наружной мембраны бактерий Xanthomonas campestris.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Выделить ЛПС из наружной мембраны бактерий X. campestris.

2. Определить физико-химические свойства выделенного ЛПС.

3. Получить О-специфический полисахарид (О-ПС) штамма Xanthomonas campestris pv. campestris 8183a и провести анализ его химического состава.

4. Выделить внеклеточные полисахаридсодержащие биополимеры из культуральной жидкости бактерий X. campestris pv. campestris и X. campestris pv. vesicatoria;, провести сравнительное исследование их физико-химических свойств.

5. Изучить биологическую активность углеводсодержащих биополимеров из культуральной жидкости и ЛПС из наружной мембраны X. campestris pv. campestris.

растениями-хозяевами патовара X. campesrtis pv. vesicatoria. Показано, что полисахарид из культуральной жидкости. бактерий

X. campestris представляет собой сложный биополимер, в состав которого входит липидная часть. Обнаружено различие в количественном моносахаридном составе углеводной части внеклеточных полисахаридов (ПСЖ) бактерий X. campestris pv. campestris штаммов В 610 и X. campestris pv. campestris 8183a и- ЭПС X. campestris pv. vesicatoria штаммов В 546, различающихся по растению-хозяину. Впервые выделен и охарактеризован по физико-химическим свойствам экзолипополисахарид (ЭЛПС) из культуральной жидкости бактерии X. campestris и модифицирован метод его выделения. Выделен и охарактеризован по физико-химическим свойствам ЛПС из наружной мембраны штамма X. campestris pv. campestris 8183a. Установлен химический состав О-специфического полисахарида, полученного из ЛПС этого штамма. Впервые для О-ПС бактерий рода Xanthomonas установлено присутствие фукозамина. Произведена сравнительная характеристика ЭЛПС и ЛПС штаммов X. campestris pv. campestris 8183a и X. campestris pv. campestris В 610, установлено различие в их химических и биологических свойствах. Установлена фитотоксичность ЭЛПС, проявляющаяся в виде не описанных ранее для действия данного препарата симптомов заболевания, специфичных для растения-хозяина (семейства крестоцветных), коренным образом отличаяющися от изменений, вызываемых ЛПС этого же штамма.

Практическая значимость работы. Изучение свойств углеводсодержащих биополимеров бактерий X. campestris позволяет приблизиться к пониманию взаимоотношении в инфекционном процессе между возбудителем и организмом-хозяином. Полученные нами данные по расшифровке механизма вирулентности фитопатогенных бактериозов могут послужить основой для создания эффективных средств борьбы с ними, для определения восприимчивости растений к заболеванию.

Модифицированная нами методика выделения ЭЛПС бактерий рода Xanthomonas позволяет оптимизировать процесс получения данных веществ с целью дальнейшего их изучения.

Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе в Саратовском государственном аграрном университете им. Н.И. Вавилова, Саратовском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского при выполнении курсовых и дипломных работ, а также при чтении лекций по курсу «Микробиология» для студентов и аспирантов Саратовского государственного аграрного университета им. Н. И. Вавилова.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Бактерии рода Хашкотопая способны выделять в окружающую среду два различных биополимера:

а) внеклеточный липополисахарид (ЭЛПС), отличающийся по своему строению и биологическим свойствам от ЛПС наружной мембраны;

б) углеводсодержащий биополимер из культуральной жидкости, представляющий собой - полисахаридлипидный комплекс (ПСЛК), в состав которого входит липидная часть.

2. В состав ЛПС из наружной мембраны штамма X. сатре$1т ру. сатреэГт 8183а входит два О-ПС, различающихся по своему заряду и состоящих из остатков рамнозы и фукозамина.

3. Низкомолекулярные производные (олигосахариды и модифицированные моносахариды), фрагменты из полисахаридлипидных комплексов (ПСЛК) и экзолипополисахаридов (ЭЛПС) бактерий X. сатрез1пх обладают фитотоксичностью в отношении растения-хозяина, проявляющейся в виде специфических симптомов заболевания. Действие данных фрагментов имеет более широкий спектр, чем область фитопатогенного действия самих бактерий.

4. Внеклеточные углеводсодержащие биополимеры бактерий рода ХаЫкотопся обладают фитотоксичностью в отношении растения-хозяина.

5. Модифицированный метод Вестфаля является эффективным для разделения и выделения углеводсодержащих биополимеров из культуральной жидкости бактерий рода ХаМкотопат. ПСЛК и ЭЛПС.

Апробация работы. Материалы исследований, приведённые в диссертации, были представлены на конференции «Биосинтез и деградация микробных полимеров. Фундаментальные и прикладные аспекты» (г. Пущино-на Оке, 1995), Международной конференции молодых учёных «Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии» (Тверь, 2003); научно-практической коференции «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте "Микроб"» (Саратов, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ, 2 из которых - в журналах ВАК РФ.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 3 глав, включающих обзор литературы, методы и материалы исследования, результаты исследований и их обсуждение, заключения, выводов и списка литературных источников, содержащего 152 наименования, в том числе - 88

зарубежных. Работа изложена на 151 страницах машинописного текста, содержит 32 рисунка и 7 таблиц.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы

В качестве объекта исследования использовали штаммы бактерий X. campestris pv. campes tris 8183a, X. campestris pv. campestris В 610 (NCPPB 45) и X. campestris pv. vesicatoria В 546. Штамм X. campestris pv. campestris 8183a выделен из поражённых тканей капусты, классифицирован Институтом микробиологии и вирусологии НАН Украины, характеризуется способностью вызывать заболевание растений семейства крестоцветных, в том числе сосудистый бактериоз капусты, не вирулентен по отношению к растениям другого семейства.

Штамм X. campestris pv. campestris В 610 (NCPPB 45) получен из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ). Характеризуется специфической вирулентностью к растениям семейства крестоцветных и не способен вызывать заболевания у растений других семейств.

Штамм X. campestris pv. vesicatoria В 546 получен в 1989 г. из ВКМ. Выделен из поражённых тканей томатов. Характеризуется способностью вызывать заболевание у растений семейства паслёновых. Не способен поражать растения других семейств.

Культивирование ксантомонад проводилось до окончания логарифмической фазы роста в условиях самопроизвольной аэрации, на среде Эйкмана с пептоном и глюкозой; рН - 7.

Растительными объектами для изучения механизма фитопатогенного процесса служили семена капусты белокачанной (Brassica olerasea var. capitata f. alba) различных сортов, в зависимости от сроков созревания. Ранних сортов: «Июньская», «Точка»; поздних и средне-поздних: «Слава», «Белорусская». Также семена редиса (Raphanus sativus), физалиса (Physalis pubescens), перца сладкого (Capsicum аппит), картофеля (Solanaceae tuberosum), томата (Lycopersicon esculentum), огурца (Cucumis sativus), петрушки листовой (Pctroselinum crispum), мяты (Mentha piperita), бархатцев (Tagetes erecta). Проросшие семена помещали стерильно в пробирки со средой Мурасиге-Скуга (Murashige, 1962). Для получения достаточных по размеру листовых пластинок испытываемые растения выращивали в открытом грунте в вегетаторах. Выращивание проводилось при естественном освещении и температуре 25-30° С.

Концентрирование растворов проводили на перегонной установке, а также на ротационном испарителе ИР-1М 2 (СССР) при пониженном давлении.

Колометрические измерения осуществляли на спектрофотометре СФ-46 (Ломо, СССР). Хроматографические измерения проводили на следующих приборах: «Chrom-5» (ЧССР), «Биохром-1» (СССР), «Страйер» (Россия). Гель-фильтрацию осуществляли на гелях: Sepharose CL-4B; Sephadex G-50 фирмы Pharmacia (Швеция). Также использовали анионообменник DEAE-Toyopearl 650 М («Toyo Soda», Япония). Аминосахара определяли при помощи аминокислотного анализатора ААА-339 (ЧССР). Определение вязкости исследуемых растворов производили на вискозиметре капиллярном стеклянном ВПЖ - 1. Диализ проводили с помощью мембран фирмы «Serva» (Германия), с пределом исключения 10-14 кДа.

Внесение материала в исследуемые растения проводили путём инъекции в жилку листа, с помощью шприца объёмом 1 мл, а также путём втирания в мезофильную ткань листовой пластинки. Помимо этого, применяли метод штрихового ранения листовой пластинки с последующим нанесением препаратов и метод погружения срезанных проростков в ёмкость с исследуемым раствором.

Для определения моносахаридного состава исследуемых образцов использовали метод распределительной хроматографии на бумаге (Захарова, 1982). Для определения нейтральных моносахаридов и уроновых кислот использовали методы высокоэффективной и газо-жидкостной хроматографии. Качественное и количественное определение жирных кислот липидов в образцах осуществляли методом газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ). Колориметрические исследования содержания белка, углеводов, кето-дезоксиоктановой кислоты (КДО), нуклеиновых кислот, О-ацетильных групп, пировиноградной кислоты (ПВК), общего фосфора, гексуроновых кислот, гексозаминов, удаление остатков ПВК, дезацетилирование проводили с помощью методик, приведённых в работе И. Я. Захаровой (1982). Для разделения ЭЛПС и ПСЛК использовали обработку материала из культуральной жидкости 45% фенолом. Полисахарид выделяли путём осаждения в 55% этаноле. Для выделения ЛПС применяли методику Вестфаля. Для отделения О-специфического полисахарида от коровой части ЛПС проводили гидролиз в 1% уксусной кислоте при 100°С в течение четырёх часов. Удаление белковых примесей проводили с помощью проназы. Для этой цели и для удаления липидного компонента применяли обработку полисахарида хлороформом по методу Севага (Кочетков, 1967).

Выделение и определение физико-химических свойств ЛПС и О-ПС X. campestris pv. campestris 8183a

Известно, что ЛПС является сложным биополимером, обладающим выраженным токсическим действием и вызывающим иммунные реакции у организма-хозяина. Биологическая роль ЛПС во взаимоотношениях растение - патоген и её зависимость от химического состава ЛПС изучена недостаточно (Яковлева, 1992).

Для получения ЛПС были выбраны штаммы X. campestris pv. campestris 8183a и В 610, вызывающие сосудистый бактериоз крестоцветных. Полученную сухую биомассу подвергали стандартной процедуре экстракции 45% фенолом по Вестфалю (Westphal, 1965). ЛПС штамма X. campestris pv. campestris 8183a на 90% процентов переходил в фенольный слой. ЛПС штамма X. campestris pv. campestris В 610 распределялся следующим образом: 70% находилось в водном слое; 30% - в фенольном. И в том и в другом случае исследовался ЛПС из фенольного слоя. Обусловлено это не только массовым распределением в первом случае, но и тем, что в дальнейших исследованиях проводилась сравнительная характеристика ЭЛПС из культуральной жидкости, обладающего липофильными свойствами, и ЛПС из наружной мембраны.

Хроматографическое разделение ЛПС и определение его химического состава

Дальнейшую очистку ЛПС осуществляли с помощью колоночной гель-фильтрации. На первом этапе материал из фенольной части экстракта по Вестфалю пропускали через колонку с гелем Sepharosae CL-4B (рис. 1).

Пик, выходящий с нулевым объёмом, соответствует веществам с молекулярной массе больше 5 х 106 Да. Элюиионные характеристики обоих ЛПС были схожи. Выход лиофильно высушенных данных препаратов по отношению к сухой биомассе был следующий: X. campestris pv. campestris 8183a hI campestris pv. campestris В 610 : 0,27% и 0,08 % соответственно.

Так как использовался только перешедший в фенольный слой ЛПС штамма X. campestris pv. campestris В 610, а большая часть его (70%) находилась в водном, то общий выход ЛПС из обоих штаммов близок друг к другу. Отмечено, что в обоих препаратах присутствует КДО, которая является обязательным компонентом коровой части липополисахаридов.

Среди жирных кислот п««

им

липида А X. сатреэ^'а ру. сатреяКи штамма 8183" преобладают • тетрадекановая, пентадекановая и гекса-декановая кислоты. Состав липида А штамма X. сатрап сатрез1т В 610 в основном представлен гексадекановой и олеиновой кислотами. Присутствие в образцах данных кислот подтверждает принадлежность выделенных веществ к ЛПС бактерий рода ХаЫИотопаз (Гвоздяк, 1989).

Рис 1. Хроматограмма материала фенольной части экстракта биомассы шт. X. campe stris pv. campes tris 8183a Примечание: Пик -1: ЛПС;Пик -II и III: нюкомолекулярные продукты

1,5

1,0

0.5

L_A

Деградация ЛПС и получение О-ПС, определение его химического состава

Для разделения О-ПС и липида А О)90 ЛПС указанных штаммов 2,о подвергали мягкому кислотному гидролизу в 1% уксусной кислоте в течение 3" часов (МиПег-Бе^, 1968). Раствор, содержащий О-ПС штамма X. сатре51п^ ру. сатреяПпзЪХ&Ъ3, подвергали гель-фильтрации, используя колонку с гелем 8ерЬас)ех 0-50 и ЗерЬагозе СЬ-4 В (рис. 2). Полученные хроматографические данные показали, что молекулярная масса О-ПС равна 4 х 105 Да. В процессе ионообменной хроматографии

О-ПС разделялся на нейтральную и отрицательную фракции. Таким образом, была обнаружена гетерогенность О-ПС. Обе фракции имели практически один и тот же моносахаридный состав, представленный рамнозой на 56-62% и на 2730% аминосахаром, идентифицированным методом 13С ЯМР-спектроскопин

SO V, мл

Рис. 2. Хроматограмма гндролизованной смеси ЛПС штамма X. сатрезк 'и р\\ сатреяИз 8183а

Примечание: Пик -1: ЛПС; Пик - II: смесь О-ПС.

как фукозамин с аминогруппой в положении 3. Следует отметить, что данный аминосахар обнаружен впервые для О-ПС бактерий рода ХапЖотопаз. Наличие в О-ПС рамнозы характерно для рода ХаМИотопаз (Книрель, 1994).

Выделение полисахаридсодержащего продукта из культуральной жидкости бактерий ХаглИотопая сатреМпь pv. сатреьть штаммов В 610 и 8183"

Отделённые от низкомолекулярных примесей и концентрированные образцы из культуральной жидкости штаммов X. сатре$1ш ру. сатрезМэ 8183" и X. сатре$1т ру. сатрехМх В 610 подвергали аналитической гель-фильтрации. Материал из обоих штаммов разделялся на две фракции: экзополисахарид и пигмент. Было выяснено, что в состав данных образцов входит КДО. Известно, что КДО является необходимым компонентом коровой части ЛПС.

На основании этого, а также данных, приведённых в работе Г. М. Здоровенко (1988) было выдвинуто предположение о содержании в культуральной жидкости исследуемых штаммов ЭЛГ1С.

Тот факт, что ЛПС данных штаммов обладает липофиль-ностью, позволило предположить, что при экстракции фенолом высокомолекулярного продукта из культуральной жидкости возможно преимущественное растворение ЭЛПС в феноле. В связи с этим лиофильно высушенный материал из культуральной жидкости исследуемых штаммов подвергли экстракции 45% фенолом. После последующего центрифугирования смесь разделилась на два слоя: фенольный и водный. При этом пигмент переходил в фенольный слой и в дальнейшем при диализе выпадал в осадок.

Аналитическая хроматография препаратов из обоих слоев подтвердила, что препараты выходят практически одним пиком (рис. 3). Было выяснено, что молекулярная масса исследуемых веществ была выше 5 х 10б Да.

Рис. 3. Хроматограмма смеси углеводных компонентов, водной части экстракции культуральной жидкости Примечание: I- ПСЛК; II- нигмеит.

Определён биополимерный состав выделенных препаратов (табл. 1). Из приведённых данных видно, что содержание КДО в препарате II превышает содержание её в препарате I. Определено, что в состав образцов обоих штаммов входят липиды.

Таблида1

Биополимерный состав, содержание КДО и ПВК углеводсодержащих биополимеров штамма X. сатреит ру. сатрез1па 8183а

Образец Содержание, %

Углеводы Белки Нуклеиновые кислоты КДО Пировиноградная кислота

шелк 28 3,7 0,16 0,07 0,38

II ЭЛПС 19 16,5 0,08 0,15 0,42

Жирнокислотный состав препаратов из культуральной жидкости штаммов X. campestris pv. campestris 8183a сходен по качественному составу жирных кислот, но различен по количественному. В связи с установленным фактом содержания липидов в образцах ЭПС, полученных из штаммов X. campestris pv. campestris 8183a и X. campestris pv. campestris В 610 данный препарат, по аналогии с работой С. А. Конновой (1990), был назван нами полисахаридлипидным комплексом (ПСЛК).

Препарат из фенольной части экстракта культуральной жидкости, на основании его физических и химических свойств, был назван нами экзолипополисахаридом (ЭЛПС). Анализ данных по содержанию липидной части образцов показал, что жирнокислотный состав ПСЖ и ЭЛПС штаммов X. campestris pv. campestris В 610 не сходны с друг другом.

В результате анализа на содержание белков и липидов, проведённого после обработки хлороформом по методу Севага, было выяснено, что количество белка в образцах ПСЛК и ЭЛПС значительно снизилось. Содержание липидов осталось без существенных изменений.

Для установления степени прочности связи между липндной и углеводной частью исследуемых биополимеров ЭЛПС и ПСЛК штаммов X. campestris pv. campestris В 610 подвергали гидролизу в растворах соляной кислоты различной концентрации. Также использовали уксусную кислоту по аналогии с методикой для отделения липида А от ЛПС (Muller-Seitz, 1968). С целью сравнения параллельно использовали раствор ЛПС из наружной мембраны этого же штамма. Таким образом, было выявлено, что связь между

углеводной и липидной частью углеводсодержащих биополимеров из культуральной жидкости имеет иную природу, чем в ЛПС из наружной мембраны, и более устойчива к кислотному гидролизу.

Определение моносахаридного состава полимеров из культуральной жидкости Было установлено, что в состав ПСЛК из обоих штаммов входят глюкоза, манноза и галактуроновая кислота в соотношениях 2:2:1 соответственно. Определено сходство в качественном, но различие в количественном соотношении этих моносахаридов для ПСЛК из X. campestris pv. campestris В 610 и ЭПС из X. campestris pv. vesicatoria В 546. Для ЭПС X. campestris pv. vesicatoria В 546 эти показатели были следующие: глюкоза, манноза и галактуроновая кислота: 1:3:3 соответственно. Моносахаридные компоненты ЭЛПС штамма X. campestris pv. campestris 8183a были представлены рамнозои и амисахаром, который по величине Rf мы идентифицировали как фукозамин. Аминосахар и рамноза в ЭЛПС из этого штамма находились в соотношении близким к 1:1. Выявлено, что глюкоза и рамноза в ЭЛПС из штамма X. campestris pv. campestris В 610 находятся в соотношении 1 : 0,9. Таким образом, можно сделать вывод о том, что в культуральной жидкости штаммов X. campestris pv. campestris В 610 и 8183a содержится два углеводсодержащих полимера, имеющих различное сродство к фенолу и отнесённых нами к различным классам веществ.

Выявлено, что они имеют сложный состав, включающий в себя углеводную и липидную часть. Данный факт является впервые установленным для бактерий данного рода. Отмечено, что выделенные из культуральной жидкости полисахариды имеют более прочную связь липидной части молекулы с углеводной по сравнению с ЛПС из наружной мембраны. Описанная выше обработка материала из культуральной жидкости горячим (65°С) 45% фенолом ранее не использовалась для выделения ЭЛПС бактерий рода Xanthomonas, и её можно предложить как метод их выделения, а также способ обработки «ксантана» для очистки его от пигмента, белковых и углеводных примесей.

Было показано, что ЭПС представляет собой смесь минимум двух веществ: ПСЛК и ЭЛПС. Возможно, именно присутствие ЭЛПС может объяснить биологический эффект специфичности.

Показано, что моносахар идный состав ЛПС и ЭЛПС сходен (табл. 2).

Таблица 2

Качественный моносахаридами состав и соотношение площадей пиков полнсахаркдсодержащих биополимеров штаммов X. campestris. pv. campestris В 610 и X. campestris. pv. vesicatoria В 546

Образец Моносахарид ( соотношение площадей пиков)

Рамноза Глюкоза Манноза Галактуроновая кислота Амино-сахар

ЭЛПС (X. campestris. pv. campestris. 8183") 0,8 1

ЭЛПС (X. campestris. pv. campestris. В 610) 0,9 1 - - -

ЭПС (X.campestris. pv. vesicatoria. В 546) - 1 3 3 -

ПСЛК (X. campestris. pv. campestris. В 610) - 2 2 1 -

Впервые установлено, что в строении ЭЛПС и ЛПС существует различие в связи между липидной и остальной частью молекулы. Моносахаридный состав ПСЛК близок с ранее определёнными таковыми для ЭПС бактерий патовара Xanthomonas campestris pv. campestris, за исключением галактуроновой кислоты, которая обнаружена для ЭПС данного рода бактерий впервые. Выявлено сходство в качественном моносахаридном составе и различие в количественном соотношении между ПСЛК штаммов X. campestris pv. campestris 8183a и X. campestris pv. campestris В 610 и ЭПС штаммов X. campestris pv. vesicatoria В 546. Этот факт для перечисленных выше штаммов обнаружен впервые.

Биологический эффект углеводсодержащих биополимеров бактерий

рода Xanthomonas Были произведены эксперименты по выявлению биологического эффекта, вызываемого выделенными углеводсодержащими биополимерами штаммов X. campestris pv. campestris 8183a и X. campestris pv. campestris В 610 и экзополисахарида штамма X. campestris pv. campestris В 611 (NRRL-1459). В результате исследований было выявлено, что ПСЛК исследуемых штаммов является биологически активным биополимером в отношении растения-хозяина Brassica olerasea var. capitata f. alba (капусты белокочанной).

Биологическая активность ГТСЛК проявлялась в фитотоксичности по отношению к растению-хозяину, в листья которых он был иннокулирован. Морфологически взаимодействие проявлялось в виде появления темных пятен, которые имели свою динамику развития и приводили к гибели листовой пластинки (рис 4). Способность препаратов ПСЛК из штаммов X. сатрезМв ру. сатрезМв В 611 и X. сатрезМз. ру. сатре^ш 8183а оказывать фитотоксический эффект на растения семейства крестоцветные была установлена впервые. Этот факт подтверждает общую способность ЭПС рода ХапЛотопаэ проявлять фитотоксичность к растениям-хозяевам.

Ранее существовала точка зрения, что данные «маслянистые пятна» возникают за счёт перенасышения влагой листовой ткани (Матышевская, 1984; Яковлева, 1992). Нами экспериментально было установлено, что чем темнее становились пятна и чем больше проходило времени с начала их появления, тем более сухими они являлись.

На основании проведённых исследований нами сделано заключение, что процессы, происходящие в растительной ткани при нанесении препарата ПСЛК, приводят к образованию геля той или иной степени прочности. Вследствие этого наблюдалась гибель клеток листовой пластинки в окружающей области, как правило превышающей в несколько раз площадь участка взаимодействия ПСЛК с растительными клетками.

Заражение бактериальной культурой исследуемых штаммов вызывало возникновение типичных изменений, характерных для сосудистого бактериоза крестоцветных. В свою очередь нанесение культуральной жидкости влекло некоторое пожелтение листовой пластинки в области её введения. При инокуляции ЭЛПС происходило пожелтение листовой пластинки, при этом лист становился более прозрачным. В ряде случаев при нанесении ЭЛПС происходило локальное обесцвечивание участка листа в месте скапливания препарата при инъекции его в жилку листа. Помимо иннокуляции применяли метод погружения срезанных листьев в лунки, заполненные исследуемым раствором препарата. В результате отмечалась гибель листовой пластинки вследствие хлороза с последующим обесцвечиванием листа. Отмечено, что

Рис. 4. Поражение листовой пластинки капусты при воздействии ПСЛК

биологическое действие ЭЛПС после удаления белка проназой не изменялось. Таким образом, можно сделать вывод о том, что в биологическом эффекте ЭЛПС белковая составляющая не принимает участия.

Иннокулирование ЛПС вызывало появление выраженных участков почернения на листьях, корешках (при непосредственном на них нанесении) и стеблях. Перечисленные явления для ЛПС наиболее чётко проявлялись при нанесения препарата на растения, выращенные в стерильных условиях.

Использование контрольных растений из различных семейств показало, что симптомы, описанные выше, возникали только у крестоцветных. Это свидетельствует о специфическом характере воздействия исследуемых препаратов.

Для установления связи патогенности с молекулярной массой и соответственно с вязкостью ПСЛК были исследованы препараты из штамма X. campestris pv. campestris В 610, полученные после воздействия ультразвуком и гидролиза в соляной кислоте различной концентрации. Полученные после данных процедур препараты имели уменьшенную вязкость. В результате проведённых экспериментов можно сделать вывод о корреляции способности ПСЛК вызывать гелевые образования в листьях капусты с вязкостью и соответственно молекулярной массой ПСЛК. Удаление пирувильных и ацетильных группировок не приводит к потере способности ПСЛК вызывать гелиевые образования в листьях.

Ранее был установлен факт, что олигосахаридные компоненты различных микроорганизмов способны проявлять биологическую активность (Феофилова, 1983; Озерецковская, 2001). На основании этого возникло предположение о возможном участии олигосахаридов в фитопатогенезе. Для подтверждения этого предположения нами были проведены эксперименты по иннокулированию в листья капусты низкомолекулярных продуктов гидролиза, содержащих олигосахариды из ПСЖ и ЭЛПС бактерий рода Xanthomonas.

ЭЛПС, полученный из культуральной жидкости бактерий штамма X. campestris pv. campestris В 610, а также ПСЛК из штамма X. campestris pv. campestris В 610 и X. campestris pv. campestris 8183a, ЭПС из штамма X. campestris pv. campestris В 611 подвергали. Срезанные листья капусты помещали в лунки с раствором полученных препаратов. В качестве контроля использовали растения семейства паслёновых: картофель, перец, а также растения других семейств: петрушку (Petroselimm crispum), мяту (Mentha piperita), бархатцы обыкновенные (Tagetes erecta). Листья контрольных растений помещали в раствор гидролизата ПСЛК. С целью проверки

биологического действия олигосахаридов из других источников использовали водорастворимый крахмал, природный полимер полисахаридной природы «агар», растворы олигосахаридов лактозы и сахарозы в концентрациях 3 и 6 | мг/мл. Крахмал и «агар» гидролизовали в 4Н серной кислоте при тех же i условиях, что и ЭЛПС и ПСЛК.

Исследуемые растения помещали под солнечный свет при температуре 26-30° С. Было отмечено, что на 3 или 4 день листовые пластинки капусты, а I также картофеля и перца теряли свой тургор и на 5 день отмечался хлороз. На 6 I или 7 день наступала гибель листа. У листьев капусты при воздействии I препаратов из ПСЛК, ЭПС и ЭЛПС, а также у листьев перца (рис. 5) при воздействии препаратов ПСЛК и ЭПС перечисленных выше штаммов на 5 или 6 день возникало почернение жилок листа и появление чёрных пятен на листьях.

Следует отметить, что появление ' данных образований на листьях перца соответствует описанным симптомам чёрной бактериальной пятнистости паслёновых (Jeanes, 1976). Бархатцы, петрушка и мята не изменялись под воздействием данных препаратов. Контрольные растворы не вызывали 1 изменений у исследуемых растений. 1 Проверку наличия олигосахаридов в ис-1 следуемых растворах ПСЛК и ЭЛПС про-1 водили методом высокоэффективной жид-I костной хроматографии (ВЭЖХ), предварительно определяя зону выхода I олигосахаридов. На хроматограмме гидролизатов ПСЛК и ЭЛПС штамма I X. campestris pv. campes tris В 610 наблюдалось присутствие пиков, 1 соответствующих олигосахаридам (рис. 6). С целью проверки действия содержащихся в гидролизате моносахаридов использовали раствор из определённых ранее в составе исследуемых образцов моносахаридов, взятых в аналогичных соотношениях. Также употребляли в качестве контроля раствор глюкозамина. Патологических изменений в листьях крестоцветных обнаружено не было.

Из приведённых данных следует, что олигосахариды и 1 модифицированные моносахариды из ПСЛК и ЭЛПС штамма X. campestris pv. campestris В 610 и ПСЛК штамма X. campestris pv. campestris 8183a и

Рис. 5. Изменения, возникающие в листьях капусты при погружении в раствор гидролизам ПСЛК.

олигосахариды из ЭПС из штамма X. сатреяМз р\. сатрев1ш В 611 оказывают фитотоксическое действие на растения-хозяева.

Рис. 6. Хроматограмма смеси гидролизата материала ПСЖ из культуральной жидкости штамма X. сатреИгг! ру. сатреыгк В 610

Примечание:

Пик - 1 и 2 соответствуют олигосахаридам

Пик - 3 соответствует галактуроновой кислоте

Пик - 4 соответствует глюкозе

Пик - 5 соотвествует маннозе

Пик - 6 неидешифицированный компонент.

Описанные выше изменения в листовой пластинке соответствуют симптомам болезни сосудистого бактериоза и возникают при тех же условиях и примерно через тот же временной промежуток. Явление действия олигосахаридов как факторов фитотоксичности показано впервые для бактерий рода Хапйютопаъ. Также нами не найдено сведений в литературе, говорящих о проявлениях фитотоксичности олигосахаридов (т.е. участии олигосахаридов в развитии симптомов заболевания), касающихся фитопатологии.

Отмечено явление расширения спектра специфичности за счёт способности смеси олигосахаридов и модифицированных моносахаридов ПСЛК из штаммов X. сатрезМя ру. сатреБЫз В 610 и X. сатрезМэ ру. сатретт 8183" и олигосахаридов из ЭПС X. сатреъгш ру. сатре$1т В 611 оказывать фитотоксическое действие на растения семейства паслёновых, которые являются растениями-хозяевами бактерий X. сатреБ^ ру.уеякШопа. Данный эффект свидетельствует о сходстве о л игосахар и дны х фрагментов из полисахаридов штаммов бактерий обоих патоваров и об общности механизмов

фитопатогенеза. Подтверждением этого являются установленные соотношения моносахаридов в ПСЛК штамма X. campestris pv. campestris В 610 и ЭПС штамма X. campestris pv. vesicatoria В 546. Из этого следует, что качественный моносахаридный состав их сходен, а количественные соотношения моносахаридов различны. Можно полагать, что при деполимеризации возникают олигосахаридные фрагменты, близкие по своему строению и оказывающие сходное биологическое действие. Возможно, что различия в специфичности заключаются в способности растений-хозяев оказывать специфическое деполимеризующее воздействие на макромолекулы патогенов, что требует дополнительных исследований.

Выводы

1. Проведён анализ биополимерного состава липополисахарида штамма X. campestris pv. campestris 8183a. Установлен жирнокислотный состав липида А. Выявлено, что О-ПС из данного штамма состоит из двух фракций: нейтральной и имеющей отрицательный заряд. Определён качественный и количественный моносахаридный состав обеих О-ПС.

- полимер, не растворимый в водном феноле, является сложным по своему составу, содержит значительное количество липидов, что дало основание обозначить его как полисахаридлипидный комплекс (ПСЛК);

- полимер, имеющий сродство к водному фенолу, назван нами ЭЛПС в связи с его физико-химическими свойствами.

3. Выявлено сходство в жирнокислотном составе липидной части ПСЛК и ЭЛПС.

4. Установлено, что связь между липидной и углеводной частью макромолекул ПСЛК и ЭЛПС является более устойчивой к кислотному гидролизу и отличается от таковой в ЛПС наружной мембраны.

5. Выявлено, что качественный и количественный моносахаридный состав сходен у ПСЛК штаммов X. campestris pv. campestris В 610 и X. campestris pv. campestris 8183a. У ЭПС штамма X. campestris pv. vesicatoria В 546 сходен с предыдущими по качественному составу, но различен по количественному. Определён моносахаридный состав у ЭЛПС штамма X. campestris pv. campestris 8183a и X. campestris pv. campestris В 610.

6. Установлено, что модифицированный метод Вестфаля эффективен для разделения ЭЛПС и ПСЛК из культуральной жидкости бактерий вида X. campest ris.

7. Показано, что ПСЛК штаммов X. campestris pv. campestris В 610 и X. campestris pv. campestris 8183a способны оказывать фитотоксическое действие посредством образования геля с растительной тканью только растения-хозяина. ЭЛПС штамма X. campestris pv. campestris В 610 вызывает появление специфических симптомов в листьях растения-хозяина, ЛПС из наружной мембраны штамма X. campestris pv. campestris В 610 проявляет биологическую активность, отличную от симптомов вызываемых ЭЛПС.

8. Установлено, что низкомолекулярные компоненты (олигосахариды и производные моносахаридов), полученные путём гидролиза ПСЖ и ЭЛПС штаммов X. campestris pv. campestris В 610, ПСЛК X. campestris pv. campestris 8183a и ЭПС X. campestris pv. campestris В 611, вызывают появление специфических симптомов заболевания сосудистого бактериоза у капусты белокочанной (Brassica olerasea var. capitata f. alba) и чёрной бактериальной пятнистости паслёновых у перцев сладких.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Козулин, В.В. Полисахаридные комплексы, липополисахаридыи О-специ-фические полисахариды бактерий Xanthomonas campestris pv. campestris 8183a / B.B. Козулин, A.H. Микеров, O.E. Макаров, И.М. Скворцов // Биосинтез и деградация микробных полимеров. Фундаментальные и прикладные аспекты : тезисы докладов и сообщений Всероссийской конференции, 13-17 июня 1995 г., Пущино, Россия. - Пущино, 1995. - С. 28.

2. Козулин, В.В. Полисахаридные комплексы, липополисахариды и О -специфические полисахариды бактерий Xanthamonas campestris pv. campestris 8183" / B.B. Козулин, A.H. Микеров,. O.E. Макаров, И.М. Скворцов, В. В. Игнатов // Микробиология. - 1997. - Т. 66, № 2. - С. 192-197.

3. Козулин, В.В. Полисахаридные комплексы, липополисахариды и О -специфические полисахариды бактерий Xanthomonas campestris pv. campestris 8183а/B.B. Козулин, И.М. Скворцов, A.A. Щербаков // Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологические безопасные технологии : тезисы международной конференции молодых учёных, 28 сентября 2003, Тверь, Россия. - Тверь, 2003. - С. 11-12.

4. Козулин, B.B. Углеводсодержащие биополимеры Xanthomonas campestris pv. campestris В 610 / B.B. Козулин, В.А. Пискунов, И.К. Сорокина, A.A. Щербаков // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н. И. Вавилова. - 2005. -№1.-С. 13-17.

5. Козулин, В.В. Механизмы вирулентности углеводсодержащих комплексов бактерий Xanthomonas campestris ! B.B. Козулин, A.A. Щербаков // Информационные технологии в науке, производстве и социальной сфере : сб.. научных трудов. - Саратов : Научная книга, 2005. - С. 185-188.

6. Козулин, В.В. Химический состав и биологическая активность углеводсодержащих биополимеров Xanthomonas campestris pv. campestris В 610 и Xanthomonas campestris pv. campestris В 546 / B.B. Козулин, A.A. Щербаков II Актуальные проблемы ветеринарной патологии, физиологии, биотехнологии, селекции животных. Современные технологии переработки сельскохозяйственной продукции : тезисы Всероссийской конференции, 4-8 февраля 2008, Саратов, Россия. - Саратов, 2008. - С. 25-26.

Выражаю благодарность за заданное научное направление и руководство на начальных этапах выполнения диссертационной работы доктору химических наук, профессору Скворцову К М.

Подписано в печать 27.04.2009 Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Roman. Печать RISO. Объем 1,0 печ. л. Тираж 100 экз. Заказ № 151

Отпечатано с готового оригинал-макета Центр полиграфических и копировальных услуг Предприниматель Серман Ю.Б. Свидетельство №3117 410600, Саратов, ул. Московская, д.152, офис 19, тел. 26-18-19, 51-16-28

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Козулин, Владимир Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Фитопатогенные бактерии рода ХагйкотопаБ.

1.1.1. Таксономическое расположение бактерий рот.ХапЖотопа8 . . 13 1.1.2 Физиолого — морфологические особенности бактерий рода ХаЫкотопаБ.

1.1.3. Характеристика фитопатогенных процессов, вызываемых бактериями рода ХаЫкотопай.

1.1.4. Практическое значение бактерииХаЫкотопах сатре&1г'1&.

1.2. Участие углеводсодержащих биополимеров в фитопатогенезе.

1.2.1 .Строение клеточной оболочки грамотрицательных микроорганизмов.

1.2.2. Выделение и очистка углеводсодержащих биополимеров из культуральной жидкости и липополисахаридов из наружной мембраны бактерий ХаМ/ютопаз сатреьичз.

1.2.3. Реологические характеристики растворов полисахаридов.

1.2.4. Биологическая роль углеводсодержащих биополимеров и зависимость её от их физико-химических свойств.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Культуры микроорганизмов.

2.1.2. Растительные объекты.

2.1.3. Приборы и материалы.

2.2. Методы исследований.

2.2.1. Проведение инокуляции растительных объектов бактериальной культурой и исследуемыми препаратами.

2.2.2. Хроматографические методы.

2.2.3. Колориметрические определения.

2.2.4. Обработка высокомолекулярного материала из культуральной жидкости 45% фенолом.

2.2.5. Определение содержания жирных кислот.

2.2.6. Выделение и,очистка экзополисахарида из культуральной жидкости.

2.2.7. Методы выделения ЛПС из наружной мембраны.

2.2.8. Получение О-ПС посредством кислотного гидролиза ЛПС

2.2.9. Обработка полисахарида ультразвуком.

2.2.10. Удаление белковых примесей с помощью проназы.

2.2.11. Определение вязкости полисахарида.

2.2.12. Обработка водных растворов полисахаридов хлороформом

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Выделение и определение физико-химических свойств ЛПС и О-ПС X. campestris pv. campestris 8183a.

3.1.1. Получение и выделение ЛПС наружной мембраны бактерий X. campestris pv. campestris 8183a и X. campestris pv. campestris B610.

3.1.2. Хроматографическое разделение ЛПС и определение его химического состава.

3.1.3. Деградация ЛПС штаммов X campestris pv. campesrtris 8183a и В 610 и получение О-ПС штамма X. campestris pv. campesrtris 8183a и его химический состав.

3.2. Выделение полисахаридсодержащего продукта из культуральной жидкости бактерий штаммов Xanthomonas campestris pv. campestris

В 610 и Xanthomonas campestris pv. campestris 8183a и определение его физико-химических свойств.

3.2.1. Получение и выделение углеводсодержащих биополимеров из культуральной жидкости штаммов бактерий X campestris pv. campestris В 610 и X. campestris pv. campestris 8183a.

3.2.2. Определение и анализ биополимерного состава углеводсодержащих полимеров из культуральной жидкости.

3.2.3. Определение моносахаридного состава полисахаридсодержащих полимеров из культуральной жидкости штаммов X. campestris pv. campestris 8183a, X. campestris pv. campestris В 610 иХ. campestris pv. vesicatoria В 546.

3.3. Биологический эффект углеводсодержащих биополимеров бактерий рода Xanthomonas.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Углеводсодержащие биополимеры Xanthomonas campestris и их роль в фитопатогенных процессах"

Актуальность темы.

Микроорганизмы рода Хаыкотопаз являются фитопатогенами широкого спектра действия, охватывающего большинство семейств сельскохозяйственных культур. Экономический ущерб, наносимый заболеваниями, вызываемыми бактериями этого рода, значителен и достигает высоких цифр. В связи с этим изучение ксантомонад начато с периода их выделения и установления их вирулентных свойств.

С целью поиска эффективных средств защиты для борьбы с болезнями, возбудителями которых являются микроорганизмы данного рода, выявление механизмов фитопатогенеза становится одним из приоритетных направлений научных работ в этой области [10, 15, 38, 61, 64].

Важнейшей задачей в данной отрасли исследований является нахождение веществ микробного происхождения, ответственных за проявление тех или иных симптомов заболевания. Особую роль во взаимодействии растение-хозяин - микробная клетка играют полисахариды микробного происхождения, т.к. возможность различных вариаций из моносахаридов практически беспредельна [27]. Обусловлено это также высокой реакционной способностью моносахаридов. Исследования в этой области начаты сравнительно недавно [26, 38, 64], в связи с этим основной недостаток существующей информации состоит в её противоречивости. Большинство исследователей считает, что полисахариды ксантомонад биологически активны в отношении растения-хозяина, но этот вопрос остаётся не решённым окончательно.

Известно, что виды этого рода подразделяются на многочисленные патовары, которые отличаются друг от друга способностью вызывать заболевание только у определённых растений. Невыясненным остаётся вопрос, с чем связан механизм специфичности. Некоторые работы подтверждают, что внеклеточные полисахариды Xanthomonas campestris оказывают специфическое фитотоксичное действие [64, 38]. Результаты других не подтверждают этого [38, 66, 71, 143]. Если утверждение первых верно, то неясно, каким образом это происходит, т. к. моносахаридный состав полисахаридов этого вида схож [10].

Данные по химическому составу и биологическому действию внеклеточных липополисахаридов (ЛПС) грамотрицательных бактерий немногочисленны [17]. У бактерий рода Xanthomonas они выделены не были. Информация по физико-химическим и биологическим свойствам ЛПС микроорганизмов данного рода носит ограниченный характер [98, 143, 144, 145, 59]. Показано, что при внесении их в корневую область проростков капусты также происходит угнетение роста [59]. Комплексное, сравнительное изучение свойств углеводсодержащих биополимеров ксантомонад позволит более определённо ответить на вопрос об их участии в фитопатогенных процессах.

Цель и задачи исследования.

Цель исследования — выделение и изучение физико-химических и биологических свойств углеводсодержащих биополимеров из культуральной жидкости и наружной мембраны бактерий Xanthomonas campestris.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Выделить ЛПС из наружной мембраны бактерий X. campestris.

2. Определить физико-химические свойства выделенного ЛПС.

3. Получить О-специфический полисахарид (О-ПС) штамма Xanthomonas campesti'is pv. campestris 8183a и провести анализ его химического состава.

4. Выделить внеклеточные полисахаридсодержащие биополимеры из культуральной жидкости бактерий X. campestris pv. campestris и X. campestris pv. vesicatoria, провести сравнительное исследование их физико-химических свойств.

Научная новизна. Впервые показано фитотоксическое действие смеси низкомолекулярных производных (олигосахаридов и модифицированных моносахаридов), фрагментов из полисахаридлипидных комплексов (ПСЛК) и экзолипополисахаридов (ЭЛПС) бактерий шаммов X. campestris pv. campesrtis 8183a, X. campesrtis pv. campesrtis В 610, X. campesrtis pv. campesrtis В 611. Этот тип взаимоотношений описан в фитопатологии впервые. Показано, что полисахаридлипидные комплексы (ПСЛК) штаммов X. campesrtis pv. campestris В 610 и X. campesrtis pv. campestris 8183a также способны оказывать специфическое фитотоксическое действие посредством образования гелевых структур в ткани растения-хозяина. Выявлено, что в результате деполимеризации внеклеточных углеводсодержащих 1 биополимеров (ПСЛК) штаммов X. campesrtis pv. campestris В 610, X. campesrtis pv. campestris В 611 и X. campesrtis pv. campestris 8183a происходит расширение спектра специфичности их действия на растения семейства паслёновых, являющихся растениями-хозяевами патовара X. campesrtis pv. vesicatoria. Показано, что полисахарид из культуральной 1 жидкости бактерий X. campestris представляет собой сложный биополимер, в состав которого входит липидная часть. Обнаружено различие в количественном моносахаридном составе углеводной части внеклеточных полисахаридов (ПСЛК) бактерий X. campestris pv. campestris штаммов В 610 и X. campestris pv. campestris 8183a и ЭПС X. campestris pv. vesicatoria штаммов В 546, различающихся по растению-хозяину. Впервые выделен и охарактеризован по физико-химическим свойствам экзолипополисахарид (ЭЛПС) из культуральной жидкости бактерии X. campestris и модифицирован метод его выделения. Выделен и охарактеризован по физико-химическим свойствам ЛПС из наружной мембраны штамма X. campestris pv. campestris 8183 a. Установлен химический состав О-специфического полисахарида, полученного из ЛПС этого штамма. Впервые для О-ПС бактерий рода Xanthomonas установлено присутствие фукозамина. Произведена сравнительная характеристика ЭЛПС и ЛПС штаммов X. campestris pv. campestris 8183a и X. campes tris pv. campes tris В 610, установлено различие в их химических и биологических свойствах. Установлена фитотоксичность ЭЛПС, проявляющаяся в виде не описанных ранее для действия данного препарата симптомов заболевания, специфичных для растения-хозяина (семейства крестоцветных), коренным образом отличающихся от изменений, вызываемых ЛПС этого же штамма.

Практическая значимость работы. Изучение свойств углеводсодержащих биополимеров бактерий X. campestris позволяет приблизиться к пониманию взаимоотношений в инфекционном процессе между возбудителем и организмом-хозяином. Полученные нами данные по ' расшифровке механизма вирулентности фитопатогенных бактериозов могут послужить основой для создания эффективных средств борьбы с ними, для определения восприимчивости растений к заболеванию.

Модифицированная нами методика выделения ЭЛПС бактерий рода Xanthomonas позволяет оптимизировать процесс получения данных веществ ' с целью дальнейшего их изучения.

Основные положения, выносимые на защиту: 1. Бактерии рода Xanthomonas способны выделять в окружающую среду два различных биополимера: а) внеклеточный липополисахарид (ЭЛПС), отличающийся по своему строению и биологическим свойствам от ЛПС наружной мембраны; б) углеводсодержащий биополимер из культуральной жидкости, представляющий собой полисахаридлипидный комплекс (ПСЛК), в состав которого входит липидная часть.

2. В состав ЛПС из наружной мембраны штамма X. сатреяЬчБ pv. сатреяМв 8183а входит два О-ПС, различающихся по своему заряду, и состоящих из остатков рамнозы и фукозамина.

3. Низкомолекулярные производные (олигосахариды и модифицированные моносахариды), фрагменты из полисахаридлипидных комплексов (ПСЛК) и экзолипополисахаридов (ЭЛПС) бактерий X. сатреэ^чэ обладают фитотоксичностью в отношении растения-хозяина, проявляющейся в виде специфических симптомов заболевания. Действие данных фрагментов имеет более широкий спектр, чем область фитопатогенного действия самих бактерий.

4. Внеклеточные углеводсодержащие биополимеры бактерий рода ХаЫкотопаБ обладают фитотоксичностью в отношении растения-хозяина.

5. Модифицированный метод Вестфаля является эффективным для раз- 1 деления и выделения углеводсодержащих биополимеров из культуральной жидкости бактерий рода ХапЖотопаз: ПСЛК и ЭЛПС.

Апробация работы. Материалы исследований, приведённые в диссертации, были представлены на конференции «Биосинтез и деградация микробных полимеров. Фундаментальные и прикладные аспекты» (г. Пущино-на-Оке, 1995), Международной конференции молодых учёных «Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии» (Тверь, 2003); научно-практической коференции «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте "Микроб"» (Саратов, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ, 2 из которых - в журналах ВАК РФ.

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии Саратовского государственного университета им. Н.И. Вавилова.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Козулин, Владимир Владимирович

Выводы

1. Проведён анализ биополимерного состава липополисахарида штамма X. campes tris pv. campestris 8183a. Установлен жирнокислотный состав липида А. Выявлено, что О-ПС из данного штамма состоит из двух фракций: нейтральной и имеющей отрицательный заряд. Определён качественный и количественный моносахаридный состав обеих О-ПС.

2. Установлено, что в культуральной жидкости штаммов X. campestris pv. campestris 8183a и X. campestris pv. campestris В 610 содержатся два различных углеводсодержащих биополимера: полимер, не растворимый в водном феноле, является сложным по своему составу, содержит значительное количество липидов, что дало основание обозначить его как полисахаридлипидный комплекс (ПСЛК);

- полимер, имеющий сродство к водному фенолу, назван нами ЭЛПС в связи с его физико-химическими свойствами.

3. Выявлено сходство в жирнокислотном составе липидной части ПСЛК и ЭЛПС.

7. Показано, что ПСЛК штаммов X. campestris pv. campestris В 610 и X. campestris pv. campestris 8183a способны оказывать фитотоксическое действие посредством образования геля с растительной тканью только растения-хозяина. ЭЛПС штамма X. campestris pv. campestris В 610 вызывает появление специфических симптомов в листьях растения-хозяина. ЛПС из наружной мембраны штамма X. campestris pv. campestris В 610 проявляет биологическую активность, отличную от симптомов вызываемых ЭЛПС.

8. Установлено, что низкомолекулярные компоненты (олигосахариды и производные моносахаридов), полученные путём гидролиза ПСЛК и ЭЛПС штаммов X campestris pv. campestris В 610, ПСЛК X. campestris pv. campestris 8183a и ЭПС X. campestris pv. campestris В 611, вызывают появление специфических симптомов заболевания сосудистого бактериоза у капусты белокочанной (Brassica olerasea var. capitata f. alba) и чёрной бактериальной пятнистости паслёновых у перцев сладких.

Заключение

Микроорганизмы в фитопатогенезе растений имеют определённое значение как для получения качественного урожая так и для сохранения вида.

Известно, что бактерии вида Xanthomonas способны поражать многочисленные виды сельскохозяйственных растений. Широкое распространение и значительные экономические потери, наносимые сельскому хозяйству обусловливают необходимость исследований бактерий этого рода. Сходство по морфологическим, культуральным, генетическим и биохимическим характеристикам многочисленных патоваров Xanthomonas campestris делают его удобным объектом для выявления факторов патогенности и их связей со специфичностью.

Внимание исследователей фитопатогенных микроорганизмов, начиная с 60х годов, привлекли углеводсодержащие полимеры бактерий. Их высокая информативная ёмкость, поверхностное расположение, дистантное действие обусловливает их особое значение.

К сожалению, накопленная информация о углеводсодержащих биополимерах обладает противоречивостью. Нет чёткого понимания о биологической роли экзополисахаридов, недостаточно изучен их химический состав. Не выяснено присуща ли им специфичность действия. Не прослеживается зависимости их биологических свойств от химического состава.

Вторым важным моментом является вопрос о гетерогенности полисахаридов накапливающихся в культуральной жидкости.

Данные по химическому составу ЛПС Xanthomonas campestris ограничены [28; 111, 10]. Роль в фитопатогенных процессах ЛПС не ясна. Исследования в этом направлении так же отличаются противоречивостью[59, 64]. Существует информация, что они способны оказывать угнетающее действие на развитие проростков капусты, т. е. обладают фитотоксичностью

59]. По другим данным, приводимым в обзоре JI. М. Яковлевой [64] ЛПС являются индукторами защитных сил растений.

Такие противоречия и определили направления наших исследований.

В этой связи были проведены исследования углеводсодержащих биополимеров из культуральной жидкости и наружной мембраны Xanthomonas campestris. В работе были использованы 3 штамма патовара X. campestris pv. campestris патогенные для крестоцветных и 1 штамм патовара X. campestris pv. vesicatoria патогенного для паслёновых.

В качестве объекта заражения использовались в основном растения семейства крестоцветных трёх сортов различающихся по времени созревания: ранний, средний и поздний. Так же заражению подвергались растения семейства паслёновых.

Был выделен и исследован по своим физико-химическим свойствам ЛПС из наружной мембраны шт. X campestris pv. campestris 8183a. Обработка биомассы проводилась по стандартному методу Вестфаля. Выделение и очистка от посторонних примесей - посредством гель-фильтрации.

Отделение О-ПС от липида А осуществлялось в условиях «мягкого» кислотного гидролиза в 1% уксусной кислоте. Моносахаридный состав О-ПС определялся с помощью методов бумажной хроматографии, ГЖХ, ВЭЖХ. Содержание аминосахаров определялось колориметрическими методами, а

13 . |. . . так же с помощью аминокислотного анализатора и посредством С ЯМР-спектроскопии.

В результате проведённых исследований было выяснено, что ЛПС обладает липофильностью, в его состав входят два О-ПС различающихся по своему заряду и имеющие одинаковый моносахаридный и аминосахаридный состав.

Был получен и исследован полисахарид из культуральной жидкости X. campestris. В результате его анализа, а так же по результатам других работ [18], показывающих наличие в культуральной жидкости грамотрицательных бактерий ЭЛПС, было предположено, что он находится в смеси с другими полимерами. Для их разделения нами был предложен модифицированный вариант метода Вестфаля для выделения ЭЛПС обладающего способностью преимущественно растворяться в водном феноле. Анализ выделенных полимеров проводился теми же методами, что и для ЛПС.

В результате исследований было установлено, что в состав полисахарида из культуральной жидкости входит липидный компонент. В связи с этим он был обозначен нами как - полисахаридлипидный комплекс (ПСЛК) [29, 30]. Выявлено отличие прочности связи липидной части с остальной частью молекулы у ПСЛК и ЭЛПС от связи липида А с кором в ЛПС. Показано, что моносахаридный состав ПСЛК X. campestris pv. campestris отличается по своим количественным характеристикам при сходстве качественных от X. campestris pv. vesicatoria. Отмечено, что липидный состав ЭЛПС у штамма X. campestris pv. campestris 8183a сходен с составом ПСЛК и различен с ЛПС. Отмечено сходство в моносахаридном составе ЭЛПС и ЛПС.

Для выявления биологической роли препаратов углеводсодержащих биополимеров были проведены эксперименты по заражению и исследованию растений семейства крестоцветных, паслёновых и растений других семейств. В результате таких экспериментов было выявлено, что ПСЛК из штамма X. campest?is pv. campestris 8183a и X. campestris pv. campestris В 610 обладают способностью вызывать фитоксичное действие и появление специфических пятен гелевой природы. Это подтверждает точку зрения (Rudolph К. 1978, El-Banoby F.E., 1980), о специфическом характере действия полисахарида из культуральной жидкости [88, 127].

Показано, что ЭЛПС штамма X. campestris pv. campestris В 610, так же проявляет фитотокисческие свойства, в виде специфических симптомов характерных для сосудистого бактериоза крестоцветных, ЛПС из штамма X. campestris pv. campestris В 610 вызывает образование чёрных пятен на растении-хозяине (капуста), которые можно охарактеризовать, как проявление реакции гиперчувствительности. Таким образом, следует сделать вывод о различном действии ЭЛПС и ЛПС.

Были проведены исследования по действию низкомолекулярных компонентов (олигосахаридов и модифицированных моносахаридов) производных из ПСЛК и ЭЛПС штаммов X. сатреяМБ ру. сатреяМя. Данные препараты получали путём кислотного гидролиза ПСЛК и ЭЛПС. Наличие олигосахаридов и других компонентов проверяли исследованием образцов с помощью метода ВЭЖХ.

В результате было показано, что смесь олигосахаридов и производных моносахаридов из данных полимерных комплексов обладает фитотоксической активностью проявляющейся в виде появления специфических симптомов сосудистого бактериоза капусты и чёрной бактериальной пятнистости паслёновых. Таким образом, был установлен факт не только фитотоксичности, но и расширения спектра фитотоксического действия низкомолекулярных производных из ПСЛК исследуемых штаммов. В связи с этим можно предположить, что олигосахаридные фрагменты из углеводсодержащих биополимеров различных штаммов сходны с друг другом и различие в спектре их действия связано со специфичным механизмом деполимеризации их.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Козулин, Владимир Владимирович, Саратов

1. Авазходжаев М.Х., Нуритдинова Х.В., Зельцер С.Ш., Мадаминова JI.M. Агглютинация инфекционных структур возбудителя вертициллёзного вилта фракциями лектина хлопчатника // Докл. АН. УзССР. 1969. - № 11. -с. 54-56.

2. Альсбергейм П. , Дарвилл А. Олигосахарины // В мире науки. 1985. №11. С. 16-23.

3. Бактериальные болезни растений. М., Сельхозгиз. 1960. 468 с.

4. Бельтюкова К. И., Матышевская М. С., Куликовская М. Д., Сидоренко С. С. Методы исследования возбудителей бактериальных болезней растений. Киев: Наукова думка, 1968. 316 с.

5. Варбанец Л.Д., Книрель Ю.А., Кочарова Н.А., Мурас В.А. Фитотоксины Corynebacterium sepedonicum и Pseudomonas solanacearum II Фитонциды. Бактериальные болезни растений: Материалы конф. ( Львов, сент. 1990 ). Львов, 1990. - Ч. II. - С. 35.

6. Воронкевич И.В., Шманенкова Т.Н. Биологическая роль внеклеточных полисахаридов возбудителя бактериоза сои Xanthomonas phaseoli var. sojense // Науч. докл. высш. шк. Биол. науки — 1968. — № 8. — С. 95-100.

7. Выгонский В.М., Узунов И.С Болезни и вредители плодов субтропических и тропических культур. Торгово-промышленная палата СССР, 1982 . 68 с.

8. Гарейшин А. Э. Свойства загустителей воды микробного происхождения. // Микробиологический журнал. 1983. - Т.45, №4. - С. 4751.

9. Гвоздяк Р.И., Матышевская М.С., Григорьев Е.Ф., Литвинчук О. А. Микробный полисахарид ксантан. Киев. Наукова думка 1989. 348 с.

10. Гвоздяк Р.И., Матышевкая М.С., Пасичник Л.А., Литвинчук O.A. Пировиноградная кислота экзополисахаридов бактерий рода Xanthomonas II Микробиологический журнал 1985. - Т. 47, № 3. - С. 29-31.

11. Гремякова Т. А. Структурно-функциональная вариабельность антигенов Yersinia pestis и методология конструирования противочумных иммунопрофилактических препаратов: Дис. .докт. биол. наук. — М., 2004 . -320 с.

12. Джалилов Ф.С. Сосудистый бактериоз. // Защита и карантин растений. 1999. - №4 . - С 56-57.

13. Джалилов Ф.С., Монахос Г.Ф., Тивари Р.Д. Вредоносность сосудистого бактериоза капусты // Известия ТСХА. 1989. - Вып. 3. - С. 169-172.

14. Дьяков Ю.Т., Озерецковская О.Л., Джавахия В.Г., Багирова С.Ф. Общая и молекулярная фитопатология. Москва. «Общество фитопатологов» 2001.-192 с.

15. Блинов Н.П. Химия микробных полисахаридов М.: Высш. шк., 1984.-256 с.

16. Захарова И.Я., Косенко Л.В. Методы изучения микробных полисахаридов. Киев: Наук, думка, 1982.- 192 с.

17. Здоровенко Г.М. Внеклеточный липополисахарид грамотрицательных бактерий // Микробиологический журнал. 1988.- Т. 50, №4.-С. 98-107.

18. Зимон А.Д., Лещенко А.Д. Коллоидная химия-М.: Химия, 1990 г. -336 с.

19. Игнатов А.Н., Кугинуки Я., Хида К., Монахос Г.Ф., Джалилов Ф.С. Патоген крестоцветных ХаЫкотопаз сатрезМя. О создании устойчивых к ксантомонадам растений семейства ВгазБгсеае II Сельскохозяйственная биология. 2002. - № 5. - С. 79-84.

20. Игнатов А.Н. Генетическое разнообразие фитопатогенных бактерий ХаШкотопаБ camptstris и устойчивость к ним растений семейства Вга.881сасеае\ Дис. . .докт. биол. наук. М., 2006. - 340 с.

21. Игнатов А. Н., Поляков К.Л., Самохвалов А.Н. Количественный анализ серологических признаков ХапШотопаБ сатреБМБ II Сельскохозяйственная биология 1998. — № 1.- С. 106-115.

22. Иссельбахер К.Е., Браунвельдф, Дж. Вильсон, Дж. Мартин, Фаучи А., Каспер Д. Справочник Харрисона по внутренним болезням. Серия Спутник врача. Питер, Издательский дом, 2001 г. 524 с.

23. Казаков И.Н., Ахмеджанов И.Г., Зельцер С.Ш., Авазходжаев М.Х. Мембраноактивные свойства токсического метаболита возбудителя вертициллёзного вилта хлопчатника // Узб. биол. журн. - 1989. — № 5. — С. 810.

24. Калашникова Е.Е., Чернышова М.П., Игнатов В.В. Внеклеточные протеазы фитопатогенных бактерий ХаЫЬатопаъ сатреяМз. // Микробиология. 2003.- Т. 72,№ 4. - С. 498-502.

25. Кирчова М. / Биосинтеза на ксантан от Хап^отопаэ сатрезЫз VI. Белтъчно съдържание и аминокиселинен състав на полимерн, синтезирани от щам К-6 // Науч. тр. Биол. / Пловдив, унив. 1988, - 26, № 6. - С. 355-361.

26. Книрель Ю.А.,. Кочетков Н.К Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий // Биохимия. 1993. - Т.58, Вып. 2 - С. 166201.

27. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. // Биохимия. 1994. - Т.59, Вып. 12. - С. 17841851.

28. Кочетков . Н.К., Бочков А.Ф., Дмитриев Б.А., Усов А.И., Чинсов Д.С., Шибаев В.Н. Химия углеводов. М. Химия, 1967.- 672 с.

29. Кулыиин В.А., Яковлев А.П., Аваева С.Н., Дмитриев Б.А. Улучшенный метод выделения липополисахаридов из грамотрицательных бактерий // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1987. -№5. - С. 44-46.

30. Кушманова О. Д., Ивченко Т. М. Руководство к практическим занятиям по биологической химии. М.: Медицина, 1966. 163 с.

31. Лазарев A.M. Бактериозы томата в защищённом грунте. // Защита и карантин растений. 2005 - №1 - С.22

32. Липатов Ю.С. Коллоидная химия полимеров. Киев: Наукова думка, 1984.-343 с.

33. Матвеева Е.В, Чумаевская М.А., Королева И.Б. Бактериальные болезни злаковых культур. — М.: "Агропромиздат", 1985. — 287 с.

34. Матышевкая М.С. Влияние фитопатогенных бактерий на физиолого-биохимические свойства растений. Киев: Наук. Думка, 1975. -236 с.

35. Матышевская М.С. Экзополисахариды фитопатогенных бактерий и их роль в развитии бактериозов // Микробиол. журнал. 1984. - Т. 46, № 3. -С. 88-100.

36. Матышевская М.С., Гвоздяк Р.И., Сидоренко С.С., Литвинчук O.A., Пасичник Л.И. Моносахаридный состав экзополисахаридов бактерий рода Xanthomonas II Микробиол. журнал. — 1985. — Т. 47, № 2, — С. 30-33.

37. Матышевская М.С., Майко И.И., Гвоздяк Р.И. и др. Образование экзополисахаридов бактериями рода Xantomonasll Микробиол. журнал. -1981.-Т. 43, №5.-С. 594-601.

38. Матышевская М.С., Майко И.И., Сидоренко С.С. и др. Экзополисахариды бактерий рода Xantomonas II VI съезд Всесоюзного микробиологического общества ( Рига, март 1980 г. ) : Тез. докл. — Рига, март -1980.-Т. 4-С. 55.

39. Мдивани Р. В. Анатомические изменения растений томатов при бактериозах // Защита и карантин растений. — 2000. — №3 — С.44.

40. Методы химии углеводов. / Под редакцией Н.К. Кочеткова. М.: Мир, 1967.-С. 261-262.

41. Методы общей бактериологи. / Под ред. Ф. Герхарда и др. М.: Мир, 1983.-Т. 1. -340с.

42. Нойбергер А., Маршалл Р. Методы качественного иколичественного анализа углеводных компонентов // Гликопротеины / Под. ред. А. Тотшалка. М.: Мир, 1969. Т. 1. - С.195-238.

43. Обзор появления и распространения вредителей и болезней сельскохозяйственных культур в 1970 году, прогноз на 1971 г. и мероприятияпо защите растений по Ярославской области. Ярославль, 1971 г. / Под редакцией В. Н. Михайлова . Ярославль, 1971 г. С. 79.

44. Озерецковская О. Л., Роменская И.Г., Олигосахарины как регуляторные молекулы растений // Физиология растений. — 1996. — Т. 43, № 5, С. 743-752.

45. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985.-536 с.

46. Перечень вредителей, болезней растений и сорняков, имеющихкарантинное значение для СССР. — М., 1986г. — 29 с.

47. Поляков И.Я., Персов М.П., Смирнов В.А. Прогноз развития вредителей и болезней сельскохозяйственных культур. — Л.: Колос. Ленинградское отделение, 1984. — 318 с.

48. Рабек Я. Экспериментальные методы в химии полимеров / Под редакцией В. В. Коршака М.: Мир. 1983. -253 с.

49. Распространение вредителей и болезней сельскохозяйственных культур в РСФСР в 1969 г. и прогноз их появления в 1970 г. // М.: ВНИИ защиты растений. 1970 г. -295 с.

50. Рябчинская Т.А. К защите растений особый подход // Защита и карантин растений. — 2000 . - №5. — С. 35-42.

51. Самохвалов А.Н., Игнатов А.Н., Рогачёв Ю.Б., Колесников И.М., Захаров Н.И. Сосудистый бактериоз капусты // Защита и карантин растений. -1996. -№7.- С. 37.

52. Сидоренко С.С., Матышевская М.С., Айзенберг С. 3. и др. Сверхчувствительная реакция табака и томатов, вызываемая бактериями рода ХаЫкатопаэ II Микробиол. журнал. — 1981. — Т.43, №5. — С. 601 605.

53. Слонекер Д. Газожидкостная хроматография ацетатов альдегидов // Методы исследования альдегидов/ Под. ред. А. Я. Хорлина. М.: Мир, 1975. — С. 22-25.

54. Спирин А. С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот // Биохимия. 1958. - Т. 23, № 5. — С. 656662.

55. Стадник Г.И., Калашникова Е.Н., Коннова С.И., Игнатов В.В. Роль поверхностных и внеклеточных соединений бактерий Xanthomonas campestris в патогенных взаимоотношениях с растениями капусты. // Микробиология. 2001г. -Т. 70, № 2 - С. 270 -274.

56. Страйер Л. Биохимия. М. «Мир», 1984 - С. 218-233.

57. Тарр С. Основы патологии растений. М.: Мир, 1975 г. —587 с .

58. Усов А.И. Олигосахарины новый класс сигнальных молекул ратений. // Успехи химии. - 1993. - Т. 62., № 11 - С. 1119-1144.

59. Феофилова Е.П. Клеточная стенка грибов. М.: Наука, 1983. — 367с.

60. Яковлева Л.М. Роль гликополимеров бактерий в патогенезе бактериозов растений. // Микробиол. журнал. 1992. - Т. 54, № 3. — С. 87 -102.

61. Akiyama Y., Shigeru E., Shigeri Nishikawaji et al. Extracellular polysaccharide produced by a virulent strain (U-7) of Psendomonas solanacearum II Agr. Biol. Chem. 1986. -Vol.50, № 3. - P. 747-751.

62. Akiyama Y., Shigeki Nishikawaji, Shigeru Eda et al. Lipopolysaccharide of Psendomonas solanacearum II Agr. Biol. Chem. 1985. - Vol. 49, № 4. - P. 1193-1194.

63. Al Hendy Ayman, Toivanen R., Skurnik M. / Rapid method for isolation and staining of bacterial lipopolysaccharide // Microbiol. And Immunol. — 1991, -Vol.35, №4.-P. 331-333.

64. Alexander C., Rietschel E.T. Bacterial lipopolisaccharides and innate immunity // J. Endotoxin Res. 2001. -Vol. 7 - P. 167-202.

65. Angadi C.V. In vivo production of slime toxin in bacterial blight infected rice plants. //- Phytopathol. 1978, -V. 92, № 3, - P. 171 - 180.

66. Angadi C.V. Extracellular slime of Xanthomonas oryzae in bacterial of of blight rice // Phytopath. Z. 1979. - Vol. 93, № 2 - P. 171-180.

67. Ayers A.R., Ayers S.B., Goodman R.N. Extracellular polysaccharide of Erwinia amylowora a correlation with virulence. // Appl. and Environ. Microbiol.,- 1969, Vol.38, № 4. P. 659 - 666.

68. Baron C., Zambryski P.C. Notes from the underground: Highlights from plant microbe interactions // Disease Pest. Resist. 1995. - Vol. 3 — P. 356 — 362.

69. Barton-Willis P.A., Wang M.C., Holliday M.I. et al. Purification and composition of lipopolysaccharide from Pseudomonas syringae pv. glycinea // Physiol. Plant. Pathol. 1984. - Vol. 25, № 3. - P. 387-396.

70. Berenblum I., Chain E. An improved method for the colorimetric determination of phosphate // Biochem. J. 1938. - V. 32, № 2. - P. 295-298.

71. Bergey s manual of Determinative Bacteriology. Baltimore / London Williams and Wilkins, 1997. - Vol. 1. - p. 964

72. Beveridige T. J. The periplasmic space and the periplasm in Grampositive and Gram-negative bacteria. // ASM News 1995 - Vol. 61: — P.125-130.

73. Bukharov A.V., Skvortsov I.M., Ignatov V.V., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Dabrowski J. Structure of O-specific polysaccharide of Xanthomonas campestris NCPPB 45 lipopolysaccharide // Carbohydrate Research. 1993. — Vol. 241.-P. 309-316.

74. Cadieux J.E., Kuzio J., Milazzo F.H., Kropinski A.M. Spontantaneous release of lipopolisaccharides dy Pseudomonas aeruginosa II J. Bacteriol. — 1983. -Vol. 155, № 2-P. 817-825.

75. Cheetman N.W. H., Mashimba E.N. M. Proton and carbon-13 NMR studies on xathan derivatives // Carbohydr. Polym. 1992. - Vol. 17, № 2. -P. 127-136.

76. Clatlin L.E., Vidaver A.K, Sasser M. MXP a semi-selective medium for Xanthomonas campestris pv. phaseoli II Phytopatology. — 1987. — Vol. 77, № 5. — P.730-734.

77. Darveau R. P. Hancock R. E. Procedure for isolation of bacterial lipopolysaccharides from both smooth and rough Pseudomonas aeruginosa and Salmonella typhimurium strains. //1. Bacteriol. 1983. - V. 155, № 2 - P. 831-838

78. DiRenso J.M., Nacamura K., Inouye M. The outer membrane proteins of gram-negative bacteria: biosynthesis, assembly, and functions // Ann. Rev. Biochem. 1978 - Vol. - 47. - P.481 -532.

79. Dische Z. A new specific color reaction of hexuronic acid // J. Biol. Chem. -1947. -V. 167, № 1. P. 295-298.

80. Dorkar S.G., Verma J.P. Correlation between sugar uptake, virulence and exopolysaccharide production by races of bacterion by races Xanthomopnas campestris pv. malvacearum II Indian J. Exp. Biol. — 1990. — Vol. 28, № 7. — P. 699-700.

81. Dubois M., Gilles K. Colorimetric method for determination of sugars and related substances II Anal. Chem. 1956. - Vol. 28, № 3. P. 350-356.

82. El-Banoby F.E., Rudolph K., Huttermann A. Biological and physical properties of anxtracellular polysaccharide from Pseudomonas phaseolicola II Physiol. Plant. Pathol. 1980. - Vol. 17, № 3. - P. 291 - 301.

83. El-Banoby F.E., Rudolph K. Induction of water soaced lesions in plant leaves by polysaccharides of phytopatogenic pseudomonads and xanthomonads. — In. 3 rd. Int. congr. of Plant. Pathol. (16-23 Aug. Munchen). Munchen, 1978, p. 38-43.

84. Fareed V.S., Persival E. Structural investigation of the extracellular polysaccharide elaborated dy SI9. A Xanthomonas-type bacterium // Carbohydr. Res. 1976. - № 49. - P. 427-438.

85. Fett W. F., Osman S.F., Fishman M.R., Siebles T. S. Alginate production by plant pathogenic Pseudomonas II Appl. Environ. Microbiol. 1986. - 52, № 3 -P. 466-473.

86. Garcin A., Neyrand S., Fabresse M. Fruits a noyau sensibilite varietale au Xanthomonas II Arboric. fruit.-2007.-N 612.-P. 28-32.

87. Girardin S.E., Philpott D.J., Lemaitre B. Sensing microbes by diverse hosts. Workshop on Pattern Recognition Proteins and Receptors // EMBO reports — 2003, Vol.4.-P. 932-936.

88. Gorin P.A., Spenser J.F. Structural relatoinship of extracellular polysaccharides from phytopathogenic spp. Pt 2. X. hyacinthi, X. translucens, X. maculifolii-gardeniae II Can. J. Chem. — 1963. Vol. 41, №9.-P. 2357-2361.

89. Hayward .A.S. A method for caracterising P. solanacearum II Nature. — 1960 Vol. 186, № 4722. - P. 405-406.

90. Hestrin S. The reaction of acetylcholine and other carboxylic acid derivatives with hydroxylamine, and its analyticalfhhlicftion // J. Biol. Chem. -1949. Vol. 180, № 1. - P. 249-261.

91. Hickman J., Ashwell J. Isolation of a Bacterial Lipopolysaccharide from Xanthomonas campestris Containing 3-Acetamido-3, 6-dideoxy-D-galactose and d-Rhamnose II J. Biol. Chem. 1966. - Vol 241, № 6. - P. 1424-1428.

92. Hodgson R., Rirer A.I., Peterson W.H. Polysaccharide production by virulent and attenuated crown gall bacteria // J. Biol. Chem. - 1945. - Vol. 159, № l.-P. 89-100.

93. Hodgson R., Peterson W.H. Ricer A.I. The toxicity to polysaccharides and other large molecules to tomato cuttings // Phytopathology. 1949. - Vol.39, № 1 P. 47-62.

94. Holzwarth G. Molecular weight of xanthan polysaccharide // Carbohydrate Research. 1978- Vol. 66 - P. 173-186

95. Horton D., Mols O., Walaszek Z. Structural and biosynthetic on1 "Jxanthan by C n. m. r. spectros-copy // Carbohydr. Res. 1985. - Vol. 141. - P. 340-346.

96. Intire F.C., Peterson W.H., Riker A.I. A polysaccyaride produced by the crowngall organism // J. Biol. Chem. 1942. - Vol. 143, № 49, - P. 491-496.

97. Jansson P.E., Kenne L., Lindberg B. Structure of extracellular polysaccharide from Xcinthomonas campestris II Carbohydr. Res. 1975. — Vol. 23 - P. 275-282.

98. Johnson A. R. Improved method of hexosamine determination // Anal. Biochem.- 1971, -Vol. 44, №2-P. 628-635.

99. Jonhnson K.G., Peny M.B., Mc Donald I.J., Russel R R. Cellular and free lipopolysaccharides of some species of species pf Neisseria II Can. J. Microbiol.-1975.-Vol. 21, № 12.-P. 1969-1980.

100. Kamdar H.V., Kamonn S., Kado C.I. Restoration of pathogeniciti of avirulent Xanthomonas otyzae pv. oryzae and X. campestris pathovars by reciprocal complementation with the hrpXo and hrpXc genes and identification of

101. HrpX function by secuence analyses // J. Bacteriol. 1993. - Vol. 175, №7. - P. 2017-2025.

102. Kandler O., Cell Wall Structures and Their Phylogenetic Implications // Zentralb. Bacteriol. Parasitenkd. Infectionskr. Hyg., -1982 Abt. 1, Orig. C., 3, P. 149.

103. Karkanis D., Zelther Y. A new and improwed microassay to determine 2-keto-3-desoxyoctanate in lipopolysaccharide of gram-negative bacteria // Anal. Biochem. 1978. - № 2.- P. 596-601.

104. Koch A.L. The biophysics of the gram-negative periplasmic space // Crit. Rev. Microbiol. 1992. - Vol. 24. - P. 23-59.

105. Leyns F., De Cleene M, Swings J.G., De Ley J. The host range of the genus Xanthomonas II Bot. Rev. 1984. - Vol. 50, № 3. - P. 308-356.

106. Lilly V.G., Wilson H.A., Leach J.G. Bacterial polysaccharides. 2. Laboratory-scale production of polysaccharides by species of Xanthomonas II Appl. Microboil. 1958. Vol. 6. - P. 105-108.

107. Lowry H. O., Rosebroug T. N., Farr G. A. Protein measurement with the Folin phenol reagents II J. Biol. Chem. 1951. - Vol. 192, № 3 - P. 256-275.

108. Lund B.M. The effect of bacteria an post-harvest quality of vegetalles and fruits, with particular reference bo spailage // Bacteria and Plants/ Eds. Rodes-Roberts, F. A. Skinner. London ebs., 1982, p. 133-153.

109. Mayer K., Tharanthan R., Weckesser J. Analysis of lipopolysaccharides o gram-negative bacteria // Meth. Microbiol. -1985. V. 18 P. 157-207.

110. Metlton L.D., Mindt L., Ress D.A., Covalent structure of the extracellular polysaccharide from Xanthomonas campestris evidense from partial hydrolysis studies // Carbohydrat. Res. 1976. - Vol. 46. - P. 245-257.

111. Muller-Seitz E., Jann B., Jann K. Degradación studieson the lipopolysaccharide from E. coli 0.7: k:H 12. Separation and inoestigation of O-specificand core polysaccharides // FEBS Letters. 1968. - Vol. 1, № 5. - P. 311314.

112. Murashige T., Scoog F. A revised medium forrapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol plantarum. 1962. - Vol. 15. - P.; 473-497. 1 ' •

113. Nikaido H., Permeability of the outer membrane of bacteria // Angew. Chem. (Int. End.), -1979. Vol. 18, - P. 337-350.

114. Orentas D.G., Sloneker J.A., Jeanes A. Pyruvic acid content and consistuent sugars of extracellular polysaccharides from different species genus Xanthomonas I I Can. J. Microbiol. 1963. - V. 9, № 5. - P. 427-430.

115. Pat. 4299825 USA MKU A 61 K 31/79. Concentrated xantan gum solutions /Le HO-Lun Colanese Corp. -Publ. 10. 11. 81.2.

116. Ramsey G. B., Smith M. A. Marcetdiseases of cabbage, cauliflower, turnips, cucumber, melanis and related crops. Agriculture hand book № 184. Washigton DC: united states Departament of Agriculture. -1961.

117. Rudolph K. A host specific principle from Pseudomoncis phaseolicola (Burnh) Dowson. inducing water soaking in bean leaves. — Phytopatol. Z., -1978. - Vol.93, № 3, - P. 218-226.

118. Sadder G.S. et al. Names of plant pathogenic bacteria 1864 1995 // Rev. Plant. Pathol. - 1996. Vol.75. - P. 921-763.

119. Schulte R., Bonas U. Expression of the Xanthomonas campestris pv. vesicatoria hrp gene cluster, which determines pathogenicity and hypersensitivity an pepper and tomato, is plant inducible // J. Bacteriol. -1992. Vol. 174, №3. — P.815-823.

120. Shatwell K.R., Sutherland G.W., Dea J.C. Gufluence of the acetyl substituent an the interaction of xanthan with plant polysaccharides. III. Xanthan-kojacmannan systems // Carbohydr. Polym. 1991. - Vol. 14, № 2. - P. 131-147.

121. Shwan J.J Kado C.I. Whole plant wound inoculation for consistent reproduction of black rot of crucifers // Phytopathology. 1988. - Vol. 78, № 7. -P. 981-986.

122. Siddiqui I.R. An extracellular polysaccharide from Xanthomonas campestris // Carbohydr. Res. 1967. -№ 4. -P.284-291.

123. Sijam K., Karr A.L., Goodman R.N. Antigenic and biochemical relationschip of capsular polysaccharide produced by Erwinia amilovora in vivo and vitro. Phytopathology, -1981.- Vol. 71, № 8, - P. 904.

124. Sloneker J.H., Jeanes A. Exocellular bacterial polysaccharide from Xanthomonas campestris NRRL B 1459 // Canad. J. Chem. 1962. - Vol. 40. - P. 2066-2071.

125. Starr M.P. The genus Xanthomonas II The Prokaryotes / Eds by M. P. Starr, H. Stolp, H. G. Truper, A. Balows, H. G. Schlegel. Berlin, Heidelberg, New York: Springer-Verlag, - 1981. - Vol. I. - P. 742-763.

126. Sutherland.I.W. Xanthomonas polysaccharides improved methods for their comparison// Garbohydr. polymers.— 1981.- Vol. 1. - P. 107-115.

127. Tanaka H. Protection of tobacco and tomato agsinst root infection of Pseudomonas solanacearumby heat-killed bacterial cell // Ann. Phytopäthol. Soc. Jap. 1983 - 49, № 1. - P. 66-68. •

128. Van Alfen N.K., McMillian B.D., Wang Y. Properties the extractllular polysaccharides of Clavibactermichiganense subsp. Insidiosum that may affect pathogenesis//Phytopathology 1987.- 77, № 3. -P. 501-505.

129. Volk W.A. Cell wall lypopolyccharides from Xantyomonas species II J. Bacteriol.-1966,-Vol.91.-P. 39-42.

130. Volk W.A. Quantitative assay of polysaccyaride components obtained from cell wall lypopolysaccharides of Xanthomonas species II Ibid. 1968. — 95 , № 3 — P. 980-982.

131. Volk W.A., Salmonsky N. L., Hunt D. Xanthomonas sinensis cell wall lypopolysaccharides. 1. Isolationof 4,7 anliydro-and 4,8-anhydro-3-deoxyoctulosonic acidfollowing hydrolysis // J. Biol. Chem. — 1972.- № 247. — P. 3881-3887.

132. Westphal O., Jann K. Bacterial lipopolysaccharides. Extraction with phenol-water and further applications of the procedure // Methods Carbohydr. Chem. 1965. - Vol. 5. - P. 21-25.

133. Whatley M. H., Sequeira L. Bacterial attachment to plant cell walls// Rec. Adv. Phytochem. -1981.-15 -P. 213 240.

134. Wood P. J. Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides// Carbohydr. Res. 198,0. rj-Vol: 85. - P. 271-287.

135. WydraK., Rudolph K. An agglutination'factor from bush btan leaves against Pseudomonas syryngaepv. pyfseolicola //»7th lnt. Conf. Plant Path. Bact Budapest,-1989.-P. 10. • • '

136. Yoschikawa M., Yamooka N., TakeuchhY. Elicitors: Their significance and primary modes of action in induction: of plant defense reaction. // Plant Cell Pysiol. 1993. - Vol. 34. - P. 1163-1173. -> \ ' ' !

137. Young J.M., Takikawa Y., Gardan L., Stead D.E. Changing concepts in the taxonomy of plant pathogenic bacteria // Annu. Rev. Phytopathol. 1992. — Vol. 30.-P. 67-105.

138. Zamze S.E., Smith A.R., Hignett R.C. Composition of lipopolysaccharide from strains of Pseudomonas syringae pv. morsprunorum of differing host specificity and virulence // J. Gen. Microboil. — 1985. Vol. 131, №8-P. 1941 -1950.1. Благодарности

Информация о работе

Козулин, Владимир Владимирович
кандидата биологических наук
Саратов, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Углеводсодержащие биополимеры Xanthomonas campestris и их роль в фитопатогенных процессах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы