Экзогенные и секретируемые клетками нуклеиновые кислоты, их взаимодействия с компонентами крови в норме и при онкологических заболеваниях

Рыкова, Елена Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экзогенные и секретируемые клетками нуклеиновые кислоты, их взаимодействия с компонентами крови в норме и при онкологических заболеваниях
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Экзогенные и секретируемые клетками нуклеиновые кислоты, их взаимодействия с компонентами крови в норме и при онкологических заболеваниях"

На правах рукописи

РЫКОВА ЕЛЕНА ЮРЬЕВНА

ЭКЗОГЕННЫЕ И СЕКРЕТИРУЕМЫЕ КЛЕТКАМИ НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ, ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С КОМПОНЕНТАМИ КРОВИ В НОРМЕ И ПРИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Новосибирск - 2009

003468199

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной

медицины СО РАН

Научный консультант: доктор химических наук, академик РАН,

профессор Власов Валентин Викторович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Меркулова Татьяна Ивановна

доктор биологических наук, профессор Ильичев Александр Алексеевич

доктор биологических наук Кудаева Ольга Тимофеевна

Ведущая организация: ГУ Научно-исследовательский институт

онкологии Томского научного центра СО РАМН

Защита диссертации состоится « 24 » апреля 2009 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: Новосибирск 630090, пр-кт. акад. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан « 23 » марта_2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук, доцент

Коваль В. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Феномен внеклеточных нуклеиновых кислот (внНК), обнаруженный первоначально в культуральной среде эукариотических клеток, является универсальным для многоклеточных организмов. Высокомолекулярные внНК могут появляться во внеклеточном пространстве как при разрушении клеток, так и путем активной секреции в процессе их жизнедеятельности. Несмотря на отсутствие прямых доказательств функциональной роли существующих в организме внНК, накопленные к настоящему моменту экспериментальные данные свидетельствуют в пользу их биологической значимости.

ВнНК могут перемещаться между соседними клетками и на дальние расстояния, достигая отдаленных органов и тканей посредством флоэмного тока у растений и через кровь у животных. В норме внНК присутствуют в плазме крови в невысокой концентрации и в такой форме, которая препятствует их распознаванию как «сигналов опасности» со стороны иммунной системы. Это позволяет предполагать, что в организме существует система метаболизма, направленная на эффективную утилизацию внНК эндогенного происхождения. Нарушения функционирования компонентов этой системы, снижающие эффективность деградации и выведения внНК, вызывают развитие таких патологических состояний, как воспаление и аутоиммунные реакции. Например, предполагают, что пусковым фактором системной красной волчанки (СКВ) могут быть эндогенные внДНК, появляющиеся в результате некротического или нестандартного апоптотического разрушения клеток, которые вызывают ответ иммунной системы (Napirei et al., 2006). В связи с этим изучение механизмов деградации и распределения внНК в крови необходимо для понимания их роли в норме и при патологиях.

Иммунный ответ на НК вирусов и бактерий возникает для защиты многоклеточного организма от чужеродной генетической информации. Иммуностимулирующая активность CpG-содержащих последовательностей ДНК была обнаружена в экспериментах по лечению опухолей с помощью бактериальной ДНК и как побочный эффект при использовании антисмысловых олигонуклеотидов in vivo (Krieg et al., 2002). Поэтому важной задачей является изучение взаимодействия внДНК с белками плазмы и клеток крови, которые могут опосредовать влияние внДНК на иммунную систему. Удобным инструментом для исследования взаимодействия внДНК с биополимерами крови являются реакционноспособные производные олигонуклеотидов, которые позволяют выявлять образующиеся комплексы как in vitro, так и при введении ДНК in vivo (Челобанов и соавт., 2006).

Было показано, что при развитии онкологических заболеваний происходит увеличение количества внДНК, циркулирующих в плазме крови, однако причины, механизмы и последствия этого явления остаются до сих пор неизвестными (Fleischhacker and Schmidt, 2007). В плазме крови раковых больных были обнаружены внДНК, которые характеризовались изменениями, идентичными изменениям ДНК опухоли (Anker et al., 2003). Поэтому возникло предположение, что ДНК из клеток опухоли, попадая через кровь в другие органы и ткани, могут проникать в здоровые клетки,

трансформировать их и приводить к образованию ближних и удаленных метастазов (теория «генометастазов») (Garcia-Olmo et al., 2005). В настоящее время ведутся исследования передачи опухолевых сигальных молекул между клетками через экзосомы, содержащие мРНК, микроРНК и белки ангиогенеза (Valadi et al., 2007). Накоплены данные о том, что при развитии опухолевых заболеваний происходят изменения в составе микроРНК, циркулирующих в плазме крови, которые предположительно могут играть роль в ингибировании иммунного ответа при раке (Ichim et al., 2008). Сравнительные исследования внДНК и внРНК крови у здоровых людей и у пациентов с онкологическими заболеваниями разной тяжести необходимы для получения новых знаний о механизмах развития опухолей, а также о клеточном гомеостазе в норме.

Целью настоящей работы являлось изучение факторов, влияющих на метаболизм, распределение в крови и биологические эффекты экзогенных и эндогенных внДНК, определение и количественная оценка эндогенных НК крови при онкологических заболеваниях, установление диагностической и прогностической значимости их анализа.

В ходе исследования решались следующие основные задачи:

1. Определение устойчивости экзогенных ДНК и их производных в крови, изучение их взаимодействий с белками плазмы и клеток крови in vivo методом аффинной модификации.

2. Исследование стимулирующих эффектов ДНК, содержащих CpG- и G-богатые участки, на пролиферацию лимфоцитов in vitro.

3. Выявление и количественный анализ эндогенных внДНК и внРНК, присутствующих в плазме и на поверхности клеток крови людей в норме и при онкологических заболеваниях.

4. Установление диагностической значимости количественного анализа внРНК и копийности опухоль-ассоциированных РНК в крови больных с опухолями молочной железы.

5. Анализ паттерна метилирования опухоль-ассоциированных генов во фракциях внДНК крови больных раком желудка и молочной железы.

Научная новизна и практическая ценность работы. Выполнено первое комплексное исследование взаимодействий экзогенных и секретируемых в организме человека внеклеточных нуклеиновых кислот с компонентами крови. Определены факторы, влияющие на метаболизм и утилизацию экзогенных ДНК-олигомеров in vivo. Выявлено формирование комплексов ДНК с белками плазмы, в составе которых ДНК-олигомеры частично защищены от деполимеризации. Впервые показано, что эритроциты участвуют в связывании коротких продуктов гидролиза ДНК. Получены новые данные о взаимодействии ДНК с белками лейкоцитов, которые могут принимать участие в иммуностимулирующем действии ДНК. Полученные результаты являются принципиально значимыми для разработки новых терапевтических препаратов на основе ДНК, способных селективно влиять на экспрессию целевых генов и не вызывающих нежелательных побочных эффектов in vivo (например, неспецифическую активацию иммунной системы).

В результате проведенного анализа внДНК и внРНК впервые обнаружены не только в плазме, но и на поверхности клеток крови. Получены новые знания об изменениях, происходящих в составе и количестве внНК во фракциях крови на разных стадиях онкологических заболеваний, которые расширяют современные представления о молекулярных основах патогенеза опухолей и открывают перспективы для поиска новых подходов к их лечению. Результаты работы вносят существенный вклад в решение одной из острейших проблем современности, а именно, в разработку методов малоинвазивной первичной диагностики, стадирования и прогноза развития опухолей различной этиологии.

Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликована 21 статья. Результаты работы были представлены на международных и российских конференциях: The 23-d FEBS Meeting (Basal, Switzerland, June 1995), XIII International Round Table "Nucleosides, Nucleotides and Their Biological Applications" (Montpellier, France, September 1998), III Съезд иммунологов и аллергологов СНГ (Сочи, Россия, сентябрь 2000), The Third International Conference "Radioisotopes and Their Applications" (Tashkent, Uzbeckistan, October 2002), Научная конференция "Фундаментальные науки - медицине" (Москва, Россия, ноябрь 2002), The International conference "Biology and Biochemistry of Extracellular Nucleic Acids" (Novosibirsk, Russia, June 2003), Научная конференция «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, Россия, декабрь 2003), Российская научно-практическая конференция «Новые диагностические и лечебные технологии в онкологии» (Томск, Россия, сентябрь 2003), International conference "Circulating nucleic acids in plasma and serum and serum proteomics" (Santa Monica, California, USA, November 2003), Российская научно-практическая конференция «Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, Россия, сентябрь 2004), International Conference on Chemical Biology (Novosibirsk, Russia, July 2005), Российская научно-практическая конференция «Новые технологии в онкологической практике» (Барнаул, Россия, июнь 2005), IV, V International Conferences on Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum, (London, UK, September 2005, Moscow, Russia, August 2007), International workshop "Biosphere Origin and Evolution" (Novosibirsk, Russia, June 2005), Конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения - 2005, 2006, 2007» (Санкт-Петербург, Россия, апрель 2005, 2006, 2007), Russian-American conference "Biotechnology and oncology 2005' (St.Peterburg, Russia, June 2005), I, II, III, IV International Conferences «Basic Science for Biotechnology and Medicine» (Novosibirsk, Russia, September 2005, 2006, 2007, 2008), Российская научно-практическая конференции «Актуальные вопросы экспериментальный и клинической онкологии» (Томск, Россия, июнь 2006 и 2008), IX, X, XI Российские онкологические конгрессы (Москва, Россия, ноябрь 2005, 2006, 2007), Международная конференция «Физико-химическая биология» (Новосибирск, Россия, август 2006), 31th Meeting of the Federation of the European Biochemical Societies «Molecules in Health and Disease» (Istanbul, Turkey, June 2006), II Молодежный медицинский конгресс «Санкт-Петербургские научные чтения» (Санкт-Петербург, Россия, 2007), IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, май 2008).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 284 страницах машинописного текста, состоит из введения, десяти глав, выводов, списка цитированной литературы (432 ссылки) и содержит 36 рисунков и 48 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Выявление факторов, влияющих на накопление, распределение и устойчивость экзогенных ДНК в крови

В работе был проведен анализ фармакокинетики экзогенных синтетических ДНК-олигомеров в крови, а также методом аффинной модификации были получены данные о взаимодействии ДНК с белковыми и клеточными компонентами крови in vivo.

1.1. Стабильность и распределение производных

олигонуклеотидов в крови in vivo

Было показано, что фосфодиэфирные олигонуклеотиды с высокой скоростью деградируют в плазме крови in vivo (Shaw et al, 1991). В настоящей работе были использованы производные фосфодиэфирного олигонуклеотида (А) и модифицированных аналогов, предположительно устойчивых к нуклеазам (Б и В), которые содержали алкилирующую

группировку 4-[(Г\1-2-хлорэтил-М-метил)-амино] бензиламин (CIR) на 5'- фосфате (рис. 1). Производные олигонуклеотидов Б и В, синтез которых был проведен на основе исходного олигонуклеотида Тр(ТрСр)б, были любезно предоставлены Н.В. Амирхановым, сотрудником

лаборатории химии нуклеиновых кислот НИБХ СО РАН.

Рис. 1. Структура олигонуклеотидов, использованных в работе: А - p(Ñ)ie, фосфодиэфирный олигонуклеотид, Б - p(N)i4sme, производное олигонуклеотида, содержащее 3'-pSMe группировку, В - p(N)i4sTsT, химерный фосфодиэфирный

олигонуклеотид, содержащий 2 межнуклеотидные фосфоротиоатные группы на З'-конце.

Мышам линии BALB/c внутрибрюшинно вводили в дозе 0.5 мг/кг алкилирующие производные олигонуклеотидов А, Б и В, меченные 32Р по 5'-концу. Через определенные промежутки времени производили забор крови и получали отдельные фракции центрифугированием. Олигонуклеотиды, выделенные из фракций крови осаждением при помощи 2%-ного перхлората лития, анализировали электрофорезом (20% ПААГ, 8М мочевина) с последующей радиоавтографией.

В сыворотке крови уже через 20 мин после введения были выявлены только 6-, 7- и 8-звенные продукты деградации 5'-защищенных фосфодиэфирных олигонуклеотидных производных CIRp(N)i6 и p(N)i4sme, причем З'-pSMe группа не приводит к существенному возрастанию

ciRpq =

СН\ '

/N—(())—CH2NH—Р—О—X

CI—CH2CH2 V-V I

О-

X =

д TpG рАрС рСрС рТрСрТрТрСрС рС рАрТрТ - ОН

Б Тр(ТрСр).Т-0-Р-0 S

Ме

0 О

II II

В Тр(ГрСр),Т-0-Р-0-Т-0-Р-0-Т-0Н

1 I

S" S"

устойчивости p(N)-Msme сыворотки крови (рис. 2).

производного к действию фосфодиэстераз

старт

,-Ф

Рис 2. Анализ продуктов метаболизма олигонуклеотидов в

сыворотке крови: 1 -маркерные

олигонуклеотиды, 2 - 4 - (Жр^цвте через 20 мин, 40 мин и 1.5 ч после введения,

5 -10- СКр^^ТвТ через 20 мин, 40 мин, 1.5, 3, 9 и 24 ч после введения , 11 - ?3-СЖр(Ы)16 через 20 мин, 40 мин и 1.5 ч после введения.

Недеградированный химерный олигонуклеотид CIRp(N)i4sTsT и 3, 4, 7, 10, 13 и 14-звенные продукты его частичной деградации выявлялись в сыворотке в течение 24 часов от момента введения.

Таким образом, присутствие двух межнуклеотидных фосфоротиоатных групп на З'-конце химерных ДНК-олигомеров препятствует их разрушению под действием З'-экзонукпеаз крови и других тканей. Эти результаты свидетельствуют о перспективности разработки ген-направленных препаратов на основе таких частично модифицированных производных ДНК, которые так же устойчивы, как их полные фосфоротиоатные аналоги, но не вызывают побочных эффектов /п vivo. В отличие от сыворотки крови, в эритроцитах при введении каждого из трех производных олигонуклеотидов обнаружены только низкомолекулярные продукты деградации олигонуклеотидов: moho-, ди-, три- и тетрануклеотиды (рис. 3).

Рис. 3. Анализ продуктов метаболизма олигонуклеотидов в

эритроцитах крови: 1 - 5 - CIRp(N),4sme через 20 мин, 40 мин, 1.5, 3, 9 и 24 ч после введения, 6-11 - CIRp(N)i4sTsT через 20 мин, 40 мин, 1.5, 3, 9 и 24 ч после введения 12-16- CIRp(N)16 через 20 мин, 40 мин, 1.5, 3, 9 и 24 ч после введения, 17 - маркерные ДНК-олигомеры,78 - продукты деградации CIRp(N)i6 до и после обработки хлорной кислотой (через 3 ч после введения).

Гидролиз кислотолабильной фосфамидной связи обработкой 5%-ной НСЮ4 приводил к увеличению электрофоретической подвижности динуклеотида эритроцитарной фракции (18, 19, рис. 3). Это свидетельствует

о том, что олигонуклеотиды, экстрагированные из эритроцитов, являются продуктами деградации исходных 5'-фосфамидных производных, а не результатом включения меченого фосфата при синтезе de novo. Отсутствие в сыворотке крови низкомолекулярных ДНК-олигомеров, выявленных в эритроцитарной фракции, позволяет предположить, что эритроциты избирательно накапливают короткие продукты деградации ДНК. Это предположение подтвердили результаты экспериментов in vitro, которые показали снижение уровня связывания в ряду ATP, р(ТТ), p(GATC), p(N)ie (рис. 4).

Рис. 4. Накопление олигонуклеотидов и АТР эритроцитами in vitro: эритроциты инкубировали в среде ДМЕМ в концентрации 107 и 108 клеток/мл с 32Р-мечеными АТР и олигонуклеотидами (в концентрации 5 мкМ) при

температуре течение 3 ч.

37 С

p(N)w

p(GATC) р(ТТ)

АТР

Эритроциты удерживают 95% тетрануклеотида [32Р]р(САТС) в течение 2-х часов в отличие от других эукариотических клеток, которые за то же время экскретируют до 70% захваченных олигонуклеотидов. Таким образом, эритроциты не участвуют в метаболизме исходных ДНК-олигомеров, однако избирательно накапливают короткие продукты их деградации, происходящей в сыворотке крови или в других тканях.

График изменения количества 32Р-меченых продуктов олигомерных фрагментов ДНК в сыворотке крови в зависимости от времени представлен двухфазной кривой, которая характеризуется вначале быстрым уменьшением концентрации ДНК-олигомеров со временем полувыведения СП/га), равным 30 мин, а затем медленным снижением концентрации со временем полувыведения (Т1/2Р) равным 48-50 ч (рис. 5). Интересно, что значения Т1/201 и Т1/2Р в сыворотке не зависят от стабильности использованных в работе производных олигонуклеотидов и согласуются с данными других работ по распределению в крови более стабильных полностью модифицированных фосфоротиоатных олигонуклеотидов (|уегееп е!а1„ 1993).

В отличие от сыворотки в эритроцитах происходит накопление 32Р-меченых олигонуклеотидов и продуктов их деградации, причем более интенсивно в случае стабильных аналогов, особенно С^р^-ивТвТ (рис. 5). Через 20 мин после введения всех олигонуклеотидов 95% 32Р-меченого материала содержится в сыворотке, а через 24 ч радиоактивность эритроцитов составляет 25% и 80% от суммарной радиоактивности крови после введения р(1^)16 и рМиэТэТ соответственно. В результате накопления продуктов деградации олигонуклеотидов эритроцитами временная

зависимость суммарной радиоактивности крови (см. рис. 5) в значительной степени отличается от временной зависимости радиоактивности сыворотки.

Сынорсггкя

Кровь

Эрпгроциты

Время. 'I

Время, ч врви.4

Рис. 5. Зависимость содержания радиоактивного материала от времени в лейкоцитах, эритроцитах, сыворотке и в цельной крови в расчете на 1 мл крови после внутрибрюшинного введения мышам ВАИЗ/с 32Р-меченых алкилирующих производных олигонуклеотидов в дозе 0.5 мг/кг:

СКр(1Ч)1в (------•------); С1Рр(Ы)14зте (---■---); аЯрНивТвТ (->•- ).

Через 1.5 ч после введения производных CIRp(N)i4sTsT и CIRp(N)i4sme наблюдается рост суммарной радиоактивности крови, тогда как снижение концентрации CIRp(N)i6 в цельной крови происходит медленнее, чем в сыворотке (Т1/2Р = 76-82 ч). В отличие от производных, использованных в работе, при введении более стабильных полностью модифицированных фосфоротиоатных аналогов радиоактивность сыворотки крови была в 2.5-3 раза выше, чем радиоактивность эритроцитов (Agrawal et al., 1995), что подтверждает результаты о связывании эритроцитами только коротких продуктов деградации ДНК.

В лейкоцитах наблюдается накопление радиоактивных продуктов со временем. Суммарная радиоактивность лейкоцитов составляет 5-8% и 2.5% от суммарной радиоактивности эритроцитов через 20 мин и 24 ч после введения олигонуклеотидов, соответственно. Поскольку в 1 мл крови лейкоцитов в 1000 раз меньше, чем эритроцитов, единичный лейкоцит связывает больше олигомеров и продуктов их деградации, чем единичный эритроцит.

1.2. Взаимодействия олигонуклеотидов с белками сыворотки крови

Первоначально для выявления белков, взаимодействующих с ДНК, инкубировали in vitro сыворотку крови человека с 32Р-меченым алкилирующим производным CIRp(N)i6- Анализ продуктов реакции модификации SDS-дискэлектрофорезом в градиентном (10—20%) ПААГ с последующей радиоавтографией показал, что происходит образование

ковалентных аддуктов опигомерных фрагментов ДНК с альбумином и иммуноглобулинами (1дМ и 1дв) (рис. 6, А).

Для того, чтобы охарактеризовать прочность ДНК-белковых комплексов, был проведен анализ зависимости степени модификации этих белков от концентрации реакционноспособного производного С1Р?[32Р]р( N )16 на очищенных препаратах альбумина, и 1дМ (рис. 6, Б). Степень

модификации белка вычисляли, исходя из данных об интенсивности радиоактивной метки (в имп/мин) во фрагментах геля, содержавших аддукты ДНК-белок. Полученные данные позволили оценить константы диссоциации (Кс1) комплексов, которые составляли 4 мкМ для 1дМ, 6 мкМ для 1дй и 20 мкМ для альбумина (Якубов и соавт., 1992).

Для исследования специфичности связывания основных белков сыворотки крови с ДНК, была проведена их аффинная модификация алкилирующим производным С1Р[ 2Р]р( N )16 в присутствии соединений, способных конкурировать с ним за сайты связывания (табл. 1).

А 1 2 3 4 5 6 7 £

кд»

72 -

23 -■

[С1Яр(М)16]

Рис. 6. Модификация белков сыворотки крови С11Ч[32Р]р(М)16.

А: 1 - 1дС, 2 - 1дМ, 3 - альбумин инкубировали с С1Р[32Р]р(1\1)16 (15 мкМ); 4-7 -сыворотку крови человека инкубировали с С1Щ32Р]р(Ы)1в в концентрации 1.25, 2.5, 5 и 10 мкМ при 37°, 45 мин.

Б: График зависимости степени модификации белков крови от концентрации (мкМ) реагента С1Кр(Ы)16.

Сродство ДНК-олигомеров к альбумину, 1дй и 1дМ не зависит от последовательности нукпеотидов, поскольку 16-и 15-звенные ДНК-олигомеры различной последовательности характеризуются сходными константами диссоциации комплексов (табл. 1). Эффективность связывания пиримидин-богатых фрагментов ДНК со всеми исследованными белками возрастает с увеличением длины олигонуклеотида.

При замене фосфодиэфирных связей на фосфоротиоатные сродство аналогов ДНК ко всем исследованным белкам сыворотки возрастает практически в 10 раз. Полианионы различной структуры эффективно ингибируют аффинную модификацию белков (см. табл. 1). Эти данные

свидетельствуют об участии фосфатного остова ДНК в формировании комплексов с участками взаимодействия основных связывающих белков сыворотки.

Таблица 1. Значения констант диссоциации (Кс1) комплексов альбумина (А), 1дС и 1дМ с ДНК-олигомерами, высокомолекулярной ДНК и полианионами

Олигонукпеотид*, соединение длина Кс1, мкМ

|дм |дс А

р(ТТ) 2 80 120 250

р(САТС) 4 80 115 240

р(ССТСТС) 6 55 110 240

р(ТТТСТТСТ) 8 42 75 90

р(ТСТТТТСТТ) 10 30 75 150

р(ТСССТСССТСТТАТТ) 15 15 30 45

Р(Т)16 16 15 30 45

р(ТСАСССТСТТСССАТТ) 16 15 30 45

р(СТТТСТТТТССТСТСССТ) 18 12 24 32

Р^ТЗСЗАЗСЗСЗСЗТЗСЗТЗТЗСЗСЗСЗАЗТЭТ)** 16 2 3 1.5

р(зС)28** 28 1 1.5 1

Двуцепочечная ДНК 12 15 50

Одноцепочечная ДНК 3 5 25

Гепарин 16 17 1

Декстран сульфат 10 6 1

Трипановый синий - 8 0.5

Активный красный - 20 1.5

в работе были использованы только дезоксирибоолигонукпеотиды **- фосфоротиоатные аналоги олигонукпеотидов, б обозначает межнуклеотидную фосфоротиоатную группу

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14 15

Рис. 7. Анализ продуктов модификации белков сыворотки и клеток крови мышей линии ВАИЗ/с после в/б введения 0.5 мг/кг 32Р-меченого С1Кр(1М)16: ЗОБ-дискэлектрофорез в градиентном (10-20%) ПААГ, радиоавтограф.

1.4.7.10.13-белки сыворотки через 40 мин, 1.5, 3, 9, 24 ч после введения,

2.5.8.11.14- белки лейкоцитов через 40 мин, 1.5, 3, 9, 24 ч после введения, 3,6,9,12,15 - белки эритроцитов через 40 мин, 1.5, 3, 9, 24 ч после введения С1Р[32Р]р( N )16.

При исследовании in vivo алкилирующих производных CIR[32P]p( N и CIR[32P]p(N)i4sTsT было показано появление ковалентных ДНК-белковых аддуктов в плазме крови, которые по данным электрофоретического анализа соответствовали тяжелой цепи иммуноглобулина класса G и сывороточному альбумину (рис. 7).

Идентификация именно этих белков, образовавших ковалентные аддукты, была подтверждена методом иммунодиффузии сыворотки крови мыши против антисыворотки, специфичной к белкам сыворотки крови мыши и антител, специфичных к иммуноглобулину G мыши, с последующей радиоавтографией.

В работе также показано влияние формирования ДНК-белковых комплексов на сохранность ДНК-олигомеров в крови. Для этого после разделения белков электрофорезом олигонуклеотиды элюировали из фрагментов геля, содержащих ковалентные аддукты ДНК-белки, путем разрушения кислотолабильной связи обработкой 5%-ной HCIO4.

Рис. 8. Анализ олигомерных фрагментов ДНК, ассоциированных с белками сыворотки крови через 24 ч после в/б инъекции CIR[32P]p( N )1В (0.5 мг/кг). Электрофорез (20% ПААГ; 8М мочевина), радиоавтограф.

1 - маркерный 16-звенный олигонуклеотид,

2 - ДНК-олигомеры, ассоциированные с белками сыворотки

3-маркерный 10-звенный олигонуклеотид,

4- маркерные олигонуклеотиды.

Анализ полученных продуктов показал, что в составе ковалентных аддуктов ДНК-белок происходит неполная деполимеризация 16-звенных

олигонуклеотидов с образованием 7-8-звенных фрагментов (рис. 8).

После введения мышам CIR[32P]p( N )i6 и CIR[32P]p(N)i4sTsT в мембранной фракции лейкоцитов была выявлена аффинная модифицикация белка с мол. массой 72 кДа по данным SDS-дискэлектрофореза (рис. 7). В эритроцитарной фракции ДНК-связывающих белков не было обнаружено. Анализ полученных данных позволил сделать предположение, что выявленный белок лейкоцитов относится к семейству иммуноглобулиновых рецепторов.

2. Стимулирующее действие ДНК, содержащих CpG- и G-богатые участки, на пролиферацию лимфоцитов в культуре

Интенсивное исследование стимулирующих свойств ДНК на иммунитет ведется с конца 1980-х гг., когда группой Ямамото была выявлена противоопухолевая активность бактериальной ДНК (Yamamoto et al., 1989). Впервые сиквенс-специфичность митогенного действия для гексамерных CpG-содержащих участков была показана Критом и соавторами (Krieg et al., 1995).

В настоящей работе показано стимулирующее действие ДНК плазмиды PÜC19 на пролиферацию лимфоцитов селезенки мышей линии СВА in vitro.

1 2 з 4

1*—старт

«~P(N)K -p(N)io

*-pN

В дальнейшем при изучении свойств ДНК этой плазмиды ее иммуностимулирующее действие было связано с входящими в ее состав CpG-содержащими участками (Raz et al., 1996). Иммуностимулирующие эффекты ДНК изучали при культивировании лимфоцитов селезенки мышей в течение 72 ч. Пролиферативный ответ определяли по включению клетками [3Н] тимидина ([3Н]Т) после инкубации с ним в течение последних 18 ч. Интенсивность пролиферативного ответа на ДНК увеличивалась при возрастании ее концентрации начиная от 50 нг/мл с выходом на плато при 50 мкг/мл (рис. 9).

Рис. 9. Зависимость пролиферации лимфоцитов селезенки от концентрации ДНК: в культуральную среду добавляли ДНК

плазмиды pUC19 (ДНК), ДНК, обработанную ДНКазой (ДНК + ДНКаза), ДНК и олигонуклеотид p(TGACCCTCTTCCCATT) (P(N),6).

100

концентрация дгк (р*г/мп) Полученные данные о

концентрационной

зависимости согласовались с результатами работы Мессина и соавторов по стимуляции лимфоцитов селезенки мышей линии BALB/c под действием суммарной ДНК E.coli (Messina et al., 1991). Митогенный эффект был вызван именно полинуклеотидным материалом, поскольку ДНК, предварительно обработанная ДНКазой, не вызывала стимуляции пролиферации лимфоцитов (рис. 9).

Рис. 10. Влияние полиэтиленимина (ПЭИ) на пролиферацию лимфоцитов под действием CpG-содержащей ДНК и олигонукпеотида (GAAGGGAGGA)p: лимфоциты культивировали в присутствии плазмидной ДНК (0.5 м кг/лунку), олигонуклеотида (6

мкг/лунку), или в присутствии комплексов этих соединений с ПЭИ. КонА (1 мкг/мл) и ЛПС (2.5 мкг/мл) добавляли к лимфоцитам одновременно с ДНК и олигонуклеотидом.

КснА. ДЖ ДНЮса

ЛПС p(N>„ ДЖша П31

60 80 HMVM1H Ю3

Кроме того, добавление p(N)i6, не имеющего

в культуральную среду олигонуклеотида активирующего влияния на лимфоциты, также приводило к ингибированию

действия ДНК. В настоящей работе было выявлено стимулирующее действие G-богатой декамерной последовательности GAAGGGAGGA.

Включение [3Н]Т лимфоцитами под действием этого олигонуклеотида в концентрации 10 мкг/мл составляло более 20% от включения [3Н]Т под действием плазмидной ДНК (10 мкг/мл), 70% от включения [ Н]Т под действием бактериального липополисахарида (ЛПС) и 44% от включения [3Н]Т под действием конканавалина А (Кон А) (рис.10). Обработка олигонуклеотидов ДНКазой приводила к исчезновению стимулирующего влияния на лимфоциты.

Для выявления клеточных мишеней ДНК в суммарной культуре лимфоцитов было исследовано комитогенное влияние плазмидной ДНК и нескольких известных митогенов на их пролиферацию (рис. 11). Для выявления с инергичного влияния митогены были использованы в субоптимальных концентрациях. Результаты настоящей работы совпадают с данными о влиянии бактериальной ДНК на B-клетки, которое не зависит от Т-лимфоцитов (Krieg et al., 2003). Митогенный активатор Т-лимфоцитов КонА аддитивно усиливает эффект плазмидной ДНК, что свидетельствует о независимой активации Т- и B-клеточной пролиферации в культуре лимфоцитов. В присутствии активатора B-клеточной пролиферации ЛПС активирующее влияние ДНК усиливается, однако совместное действие несколько меньше суммы двух независимых эффектов. Вероятно, ДНК и

ЛПС стимулируют

различные, но

перекрывающиеся субпопуляции В-

лимфоцитов.

Рис. 11. Костимулирующее действие плазмидной ДНК и митогенов: лимфоциты селезенки культивировали в присутствии плазмидной ДНК (0.5 мкг/мл), ФМА (10 нг/мл), Кон А (0.2 мкг/мл), ЛПС (2.5 мкг/мл) и без митогенов (контроль).

Синергичное

влияние на поликлональную стимуляцию лимфоцитов было обнаружено при совместном использовании плазмидной ДНК и форбопового эфира ФМА, которое может быть результатом того, что их активирующее влияние на клетки реализуется различными сигнальными механизмами. В отличие от многих митогенов, которые взаимодействуют с поверхностными рецепторами клетки, форболовые эфиры активируют сигнальные пути, минуя рецепторные взаимодействия, за счет связывания и активации протеинкиназы С (РКС) (Li et al., 1991). Данные о синергичности действия ФМА и ДНК позволили сделать предположение о рецептор-опосредованном влиянии ДНК.

В настоящей работе показано снижение активирующего действия на пролиферацию лимфоцитов CpG-содержащих и G-богатых ДНК при их

использовании в комплексах с полиэтиленимином (ПЭИ), который увеличивает доставку ДНК в эукариотические клетки (см. рис. 10). Этот результат является еще одним косвенным подтверждением участия рецепторов в стимулирующем действии ДНК. Поскольку добавление комплексов ПЭИ с ДНК не снижало жизнеспособность лимфоцитов и не влияло на пролиферацию под действием ЛПС и КонА, снижение активации пролиферации под действием ДНК не было связано с цитотоксичностью ПЭИ. Эти результаты подтверждены недавно другими исследованиями. Так, в составе комплексов с ПЭИ CpG-содержащая плазмидная ДНК не вызывала увеличения синтеза ИЛ-12 в сыворотке при в/в введении мышам (de Wolf et al., 2008). При этом комплексы ДНК с липосомами DOTAP приводили к усилению стимуляции синтеза ИЛИ2. Было также показано ингибирующее влияние положительно заряженных желатиновых наночастиц на стимулирующее действие CpG-содержащих олигомерных ДНК на секрецию ИЛ-6 В-клетками человека в культуре (Zwiorek et al., 2008).

Таблица 2. Влияние анти-1д антител и их РаЬ-фрагментов на активацию пролиферации клеток селезенки под действием плазмидной ДНК

Митогены Включение [JH] тимидина (имп/мин хЮ^)

Контроль Анти-lg Fab (Fab)2

Контроль 2.6 ± 0.2 1.9 ±0.2 2.0 ±0.1 11.5 ±2.1

ДНК, 10 мкг/мл 51.5 ±7.2 16.5 ± 1.3 26.0 ± 3.2 39.0 ± 5.3

ДНК, 1 мкг/мл 41.0 ±4.5 9.0 ±1.1 11.0 ± 1.4 27.0 ± 2.3

ДНК, 0.1 мкг/мл 15.0 ± 1.5 4.5 ±3.9 2.8 ±0.4 13.0 ± 1.8

ЛПС, 2.5 мкг/мл 42.0 ±5.1 20.0 ± 3.5 35.0 ± 4.2 38 ± 3.7

Примечание: кроличьи поликлональные антитела против lg мыши, их моновалентные Fab- и бивалентные (РаЬ)2-фрагменты (все в концентрации 50 мкг/мл) добавляли к лимфоцитам одновременно с митогенами

Поскольку в настоящей работе обнаружено взаимодействие ДНК с 1д сыворотки крови, то можно было предполагать, что одним из посредников активирующего влияния ДНК являлись поверхностные 1д-рецепторы В-лимфоцитов (ВСР). В связи с этим было исследовано влияние нестимулирующих пролиферацию анти-1д антител на активирующее влияние плазмидной ДНК. Оказалось, что в присутствии кроличьих антител против 1д мыши стимулирующее действие плазмидной ДНК на включение [3Н]Т В-лимфоцитами селезенки снижается в 3-5 раз (табл. 2). Поскольку анти-1д антитела кролика ингибируют стимулирующее действие ЛПС, было исследовано и выявлено также значительное ингибирование пролиферативного эффекта под действием моновалентных РаЬ-фрагментов анти-1д антител (см. табл. 2), которые не оказывают ингибирующего влияния на действие ЛПС. Бивалентные (РаЬ)г-фрагменты оказывают стимулирующее действие на В-клеточную пролиферацию, однако подавляют действие ДНК, хотя и не так существенно, как моновалентные РаЬ-фрагменты. Неполное ( на 40-50% ) ингибирование РаЬ-фрагментами анти-1д антител стимуляции пролиферации лимфоцитов под действием ДНК в высокой концентрации (от 10 мкг/мл и более) свидетельствует о том, что

существуют различные пути активации пролиферации лимфоцитов под действием ДНК.

Данные о важной роли Toll-like receptor 9 (TLR9), экспрессированных в эндоплазматическом ретикулуме, в активирующем действии CpG-содержащих ДНК на индукцию Т-независимого ответа B-лимфоцитов и дендритных клеток были опубликованы впервые в 2000 г. (Hemmi et al., 2000). В дальнейших исследованиях было показано, что CpG-содержащие ДНК захватываются клетками путем эндоцитоза, взаимодействуют с TLR9 и активируют соответствующие им сигнальные пути (Bauer et al., 2008). Однако накоплены также данные, которые свидетельствуют о существовании независимых от TLR9 путей активации В-лимфоцитов (Wagner and Bauer, 2006). Следует отметить, что у больных СКВ при поглощении иммунных комплексов дендритными клетками FcyR-опосредованным путем, происходит стимуляция продукции интерферонов 1 типа, которая только частично зависит от активации TLR9 (Boule et al., 2004). Активация B-клеток под действием иммунных комплексов, содержащих ДНК, происходит за счет вовлечения как TLR, так и lgM-рецепторов (Leadbetter et al., 2002). Группой Крига было показано, что в зависимости от зрелости В-клеточной субпопуляции CpG-содержащие ДНК либо усиливают, либо подавляют активирующий сигнал, опосредованный В-клеточными рецепторами (Yi et al., 2003). Таким образом, можно предполагать наличие нескольких путей рецептор-опосредованного стимулирующего действия CpG-содержащих ДНК.

3. Концентрации и распределение внНК в крови

Интенсивные исследования внНК в последние годы связаны с перспективами разработки методов диагностики различных заболеваний на основе анализа внДНК и внРНК крови. Все проводившиеся ранее исследования были посвящены только внДНК и внРНК, присутствующим в плазме, хотя половину объема крови составляют клеточные элементы, на поверхности которых присутствуют белки, способные связывать внНК (Bennett et al., 1987). Было также известно, что внДНК могут связываться с фосфолипидами липосом и клеточных мембран с участием двухвалентных катионов металлов (Беляев и соавт., 1988). В данной работе было впервые показано присутствие внНК, связанных с поверхностью клеток крови, и выявлены особенности распределения внНК во фракциях крови в норме и при онкологических заболеваниях.

Данная работа проводилась с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ от 24.12.1993 № 2288). На проведение работ с клиническим материалом было получено разрешение этического комитета ИХБФМ СО РАН. Образцы крови получали от здоровых людей и пациентов с опухолями различной этиологии, стабилизировали ЭДТА и обрабатывали, как показано на рис. 12.

Для элюции внНК, связанных с поверхностью форменных элементов крови ионными мостиками, клетки обрабатывали ФБ, содержащим хелатирующий агент (ФБ-ЭДТА). Для разрушения комплексов поверхностных белков с нуклеиновыми кислотами и нуклеопротеиновыми

комплексами клетки обрабатывали 0.125 % раствором трипсина. Отсутствие лизиса клеток при такой обработке контролировали, оценивая их жизнеспособность при помощи окрашивания трипановым синим. Концентрации внИК в образцах плазмы крови и клеточных элюатах были определены методом детекции комплексов флуоресцентных красителей Hoechst 33258 и SYBR Green II с очищенными ДНК и РНК, выделенными на

модифицированных силикатных сорбентах.

Рис. 12. Схема обработки образцов крови: кровь собирали в пробирку, содержащую фосфатный буфер с ЭДТА, и разделяли на плазму и клетки. Клетки крови отмывали фосфатным буфером с 5 мМ ЭДТА (ФБ-ЭДТА элюат), а затем 0.125% раствором

трипсина (трипсиновый элюат).

Использованные в работе методы выделения нуклеиновых кислот из биологических жидкостей позволяли с эффективностью 92% и 86% выделять как высоко-, так и низкомолекулярные ДНК и РНК соответственно (от 100 п.н. до 20 т.п.н.) (Лактионов П.П., Тамкович С.Н., Симонов П.А., Рыкова Е.Ю., Власов В.В. Патенты на изобретение №2232768; № 2232810). Минимальный уровень детекции внДНК и внРНК в крови составлял для плазмы 8 нг/мл, для ФБ-ЭДТА элюата - 40 нг/мл и для трипсинового элюата - 20 нг/мл крови. Обработка данных проводилась с использованием методов статистического анализа при помощи программ MedCalc и Statistica 6.

3.1. внДНК в крови здоровых людей

Контрольную группу составили 30 человек без выявленных патологий -доноров отделения переливания крови ЦКБ СО РАН г. Новосибирска. Измерение концентрации внДНК в крови здоровых доноров было проведено сотрудниками ГКБ ИХБФМ СО РАН O.E. Брызгуновой и С.Н. Тамкович (Tamkovich et al., 2005).

Концентрация внДНК в плазме здоровых людей варьировала от 0 до 28 нг/мл и в среднем составляла 10 нг/мл. Концентрация внДНК плазмы здоровых мужчин (среднее значение 13 нг/мл) достоверно не отличалась от концентрации внДНК плазмы здоровых женщин (8 нг/мл) (t-критерий, р=0.1) (рис. 13). Полученные значения согласуются с данными исследователей, определявших концентрацию внДНК в плазме крови другими методами (Wu et al., 2002, Fleischhacker and Schmidt, 2007).

У большинства обследованных как в норме, так и при патологиях, более 50% внДНК, связанных с поверхностью клеток крови, находится в трипсиновой фракции (у 63% здоровых доноров, 83% больных раком

Обран-ц краии Илаша и клеточная фракция

I ' j Цгн I |>Иф\> ириними,' —I

Клеточная фракция

(*р,бот«ФБ-ЭДТА-| фб-эдта

VI КПП

Клеточная фракции

()бра6о1К< |рн||синим

Трннснновый элюат

желудка и 81% больных раком легких). Эти значения согласуются с результатами, полученными в настоящей работе при определении количества внДНК, связанных с поверхностью культивируемых первичных эндотелиоцитов человека Н11\/ЕС. Оказалось, что более значительное количество внДНК находится в трипсиновом элюате с их поверхности (110 нг/млн клеток), по сравнению с ФБ-ЭДТА элюатом (20 нг/млн клеток). На рис. 13 и далее представлены данные о концентрации внДНК плазмы и внДНК, связанных с клеточной поверхностью, которые определены как сумма значений для внДНК, выделенных из ФБ-ЭДТА и трипсинового элюатов по отдельности.

юооо

с; 5

ч £ т к

я-&

1000

100

г I

-ЕЕ0Ш-

Плазма Клетки Мужчины

—ШЗ-ЕЕ-

Рис. 13. Концентрация внДНК плазмы (Плазма) и внДНК, связанных с поверхностью клеток крови (Клетки) здоровых людей.

Плазма Клетки Женщины

В данной работе впервые было показано, что в крови клинически

здоровых людей

основная часть (в среднем 97% и 98% для мужчин и женщин) внДНК связана с поверхностью форменных элементов крови (см. рис. 13). Достоверной корреляции между концентрацией внДНК, связанных с клеточной поверхностью, и количеством форменных элементов крови (лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов) по критерию Спирмена не обнаружено.

Оказалось, что концентрация связанных с поверхностью клеток внДНК достоверно выше у мужчин (среднее значение 703 нг/мл), чем у женщин (429 нг/мл) при сравнении выборок по критерию Манна-Уитни (р=0.04) (табл. 4). Полученные данные таких различий у здоровых людей свидетельствовали о том, что при сравнительном исследовании уровня внДНК при патологиях необходимо учитывать пол пациента.

3.2. внДНК в крови больных раком легких

Исследуемую группу составили 42 мужчины, больных раком легких, первично поступивших в Областной онкологический диспансер г. Томска, в возрасте от 46 до 79 лет. В контрольную группу вошли мужчины без выявленных патологий, сопоставимые по возрасту. Больные находились на Т-мЫх.о-гМсм стадии заболевания. Наличие метастазов в лимфатических узлах было подтверждено у 63 % больных, отдаленных метастазов - у 10% больных. По гистологической классификации (классификации ВОЗ) 24% составила аденокарцинома, 61% - плоскоклеточная карцинома, 10% -мелкоклеточный рак и 5% - железистый рак легкого. Низко-дифференцированные опухоли составляли 39%, умеренно-

дифференцированные - 53% и высоко-дифференцированные - 8%. По кпинико-анатомической классификации, центральный рост опухоли наблюдался в 61% случаев, периферический - в 39%.

Концентрация внДНК в плазме крови у больных раком легких составляла в среднем 13 нг/мл и не отличалась от концентрации в плазме крови здоровых мужчин (13 нг/мл) (рис. 14). Результаты соответствовали данным работ по определению внДНК плазмы при раке легких другими методами (Herrera et al., 2005, Belinsky et al., 2005). В данной работе было выявлено статистически достоверное уменьшение количества внДНК, связанных с поверхностью клеток крови, у больных раком легких по сравнению со здоровыми мужчинами (критерий Манна - Уитни, р<0.01, табл.

Рис. 14. Концентрация внДНК плазмы (Плазма) и внДНК, связанных с поверхностью форменных элементов крови (Клетки), здоровых мужчин (Норма) и больных раком легких (Рак легких).

Для оценки

значимости этого

параметра для

диагностирования больных раком легких определяли чувствительность и специфичность теста. При определении

порогового уровня внДНК, связанных с клеточной поверхностью, как 400 нг/мл, чувствительность анализа составляет 76%, специфичность - 86%. Следует отметить, что уже на ранних стадиях рака легкого (Т1-Т2) пациенты характеризуются снижением концентрации внеклеточных ДНК, связанных с клеточной поверхностью.

Было показано снижение концентрации внДНК, связанных с поверхностью клеток крови, по мере увеличения тяжести заболевания. В группе пациентов с распространенным опухолевым процессом этот параметр был достоверно ниже, чем в группе пациентов с умеренно распространенным процессом (критерий Манна - Уитни, р<0.05) (табл. 3). После оперативного лечения были сформированы две группы - пациенты с ремиссией или стабилизацией и пациенты с прогрессирующей болезнью (см. табл. 3). При определении в качестве порогового уровня концентрации внДНК, связанных с поверхностью клеток крови, равной 84 нг/мл, пациенты, не отвечающие на терапию, выявляются с чувствительностью 94% и специфичностью 50%.

Таким образом, было показано, что данный параметр может служить дополнительным критерием прогнозирования течения болезни. Определение стандартных клинико-патологических характеристик позволяет

3).

10000

X 01 0:

S 3"

1000

100

• О

• № • t О °<Ъ 0 ¿> »

□ □ Л

О йсШ ш сш —DO—О- °0

Плазма Клетки Плазма Клетки Норма Рак легких

выявить пациентов с прогнозом прогрессирования болезни с такой же чувствительностью и специфичностью (94% и 56% соответственно).

Таблица 3. Концентрация внДНК, связанных с поверхностью клеток крови здоровых людей и больных раком легких

Группы обследованных Связанные с поверхностью клеток внДНК Достоверность различий

Здоровые мужчины 703 (М 715, Д 1901520) р<0.01

Больные раком легких 118 (М 46, Д 6-1250)

Больные с умереннно распространенным процессом1 263 (М 101, Д 22-1250) р=0.015

Больные с распространенным процессом2 55 (М 44, Д 6-319)

Больные с ремиссией и стабилизацией 207 (М 189, Д 15- 1250) р=0.034

Больные с прогрессией заболевания 54 (М46, Д 6-319)

Примечание: представлены средние значения, медиана (М), диапазон (Д), достоверность различий определяли по тесту Манна - Уитни

3 - 1-11 стадия опухоли, отсутствие метастазов, умеренная дифференцировка клеток, центральный рост опухоли,

6 - ПМУ стадия опухоли, наличие метастазов, низкий уровень дифференцировки клеток, периферический рост опухоли

3.3. внДНК в крови больных раком желудка

В исследование было включено 30 первично обратившихся больных раком желудка (РЖ) в возрасте 46-78 лет T1-4Nx.o-3Mx.o-1. Контрольную группу составляли доноры, сопоставимые по возрасту. Наличие метастазов в лимфатических узлах было подтверждено у 37% больных, отдаленных метастазов - у 23% больных. По гистологическому типу (классификации ВОЗ) у 60% больных морфологически был подтвержден диагноз аденокарцинома разной степени дифференцировки, у 25% больных -недифференцированный рак, у 15% больных - перстневидноклеточный рак. Формирование группы осуществлялось после постановки диагноза на основании клинического, морфологического, эндоскопического, рентгенологического обследования и по результатам оперативного вмешательства.

Суммарная концентрация внДНК, связанных с клеточной поверхностью, выделенных из ФБ-ЭДТА и трипсинового элюата, у больных раком желудка составила в среднем 547 нг/мл и достоверно не отличалась между мужчинами и женщинами (критерий Манна - Уитни, р>0.05) (табл. 4). По сравнению со здоровыми мужчинами у больных раком желудка мужчин отмечалось снижение концентрации внДНК, связанных с клеточной поверхностью (см. табл. 4, критерий Манна - Уитни, р=0.04). У больных РЖ

женщин показано отсутствие достоверных отличий концентрации внДНК, связанных с клеточной поверхностью, по сравнению с группой здоровых женщин (табл. 4, критерий Манна - Уитни, р>0.05). У больных раком желудка концентрация внДНК в плазме крови варьировала от 8 до 537 нг/мл, и в среднем составляла 99 нг/мл крови. Концентрация внДНК в плазме больных мужчин достоверно не отличалась от концентрации ДНК в плазме больных женщин (критерий Манна - Уитни, р>0.05) (табл. 4). Исследование показало, что по сравнению с клинически здоровыми людьми у больных раком желудка концентрация внДНК в плазме была достоверно выше (критерий Манна-Уитни, р=0.001).

Таблица 4. Концентрация (нг/мл) внДНК в крови клинически здоровых людей и больных раком желудка

Группы обследованных Пол внДНК плазмы Связанные с поверхностью клеток внДНК

Здоровые Муж. 13 (М 14, Д 0-25) 703 (М 715, Д 190-1520)

Жен. 8 (М 6, Д 0-28) 429 (М 354, Д 121-871)

Больные РЖ Муж. 116 (М 64, Д 8-527) 442 (М 457, Д 14-1464)

Жен. 77 (М 63, Д 10-1946) 685 (М 523, Д 74-1855)

Примечание: представлены средние значения, медиана (М), диапазон (Д)

Для оценки информативности показателя концентрации внДНК плазмы при раке желудка был использован ROC-анализ (площадь под графиком составляла 0.906). При выборе порогового значения концентрации внДНК плазмы 25 нг/мл, больных раком желудка можно отличить от клинической нормы с чувствительностью 77% и специфичностью 97%.

В подгруппах больных РЖ, сформированных по распространенности онкологического процесса, было обнаружено, что среднее значение концентрации внДНК плазмы у больных с неблагоприятными факторами прогноза (146 нг/мл) было достоверно выше, чем в подгруппе с благоприятным прогнозом (72 нг/мл) (критерий Манна - Уитни, р=0.04) (табл. 5).

При анализе корреляций концентрации внДНК в плазме больных раком желудка с клинико-патологическими параметрами опухоли (TNM, гистологический тип опухоли) достоверное повышение концентрации внДНК плазмы (критерий Манна - Уитни, р=0.049) было обнаружено в группе больных с отдаленными метастазами по сравнению с группой, в которой они отсутствуют (155 нг/мл и 79 нг/мл, соответственно), а также при перстневидноклеточном типе опухоли по сравнению с аденокарциномой (критерий Манна - Уитни, р=0.03) и недифференцированным раком (критерий Манна - Уитни, р=0.04) (см. табл. 5).

Достоверных корреляций между концентрацией внДНК, связанных с поверхностью клеток крови, и распространенностью процесса при раке

желудка выявлено не было. Таким образом, у больных раком желудка концентрация внДНК плазмы была достоверно выше клинической нормы и возрастала по мере распространенности онкологического процесса.

Таблица 5. Зависимость концентрации (нг/мл) внДНК в крови больных раком желудка от распространенности онкологического процесса

Подгруппы больных раком желудка внДНК плазмы Связанные с поверхностью клеток внДНК

Больные с благоприятным прогнозом 72 (М 43, Д 8-297) 545 (М 457, Д 62-1855)

Больные с неблагоприятным 2 прогнозом 146 (М 128, Д 10-527) 562 (М 594, Д 74-1464)

Больные с метастазами в регионарные лимфоузлы (Mi x) 155 (М 100, Д 30-527) 550 (М 544, Д 131-1464)

Больные без метастазов (М0) 79 (М 45 Д 8-297) 552 (М 468, Д 62-1855)

Больные с аденокарциномой 71 (М 38, Д 10-278) 431 (М 344, Д 62-1464)

Больные с недифференцированным типом рака 90 (М 56, Д 8-297) 724 (М 493, Д 124-1855)

Больные с перстневидноклеточным типом рака 204 (М 159, Д 71-527) 623 (М 608, Д 114-1101)

Примечание: представлены средние значения, медиана (М), диапазон (Д)

1 - Подгруппу больных с благоприятным прогнозом составили пациенты l-llla стадии онкологического процесса и с морфологически подтвержденными аденокарциномой разной степени дифференцировки и недифференцированным типами рака

2 - В подгруппу больных с неблагоприятным прогнозом вошли пациенты III6-IV стадии заболевания и с морфологически подтвержденным перстневидноклеточным типом рака

В отличие от больных раком желудка, у пациентов при раке легких не выявлено изменений внДНК плазмы, тогда как наблюдалось достоверное снижение количества внДНК, связанных с поверхностью клеток, по сравнению с нормой, которое было ассоциировано с неблагоприятным прогнозом заболевания. Выявленные изменения концентрации и распределения внДНК крови являлись характерными для опухолей исследованной локализации, а именно, легких и желудка, и отличались от обнаруженных ранее изменений, обнаруженных при опухолях молочной железы. Например, у женщин, больных раком молочной железы наблюдалось достоверное снижение количества внДНК, связанных с поверхностью клеток крови, что не было выявлено у женщин, больных раком желудка (Laktionov et al, 2004).

Полученные в настоящей работе результаты делают очевидной перспективность дальнейших исследований «групп риска» по онкологическим заболеваниям и групп пациентов, прошедших лечение,

которые необходимы для оценки значимости изменений концентрации и распределения внДНК в крови с целью использования их в качестве дополнительных параметров при выявлении опухолей, их стадировании и для мониторинга рецидивов болезни.

Причины изменения распределения внДНК в крови больных опухолевыми патологиями остаются невыясненными. Согласно данным настоящей и других работ, внДНК могут гидролизоваться ДНК-гидролизующими ферментами крови (эндонуклеазами,

фосфодиэстеразами) (Барановский и соавт., 2004). Проведенные недавно исследования выявили корреляцию повышения уровня внДНК плазмы крови и понижения ДНКазной активности в плазме крови при раке предстательной железы и желудка по сравнению с нормой (Tamkovich et al., 2006). Можно предполагать, что одной из причин снижения нуклеазной активности плазмы при развитии опухолей является повышение концентрации ингибиторов дезоксирибонукпеаз в крови (Ramandanis et al., 1982).

В настоящей работе показано, что внДНК связаны с клетками крови за счет формирования комплексов с поверхностными белками. Поэтому одним из факторов, влияющих на количество связанных с клетками внДНК, может быть активность протеаз плазмы крови. Известно, что протеазы играют важную роль в опухолевом процессе, обеспечивая лизис компонентов внеклеточного матрикса, что обеспечивает быстрый рост опухоли, ее инвазию и метастазирование (Клишко и соавт., 2003). Повышенная активность специфических протеаз может приводить к деградации нуклеопротеиновых комплексов и отделению их от поверхности клеток (Matrisian et al., 2003). Дальнейшее распределение внДНК в плазме крови, их метаболизм и секреция определяются действием целого комплекса факторов, которые являются либо общими, либо специфическими при развитии опухолей различной локализации.

4. Количество и распределение в крови внРНК

Данные о концентрации внРНК в плазме в норме и при патологиях характеризуются высокой вариабельностью значений (Fleischhacker and Schmidt, 2007). Метод количественной ОТ-ПЦР является чувствительным и специфичным для определения копийности специфических мРНК, однако их содержание может значительно варьировать в общем количестве внРНК молекул крови. Причинами являются изменения экспрессии генов в клетках, а также влияние многих факторов, обеспечивающих метаболизм и утилизацию в организме внРНК. В данной работе количество внРНК крови было определено различными методами и проведен корреляционный анализ полученных данных.

4.1.Анализ суммарных внРНК методом флуоресценции

4.1.1. внРНК в крови клинически здоровых людей

Образцы крови 15 здоровых мужчин и 15 здоровых женщин были получены из ЦКБ СО РАН г. Новосибирска. Концентрацию общего количества внРНК определяли в плазме и ФБ-ЭДТА и трипсиновом элюатах с клеточной поверхности методом анализа флуоресценции комплексов выделенных РНК с красителем SYBR Green II.

Концентрация внРНК в плазме здоровых людей варьировала от 0 до 17 нг/мл крови. У клинически здоровых мужчин и женщин в плазме крови концентрация внРНК достоверно не различается и составляет в среднем 5 и 3 нг/мл крови (^критерий, р=0.13) (рис. 15). Следует отметить, что, как и в случае внДНК, внРНК в норме оказались преимущественно связанными с поверхностью форменных элементов - в среднем 97% и 90% от общего количества внРНК крови для мужчин и женщин, соответственно.

юоо

100

Рис. 15. Концентрация внРНК плазмы (Плазма) и внРНК, связанных с поверхностью клеток крови (Клетки) здоровых людей.

Было показано, что суммарная концентрация внРНК, связанных с клеточной поверхностью, у здоровых мужчин

достоверно выше, чем у женщин и составляют в среднем 262 нг/мл и 35 нг/мл крови ^-критерий, р<0.001). Выявленные в работе различия между здоровыми мужчинами и женщинами по суммарной концентрации внРНК крови учитывались в дальнейших исследованиях при формировании контрольных групп.

с 5

Ьй X о. X ш к а

I ю

а' х

• • ♦ » *

•

' в п ¡4

$ во ш □ шп 0

■ в р -ПО— □ поп -гт-

Плазма Клетки Плазма Клетки Мужчины Женщины

4.1.2. внРНК крови больных с опухолями молочной железы

Образцы крови были получены от 20 здоровых женщин, 13 больных с доброкачественными (фиброаденома) опухолями и 20 больных раком молочной железы (МЖ), первично обратившихся в Областной онкологический диспансер г. Новосибирска. Больные раком молочной железы находились на Т^Ых.о-гМо стадии заболевания (классификация ТЫМ). Больные 1-И стадии составляли 85%, больные с выявленными метастазами в регионарные лимфоузлы составляли 80%, отдаленных метастазов у всех больных выявлено не было. В табл. 6 представлены средние значения концентрации внРНК, определенной флуоресцентным методом.

Было показано отсутствие достоверных отличий концентрации внРНК между здоровыми женщинами и больными раком молочной железы при сравнении их как в плазме (критерий Манна - Уитни, р=0.212), так и для внРНК, связанных с клеточной поверхностью (критерий Манна - Уитни, р=0.356). Статистически значимое отличие было выявлено только при сравнении концентрации внРНК в плазме у больных с фиброаденомой и больных раком молочной железы (критерий Манна - Уитни, р<0.05), тогда как концентрация внРНК на поверхности клеток крови в этих группах не различается (критерий Манна - Уитни, р>0.05). Таким образом, при

опухолях молочной железы анализ концентрации внРНК крови методом флуоресценции не имеет диагностической значимости.

Таблица 6. Концентрация (нг/мл) внРНК в крови у здоровых женщин и у больных с опухолями молочной железы

Группы обследованных внРНК плазмы внРНК, связанные с поверхностью клеток

Здоровые женщины 3.3 (М2,Д 1 -11) 39 (М 26, Д 15-127)

Больные с фиброаденомой молочной железы 5.7 (М 3.4, Д 2 -19) 53 (М 41, Д 11 -142)

Больные раком молочной железы 1.9 (М 1.4, Д 0-7) 47 (М 28, Д 4 - 248)

Примечание: представлены средние значения, медиана (М), диапазон (Д)

4.1.3. внРНК крови больных раком легких

Группу больных раком легких составили 25 мужчин, первично обратившихся в Областной онкологический диспансер г. Томска, в возрасте от 46 до 74 лет. Контрольную группу составили 12 мужчин, сопоставимых по возрасту. Больные находились на Т)^Ых,о-гМо-1 стадии заболевания (классификация ТШ).

Таблица 7. Концентрация (нг/мл) внРНК в крови здоровых мужчин и больных раком __легких___

Группы обследованных внРНК плазмы внРНК, связанные с поверхностью клеток

Здоровые мужчины 5.3 (М 4, Д 0-17) 270 (М 262, Д 148-432)

Больные раком легких 7.7 (М 4, Д 0-32) 335 (М 242, Д 29-1266)

Больные со стабилизацией или регрессией болезни 6(М 3,Д 1-9) 205 (М 216, Д 29-378)

Больные с прогрессией болезни 9 (М 6.5, Д 0-32) 408 (М 245, Д 104-1266)

Примечание: представлены средние значения, медиана (М), диапазон (Д)

У больных раком легких по сравнению со здоровыми мужчинами не было выявлено статистически значимых отличий концентраций внРНК в плазме и внРНК, связанных с клеточной поверхностью (критерий Манна -Уитни, р>0.05) (табл. 7). Было выявлено также отсутствие достоверной ассоциации повышенного уровня внРНК на клеточной поверхности с прогрессией рака легких (205 нг/мл и 408 нг/мл, критерий Манна - Уитни, р=0.141). Таким образом, при раке легких определение концентрации внРНК, находящихся в плазме и связанных с поверхностью форменных элементов крови, при помощи флуоресцентного метода не имеет значимости для прогнозирования течения заболевания.

В работе получены данные о том, что внРНК, связанные с поверхностью клеток, составляли не менее 90% от общего количества внРНК крови как в

норме, так и при раке легких и молочной железы. Можно было предполагать, что использование этих внРНК возможно для разработки диагностики на основе анализа опухоль-ассоциированных мРНК.

4.2. Анализ РНК различных генов во внРНК крови

Для получения фундаментальных знаний о закономерностях секреции и метаболизма внРНК в крови необходим детальный анализ количества и распределения по фракциям крови РНК разных генов и выявление корреляций между ними. Сравнение их в норме и при заболеваниях может иметь значение для практической медицины поскольку поможет выбрать опухоль-ассоциированные маркеры и надежные внутренние стандарты.

4.2.1. Анализ мРНК генов маммаглобина и ß-актина во внРНК крови

Одним из кандидатов на роль специфичного маркера, ассоциированного с опухолями молочной железы, является мРНК гена, кодирующего белок маммаглобин (МГ). По литературным данным детекция мРНК МГ в тканях опухолей молочной железы достигала 81%, тогда как частота выявления мРНК маммаглобина в плазме крови составляла 54% (Min et al., 1998).

Больная раком молочной железы

10 11 12 13

■ 343 П.Н.

• 26В п.н.

Клинически здоровая женщина

■ 343 ггн.

■ 25Впн.

(1, 2), маркеры длины дцДНК на основе pUC19/Kzo9l (13).

Рис. 16. Анализ продуктов ОТ-ПЦР мРНК З-актина (1, 3, 5, 7, 9, 11) и мРНК маммаглобина (2, 4. 6, 8, 10, 12): электрофорез в нативном 6% ПААГ. Для ОТ-ПЦР использовали внРНК, выделенные из плазмы крови (3, 4), ФБ-ЭДТА элюата с поверхности эритроцитов (5, 6), ФБ-ЭДТА элюата с поверхности лейкоцитов (7, 8), трипсинового элюата с поверхности эритроцитов (9, 10), трипсинового элюата с поверхности лейкоцитов (11, 12), отрицательный контроль

Были проанализированы образцы крови 15 больных раком молочной железы в возрасте от 34 до 65 лет и 8 здоровых женщин, сопоставимых по возрасту. Больные раком молочной железы находились на Т1^Мх,о-2Мо стадии заболевания (классификация ТШ).

Для выявления мРНК МГ методом качественной ОТ-ПЦР были использованы внРНК, выделенные из всех фракций, полученных после обработки цельной крови: плазмы и элюатов с поверхности предварительно разделенных эритроцитов и лейкоцитов. Для контроля выделения внРНК, использовали ОТ-ПЦР на мРНК /3-актина. Данные анализа продуктов ОТ-ПЦР мРНК маммаглобина и р-актина в РНК из фракций крови приведены на рис. 16.

Было показано, что для увеличения чувствительности анализа мРНК МГ методом качественной ОТ-ПЦР следует использовать суммарные внРНК крови. мРНК МГ детектировалась с чувствительностью 60% в плазме крови, тогда как при использовании суммарных внРНК чувствительность анализа возрастала до 73%. При этом мРНК МГ не детектировалась у здоровых женщин, что говорило о 100% специфичности анализа этого маркера в суммарных внРНК крови. Присутствие фрагментов РНК, которые выявляются методом ОТ-ПЦР, вероятно, свидетельствует о том, что внРНК в плазме и на клеточной поверхности находятся в составе комплексов, которые предотвращают быструю деградацию молекул под действием РНК-гидролизующих ферментов крови.

Прямое подтверждение этому получено в исследованиях Her и соавторов, показавших ассоциацию молекул мРНК гена GAPDH в плазме с микро-частицами, которые не проходят через 0.2 мкм фильтры и осаждаются при высокоскоростном центрифугировании плазмы (Ng et al, 2003). Известно, что секретируемые клетками в культуре внРНК входят в состав нуклеопротеиновых комплексов, комплексов с липидами, протеолипидами, фосфолипидами и белками. Однако неясно, является ли состав таких комплексов в крови универсальным для РНК различных генов. Можно предполагать, внРНК присутствуют в крови в разных формах, что, вероятно, влияет на их деградацию, выведение из кровотока, распределение в крови и других тканях, что в итоге определяет уровень их копийности.

4.2.2. Копийность 18S рРНК и мРНК GAPDH во внРНК крови

Были проанализированы 18S рРНК и мРНК GAPDH в тех же образцах внРНК здоровых женщин и пациенток с патологиями молочной железы, в которых была ранее определена концентрация внРНК методом флуоресценции (как описано в п. 4.1.1). Измерение количества копий мРНК GAPDH и 18S рРНК проводили методом количественного ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием флуоресцентно меченых Taqman зондов (наборы фирмы Eurogentec, Бельгия).

Согласно полученным данным, копийность мРНК GAPDH не может быть использована в качестве стабильного внутреннего стандарта при анализе внРНК крови. Копийность мРНК GAPDH в крови характеризовалась очень высокой вариабельностью, особенно в группе пациенток со злокачественными опухолями, где разброс числовых значений достигал трех порядков (рис. 17). Возможно, с этим связано отсутствие достоверных различий между клинически здоровыми женщинами и больными раком молочной железы при анализе копийности мРНК GAPDH в плазме и суммарного их количества в крови (критерий Манна - Уитни, р=0.155 и 0.096). Количество копий 18S рРНК, определяемое во внРНК крови, характеризовалось существенно меньшей вариабельностью по сравнению с мРНК GAPDH (рис. 18).

•V 4 А «

* ♦ % • » ъ * ■ я* • ■

• " •V 1 ■ ■ * ■ • ■

А ■

Плазма Клетки Плазма Кпетки Плазма Клетки Норма Фиброаденома РакМЖ

Рис. 17. Копийность мРНК вАРОН во внРНК плазмы (Плазма) и внРНК, связанных с поверхностью клеток (Клетки), во фракциях крови здоровых

женщин (Норма), больных с

фиброаденомой (Фиброаденома) и раком молочной

железы (Рак МЖ).

100Q0

Было выявлено достоверное повышение количества копий 18S рРНК в плазме крови и на поверхности клеток у больных раком молочной железы по сравнению с клинически здоровыми женщинами и по сравнению с пациентками с диагнозом фиброаденома (критерий Манна - Уитни, р<0.01) (данные представлены в сводной табл. 10).

Рис. 18. Копийность 18S рРНК во внРНК плазмы (Плазма) и внРНК, связанных с поверхностью клеток (Клетки), во

фракциях крови здоровых женщин (Норма), больных с фиброаденомой (Фиброаденома) и раком молочной железы (Рак МЖ).

г юоо

100

♦ . ♦ ,1 А 4 А V" Л» « % ■ fJ

• ч* « 1 » А «я ■ в ■

•1 • « * И А А S ш ■ ■

* А

Плазма Клетки Норма

Плазма Клетки Фиброаденома

Плазма Кпетки РакМЖ

Следовательно, при опухолях молочной железы возможно использование 18S рРНК в качестве маркера, позволяющего не только отличить норму от патологии, но и дифференцировать злокачественные и доброкачественные новообразования.

Как и в случае мРНК GAPDH, во всех исследованных группах большое количество 18S рРНК в крови было связано с поверхностью клеток, по сравнению с тем, что было найдено в плазме, а именно, 75, 63 и 64% (табл. 8).

Следует отметить, что при измерении внРНК методом флуоресценции, процент связанных с клеточной поверхностью внРНК был выше, чем при измерении мРНК GAPDH и 18S рРНК и составлял 90, 85 и 94% в исследованных группах (см. табл. 8). Этот результаты позволили предполагать индивидуальные особенности циркуляции специфических РНК в общем пуле внРНК молекул.

Кроме того, не были выявлены корреляции между концентрациями общей внРНК, определенной по флуоресценции, и копийностью РНК генов «домашнего хозяйства» (мРНК GAPDH и 18S рРНК) в крови клинически здоровых женщин (табл. 9).

Таблица 8. Относительное распределение внРНК между свободно циркулирующей в плазме и связанной с поверхностью клеток крови

Группы обследованных внРНК* мРНК GAPDH 18S рРНК мРНК К/-67 мРНК RASSF8

Здоровые 90±24 79±28 75±27 82±23 73±23

Больные с фиброаденомой молочной железы 85±12 71 ±24 63±36 84±20 86±39

Больные раком молочной железы 94±19 75±21 64±25 76±24 70±29

Примечание: представлены средние значения и стандартные отклонения относительных количеств (%) внРНК, связанных с клеточной поверхностью

* - концентрация внРНК, измеренная методом флуоресценции комплексов РНК с красителем SYBR Green II

Полученные данные позволяют предположить, что факторы, определяющие появление и распределение в крови рибосомных РНК и матричных РНК, не являются универсальными и приводят к наблюдаемым различиям.

Таблица 9. Корреляции между концентрациями 18S рРНК и мРНК GAPDH и внРНК, определенной методом флуоресценции комплексов с SYBR Green II

Общая внРНК (детекция методом флуоресценции) Здоровые женщины Больные раком молочной железы

18S рРНК мРНК гена GAPDH 18SрРНК мРНК гена GAPDH

внРНК плазмы нет* нет нет нет

Связанные с клеточной поверхностью внРНК нет нет 0.001 0.001

Суммарные внРНК крови нет нет 0.022 нет

Примечание: обработка данных проводилась при помощи теста ранговой корреляции Спирмена, представлены значения р,

* - нет - отсутствие корреляции, р>0,05

Следует отметить, что у больных раком молочной железы суммарное количество внРНК крови по данным флуоресценции коррелирует только с суммарным количеством 18S рРНК и не коррелирует с мРНК GAPDH. Одним из объяснений полученных данных может быть различная защищенность молекул 18S рРНК и мРНК GAPDH от гидролиза в связи с их существованием в составе различных комплексов.

4.2.3. Копийность опухоль-ассоциированных мРНК генов RASSF8 и ki-67 во внРНК крови

В качестве перспективных онкомаркеров при раке молочной железы были выбраны мРНК гена RASSF8, который гиперэкспрессирован в клетках MCF-7, и гена ki-67, который является давно известным маркером опухолевого роста и характеризует активную пролиферацию клеток (Schlössen et al., 2000). Анализ копийности мРНК ki-67 и RASSF8 проводили методом ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием флуоресцентно меченых Taqman зондов (работа выполнена совместно с сотрудниками Института молекулярной медицины г. Любека, Германия).

Таблица 10. Достоверность различий копийности внРНК между группами здоровых женщин, больных фиброаденомой и раком молочной железы

Отличия между группами мРНК GAPDH 18SрРНК мРНК Ki-67 мРНК RASSF8

внРНК в плазме здоровые/рак 0.155 0.0001 0.009 0.018

внРНК суммарная здоровые/рак 0.096 0.000002 0.003 0.047

внРНК в плазме фиброаденома/рак 0.001 0.0001 0.002 0.0002

внРНК суммарная фиброаденома/рак 0.0002 0.0001 0.001 0.003

Примечание: сравнение двух независимых выборок проведено по критерию Манна - Уитни (представлены значения р)

Полученные в работе данные свидетельствуют о том, что у пациенток со злокачественными опухолями достоверно возрастает количество опухоль-ассоциированных мРНК Яг^ЭЭРЭ и кь67 по сравнению с группой клинически здоровых женщин и пациенток с фиброаденомой во внРНК плазмы и в суммарных внРНК крови (табл. 10).

Таблица 11. Чувствительность и специфичность анализа копийности мРНК R4SSF8, К/-67 и 18S рРНК при сравнении больных раком МЖ с группой без злокачественных

опухолей

Характеристики анализа мРНК RASSF8 мРНК Ki-67 18S рРНК

Пороговый уровень (коп/мл плазмы) 3000 47000 215000

Чувствительность теста (%) (95%CI) 73 (49.8 - 89.2) 73 (49.8 - 89.2) 82 (59.7 - 94.7)

Специфичность теста (%) (95%CI) 74 (53.7 - 88.8) 80 (62.1-91.3) 92 76.3 - 98.0)

Площадь под графиком (AUC) 0.74 (0.60 - 0.85) 0.78 0.64 - 0.87) 0.85 (0.72 - 0.92)

Примечание: чувствительность и специфичность определяли методом ROC-анализа

Была проведена оценка значимости анализа копийности 18S рРНК, мРНК генов RASSF8 и ki-67 во внРНК плазмы крови для дифференцировки доброкачественных и злокачественных опухолей молочной железы (табл. 11). Согласно данным ROC-анализа, определение копийности выбранных РНК позволяло не только отличить норму от патологии, но и дифференцировать злокачественные и доброкачественные новообразования с высокой чувствительностью и специфичностью.

5. Распределение аберрантно метилированных форм генов опухолевой супрессии во внДНК крови при онкологических заболеваниях

5.1. Выявление метилированных форм генов HIC-1, RAR(Î2, RASSF1A и сусГт D2 во внДНК крови

Аберрантное метилирование промоторных областей генов опухолевой супрессии HIC-1, RAR02, RASSF1A и cycliri D2 определяли методом качественной метил-специфичной ПЦР (МС-ПЦР) во внДНК, выделенных из фракций крови больных с опухолями молочной железы и здоровых женщин. Чувствительность МС-ПЦР, использованных в работе, позволяла выявлять один аберрантно метилированный аллель ДНК в присутствии 1000 неметилированных.

Н-О КВ Лей норма плазма ФБЭр Трил Эр ФБ лей Трип Лей

м и аг и м и ai и ai v ai и ai и ai и

rassfl

КАК 2»

шс-1

Рис. 19. Анализ продуктов МС-ПЦР, специфичной к метилированной (М) и неметилированной (II) формам генов ЯЛвЭРМ, 32 и Н1С-1 методом электрофореза, окраска бромистым этидием. внДНК выделяли из плазмы крови (плазма), из фракций, элюированных с поверхности эритроцитов (Эр) и лейкоцитов (Лей) при помощи ФБ-ЭДТА (ФБ) и раствора трипсина (Трип). Для контроля на метилированные формы генов использовали ДНК клеток линии КВ, на неметилированные формы - ДНК лейкоцитов в норме (Лей норма).

На рис. 19 представлены данные о выявлении аберрантно метилированных форм трех генов опухолевой супрессии RASSF1A, Н1С-1 и RARP2 во внДНК крови у пациентки со злокачественной опухолью молочной железы. Во всех фракциях внДНК присутствовали продукты реакции, специфичной к неметилированным формам генов, которые происходили из клеток здоровых тканей. В некоторых фракциях внДНК были также выявлены опухоль-ассоциированные гиперметилированные формы генов в сопоставимых количествах. У больных с опухолями молочной железы аберрантно метилированные формы каждого из трех генов с более высокой

ÎmÎ >_ i^j U

ISS

u w У tim

imîi ' ImmI ièné lu

"'¿T'y

118 95

частотой выявлялись во фракциях внДНК, связанных с клеточной поверхностью, по сравнению с внДНК плазмы крови (табл. 11). Это наблюдение оказалось достаточно неожиданным, поскольку согласно полученным ранее данным количество внДНК, связанных с поверхностью клеток при злокачественных опухолях молочной железы, существенно снижается по сравнению с этим показателем в норме (1акйопоу е1 а!., 2004). Можно предполагать, что причиной этого является более высокий уровень сорбции именно гиперметилированной внДНК на клетках крови, однако данное предположение можно подтвердить только количественным анализом.

В работе не было выявлено достоверных различий в распределении аберрантно метилированных генов между фракциями внДНК, злюированных с поверхности лейкоцитов и эритроцитов, равно как и между ФБ-ЭДТА и трипсиновым элюатами.

Таблица 12. Частота встречаемости (%) аберрантно метилированных генов ЯАБЭРЫ, ЯАЙ(32 и Н1С-1 в различных фракциях внДНК крови здоровых женщин и пациенток с опухолями молочной железы

Г руппы Гены внДНК в плазме внДНКна эритроцитах ВнДНК на лейкоцитах внДНК на клетках внДНК в крови

ФБ- трип ФБ- трип

Больные раком МЖ Н1С-1' 55 35 45 70 45 90 90

АШР/Л 15 35 0 35 30 65 75

мир 15 5 25 20 15 60 65

КА^ПА/ИИф** 30 90

Больные с фиброаденомой МЖ Н1С-1 40 27 73 67 53 93 93

7 27 33 40 27 53 53

мяр 13 0 7 0 13 20 33

ллхшл /ыщ 13 60

Здоровые женщины Н1С-1 0 10 10 50 20 50 50

0 0 0 0 0 0 0

мир 0 0 0 0 0 0 0

0 0

* - частота встречаемости аберрантно метилированных аллелей каждого из генов **- частота встречаемости аберрантно метилированных аллелей по крайней мере одного из двух генов

Частота встречаемости аберрантно метилированных аллелей была выше во фракции внДНК, связанных с поверхностью лейкоцитов, чем во фракции внДНК, злюированных с эритроцитов (табл. 12), что согласуется с полученными в работе данными, согласно которым с поверхностью отдельного лейкоцита связано, по крайней мере, в 100 раз больше внДНК, чем с поверхностью отдельного эритроцита.

Метилирование промотора гена Н1С-1 в ДНК крови в районе, выбранном для анализа, как оказалось, не является специфичным только для опухолей, поскольку выявляется у 50% здоровых женщин. Метилированная форма гена ¡ЗАЗЗПА выявляется с одинаковой частотой (60%) в элюатах с

поверхности клеток больных раком МЖ и с фиброаденомой МЖ. В отличие от RASSF1A, метилированная форма гена RAR/32 в три раза чаще встречается у пациентов со злокачественными опухолями МЖ, чем у больных с фиброаденомой во фракциях внДНК, связанных с клетками: 60% при раке и 20% при фиброаденоме МЖ (табл. 12).

Таким образом, было показано, что внДНК, связанные с поверхностью клеток крови, могут быть использованы наряду с внДНК плазмы крови для повышения чувствительности МС-ПЦР анализа метилированных генов в крови. Анализ суммарных внДНК крови приводил к выявлению метилированных форм одного из генов RAR02 и RASSF1A с частотой 90% в крови больных раком молочной железы, 60% в крови пациентов с фиброаденомой и характеризовался 100% специфичностью (табл. 12). Однако такой анализ не давал возможности дифференцировать опухоли МЖ различной этиологии.

По данным исследований, метилирование гена сyclin D2 выявлено в тканях опухоли в 57% случаев заболевших раком молочной железы и не обнаружено при других патологиях МЖ (Lewis, et а!.. 2003). Поэтому в работе был проведен анализ метилирования гена cyctin D2 во внДНК тех же образцов, в которых анализировали другие гены. Было показано, что у больных с фиброаденомой метилированные формы гена не выявлялись в плазме, но обнаруживались как в ФБ-ЭДТА, так и в трипсиновых элюатах с поверхности лейкоцитов.

Таблица 13. Частота встречаемости (%) аберрантно метилированных форм генов RASSF1A, сусНп 02 и RAR^2 во внДНК крови в норме и при опухолях молочной

железы

Гены Больные раком МЖ Больные с фиброаденомой МЖ Здоровые женщины

внДНК плазмы Суммарные внДНК внДНК плазмы Суммарные внДНК внДНК плазмы Суммарные внДНК

RASSF1A, RARP2, сусНп 02 60 95 13 87 0 0

RASSF1A, RAR/i2 30 90 13 60 0 0

RASSF1A, cyclinD2 50 95 6 80 0 0

RAR/32, cyclinD2 50 85 13 60 0 0

При анализе суммарных внДНК крови метилирование промоторной области гена сусНп 02 обнаруживалось у 70% больных раком молочной железы и у 33% пациенток с фиброаденомой. У здоровых женщин метилированная форма гена не выявлялась.

Анализ метилированных форм трех генов ЙАББРМ, сусНп 02 и RARp2, приводит к выявлению 95% злокачественных опухолей молочной железы и 87% доброкачественных опухолей при использовании суммарных внДНК крови (табл. 13). Согласно результатам исследований в ДНК, выделенных из тканей карциномы МЖ, аберрантно метилированные формы одного из трех

генов НАЯ&2, ЯАЭЭРЫ и сусИп 02 выявлялись в 96% случаев, а при доброкачественных патологиях МЖ частота метилирования этих генов снижалась до 43% (Ри е1 а1., 2003). В настоящей работе показана 60% частота выявления метилированных маркеров при доброкачественных изменениях МЖ, что может быть связано с исследованием только пациентов с фиброаденомой МЖ, исключая цистоэпителиому, фиброзно-кистозную мастопатию и другие доброкачественные патологии МЖ.

5.2. Скрининг метилированных форм ЯАЯ/32 и сусИп 02 во внДНК

Для определения применимости анализа метилированных форм генов сусИп 02 и ЯАЯ(32 как потенциальных маркеров онкологических заболеваний молочной железы, было проведено рандомизированное обследование женщин, наблюдающихся в женских консультациях Советского района г. Новосибирска. Определение маркеров проводилось «вслепую» методом МС-ПЦР с использованием суммарных внДНК крови. Было обследовано 76 женщин в возрасте от 24 до 75 лет, средний возраст пациенток составил 50.4 года.

В контрольной группе из 25 клинически здоровых женщин только у одной (4%) было обнаружено метилирование гена сусИп 02. У 10 из 24 (42%) пациенток с диагнозом фиброаденома МЖ было зафиксировано аберрантное метилирование одного из исследованных генов. Более низкая встречаемость метилированных маркеров - в 8 случаях из 24 (33%) наблюдалась у пациенток с другими доброкачественными патологиями МЖ, диагностированными как различные формы мастопатии, однако различия не являются статистически достоверными (критерий Фишера, р>0.05). В результате проведенного исследования обнаружена более низкая частота выявления метилированных форм генов сусИп 02 и ЯАЯр2 у больных доброкачественной опухолью - фиброаденомой молочной железы, чем показано ранее (42% и 60% соответственно). Одно из возможных объяснений состоит в том, что большинство женщин из «группы риска» не имели цитологического подтверждения диагноза, в отличие от первого исследования, когда диагноз был поставлен на основе гистологических анализов биопсийных проб.

Таким образом, группа пациенток с доброкачественными патологиями МЖ являлась неоднородной по наличию во внДНК крови маркеров опухолевого процесса, которые могут оказаться важными прогностическими факторами. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности дальнейших исследований для оценки эффективности выявления эпигенентических изменений генов сусИп 02 и ЯАЯ@2 в качестве прогностических критериев при опухолях МЖ.

5.3. Выявление метилированных форм генов р15, MGMT и hMLH1 во внДНК

В работе были проанализированы метилированные формы промоторных областей генов опухолевой супрессии р15, MGMT и hMLH1 во внДНК плазмы и связанных с клеточной поверхностью в крови 30 больных

раком желудка и 30 клинически здоровых людей. Больные находились на Т^ 4Их,о-2Мо-1 стадии заболевания (классификация ТШ).

Метилированные формы данных генов со значительно более высокой частотой встречаются в ДНК ткани опухоли и внДНК плазмы при раке желудка и с наименьшей частотой у здоровых людей (рис. 20).

* -Г

В опухолевой I ткан* при раке желудка

Рис. 20. Диапазон частоты встречаемости метилированых форм генов pi5, MGMT, hMLH1 в ткани слизистой желудка в норме и в опухолевой ткани при раке желудка по литературным данным.

Согласно полученным 0 10 20 30 50 60 70 80 данным (рис. 21), в

% группе больных раком

желудка аберрантное метилирование гена р15 выявлено в 50% случаев, в группе людей без диагностированных патологий в 23% случаев. Метилированная форма гена hMLH1 при анализе суммарных внДНК крови встречалась у 27% больных и у 17% здоровых людей.

здоровый донор

m D15 14Tb р.

¿58 Ьр

лиг-

|Д]Лр.

hMIHI ; 153 ьр ¡^

Шр JAi-Ьр

mMGMT I 81 b p i

,ntbp , ms bp •даир

Рис. 21. Анализ продуктов МС-ПЦР, специфичной к метилированным (М) формам генов р15, hMLH1, MGMT методом электрофореза, окраска бромистым этидием. Отрицательный контроль без ДНК (1), отрицательный контроль (ДНК лейкоцитов человека) (2), положительный контроль (ДНК лейкоцитов, обработанная

метилтрансферазой Sssl) (3), внДНК, выделенные из элюатов с поверхности клеток крови (4), маркеры длины дцДНК (5).

Частота встречаемости метилированной формы гена MGMT в суммарных внДНК крови составляла 67% у онкологических больных и 43% у здоровых доноров. Данные о частоте выявления метилированных форм генов опухолевой супрессии р15, hMLH1, MGMT в крови больных раком желудка и клинически здоровых людей представлены на рис. 22.

Частота встречаемости метилированных форм трех генов во внДНК плазмы оказалась значительно ниже, чем частота встречаемости в ткани опухоли при раке желудка. При анализе суммарных внДНК как в плазме, так и связанных с поверхностью клеток, частота выявления метилированных форм генов существенно возрастала и соответствовала результатам исследований, посвященных анализу ДНК опухолевых тканей (Sato et al., 2006).

Таким образом, использование суммарных внДНК (объединенные фракции плазмы, ФБ-ЭДТА и трипсинового элюатов) значительно повышало чувствительность детекции метилированных формы генов MGMT, р15 и hMLH1. При определении статуса метилирования генов MGMT, р15 и hMLH1 в суммарных внДНК крови рак желудка выявлялся с чувствительностью 80% и специфичностью 33%. Низкая специфичность определялась высокой частотой детекции аберрантного метилирования гена MGMT у здоровых людей (43%). Анализ метилирования этого участка гена является, по-видимому, мало перспективным для разработки первичной диагностики рака желудка.

Рис. 22. Частота выявления метилированных форм генов опухолевой супрессии р15, hMLH1, MGMT в крови больных раком желудка и здоровых доноров.

Комбинированное определение аберрантно метилированных аллелей генов р15 и hMLH1 в суммарных внДНК крови позволило дифференцировать рак желудка по сравнению с клинической нормой с чувствительностью 63% и специфичностью 63%. При анализе частоты выявления метилирования генов опухолевой супрессии на разных этапах развития опухоли было обнаружено, что у 71% больных раком желудка, находящихся на Тг стадии, детектируется изменение статуса метилирования одного из трех исследуемых генов. Метилированная форма одного из трех генов была выявлена среди больных, не имеющих метастазы в регионарные лимфатические узлы в 67% случаев, и у 75% больных без отдаленных метастазов. Была выявлена тенденция увеличения частоты встречаемости метилированной формы одного из трех генов с прогрессией опухолевого процесса, однако достоверных различий обнаружено не было. Таким образом, аберрантное метилирование генов опухолевой супрессии характерно для всех исследованных стадий развития опухоли.

В работе было проведено сравнение чувствительности и специфичности анализов эпигенетических и белковых маркеров. Для этого был определен уровень белковых маркеров РЭА, СА 19.9, СА 72.4 в крови тех же больных раком желудка и здоровых людей, у которых исследовали профиль метилирования генов. Согласно полученным данным метод, основанный на определении уровня белковых маркеров в плазме больных РЖ, характеризуется высокой специфичностью (100%), однако даже при комбинированном исследовании маркеров СА 19.9, СА 72.4 его чувствительность не превышает 30%. Определение РЭА в комбинации с СА

19.9 и СА 72.4 не повышает чувствительность, но лишь ведет к потере специфичности до 85% (рис. 23).

Рис. 23. Частота встречаемости повышенного уровня белковых маркеров СА 72.4, СА 19.9, РЭА у больных раком желудка и клинически здоровых людей.

Таким образом,

проведение сравнительного анализа показало, что чувствительность метода, основанного на определении частоты встречаемости

опухоль-ассоциированных белковых маркеров,

существенно ниже по сравнению с анализом ДНК-маркеров. Следует отметить, что достоверных корреляций между наличием аберрантного метилирования генов опухолевой супрессии МвМТ, р15 и 1пМШ1 и повышенным уровнем белковых маркеров РЭА, СА 19.9 и СА 72.4 в крови больных раком желудка обнаружено не было. Это свидетельствует о том, что данные параметры имеют независимое значение при развитии рака желудка и отражают разные стороны патогенеза.

РЭА+СА 72.4+СД 19.9

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенного исследования вносят существенный вклад в представление о базовых процессах, лежащих в основе поддержания таких концентрации и форм внНК в крови млекопитающих, которые в норме не приводят к неспецифической активации иммунной системы. В настоящем исследовании показано, что белки плазмы и клеток крови участвуют в процессах быстрого метаболизма и утилизации экзогенных фрагментов ДНК. Полученные результаты согласуются с данными о скорости выведения из крови внДНК, секретируемых клетками организма (Lo et al., 1999, То et al., 2003). Деградация фрагментов ДНК З'-экзонуклеазами плазмы и накопление образующихся коротких олигомеров в эритроцитах в норме могут препятствовать локальному увеличению концентрации в крови и других тканях олиго-, мононуклеотидов и продуктов их метаболизма (нуклеозиды, свободные основания и мочевая кислота), которые являются «сигналами опасности», актвирующими иммунные клетки (Ishii, 2008). Результаты настоящей работы подтверждают высказанные ранее предположения о том, что воспалительные реакции и развитие аутоиммунного ответа могут быть вызваны нарушениями метаболизма нуклеиновых кислот (Napirei et al., 2003).

В настоящем исследовании показано, что экзогенные ДНК-олигомеры и продукты их метаболизма /п vivo формируют комплексы с белками

сыворотки крови, причем прочность образующихся комплексов увеличивается при замене фосфодиэфирных связей на фосфоротиоатные. Были выявлены существенные различия фармакокинетики между фосфодиэфирными олигонуклеотидами и химерными фосфодиэфирными олигонуклеотидами, содержащими две фосфоротиоатные группы на 3'-конце молекулы. Полученные результаты свидетельствуют о влиянии химических модификаций ДНК-олигомеров на их биологические свойства, что согласуется с данными других исследований. Например, при использовании фосфоротиоатных аналогов CpG-содержащих олигонуклеотидов кроме целевого действия на иммунную систему были выявлены нежелательные побочные эфффекты, такие как активация гемопоэза, приводящая к значительному увеличению селезенки у мышей (Sparwasser et al., 1999).

В работе показано, что на биологические эффекты, вызываемые ДНК in vivo, кроме химических модификаций, влияет образование комплексов с полимерами поликатионной природы. ДНК и олигонуклеотиды в комплексах с полиэтиленимином оказывали существенно меньший стимулирующий эффект на пролиферацию клеток селезенки. Эти результаты позднее были подтверждены данными исследователей об отсутствии стимулирующего действия комплексов плазмидных ДНК с полиэтиленимином на синтез ИЛ-12 in vivo (de Wolf et al., 2008). Полученные в настоящей работе результаты вносят существенный вклад в развитие представлений о механизмах взаимодействия экзогенных ДНК с клетками иммунной системы, которые необходимо знать для разработки подходов, позволяющих модулировать их иммуностимулирующее действие. Эти знания позволят конструировать высокоэффективные ген-направленные терапевтические препараты, лишенные неблагоприятных побочных эффектов.

В настоящем исследовании впервые обнаружены внНК не только в плазме, но и на поверхности клеток крови. Выявлены их достоверные количественные и качественные изменения уже на ранних стадиях развития опухолей разной локализации и этиологии. Эти результаты имеют фундаментальное значение, поскольку позволяют пролить свет на практически неисследованный вопрос об их роли в патологических процессах. Следует подчеркнуть также важное практическое значение полученных данных, поскольку до сих пор известны лишь немногие параметры биохимического состава крови, которые достоверно изменяются при раке на ранних стадиях.

До сих пор не получены прямые доказательства предположения об участии внДНК опухолевых клеток в формировании метастазов в отдаленных органах (Garcia-Olmo et al., 2005). Оно возникло в связи с тем, что был обнаружен фагоцитоз апоптотических телец клетками in vitro, который приводил к проникновению ДНК опухолевых клеток в нормальные клетки (Bergdsmegh et al., 2006). Эту гипотезу подтверждают данные настоящей работы о наличии корреляции увеличения концентрации внДНК в плазме крови и тяжести заболевания при раке желудка. Другими исследователями была также выявлена корреляция между внДНК сыворотки крови и колоректальными метастазами из печени (Thijssen et al., 2002).

Другой предполагаемый способ передачи опухолевых сигнальных молекул состоит в поглощении клетками микрочастиц, называемых экзосомами, содержащими мРНК, микроРНК и белки ангиогенеза (Valadi et al., 2007). Показано, что при трансформации клеток микрочастицами, содержащими мРНК репортерного гена, происходит трансляция соответствующего белка (Skog et al., 2008). В настоящем исследовании получены данные о присутствии опухоль-ассоцированных внДНК и внРНК на поверхности лейкоцитов крови, которые позволяют предполагать их участие в формировании метастазов. Известно, что лимфоцитарные и моноцитарные клеточные элементы обладают способностью мигрировать из кровеносных сосудов в межклеточное пространство и обратно практически во всех органах и тканях. Таким образом, они могут являться переносчиками связанных с их поверхностью ДНК опухолевых клеток на большие расстояния и приводить к трансформации других тканей. Полученные знания имеют несомненное практическое значение, поскольку определяют пути разработки принципиально новых подходов к терапии рака. Исследования последних лет убедительно показали достоверное снижение метастазирования в модели опухолей у мышей при терапии их ДНК-гидролизующими ферментами (Шкляева и соавт., 2008).

До сих пор остается открытым вопрос о том, почему не развивается адекватная иммунная анти-опухолевая реакция при раке. Более того, иммунная система организма находится в супрессированном состоянии, что связывают с действием факторов, индуцирующих апоптоз Т-лимфоцитов, как, например, Fas-лигэнд (Kim et al., 2005). В связи с новыми открытиями в области циркулирующих микрочастиц, была выдвинута гипотеза о супрессирующем влиянии на иммунитет микроРНК, входящих в состав опухолевых экзосом (Ichim et al., 2008). За последние два года показано, что уровень некоторых опухоль-ассоциированных микроРНК в плазме крови существенно возрастает при лимфомах, опухолях простаты и яичников (Mitchell et al., 2008, Taylor et al., 2008). Важным результатом данной работы является обнаружение достоверного увеличения количества мРНК опухолевых клеток в плазме и на поверхности лейкоцитов крови онкологических больных по сравнению с нормой, что свидетельствует о перспективности дальнейших исследований роли свободных и связанных с клетками внРНК крови в патогенезе рака.

ВЫВОДЫ

Настоящая работа представляет собой первое комплексное исследование взаимодействий экзогенных и секретируемых в организме человека внеклеточных нуклеиновых кислот с компонентами крови. Впервые определены факторы, приводящие к поддержанию в крови равновесной концентрации внеклеточных нуклеиновых кислот, и получены принципиально новые данные, доказывающие значимость определения состава и количества внНК крови для диагностики онкологических заболеваний.

1. Впервые методом аффинной модификации in vivo определены факторы, влияющие на накопление и устойчивость экзогенных нуклеиновых кислот в крови.

Обнаружено, что низкомолекулярные продукты деградации ДНК-олигомеров (moho-, ди-, три- и тетрануклеотиды) избирательно накапливаются в эритроцитах крови.

Показано, что олигомерные фрагменты ДНК связываются в организме с белками сыворотки (иммуноглобулинами и альбумином) и с белком мембраны лейкоцитов крови. Эффективность связывания пиримидин-богатых фрагментов ДНК с белками сыворотки крови возрастает с увеличением длины ДНК-олигомеров, а также при замене фосфодиэфирных связей на фосфоротиоатные.

Впервые показано, что в составе ковалентных аддуктов ДНК-белок происходит деполимеризация ДНК с образованием 7-8-звенных фрагментов.

2. Впервые показано, что стимулирующее действие ДНК, содержащих CpG- и G-богатые участки, на пролиферацию лимфоцитов в культуре происходит рецептор-опосредованным путем.

Обнаружено ингибирование стимуляции пролиферации лимфоцитов под действием CpG-содержащих ДНК моновалентными Fab-фрагментами анти-lg антител.

3. В результате проведенного анализа концентрации и распределения внНК в крови в норме и при онкологических заболеваниях впервые обнаружено значительное количество внДНК и внРНК на поверхности клеток крови, связанных за счет ионных взаимодействий с мембраной и путем формирования комплексов с белками клеточной поверхности.

• Выявлены характерные изменения количества внДНК, связанных с поверхностью клеток и находящихся в плазме крови: при раке легких наблюдается уменьшение количества внДНК на поверхности клеток, при раке желудка возрастает концентрация внДНК в плазме. Впервые показана взаимосвязь выявленных изменений со стадией опухолевого процесса.

• Установлено, что анализ концентрации внДНК в плазме и на поверхности клеток крови может служить эффективным диагностическим фактором при выявлении опухолевого процесса и определении тяжести заболевания.

4. В результате определения концентрации внРНК во фракциях крови здоровых женщин и больных с опухолями молочной железы установлено, что анализ копийности 18S рРНК и опухоль-ассоциированных мРНК генов RASSF8 и Ki-67 во внРНК может служить эффективным диагностическим критерием для дифференцировки опухолей молочной железы различной этиологии.

метилированных аллелей генов опухолевой супрессии во внДНК, связанных с клеточной поверхностью.

• Установлено, что анализ метилированных маркеров во внДНК, связанных с клеточной поверхностью, повышает чувствительность детекции больных с опухолями желудка и молочной железы по сравнению с анализом только внДНК плазмы.

• Обнаружено, что изменение статуса метилирования хотя бы одного одного из трех генов RASSF1A, сусИп D2 u RAR/32 во внДНК крови с высокой точностью позволяет выявить больных с опухолями молочной железы разной этиологии.

• Показано, что аберрантно метилированные формы генов опухолевой супрессии р15 и hMLH1 выявляются в суммарных внДНК крови с достоверно одинаковой частотой на всех стадиях рака желудка, что свидетельствует о перспективности использования такого анализа для ранней диагностики.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Vlassov V.V., Yakubov L.A., Karamyshev V.N., Pautova L.V., Rykova EY, Nechaeva M.V. In vivo pharmacokinetics of oligonucleotides following administration by different routes. // Delivery strategies for antisense oligonucleotide therapeutics. / S. Akhtar (éd.). - CRC Press. - 1995. - P. 71-83.

2. Паутова Л. В., Рыкова Е. Ю., Лактионов П. П., Власов В. В. Исследование взаимодействий полиреактивных антител с нуклеиновыми кислотами при помощи алкилирующих производных олигонуклеотидов. // Молекуляр. биология. -1996. - Т. 30. - С. 941-950.

3. Лактионов П.П., Рыкова Е.Ю., Власов В.В. Участие поверхностных иммуноглобулинов в активации лимфоцитов плазмидной ДНК. // Молекуляр. биология. - 1997. -Т. 30. - С. 506-514.

4. Rykova E.Y., Laktionov P.P., Vlassov V.V. Polyethylenimine masks mitogenic effect of DNA. // Nucleosides Nucleotides. -1997. - Vol. 16. - P. 1883-1891.

5. Rykova E.Y., Laktionov P.P., Vlassov V.V. Activation of spleen lymphocytes by plasmid DNA. //Vaccine. -1999. - Vol. 17. - P. 1193-1200.

6. Лактионов П.П., Брыксин А.В., Рыкова Е.Ю., Амирханов Н.В., Власов В.В. Исследование фармакокинетики и стабильности в крови in vivo фосфодиэфирных и модифицированных производных олигонуклеотидов. // Вопр. мед. химии. -1999. -Т. 45. - С. 206-215.

7. Лактионов П.П., Брыксин А.В., Рыкова Е.Ю., Власов В.В. Исследование олигонуклеотид-белковых взаимодействий в крови in vivo. И Бюл. экспер. мед. -1999. - Т. 127. - С. 654-657.

8. Tosquellas G., Bryksin A., Alvarez К., Morvan F., Vasseur J.J., Rayner В., Rykova E., Laktionov P., Vlassov V., Imbach J.L. Prooligonucleotides exhibit less serum-protein binding than phosphodiester and phosphorothloate oligonucleotides. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. - 2000. - Vol. 19. - P. 995-1003.

9. Рыкова Е.Ю., Лактионов П.П., Власов В.В. Активирующее влияние ДНК на иммунную систему. II Успехи современной биологии. - 2001. - Т. 121. - С. 160-171.

10. Morozkin E.S., Laktionov P.P., Rykova E.Y., Vlassov V.V. Fluorometric quantification of RNA and DNA in solutions containing both nucleic acids. II Anal. Biochem. - 2003. - Vol. 322. - P. 48-50.

11. Rykova E.Y., Laktionov P.P., Skvortsova Т.Е., Starikov A.V., Kuznetsova N.P., Vlassov V.V. Extracellular DNA in Breast Cancer: Cell-surface-bound, tumor-derived extracellular DNA in blood of patients with breast cancer and nonmalignant tumors. //Ann. N.Y. Acad. Sci. - 2004. - Vol. 1022. - P. 217-221.

12. Morozkin E.S., Laktionov P.P., Rykova E.Y., Vlassov V.V. Extracellular nucleic acids in cultures of long-term cultivated eukaryotic cells. // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 2004. - Vol. 1022. - P. 244-250.

13. Rykova E.Y., Skvortsova Т.Е., Laktionov P.P., Tamkovich S.N., Bryzgunova O.E., Starikov A.V., Kuznetsova N.P., Kolomiets S.A., Sevostianova N.V., Vlassov W. Investigation of tumor-derived extracellular DNA in blood of cancer patients by methylation-specific PCR. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. -2004. - Vol. 23. - P. 855-859.

14. Skvortsova Т.Е., Rykova E.Y., Tamkovich S.N., Bryzgunova O.E., Starikov A.V., Kuznetsova N.P., Vlassov V.V., Laktionov P.P. Cell-free and cell-bound circulating DNA in breast tumors: DNA quantification and analysis of tumor-related gene methylation. // British J. Cancer. - 2006. - Vol. 94. - P. 1492-1495.

15. Rykova E.Y., Bryzgunova O.E., Skvortsova Т.Е., Tamkovich S.N., Senin I.S., Laktionov P.P., Zshakiel G., Vlassov V.V. Concentrations of circulating RNA from healthy donors and cancer patients estimated by different methods. // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2006. - Vol. 1075. - P. 328-333.

16. Vlassov V.V., Laktionov P.P., Rykova E.Y. Extracellular nucleic acids. II BioEssays. - 2007. - Vol. 29. - P. 654-667.

17. Рыкова Е.Ю., Скворцова Т.Э., Хоффман А.-Л., Тамкович C.H., Стариков

A.В., Брызгунова О.Е., Пермякова В.И., Варнеке Е., Шакиель Г., Власов В.В., Лактионов П.П. Циркулирующие внеклеточные ДНК и РНК крови в диагностике онкопатологий молочной железы. II Биомед. химия. - 2008. - Т. 54.-С. 94-103.

18. Rykova E.Y., Tsvetovskaya G.A., Sergeeva G.I., Vlassov V.V., Laktionov P.P. Methylation-based analysis of circulating DNA for breast tumors screening. // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2008. - Vol. 1137. - P. 232-236.

19. Kolesnikova E.V, Tamkovich S.N., Bryzgunova O.E., Shelestyuk P.I., Permyakova V.I., Vlassov V.V., Tuzikov S.A., Laktionov P.P, Rykova E.Y. Circulating DNA in the blood of gastric cancer patients. II Ann. N. Y. Acad. Sci. -2008. - Vol. 1137. - P. 226-232.

20. Морозкин E.C., Сильников B.H., Рыкова Е.Ю., Власов В.В., Лактионов П.П. Внеклеточная ДНК в культуре первичных и трансформированных клеток, инфицированных и неинфицированных микоплазмой. // Бюл. экспер. мед. - 2009. - Т. 147. - С. 67-70.

21. Елистратова Е.В., Лактионов П.П., Шелестюк П.И., Тузиков С.А., Власов

B.В., Рыкова Е.Ю. Иммунохимические и молекулярно-генетические маркеры в диагностике рака желудка. // Биомед. химия. - 2009. - Т. 55. - С. 15-31.

Подписано к печати 18 марта 2009г. Тираж 100 экз. Заказ № 812. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Рыкова, Елена Юрьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ИССЛЕДОВАНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В ОРГАНИЗМЕ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА, ИХ ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ

ЗНАЧЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ОРГАНИЗМ МЛЕКОПИТАЮЩИХ, СВЯЗАННЫЕ

С ПРИМЕНЕНИЕМ ЭКЗОГЕННЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ.

1.1. Модифицированные ДНК, используемые для направленных воздействий in vivo.

1.1.1. Производные с модифицированным сохаро - фосфатным остовом.

1.1.2. Модификации олигонуклеотидов по 5' и 3 '-концам молекулы.

1.2. Активирующее влияние экзогенных ДНК на иммунную систему.

1.2.1. Иммунные свойства нуклеиновых кислот.

1.2.2. Активация клеток иммунной системы под действием ДНК in vitro.

1.2.3. Иммуностимулирующее действие ДНК in vivo.

1.2.4. Перспективы терапевтического применения ИС ДНК.

ГЛАВА 2. ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ В КРОВИ.

2.1. Размер фрагментов внДНК и внРНК крови.

2.2. Взаимодействие внДНК и внРНК с компонентами крови.

2.2.1. внДНК в плазме / сыворотке крови.

2.2.2. внРНК в плазл ie крови.

2.2.3. Связывание внДНК с клетками крови.

2.3. Источники внДНК и внРНК в крови.

2.3.1. Апоптоз и некроз — источники нуклеиновых кислот.

2.3.2. Секрещя ДНК клетками.

2.3.3. Секреция РНК клетками.

2.4. Концентрация внДНК и внРНК в крови.

2.4.1. Концентрация внДНК в плазме крови в норме.

2.4.2. Концентрщия внДНК в плазме крови при патологиях.

2.4.3. Концентрация внРНК в плазме крови.

ГЛАВА 3. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ НУКЛЕИНОВЫХ

КИСЛОТ В МНОГОКЛЕТОЧНЫХ ОРГАНИЗМАХ.

3.1. Экзогенные ДНК, попадающие в организм млекопитающих с пищей.

3.2. внДНК и аутоиммунные заболевания.

3.3. Проникновение чужеродных молекул НК в клетки млекопитающих и возможность злокачественной трансформации.

3.4. Возможная роль малых внРНК в патогенезе нейродегенеративных заболеваний, связанных с действием прионов.

3.5. Биологическая роль малых внРНК у растений и животных.

ГЛАВА 4. ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕС

КИХ МАРКЕРОВ В ДИАГНОСТИКЕ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ.

4.1. Современное состояние исследований в диагностике онкологических заболеваний легких, молочной железы и желудка.

4.2. Инструментальные методы диагностики.

4.3. Новые направления в разработке методов малоинвазивной диагностики опухолей.

4.3.1. Белковые маркеры опухолей.

4.3.2. ДНК-маркеры опухолей.

4.4. Изменения, происходящие в ДНК клеток при раке.

4.4.1. Точковые мутации генов.

4.4.2. Выявление мутаций генов во внДНК крови.

4.4.3. Хромосомная нестабильность при раке.

4.4.4. Выявление изменений микросателлитов во внДНК плазмы крови.

4.5. Эпигенетические изменения ДНК в норме.

4.5.1. Профиль метилирования ДНК в норме.

4.5.2. Биохимические процессы метилирования в норме.

4.6. Роль аберрантного метилирования ДНК при раке.

4.6.1. Методы определения общего количества 5-МеС в геноме.

4.6.2. Гипометилирование генома в опухолевых клетках.

4.6.3. Инактивация экспрессии гена в результате гиперметилирования СрС островков промоторных районов.

4.6.4. Факторы, влияющие на гиперметилирование промоторов генов.

4.7. Стратегии поиска аберрантно метилированных генов.

4.7.1. Методы глобального геномного сканирования.

4.7.2. Принципы и методы целевого поиска генов, аберрантно метилированных при раке.

4.7.3. Бисульфитные методы детекции метилирования.

4.8. Гены, метилированные формы промоторов которых являются наиболее перспективными для диагностики рака молочной железы и легких.

4.8.1. Гены, гиперметилированные шагели которых выявляются в тканях опухолей молочной железы.

4.8.2. Гены, гиперметилированные аллели которых выявляются в тканях опухолей желудка.

4.8.3. Выявление гиперметилированных аллелей генов во внДНК крови.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экзогенные и секретируемые клетками нуклеиновые кислоты, их взаимодействия с компонентами крови в норме и при онкологических заболеваниях"

Феномен внеклеточных нуклеиновых кислот (внНК), обнаруженный первоначально в культуральной среде эукариотических клеток, является универсальным для многоклеточных организмов. Появление высокомолекулярных внНК во внеклеточном пространстве может быть как результатом разрушения клеток, так и продуктом активной секреции в процессе их жизнедеятельности. Несмотря на отсутствие прямых доказательств функциональной роли существующих в организме внНК, накопленные к настоящему моменту экспериментальные данные свидетельствуют в пользу их биологической значимости.

ВнНК могут перемещаться между соседними клетками и на дальние расстояния, достигая отдаленных органов и тканей посредством флоэмного тока у растений и через кровь у животных. В норме внНК присутствуют в плазме крови в невысокой концентрации в форме, которая препятствует их распознаванию как «сигналов опасности» со стороны иммунной системы. Это позволяет предполагать, что в организме существует система метаболизма, направленная на эффективную утилизацию внНК эндогенного происхождения. Нарушения функционирования компонентов этой системы, снижающие эффективность деградации и выведения внНК, вызывают развитие таких патологических состояний, как аутоиммунные реакции и воспаление [1]. Так, например, предполагают, что пусковым фактором системной красной волчанки могут быть эндогенные внДНК, появляющиеся в результате некротического или нестандартного апоптотического разрушения клеток, которые вызывают ответ иммунной системы [2]. В связи с этим изучение механизмов деградации и распределения внНК в крови необходимо для понимания их роли в норме и при патологиях.

Иммунный ответ на НК вирусов и бактерий активируется для защиты многоклеточного организма от чужеродной генетической информации. Стимулирующая активность CpG-содержащих последовательностей ДНК была обнаружена в экспериментах по лечению опухолей бактериальной ДНК и как побочный эффект при использовании антисмысловых олигонуклеотидов ш vivo [3]. Поэтому важной задачей является изучение взаимодействия внДНК с белками плазмы и клеток крови, которые приводят к тому, что внДНК активирует иммунную систему организма млекопитающих. Удобным инструментом для исследования взаимодействия внДНК с белками крови являются реакционноспособные производные олигонуклеотидов, которые позволяют выявлять образующиеся комплексы при взаимодействиях как in vitro, так и при введении ДНК in vivo [4].

Было показано, что при развитии онкологических заболеваний увеличивается количество циркулирующих в плазме крови внДНК, однако невыяснены прнчины, механизмы и последствия этого явления [5-7]. В плазме крови раковых больных были выявлены внДНК, которые характеризовались изменениями, идентичными ДНК опухоли [8-11]. Поэтому возникло предположение, что ДНК из клеток опухоли, попадая через кровь в другие органы и ткани, могут проникать в здоровые клетки, трансформировать их и приводить к образованию ближних и удаленных метастазов (теория «геномстастазов») [12, 13]. В настоящее время ведутся исследования передачи опухолевых сигнальных молекул между клетками через экзосомы, содержащие мРНК, микроРНК и белки ангиогенеза [14]. В последние годы получены данные о том, что при развитии опухолевых заболеваний происходят изменения в составе находящихся в плазме крови микроРНК, которые, предположительно, могут играть роль в ннгибировании иммунного ответа при раке [15]. Сравнительные исследования внДНК крови у здоровых людей и у пациентов с онкологическими заболеваниями разной тяжести необходимы для получения новых знаний о механизмах развития опухолей, а также о клеточном гомеостазе в норме.

Целью настоящей работы являлось изучение факторов, влияющих на метаболизм, распределение в крови и биологические эффекты экзогенных и эндогенных внДНК, выявление и количественный анализ эндогенных НК крови при опухолевых заболеваниях, определение диагностической и прогностической значимости их анализа.

В ходе исследования решались следующие основные задачи:

1) Определение устойчивости экзогенных ДНК и их производных в крови, выявление их взаимодействий с белковыми и клеточными компонентами крови in vivo методом аффинной модификации.

2) Исследование стимулирующих свойств CpG-содержащих ДНК и G-богатых олигонуклеотидов на пролиферацию лимфоцитов in vitro.

3) Выявление и количественный анализ эндогенных внДНК и внРНК, присутствующих в плазме и на поверхности клеток крови людей в норме и при онкологических заболеваниях.

4) Определение диагностической значимости количественного анализа внРНК и ко-пийности специфических РНК в крови больных опухолями молочной железы.

5) Анализ статуса метилирования опухоль-ассоциированных генов во фракциях внДНК крови больных раком желудка и молочной железы.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В ОРГАНИЗМЕ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА, ИХ ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ГЛАВА 1

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Рыкова, Елена Юрьевна

выводы

Показано, что олигомерные фрагменты ДНК связываются в организме с белками сыворотки (иммуноглобулинами и альбумином) и с белком мембраны лейкоцитов крови. Эффективность связывания пиримидин-богатых фрагментов ДНК с белками сыворотки крови возрастает с увеличением длины ДНК-олигомеров, а также при замене фосфоднэфнрных связей на фосфоротиоатные.

Обнаружено ингибирование стимуляции пролиферации лимфоцитов под действием CpG-содержащих ДНК моновалентными Fab-фрагментами анти-Ig антител.

4. В результате определения концентрации внРНК во фракциях крови здоровых женщин и больных с опухолями молочной железы установлено, что анализ копийно-сти 18S рРНК и опухоль-ассоциированных мРНК генов RASSF8 и Ki-67 во внРНК может служить эффективным диагностическим критерием для дифференцнровки опухолей молочной железы различной этиологии.

5. Проведенное комплексное исследование статуса метилирования опухоль-ассоциированных генов во фракциях внДНК крови больных раком желудка и молочной железы впервые показало присутствие аберрантно метилированных аллелей генов опухолевой супрессии во внДНК, связанных с клеточной поверхностью.

• Обнаружено, что изменение статуса метилирования хотя бы одного одного нз трех генов RASSF1A, cyclin D2 и RAR/32 во внДНК крови с высокой точностью позволяет выявить больных с опухолями молочной железы разной этиологии.

• Показано, что аберрантно метилированные формы генов опухолевой супрессии р15 и hMLHl выявляются в суммарных внДНК крови с достоверно одинаковой частотой на всех стадиях рака желудка, что свидетельствует о перспективности использования такого анализа для ранней диагностики.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время стремительно развивается новая область исследований молекулярной биологии, направленных на выяснение биологической роли внНК, циркулирующих в крови людей. Важнейшей практической задачей является выявление изменений во внНК крови, ассоциированных с такими опасными заболеваниями человека, как онкологические и аутоиммунные, решение которой в ближайшем будущем может революционным образом изменить подходы к их диагностике и лечению.

Проведенное в работе комплексное исследование внесло новый вклад в представления о базовых процессах, лежащих в основе поддержания равновесной концентрации внНК в крови млекопитающих. В ходе исследования было показано, что белковые и клеточные компоненты крови участвуют в процессе быстрого метаболизма и утилизации фрагментов экзогенных фрагментов ДНК. Полученные результаты согласуются с данными исследований о скорости выведения из крови внДНК, секретируемых клетками [376, 436].

Результаты настоящего исследования позволяют сформулировать предположение о том, что внДНК присутствует в крови млекопитающих в такой концентрации и в такой форме, которая не приводит в норме к неспецифической активации защитной системы. Деградация фрагментов ДНК З'-экзонуклеазами плазмы и накопление образующихся коротких олигомеров в эритроцитах в норме могут препятствовать локальному увеличению концентрации в крови и других тканях олиго-, мононуклео-тидов и продуктов их метаболизма (нуклеозиды, свободные основания и мочевая кислота), которые являются «сигналами опасности», активирующими иммунные клетки [207]. Полученные данные подтверждают высказанные ранее предположения о том, что воспалительные реакции и развитие аутоиммунного ответа могут быть вызваны нарушениями в системе метаболизма нуклеиновых кислот [1,2]. Предполагается, что апоптоз, проходящий по нестандарному пути, приводит к формированию таких комплексов, которые в отличие от стандартных апоптотических телец опознаются иммунными клетками как «сигналы опасности», приводя к развитию локальных воспалений [207].

В настоящем исследовании показано, что экзогенные ДНК-олигомеры и продукты их метаболизма in vivo формируют комплексы с белками сыворотки крови, причем прочность образующихся комплексов увеличивается при замене фосфодиэфир-ных связей на фосфоротиоатные. Были выявлены существенные различия фармако-кинетики между фосфодиэфирными олигонуклеотидами и химерными фосфоди-эфирными олигонуклеотидами, содержащими две фосфоротиоатные группы на 3'-конце молекулы. Полученные результаты свидетельствуют о влиянии химических модификаций ДНК-олигомеров на их биологические свойства, что согласуется с данными других исследований. Например, при использовании фосфоротиоатных аналогов CpG-богатых олигонуклеотидов кроме целевого действия на иммунную систему были выявлены нежелательные побочные эфффекты, такие как активация гемопоэза, приводящая к значительному увеличению селезенки у мышей [383].

В работе показано, что на биологические эффекты, вызываемые ДНК in vivo, кроме химических модификаций, влияет образование комплексов с полимерами по-ликатионной природы. ДНК и олигонуклеотиды в комплексах с полиэтиленимином оказывали существенно меньший стимулирующий эффект на пролиферацию клеток селезенки. Эти результаты позднее были подтверждены данными других исследователей об отсутствии стимулирующего действия комплексов плазмидных ДНК с полиэтиленимином па синтез ИЛ-12 in vivo [384]. Полученные в настоящей работе результаты вносят существенный вклад в развитие представлений о механизмах взаимодействия экзогенных ДНК с клетками иммунной системы, которые необходимо знать для разработки подходов, позволяющих модулировать их иммуностимулирующее действие. Эти знания позволят конструировать высокоэффективные ген-направленные терапевтические препараты, лишенные неблагоприятных побочных эффектов.

Несколько лет назад Гарсия-Олмо и соавт. высказали предположение об участии внДНК опухолевых клеток в формировании метастазов в отдаленных органах [13]. Оно возникло в связи с тем, что был обнаружен фагоцитоз апоптотических телец клетками in vitro, который приводил к проникновению ДНК опухолевых клеток в нормальные клетки [215]. Однако до сих пор не найдены прямые доказательства этой гипотезы. Была выявлена корреляция между возрастанием концентрации внДНК сыворотки крови и развитием метастазов в прямую кишку при раке печени, что позволило авторам рассматривать эти данные как косвенное подтверждение гипотезы «генометастазов» [437]. В настоящей работе также получены данные о наличии корреляции увеличения концентрации внДНК в плазме крови и тяжести заболевания при раке желудка, в частности, развития метастазов. Очевидно, что необходимы дальнейшие исследования для выявления роли внДНК опухолевых клеток в патогенезе рака.

Другой гипотетический способ передачи опухолевых «сигнальных» молекул состоит в поглощении клетками микрочастиц, называемых экзосомами, которые секре-тируются клетками и содержат мРНК, микроРНК и белки ангиогенеза [14]. Показано, что при трансформации клеток микрочастицами, содержащими мРНК репортер-ного гена, происходит трансляция соответствующего белка [438]. В настоящем исследовании получены данные о присутствии внДНК и внРНК, происходящих из опухолевых клеток, на поверхности лейкоцитов крови, которые позволяют сделать предположение об их участии в формировании метастазов. Известно, что лимфоци-тарные и моноцитарные клеточные элементы обладают способностью мигрировать из кровеносных сосудов в межклеточное пространство и обратно практически во всех органах и тканях. Таким образом, они могут являться переносчиками связанных с их поверхностью ДНК опухолевых клеток.

Другим косвенным свидетельством роли внДНК в патологическом процессс при раке могут служить результаты недавних исследований, которые показали достоверное снижение метастазирования в модели опухолей у мышей при терапии их ДНК-гидролизующими ферментами [439]. Механизм такого действия ДНКаз in vivo неизвестен, одно из предположений состоит в том, что происходит разрушение как нормальных, так и опухолевых внДНК крови. Необходимо получение новых данных о биологической роли опухолевых ДНК, находящихся в крови больных, которые будут иметь несомненное практическое значение для определения путей разработки принципиально новых подходов к терапии рака.

До сих пор остается открытым вопрос о том, почему не развивается адекватная иммунная анти-опухолевая реакция при раке. Более того, иммунная система организма находится в супрессированном состоянии, что связывают с действием факторов, индуцирующих апоптоз Т-лимфоцитов, как, например, Раэ-лиганд [440]. В связи с новыми открытиями, сделанными при изучении циркулирующих в крови микрочастиц, была выдвинута гипотеза о супрессирующем влиянии на иммунитет мик-роРНК, входящих в состав опухолевых экзосом [440]. За последние два года показано, что уровень некоторых опухоль-ассоциированных микроРНК в плазме крови существенно возрастает при лимфомах, опухолях простаты и яичников [441, 442]. Важным результатом данной работы является обнаружение достоверного увеличения количества мРНК опухолевых клеток в плазме и на поверхности лейкоцитов крови онкологических больных по сравнению с нормой, что свидетельствует о перспективности дальнейших исследований роли свободных и связанных с клетками внРНК крови в патогенезе рака.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Рыкова, Елена Юрьевна, Новосибирск

1. Yeh Т.М., Chang Н.С., Liang С.С., Wu J.J., Liu M.F. Deoxyribonuclease-inhibitory antibodies in systemic lupus erythematosus. II J. Biomed. Sci. 2003. V. 10. P. 544-551.

2. Napirei M., Gultekin A., Kloeckl Т., Moray Т., Frostegard J., Mannherz H.G. Systemic lupus-erythematosus: deoxyribonuclease 1 in necrotic chromatin disposal. // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2006. V. 38. P. 297-306.

3. Krieg A.M. CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects. // Anmt. Rev. Immunol. 2002. V. 20. P. 709-760.

4. Челобанов Б.П., Лактионов П.П., Власов B.B. Белки, участвующие в связывании и поглощении клетками нуклеиновых кислот. // Биохимия. 2006. Т. 71. С. 725-741.

5. Stroun М., Anker P. Circulating DNA in higher organisms cancer detection brings back to life an ignored phenomenon. // Cell. Mol. Biol 2005. V. 51. P. 161-11 A.

6. Tong Y.K., Lo Y.M. Diagnostic developments involving cell-free (circulating) nucleic acids. // Clin. Chim. Acta. 2006. V. 363. P. 187-196.

7. Fleishacker M., Schmidt B. Circulating nucleic acids (CNAs) and cancer a survey. // Biochim. Biophys. Acta. 2007. V. 1775. P. 181-232.

8. Anker P., Mulcahy H., Stroun M. Circulating nucleic acids in plasma and serum as a noninvasive investigation for cancer: time for large-scale clinical studies? // Int. J. Cancer. 2003. V. 103. P. 149-152.

9. Ng E.K., Tsui N.B., Lam N.Y., Chiu R.W., Yu S.C., Wong S.C., Lo E.S., Rainer Т.Н., Johnson P.J., Lo Y.M. Presence of filterable and nonfilterable mRNA in the plasma of cancer patients and healthy individuals. // Clin. Chem. 2002. V. 48. P. 1212-1217.

10. Pachot A., Jean-Luc В., Mougin В., Miossec P. Peptidylpropyl isomerase В (PPIB): a suitable reference gene for mRNA quantification in peripheral whole blood. // J. Biotechnol. 2004. V. 114. P. 121-124.

11. Chen Z., Fadiel A., Naftolin F., Eichenbaum K.D., Xia Y. Circulation DNA: Biological implications for cancer metastasis and immunology. // Med. Hypotheses. 2005. V. 65. P. 956-961.

12. Garcia-Olmo D.C., Guttierrez-Gonzalaz L., Ruiz-Piqueras R., Picazo M.G., Garcia-Olmo D. Detection of circulating tumor cells and of tumor DNA in plasma during tumor progression in rats. // Cancer Lett. 2005. V. 217. P. 115-123.

13. Valadi H., Ekstrom K., Bossios A., Sjostrand M. Lee J.J., Lotvall J.O. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. II Nat. Cell Biol. 2007. V. 9. P. 654-659.

14. Miller P.S., Cuchman C.D., Levis J.T. Synthesis of oligo-2'-deoxyrybonucleoside methylphosphonates. Oligonucleotides and Analogues. A Practical Approach. Oxford University, 1991. - P. 137.

15. Zon G., Geiser T.G. Phosphorotioate oligonucleotides: chemistry, purification, analysis, scale up and future directions. // Anticancer Drug Des. 1991. V. 6. P. 539-568.

16. Reese C.B. The chemical synthesis of oligo- and polynucleotides by phosphotriester approach. // Tetrahedron. 1978. V. 34. P. 3143-3179.

17. Marshall W.S., Caruthers M.H. Phosphoroditioate DNA as a potential therapeutic drug. II Science. 1993. V. 259. P. 1564-1570.

18. Seliger H., Frohlich A., Groger G., Krist B., Montenarh M., Rosch H., Rosch R., Ortigao F.R. Synthetic oligonucleotides for biomedical applications. // Nucleic. Acids Symp. Ser. 1991. V. 24. P. 193-196.

19. Nielsen P.E., Egholm M., Berg R.H., Moulds C. Sequense- selective recognition of DNA by strand displacement with a thymidine- substituted polyamide. // Science. 1991. V. 254. P. 1497-1500.

20. Shoji Y., Achtar S., Pariasami A., Herman B., Juliano R.L. Mechanism of cellular uptake of modified oligonucleotides containing methylphosphonate linkages. // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 5543-5549.

21. Chang E.H., Miller P.S. Ras, an inner membrane transducer of growth stimuli. // Prospects for Antisense Nucleic Acid Therapeutics for cancer and AIDS. / Ed. Wickstrom E. New York: Wiley-Liss, 1991. - P. 115-124.

22. Achtar S., Basu S., Wickstrom E., Juliano R.L. Interactions of antisense DNA oligonucleotide analogs with phospholipid membranes (liposomes). // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 5551-5559.

23. Agrawal S., Goodchild J., Civeira M.P., Thornton A.T., Sarin P.M., Zamecnik P.S. Oligodeoxynucleotide phosphoramidates and phosphorothioates as ingibitors of human immunodeficiency virus. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 7079-7083.

24. Dagle J.M., Walder J.A., Weeks D.R. Targeted degradation of m-RNA in Xenopus oocytes and embryos, directed by modified oligonucleotides : studies of An2 and cyclin in embryogenesis. II Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. P. 4751-4757.

25. Letsinger R.L., Lunsford W.B. Synthesis of thymidin oligonucleotides by phosphite triester intermediates. II J. Am. Chem. Soc. 1976. V. 98. P. 3655-3659.

26. Campbell J.A., Bacon T.A., Wickstrom E. Oligonucleotide phosphorothioate stability in cellular extracts, culture media, sera and cerebrospinal fluid. // J. Biochem. Biophys. Methods. 1990. V. 20. P. 259-267.

27. McSwiggen J.A., Cech T.R. Stereochemistry of RNA clevage by the tetrahymena ribozyme and evidence that the chemical step is not rate-limiting. // Science. 1989. V. 244. P. 679-683.

28. Woolf T.M., Jennings C.J., Rebagliati M., Melton D.A. The stability and effectiveness of unmodified and phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides in Xenopus oocytes and embryos. 11 Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. P. 1763-1769.

29. Yaswen P., Stampfer M.R., Ghosh K., Cohen J.S. Effects of sequence of thioated oligonucleotides on cultured human mammary epithelial cells. // Antisense Res. Dev. 1993. V. 3. P. 67-77.

30. Freier S.M. Hybridization: Considerations affecting antisense drugs. Antisense Research and Applications. Boca Raton, FL: CRC Press, 1993. - P. 67.

31. Ramsay S.B., Porter K., Briley D., Huang F. Boronated nucleic acids. // Antisense Res. Dev. 1995. V. 5. P. 106.

32. Cazenave C., Cheverier M., Thuong N.T., Helene C. Rate of degradation of a.-and [p]-oligodeoxynucleotides in Xenopus oocytes. I mplications for anti-messenger strategies. // Nucleic Acids Res. 1987. V. 15. P. 10507-10511.

33. Temsamani J., Tang J.Y., Agrawal S. Capped oligodeoxynucleotide phosphorothioates. Pharmacokinetics and stability in mice. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1992. V. 660. P. 318-320.

34. Shaw J.P., Kent K., Bird J., Fishback J., Froehler B. Modified deoxyoligonucleotides stable to exonuclease degradation in serum. // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 747-750.

35. Zendegui J.G., Vasquez K.M., Tinsley J.H., Kessler D.G., Hogan M.E. In vivo stability and kinetics of absorption and disposition of З'-phosphopropyl amine oligonucleotides. II Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 307-314.

36. Карамышев B.H., Власов B.B., Зон Д., Иванова Е.М., Якубов JI.A. Распределение производных олигонуклеотидов и их стабильность в тканях мышей. // Биохимия. 1993. Т. 8. С. 590-598.

37. Birg F., Helene C. Inhibition of simian virus 40 DNA replication in CV-1 cells by an oligodeoxynucleotide covalently linked to an intercalating agent. // Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. P. 2901-2907.

38. Gezelowitz A.D., Neckers L.M. Analysis of oligonucleotide binding, internalization and intracellular trafficking utilizing a novel radiolabeled crosslinker. // Antisense Res. Dev. 1992. V. 2. P. 17-25.

39. Бабкина И.В., Буторин A.C., Иванова E.M., Райт А.С. Химические превращения радиоактивных 4-(Л'-2-хлорэтил-Лг-метиламино)бензил-5'- ~р. фосфамидов олигодезоксирибонуклеотидов при постановке экспериментов in vivo. II Биохимия. 1988. Т. 53. С. 384-393.

40. Steinman C.R., Ackad A. Appearance of circulating DNA during hemodialysis. // Am. J. Med. 1977. V. 62. P. 693-697.

41. Stollar B.D. Antibodies to DNA. II CRC Crit. Rev. Biochem. 1986. V. 20. P. 1-36.

42. Frappier L., Price G.B., Martin R.G., Zannis-Hadjopoulos M. Characterization of the binding specificity of two anticruciform DNA monoclonal antibodies. // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 334-341.

43. Kawarada Y., Miura N., Sugiyama T. Antibody against single-stranded DNA useful for detecting apoptotic cells recognizes hexadeoxynucleotides with various base sequences.//J. Biochem. 1998. V. 123. P. 492-498.

44. Brawn W., Nakano M. Influence of oligodeoxyribonucleotides of early events in antibody formation. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1965. V. 119. P. 701-707.

45. Merritt K., Johnson A.G. Studies on the adjuvant action of bacterial endotoxins on antibody formation. VI. Enhancement of antibody formation by nucleic acids. // J. Immunol. 1965. V. 94. P. 416-422.

46. Billiau A., Buckler C.E., Danzani F., Uhlendorf C., Baron S. Induction of the interferon mechanism by single-stranded RNA: potentiation by polybasic substances. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1969. V. 132. P. 790-796.

47. Schmidtke J.R., Johnson A.G. Regulation of the immune system by synthetic polynucleotides. I. Characteristics of adjuvant action on antibody synthesis. // J. Immunol. 1971. V. 106. P. 1191-1200.

48. Yamamoto S., Yamamoto T., Kataoka T., Kuramoto E., Yana O., Tokunaga T. Unique palindromic sequences in synthetic oligonucleotides are required. // J. Immunol. 1992. V. 148. P. 4072-4076.

49. Krieg A.M., Yi A.K., Matson S., Waldschmidt T.J., Bishop G.A., Teasdale R., Koretzky G.A., Klinman D.M. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. II Nature. 1995. V. 374. P. 546-549.

50. Krieg A.M., Love-Homan L., Yi A-K., Harty J.T. CpG DNA induces sustained IL-12 expression in vivo and resistance to Listeria monocytogenes challenge. I I J. Immunol. 1998. V. 161. P. 2428-2434.

51. Liang H., Nishioka Y., Reich C.F., Pisetsky D.S., Lipsky P.E. Activation of human B cells by phosphorothioate oligodeoxynucleotides. // J. Clin. Invest. 1996. V. 98. P. 1119-1129.

52. Messina J.P., Gilkeson G.S., Pisetsky D.S. Stimulation of in vitro murine lymphocyte proliferation by bacterial DNA. // J. Immunol. 1991. V. 147. P. 1759-1764.

53. Branda R.F., Moore A.L., Mathews L., McCormack J.J., Zon G. Immune stimulation by an antisense oligomer complementary to the rev gene of HIV-1. // Biochem. Pharmacol. 1993. V. 45. P. 2037-2043.

54. Bird A.P. Gene number, noise reduction and biological complexity // Trends Genet. 1995. V. 11. P. 94-100.

55. Boggs R.T., McGraw K., Condon T., Flournoy S., Villiet P., Bennett F., Monia B.P. Characterization and modulation of immune stimulation by modified oligonucleotides. I I Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1997. V. 7. P. 461—471.

56. Ballas Z.K., Rasmussen W.L., Krieg A.M. Induction of NK activity in murine and human cells by CpG motifs in oligodeoxynucleotides and bacterial DNA. // J. Immunol. 1996. 157. P. 1840-1845.

57. Krieg A.M., Matson S., Fisher E. Oligodeoxynucleotide modifications determine the magnitude of B cell stimulation by CpG motifs. // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1996. V. 6. P. 133-139.

58. Hartmann G., Krieg A.M. CpG DNA and LPS induce distinct patterns of activation in human monocytes. II Gene Ther. 1999. V. 6. P. 893-903.

59. Lapatschek M.S., Gilbert R., Wagner H., Miethke T. Activation of macrophages and B lymphocytes by an oligodeoxynucleotide derived from an acutely pathogenic simian immunodeficiency virus. // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1998. V. 8. P. 357-370.

60. Sparwasser T., Hultner L., Koch E. S., Luz A., Lipford G.B., Wagner H. Immunostimulatory CpG-oligodeoxynucleotides cause extramedullary murine hemopoiesis. H J. Immunol. 1999. V. 162. P. 2368-2374.

61. Stacey K.J., Sweet M.J., Hume D.A. Macrophages ingest and are activated by bacterial DNA. II J. Immunol. 1996. V. 157. P. 2116-2122.

62. Roman M., Martin-Orozco E., Goodman J.S., Nguen M-D., Sato Y., Ronaghy A., Kornbluth R.S., Richman D.D., Carson D.A., Raz E. Immunostimulatory DNA sequences function as T helper-1-promoting adjuvants. // Nat. Med. 1997. V. 3. P. 849-854.

63. Benimetskaya L., Loike J.D., Khaled Z., Loike G., Silverstein S.C., Cao L., el Khoury J., Cai T.Q., Stein C.A. Mac-1 (CDllb/CD18) is an oligodeoxynucleotide-binding protein. II Nat. Med. 1997. V. 3. P. 414-420.

64. Sparwasser T., Mietke T., Lipford G., Erdmann A., Hacker H., Heeg K., Wagner H. Macrophages sense pathogens via DNA motifs: induction of tumor necrosis factor-alpha-mediated shock. II Eur. J. Immunol. 1997. V. 27. P. 1671-1679.

65. Bendigs S., Salzer U., Lipford G. B., Wagner H., Heeg K. CpG-oligodeoxynucleotides co-stimulate primary T cells in the absence of antigen-presenting cells. II Eur. J. Immunol. 1999. V. 29. P. 1209-1218.

66. Chace J.H., Hooker N.A., Mildenstein K.L., Krieg A.M., Cowdery J.S. Bacterial DNA-induced NK cell IFN-ganuna production is dependent on macrophage secretion ofIL-12. //Clin. Immunol. Immunopathol. 1997. V. 84. P. 185-193.

67. Hemmi H., Takeuchi O., Kawai T., Kaisho T., Sato S., Sanjo H., Matsumoto M., Hoshino K., Wagner H., Takeda K., Akira S. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. // Nature. 2000. V. 408. P. 740-745.

68. Bauer S., Pigisch S., Hangel D., Kaufmann A., Hamm S. Recognition of nucleic acid and nucleic acid analogs by Toll-like receptors 7, 8 and 9. // Immunobiology. 2008. V. 213. P. 315-328.

69. Wagner H., Bauer S. All is not Toll: new pathways in DNA recognition. // J. Exp. Med. 2006. V. 203. P. 265-268.

70. Leadbetter E.A., Rifkin I.R., Hohlbaum A.M., Beaudette B.C., Shlomchik M.J., Marshak-Rothstein A. Chromatin-IgG complexes activate B cells by dual engagement of IgM and Toll-like receptors. // Nature. 2002. V. 416. P. 603-607.

71. Gantner F., Hermann P., Nakashima K., Matsukawa S., Sakai K., Bacon K.B. CD40-dependent and -independent activation of human tonsil B cells by CpG oligodeoxynucleotides. H Eur. J. Immunol. 2003. V. 33. P. 1576-1585.

72. Cowdery J.S., Chace J.H., Yi A.K., Krieg A.M. Bacterial DNA induces NK cells to produce IFN-y in vivo and increases the toxicity of lipopolysaccharides. // J. Immunol. 1996. V. 156. P. 4570-4575.

73. Yi A.K., Chace J.H., Cowdery J.S., Krieg A.M. IFN-y promotes IL-6 and IgM secretion in response to CpG motifs in bacterial DNA and oligodeoxynucleotides.

74. J. Immunol. 1996. V. 156. P. 558-564.

75. Klinman D.M., Yi A.K., Beaucage S.L., Conover J., Krieg A.M. CpG motifs present in bacteria DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon y. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1996. V. 93. P. 2879-2883.

76. Deng G.M., Nilsson I.M., Verdrengh M., Colins L.V., Tarkowski A. Intra-articularly localized bacterial DNA containing CpG motifs induces arthritis. // Nat. Med. 1999. V. 5. P. 702-705.

77. Sato Y., Roman M., Tighe H., Lee D., Corr M., Nguen M.D., Silverman G.J., Lötz M., Carson D.A., Raz E. Immunostimulatory DNA sequences necessary for effective intradermal gene immunization. // Science. 1996. V. 273. P. 352—354.

78. Chu R.S., Targoni O.S., Krieg A.M., Lehmann P.V., Harding C.V. CpG oligodeoxynucleotides act as adjuvants that switch on T helper 1 (Thl) immunity. // J. Exp. Med. 1997. V. 186. P. 1623-1631.

79. Davis H.L., Weeranta R., Waldshmidt T.J., Tygrett L., Schorr J., Krieg A.M. CpG DNA is a potent enhancer of specific immunity in mice immunized with recombinant hepatitis B surface antigen. II J. Immunol. 1998. V. 160. P. 870-876.

80. Zimmerman S., Egeter O., Hausmann S., Lipford G.B., Rocken M., Wagner H., Heeg K. CpG oligodeoxynucleotides trigger protective and curative Thl responses in lethal murine leishmaniasis. II J. Immunol. 1998. V. 160. P. 3627-3630.

81. Weiner G.J., Liu H.M., Wooldridge J.E., Dahle C.E., Krieg A.M. Immunostimulatory oligodeoxynucleotides containing the CpG motif are effective as immune adjuvants in tumor antigen immunization. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1997. V. 94. P. 10833-10837.

82. Homer A.A., Ronaghy A., Cheng P.M., Nguyen M.D., Cho H.J., Broide D., Raz E. Immunostimulatory DNA is a potent mucosal adjuvant. // Cell Immunol. 1998. V. 190. P. 77-82.

83. Hsu C.H., Chua K.Y., Tao M.H., Lai Y.L., Wu H.D., Huang S.K., Hsieh K.H. Immunoprophylaxis of allergen-induced immunoglobulin E synthesis and airwayhyperresponsiveness in vivo by genetic immunization. // Nat. Med. 1996. V. 2. P. 540-544.

84. Kline J.N., Waldschmidt T.J., Businga T.R., Lemish J.E., Weinstock J.V., Thorne P.S., Krieg A.M. Modulation of airway inflammation by CpG oligodeoxynucleotides in a murine model of asthma. // J. Immunol. 1998. V. 160. P. 2555-2559.

85. Goodman J.S., Van Uden J.H., Kobayashi H., Broide D., Raz E. DNA immunotherapeutics: new potential treatment modalities for allergic disease. // Int. Arch. Allergy Immunol. 1998. V. 116. P. 177-187.

86. Steinberg A.D., Krieg A.M., Gourley M.F., Klinman D.M. Theoretical and experimental approaches to generalized autoimmunity. // Immunol. Rev. 1990. V. 118. P. 129-163.

87. Gilkeson G.S., Pippen A.M., Pisetsky D.S. Induction of cross-reactive anti-dsDNA antibodies in preautoimmune NZB/NZW mice by immunization with bacterial DNA. // J. Clin. Invest. 1995. V. 95. P. 1398-1402.

88. Mor G., Singla M., Steinberg A.D., Hoffman S.L., Okuda K., Klinman D.M. Do DNA vaccines induce autoimmune disease? // Hum. Gene Ther. 1997. V. 8. P. 293-300.

89. Katsumi A., Emi N., Abe A., Hasegawa Y., Ito M., Saito H. Humoral and cellular immunity to an encoded protein induced by direct DNA injection. // Hum. Gene Ther. 1994. V. 5. P. 1335-1339.

90. Gilkeson G.S., Conover J., Halpern M., Pisetsky D.S., Feagin A., Klinman D.M. Effects of bacterial DNA on cytokine production by (NZB/NZW)F1 mice. // J Immunol. 1998. V. 161. P. 3890-3895.

91. Davis H.L., Millan C.L., Watkins S.C. Immune-mediated destruction of transfected muscle fibers after direct gene transfer with antigen-expressing plasmid DNA. // Gene Ther. 1997. V. 4. P. 181-188.

92. Klinman D.M., Sechler J.M., Conover J., Gu M., Rosenberg A.S. Contribution of cells at the site of DNA vaccination to the generation of antigen-specific immunity and memory. H J. Immunol. 1998. V. 160. P. 2388-2392.

93. Li S., Wu S.P., Whitmore M., Loeffert E.J., Wang L., Watkins S.C., Pitt B.R., Huang L. Effect of immune response on gene transfer to the lung via systemic administration of cationic lipidic vectors. // Am. J. Physiol. 1999. V. 276. P. L796-804.

94. Mandel P, Metais P. Les Acides Nucleic Du Plasma Sanguin Chez L'Homme. // C. R. Acad. Sei. 1948. V. 142. P. 241-243.

95. Leon S.A., Shapiro B., Sklaroff D.M., Yaros M.J. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. // Cancer Res. 1977. V. 37. P. 646-650.

96. Tan E.M., Schur P.H., Carr R.I., Kunkel H.G. Deoxybonucleic acid (DNA) and antibodies to DNA in the serum of patients with systemic lupus erythematosus. // J. Clin. Invest. 1966. V. 45. P. 1732-1740.

97. Miyamoto K., Ushijima T. Diagnostic and therapeutic applications of epigenetics. II Jpn. J. Clin. Oncol 2005. V. 35. P. 293-301.

98. Bremnes R.M., Sirera R., Camps C. Circulating tumour-derived DNA and RNA markers in blood: a tool for early detection, diagnostics, and follow-up? // Lung Cancer. 2005. V. 49. P. 1-12.

99. De Kok J.D., van Solinge W.W., Ruers T.J., Roefols R.W., van Muijen G.N., Willems J.L., Swinkels D.W. Use of real-time quantitative PCR to compare DNA isolation methods. II Clin. Chem. 1998. V. 44. P. 2201-2204.

100. Giacona M.B., Ruben G.C., Iczkowski K.A., Roos T.B., Porter D.M., Sorenson G.D. Cell-free DNA in human blood plasma: length measurements in patients with pancreatic cancer and healthy controls. II Pancreas. 1998. V. 17. P. 89-97.

101. Wu T.L., Zhang D., Chia J.H., Tsao K.H., Sun C.F., Wu J.T. Cell-free DNA: measurement in various carcinomas and establishment of normal reference range. // Clin. Chim. Acta. 2002. V. 321. P. 77-87.

102. Wang B.G., Huang H.Y., Chen Y.C., Bristow R.E., Kassauci K., Cheng C.C., Roden R., Sokoll L.J., Chan D.W., Shih Ie.M. Increased plasma DNA integrity in cancer patients. // Cancer Res. 2003. V. 63. P. 3966-3968.

103. El-Hefnawy Т., Raja S., Kelly L., Bigbee W.L., Kirkwood J.M., Luketich J.D., Godfrey Т.Е. Characterization of amplifiable circulating RNA in plasma and its potential as a tool for cancer diagnostics. // Clin. Chem. 2004. V. 50. P. 564-573.

104. Cerkovnik P., Perhavec A., Zgajnar J., Novakovic S. Optimization of an RNA isolation procedure from plasma samples. // Int. J. Mol. Med. 2007. V. 20. P. 293-300.

105. Lo Y.M. Recent advances in fetal nucleic acids in maternal plasma. // J. Histochem. Cytochem. 2005. Y. 53. P. 293-296.

106. Rosi A Guidoni L., Luciani A ., Mariutti G Viti V . RNA lipid complexes released from the plasma membrane of human colon carcinoma cells // Cancer Lett. 1988. V. 39. P. 153-160.

107. Johnson S.M., Grosshans H., Shingara J., Byrom M., Jarvis R., Cheng A., Labourier E., Reinert K.L., Brown D., Slack F.J. RAS is regulated by the let-7 microRNA family. // Cell. 2005. V. 120. P. 635-647.

108. Leon S.A., Shapiro В., Servi P., Parsons R.G. A comparison of DNA and DNA-binding protein levels in malignant disease. // Eur. J. Cancer. 1981. V. 17. P. 533-538.

109. Егорова В.А., Блинов M.H. ДНК-связывающие белки сыворотки крови при гемобластозах. // Вопр. мед. химии. 1993. Т. 39. С. 36-38.

110. Van Schravendijk M.R., Dwek R.A. Interaction of Clq with DNA. // Mol. Immunol. 1982. V. 19. P. 1179-1187.

111. Hoch S.O. DNA-binding domains of fibronectin probed using Western blots. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1982. V. 106. P. 1353-1358.

112. Лактионов П.П., Рыкова Е.Ю., Крепкий Д.В., Брыксин А.В., Власов В.В. Взаимодействие олигонуклеотидов с белками барьерных жидкостей. // Биохимия. 1997. Т. 62. С. 716-723.

113. Zou S., Magura C.E., Hurley W.L. Heparin-binding properties of lactoferrin and lysozyme. // Comp. Biochem. Physiol. B. 1992. V. 103. P. 889-895.

114. Deligezer U., Yaman F., Erten N., Dalay N. Frequent copresence of methylated DNA and fragmented nucleosomal DNA in plasma of lymphoma patients. // Clin. Chim. Acta. 2003. V. 335. P. 89-94.

115. Rumore P., Muralidhar В., Lin M., Lai C., Steinman C.R. Haemodialysis as a model for studying endogenous plasma DNA: oligonucleosome-like structure and clearance. // Clin. Exp. Immunol. 1992. V. 90. P. 56-62.

116. Holdenrieder S., Stieber P. Therapy control in oncology by circulating nucleosomes. II Ann. N. Y. Acad. Sei. 2004. V. 1022. P. 211-216.

117. Halicka H.D., Bedner E., Darzynkiewicz Z. Segregation of RNA and separate packaging of DNA and RNA in apoptotic bodies during apoptosis. // Exp. Cell Res. 2000. V. 260. P. 248-256.

118. Tsui N., Ng EK., Lo Y. Stability of endogenous and added RNA in blood speciment, serum, and plasma. // Clin. Chem. 2002. V. 48. P. 1647-1653.

119. Hasselman D.O., Rappl G., Tilgen W., Reinhold U. Extracellular tyrosinase mRNA within apoptotic bodies is protected from degradation in human serum. // Clin. Chem. 2001. V. 47. P. 1488-1489.

120. Беляев Н.Д., Будкер В.Г., Горохова O.E., Соколов A.B. Mg^-зависимое взаимодействие ДНК с эукариотическими клетками. // Молекуляр. биология. 1988. Т. 22. С. 1667-1672.

121. Budker V.G., Godovikov A.A. Naumova L.P., Slepneva I.A. Interaction of polynucleotides with natural and model membranes. // Nucleic Acids Res. 1980. V. 8. P. 2499-2515.

122. Bennett R.M., Kotzin B.L., Merritt M.J. DNA receptor dysfunction in systemic lupus erythematosus and kindred disorders. Induction by anti-DNA antibodies, antihistone antibodies, and antireceptor antibodies. // J. Exp. Med. 1987. V. 166. P. 850-863.

123. Gasparro F.P., Dall'Amico R., O'Malley M., Heald P.W., Edelson R.L. Cell membrane DNA: a new target for psoralen photoadduct formation. // Photochem. Photobiol. 1990. V. 52. P. 315-321.

124. Laktionov P.P., Dazard J.E., Vives E., Rykova E.Y., Piette J., Vlassov V.V., Lebleu B. Characterisation of membrane oligonucleotide-binding proteins and oligonucleotide uptake in keratinocytes. // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 2315-2324.

125. Huss R. A 42 kD erythrocyte surface membrane protein with binding capacity to polynucleotides shows functional lack in systemic lupus erythematosus. // Immunobiology. 1988. T. 178. C. 141-142.

126. Dorsch C.A. Binding of single-strand DNA to human platelets. // Thromb. Res. 1981. V. 24. P. 119-129.

127. Wright C.F., Burton H. The use of cell-free fetal nucleic acids in maternal blood for non-invasive prenatal diagnosis. I I Hum. Reprod. Update. 2009. V. 15. P. 139-151.

128. Федченко В.И., Гурьев С.О., Семенова Н.В. Неинвазивная пренатальная ПЦР диагностика пола. // Биомед. химия. 2005. Т. 51. С. 527-535.

129. Pawlotsky J.M., Bastie A., Lonjon I., Remire J., Darthuy F., Soussy C.J., Dhumeaux D. What technique should be used for routine detection and quantification of HBV DNA in clinical samples? И J. Virol. Methods. 1997. V. 65. P. 245-253.

130. Rainer Т.Н., Lo Y.M., Chan L.Y., Lam N.Y., Lit L.C., Cocks R.A. Derivation of a prediction rule for posttraumatic organ failure using plasma DNA and other variables. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2001. V. 945. P. 211-220.

131. Anker P., Mulcahy H., Chen X.Q., Stroun M. Detection of circulating tumour DNA in the blood (plasma/serum) of cancer patients. // Cancer Metastasis Rev. 1999. V. 18. P. 65-73.

132. Webb S.J., Harrison D J., Wyllie A.H. Apoptosis: an overview of the process and its relevance in disease. II Adv. Pharmacol. 1997. V. 41. P. 1-34.

133. Rudin C.M., Thompson C.B. Apoptosis and disease: regulation and clinical relevance of programmed cell death. // Annu. Rev. Med. 1997. V. 48. P. 267-281.

134. Nagata S. Apoptotic DNA fragmentation. // Exp. Cell. Res. 2000. V. 256. P. 12-18.

135. Liu X., Li P., Widlak P., Zou H., Luo X., Garrard W.T., Wang X. The 40-kDa subunit of DNA fragmentation factor induces DNA fragmentation and chromatin condensation during apoptosis. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1998. V. 95. P. 8461-8466.

136. Holdenrieder S., Stieber P., Chan, L.Y., Geiger S., Kremer A., Nagel D., Lo D.Y. Cell-free DNA in serum and plasma: comparison of ELISA and quantitative PCR. // Clin. Chem. 2005. V. 51. P. 1544-1546.

137. Majno G., Joris I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. // Am. J. Pathol. 1995. V. 146. P. 3-15.

138. Lichtenstein A.V., Melkovyan H.S., Tomei L.D., Umansky S.R. Circulating nucleic acids and apoptosis. II Ann. N. Y. Acad. Sei. 2001. V. 945. P. 239-249.

139. Shapiro B., Chakrabarty M., Cohn E.M., Leon S.A. Determination of circulating DNA levels in patients with benign or malignant gastrointestinal disease. // Cancer. 1983. V. 51. P. 2116-2120.

140. Goessl C., Heicappell R., Munker R., Anker P., Stroun M., Krause H., Muller M., Miller K. Microsatellite analysis of plasma DNA from patients with clear cell renal carcinoma. // Cancer Res. 1998. V. 58. P. 4728-4732.

141. Lam N.Y., Rainer T.H., Chan L.Y., Joynt G.M., Lo Y.M. Time course of early and late changes in plasma DNA in trauma patients. // Clin. Chem. 2003. V. 49. P. 1286-1291.

142. Stroun M., Lyautey J., Lederrey C., Olson-Sand A., Anker P. About the possible origin and mechanism of circulating DNA apoptosis and active DNA release. // Clin. Chim. Acta. 2001. V. 313. P. 139-142.

143. Rogers J.C., Boldt D., Kornfeld S., Skinner A., Valeri C.R. Excretion of deoxyribonucleic acid by lymphocytes stimulated with phytohemagglutinin or antigen. I/Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1972. V. 69. P. 1685-1689.

144. Anker P., Stroun M., Maurice P.A. Spontaneous release of DNA by human blood lymphocytes as shown in an in vitro system. // Cancer Res. 1975. V. 35. P. 2375-2382.

145. Combaret V., Audoynaud C., Iacono I., Favrot M.-C., Schell M., Bergeron C., Puisieux A. Circulating.MYCN DNA as a tumor-specific marker in neuroblastoma patients. // Cancer Res. 2002. V. 62. P. 3646-3648.

146. Kolodny G., Culp L., Rosentha L. Secretion of RNA by normal and transformed cells. II Exp. Cell Res. 1972. V. 73. P. 65-72.

147. Bottcher K., Wenzel A., Warnecke J.M. Investigation of the origin of extracellular RNA in human cell culture. II Ann. N. Y. Acad. Sci. 2006. V. 1075. P. 50-56.

148. Stroun M., Anker P., Beljanski M., Henri J., Lederrey C., Ojha M., Maurice P. Presence of RNA in the nucleoprotein complex spontaneously released by human lymphocytes and frog auricles in culture. // Cancer Res. 1978. V. 38. P. 3546-3554.

149. Wieczorek A.J., Rhyner C., Block L.H. Isolation and characterization of an RNA-proteolipid complex associated with the malignant state in humans. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 3455-3459.

150. Raptis L., Menard H.A. Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus. // J. Clin. Invest. 1980. V. 66. P. 1391-1399.

151. Sozzi G., Conte D., Mariani L., Lo Vullo S., Roz L., Lombardo C., Pierotti M.A., Tavecchio L. Analysis of circulating tumor DNA in plasma at diagnosis and during follow-up of lung cancer patients. II Cancer Res. 2001. V. 61. P. 4675-4678.

152. Wong T.S., Kwong D.L., Sham J.S., Wei W.I., Kwong Y.L., Yuen A.P. Quantitative plasma hypermethylated DNA markers of undifferentiated nasopharyngeal carcinoma. II Clin. Cancer Res. 2004. V. 10. P. 2401-2406.

153. Lam N.Y., Rayner T.H., Lo Y.M. Plasma mitochondrial DNA concentrations after trauma. // Clin. Chem. 2004. V. 50. P. 213-216.

154. Lam N.Y., Rainer T.H., Chan L.Y., Joynt G.M., Lo Y.M. Time course of early and late changes in plasma DNA in trauma patients. // Clin. Chem. 2003. V. 49. P. 1286-1291.

155. Vasilyeva I.N. Low-molecular-weight DNA in blood plasma as an index of the influence of ionizing radiation. II Ann. N. Y. Acad. Sei. 2001. V. 945. P. 221-228.

156. Lam N.Y., Rayner T.H., Wong L.K., Lam W., Lo Y.M. Plasma DNA as a prognostic marker for stroke patients with negative neuroimaging within the first 24 h of symptom onset. // Resuscitation. 2006. V. 68. P. 71-78.

157. Geiger S., Holdenrieder S., Stieber P., Hammann G.F., Bruening R., Ma J., Nagel D., Seidel D. Nucleosomes in serum of patients with early cerebral stroke. // Cerebrovasc. Dis. 2006. V. 21. P. 32-37.

158. Partsalis T., Chen L.Y., Herworth M., Willers C., Pavlos N., Kumta N., Wood D,, Xu J., Kumta S., Lo Y.M., Zheng M.H. Evidence of circulating donor genetic material in bone allotransplantation. II Int. J. Mol. Med. 2006. V. 17. P. 1151-1155.

159. Gadi V.K., Nelson J.L., Boespflug N.D., Guthrie K.A., Kuhr C.S. Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection. // Clin. Chem. 2006. V. 52. P. 379-382.

160. Galeazzi M., Morozzi G., Piccini M., Chen J., Bellisai F., Fineschi S., Marcolongo R. Dosage and characterization of circulating DNA: present usage and possible applications in systemic autoimmune disorders. // Autoimmun. Rev. 2003. V. 2. P. 50-55.

161. Khosrotehrani K., Johnson K.L., Guegah S., Stroh H., Bianchi D. Natural history of fetal microchimerism during and following murine pregnancy. // J. Reprod. Immunol. 2005. V. 66. P. 1-12.

162. Johnson K.L., Bianchi D. Fetal cells in maternal tissue following pregnancy: what are the consequences? // Hum. Reprod. Update. 2004. V. 10. P. 497-502.

163. Birch L., English C.A., O'Donoghue K., Barigye O., Fisk N.M., Keer J.T. Accurate and robust quantification circulating fetal and total DNA in maternal plasma from 5 to 41 weeks of gestation. II Clin. Chem. 2005. V. 51. P. 312-320.

164. Hahn S., Huppertz B., Holzgreve W. Fetal cells and cell free fetal nucleic acids in maternal blood: new tools to study abnormal placentation? // Placenta. 2005. V. 26. P. 515-526.

165. Bianchi D.W. Circulating fetal DNA: its origin and diagnostic potential a review. II Placenta. 2004. V. 25. P. S93-S101.

166. Lo Y.M., Leung S.F., Chan L.Y., Chan A.T., Lo K.W., Johnson P. J., Huang D.P. Kinetics of plasma Epstein-Barr virus DNA during radiation therapy for nasopharyngeal carcinoma. II Cancer Res. 2000. V. 60. P. 2351-2355.

167. Hamilton T.C. Smith A.G., Griffin C.A., Henderson RJ. Ribonucleic acid in plasma from normal adults and multiple myeloma patients. // Clin. Chem. 1979. V. 10. P. 1774-1779.

168. Блинов M.H., Луганова И.С., Владимирова А.Д. О факторах нуклеиновой природы в крови человека. // Вопр. мед. химии. 1981. Т. 27. С. 600-603.

169. Ке L.D., Chen Z., Yung W.K. A reliability test of standard-based quantitative PCR: exogenous vs endogenous standards. // Mol. Cell Probes. 2000. V. 14. P. 127-152.

170. Zhu G., Chang Y., Zuo J., Dong X., Zhang M. Hu G„ Fang F. Fudenine, a C-terminal truncated rat homologue of mouse prominin, is blood glucose-regulated and can up-regulate the expression of GAPDH. // Cancer Sci. 2003. V. 93. P. 59-72.

171. Sirover M.A. New insights into an old protein: the functional diversity of mammalian glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 13. P. 159-198.

172. Zhang X., Ding L., Sandford A.J. Selection of reference genes for gene expression studies in human neutrophils by real-time PCR. // BMC Mol. Biol. 2005. V. 6. P. 4.

173. Biederman J., Yee J., Cortes P. Validation of internal control genes for gene expression analysis in diabetic glomerulosclerosis. // Kidney Int. 2004. V. 66. P. 2308-2322.

174. Wong B.C.K., Chan K.C.A., Chan A.T.C., Leung L.Y.S., Chow K.C.K, Lo Y.M.D. Reduced plasma RNA integrity in nasopharingeal carcinoma patients. // Clin. Cancer Res. 2006. V. 12. P. 2512-2516.

175. Li D., Butt A., Clarke S., Swaminathanan R. Real-time quantitative PCR measurement of thyroglobulin mRNA in peripheral blood of thyroid cancer patients and healthy subjects. H Ann. N. Y. Acad. Sci. 2004. V. 1022. P. 147-151.

176. Hamaoui K., Butt A., Powrie J., Swaminathan R. Real-time quantitative PCR measurement of circulatory rhodopsin mRNA in healthy subjects and patients with diabetic retinopathy. II Ann. N. Y. Acad. Sci. 2004. V. 1022. P. 152-156.

177. Hohlweg U., Doerfler W. On the fate of plant or other foreign genes upon the uptake in food or after intramuscular injection in mice. // Mol. Genet. Genomics. 2001. V. 265. P. 225-233.

178. Netherwood T., Martin-Orue S.M., O'Donnel A.G., Gockling S., Graham J., Mathers J.C., Gilbert H.J. Assessing the survival of transgenic plant DNA in the human gastrointestinal tract. // Nat. Biotechnol. 2004. V. 22. P. 204-209.

179. Doerfler W. De novo methylation, long-term promoter silencing, methylation patterns in the human genome, and consequences of foreign DNA insertion. // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2006. V. 301. P. 125-175.

180. De Vreis J., Herzfeld T., Wackernagel W. Transfer of plastid DNA from tobacco to the soil bacterium Acinetobacter sp by natural transformation. // Mol. Microbiol. 2004. V. 53. P. 323-334.

181. Ishii K.J, Akira S. Potential link between the immune system and metabolism of nucleic acids. // Curr. Oppin. Immunol. 2008. V. 20. P. 524-529.

182. Shibata D., Weiss L.M. Epstein-Barr virus-associated gastric adenocarcinoma. // Am. J. Pathol. 1992. V. 139. P. 469-475.

183. Spetz A.L., Patterson B., Lore K., Andersson J., Holmgren L. Functional gene transfer of HIV DNA by an HIV receptor-independent mechanism. II J. Immunol. 1999. V. 63. P. 736-742.

184. Zhang G., Budker V.G., Ludtke J.J., Wolf J.A. Naked DNA gene transfer in mammalian cells. IIMethods Mol. Biol. 2004. V. 245. P. 251-264.

185. Laktionov P.P., Chelobanov B.P., Rykova E.Y., Pyshnyi D.V., Marcus K., Meyer H.E., Vlassov V.V. Cell surface oligonucleotide-binding proteins of human squamous carcinoma A431cells. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2003. V. 22. P. 1715-1719.

186. Winston W.M., Molodowitch C., Hunter C.P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. // Science. 2002. V. 295. P. 2456-2459.

187. Kolodny G. Evidence for transfer of macromolecular RNA between mammalian cells in culture. II Exp. Cell Res. 1971. V. 65. P. 313-324.

188. Bergsmedh A., Szeles A., Henriksson M., Bratt A., Folkman M.J., Spetz A.L., Holmgren L. Horizontal transfer of oncogenes by uptake of apoptotic bodies. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 6407-6411.

189. Bergsmedh A., Ehnforce J., Kawane K., Motoyama N.,Nagata S., Holmgren L. DNase II and the Chk2 DNA damage pathway form a genetic barrier blocking replication of horizontally transferred DNA. // Mol. Cancer Res. 2006. V. 4. P. 187-195.

190. Supattapone S. Prion protein conversion in vitro. II J. Mol. Med. 2004. V. 82. P. 348-356.

191. Nandi P.K., Nicole J.C. Nucleic acid and prion protein interaction produces spherical amyloids which can function in vivo as coats of spongiform encephalopathy agent. II J. Mol. Biol. 2004. V. 344. P. 827-837.

192. Filipowicz W., Jaskiewicz L., Kolb F.A., Pillai R.S. Post-transcriptional gene silencing by siRNAs and miRNAs. // Curr. Opin. Struct. Biol. 2005. V. 15. P. 331-341.

193. Lough T.G., Lucas W.J. Integrative plant biology: Role of phloem long-distance macromolecular trafficking. // Annu. Rev. Plant Biol. 2006. V. 57. P. 203-232.

194. Ruiz-Medrano R., Xoconostle-Cazares В., Kragler F. The plasmodesmatal . transport pathway for homeotic proteins, silencing signals and viruses. // Curr. Opin. Plant Biol. 2004. V. 7. P. 641-650.

195. Xiang S., Fruehauf J., Li C.J. Short hairpin RNA-expressing bacteria elicit RNA interference in mammals. // Nat. Biotechnol. 2006. V. 24. P. 697-702.

196. Parkin D.M., Bray F.D., Ferlay J.M., Pisani P. Global Cancer Statistics, 2002. // CA. Cancer J. Clin. 2005. V. 55. P. 74-108.

197. Заридзе Д.Г. Эпидемиология и скрининг рака молочной железы. // Вопр. онкол. 2002. Т. 48. С. 489-495.

198. Чойнзонов E.JL, Писарева Л.Ф., Бояркина А.П., Одинцова И.Н., Тахауов P.M. Онкологическая заболеваемость населения Томской области. Томск: Изд-во ТГУ, 2004. - 254 с.

199. Мерабшнвили В.М. Рак желудка: эпидемиология, профилактика, оценка эффективности лечения на популяционном уровне. // Практ. онкол. 2001. Т. 3. С. 3-8.

200. Kwee R.M., Kwee Т.С. Imaging of local staging of gastric cacer: a systematic review. II J. Clin. Oncol. 2007. V. 25. P. 107-116.

201. Матвеев Б.П., Бухаркин Б.В. Современные возможности лечения гормоно-рефрактерного рака предстательной железы. // Современная онкология. 2003. Т. 5. С. 114-119.

202. Лихтенштейн А.В., Потапова Г.И. Генетические дефекты как маркеры опухолевого роста. П Молекуляр. биол. 2003. Т. 37. С. 181-193.

203. Белохвостов А.С., Румянцев А.Г. Онкомаркеры. М.: МАКС Пресс, 2002. -84 с.

204. Nesterova M.V., Johnson N., Cheadle C., Bates S.E., Mani S., Stratakis C.A., Khan I.U., Gupta R.K., Cho-Chung Y.S. Autoantibody canceriomarkers: extracellular protein kinase A. // Cancer Res. 2006. V. 66. P. 8971-8974.

205. Dalton W.S., Friend S.H. Cancer biomarkers an invitation to the table. // Science. 2006. V. 312. P. 1165-1168.

206. Duffy M.J. Serum tumor markers in breast cancer: are they of clinical value? // Clin. Chem. 2006. V. 52. P. 345-351.

207. Чиссов В.И., Дарьялова C.JI. Избранные лекции по клинической онкологии. М., 2000. - 735 с.

208. Sjoblom Т., Jones S., Wood L.D., Parsons D.W., Lin J., Barber T.D., Mandelker

209. Greenman C., Stephens P., Smith R., Dalgliesh G.L., Hunter C., Bignell G., Davies H., Teague J., Butler A., Stevens C., Edkins S., O'Meara S., Vastrik I., Sclimidt

210. Soda M., Choi Y.L., Enomoto M., Takada S., Yamashita Y., Ishikawa S., Fujiwara S., Watanabe H., Kurashina K., Hatanaka H., Bando M., Ohno S., Ishikawa Y.,

211. Aburatani H., Niki T., Sohara Y., Sugiyama Y., Mano H. Identification of the transforming EML4-ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer. // Nature. 2007. V. 448. P. 561-566.

212. Vasioukhin V., Anker P., Maurice P., Lyautey J., Lederrey C., Stroun M. Point mutations of the N-ras gene in the blood plasma DNA of patients with myelodysplastic syndrome or acute myelogenous leukaemia. // Br. J. Haematol. 1994. V. 86. P. 774-779.

213. Sorenson G.D., Pribish D.M., Valone F.H., Memoli V.A., Bzik D.J., Yao S.L. Soluble normal and mutated DNA sequences from single-copy genes in human blood. // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 1994. V. 3. P. 67-71.

214. Kahn S.M., Jiang W., Culbertson T.A., Weinstein I.B., Williams G.M. TomitaN. Ronai Z. Rapid and sensitive nonradioactive detection of mutant K-ras genes via 'enriched' PCR amplification. // Oncogene. 1991. Y. 6. P. 1079-1083.

215. Ahrendt S.A., Yang S.C., Wu L., Westra W.H., Jen J., Califano J.A., Sidransky D. Comparison of oncogene mutation detection and telomerase activity for the molecular staging of non-small cell lung cancer. // Clin. Cancer Res. 1997. Y. 3. P. 1207-1214.

216. Furuya N., Kawa S., Akamatsu T., Furihata K. Long-term follow-up of patients with chronic pancreatitis and K-ras gene mutation detected in pancreatic juice. // Gastroenterology. 1997. V. 113. P. 593-598.

217. Mulcahy H.E., Lyautey J., Lederrey C., qi Chen X., Anker P., Alstead E.M., Ballinger A., Farthing M.J., Stroun M. A prospective study of K-ras mutations in the plasma of pancreatic cancer patients. // Clin. Cancer Res. 1998. V. 4. P. 271-275.

218. Lindforss U., Zetterquist H., Papadogiannakis N., Olivecrona H. Persistence of K-ras mutations in plasma after colorectal tumor resection. // Anticancer Res. 2005. V. 25. P. 657-661.

219. Kimbi G.C., Kew M.C., Yu M.C., Arakawa K., Hodkinson J. 249ser p53 mutation in the serum of black southern African patients with hepatocellular carcinoma. // J. Gastroenterol. Hepatol. 2005. V. 20. P. 1185-1190.

220. Gorringe K. L., Boussioutas A., Bowtell D.D. Novel regions of chromosomal amplification at 6p21, 5pl3, and 12ql4 in Gastric cancer identified by array comparative genomic hybridization. // Genes Chromosomes Cancer. 2005. V. 45. P. 247-259.

221. Knudson A. G. Two genetic hits (more or less) to cancer. // Nat. Rev. Cancer. 2001. V. l.P. 157-162.

222. Hosseini H.A., Ahani A., Galehdari H., Froughmand A.M., Hosseini M., Masjedizadeh A., Zali M.R. Frequent loss of heterozygosity at 8p22 chromosomal region in diffuse type of gastric cancer. // World J. Gastroenterol. 2007. V. 13. P. 3354-3358.

223. Fenoglio-Preiser C.M., Wang J., Stemmermann G.N., Noffsinger A. TP53 and gastric carcinoma: a review. // Hum. Mutat. 2003. V. 21. P. 258-270.

224. Kim H.C., Kim J.C., Roh S.A., Yu C.S., Yook J.H., Oh S.T., Kim B.S., Park K.C., Chang R. Aberrant CpG island methylation in early-onset sporadic gastric carcinoma. // J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2005. V. 131. P. 733-740.

225. Sasao S., Hiyama T., Tanaka S., Yoshihara M., Yasui W., Chayama K. Clinicopathologic and genetic characteristics of gastric cancer in young male and female patients. // Oncol. Rep. 2006. V. 16. P. 11-15.

226. Chen X., Bonnefoi S., Diebold-Berger S., Lyautey J., Lederrey C., Faltin-Traub E., Stroun M., Anker P. Detecting tumor-related alterations in plasma or serum DNA of patients diagnosed with breast cancer. // Clin. Cancer Res. 1999. V. 5. P. 2297-2303.

227. Chang Y.C., Ho C.L., Chen H.H., Chang T.T., Lai W.W., Dai Y.C., Lee W.Y., Chow N.H. Molecular diagnosis of primary liver cancer by microsatellite DNA analysis in the serum. // Br. J. Cancer. 2002. V. 87. P. 1449-1453.

228. Schmidt В., Carstensen Т., Engel E., Jandrig В., Witt C,. Fleischhacker M. Detection of cell-free nucleic acids in bronchial lavage fluid supernatants from patients with lung cancer. И Eur. J. Cancer. 2004. V. 40. P. 452-460.

229. Utting M., Werner W., Dahse R., Schubert J., Junker K. Microsatellite analysis of free tumor DNA in urine, serum, and plasma of patients: a minimally invasive method for the detection of bladder cancer. // Clin. Cancer Res. 2002. V. 8. P. 35-40.

230. Лихтенштейн A.B., Киселева Н.П. Метилирование ДНК и канцерогенез. // Биохимия. 2001. Т. 66. С. 293-317.

231. McNairn A.J., Gilbert D.M. Epigenomic replication: linking epigenetics to DNA replication. // BioEssays. 2003. V. 25. P. 647-654.

232. Jeltsch A. Beyond Watson and Crick: DNA methylation and molecular enzymology of DNA methyltransferses. // ChemBioChem. 2002. V. 3. P. 274-293.

233. Cross S.H., Bird A.P. CpG islands and genes. // Curr Opin Genet Dev. 1995. V. 5. P. 309-314.

234. Antequera F., Bird A. P. Number of CpG islands and genes in human and mouse. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 11995-11999.

235. Gardiner-Garden M., Frommer M. CpG islands in vertebrate genomes. // J. Mol. Biol. 1987. V. 196. P. 261-268.

236. Turker M.S. The establishment and maintenance of DNA methylation patterns in mouse somatic cells. // Semin. Cancer Biol. 1999. V. 9. P. 329-337.

237. Esteller M., Herman J.G. Cancer as an epigenetic disease: DNA methylation and chromatin alterations in human tumors. II J. Pathol. 2002. V. 196. P. 1-7.

238. Biel M., Wascholowski V., Giannis A. Epigenetics an epicenter of gene regulation: histones and histone-modifying enzymes. // Angew. Chem. Int. Ed. 2005. V. 44. P. 3186-3216.

239. Doerfler W. On the biological significance of DNA methylation. // Biochemistry. 2005. V. 70. P. 505-524.

240. Walsh C.P., Chaillet J.R., Bestor T.H. Transcription of IAP endogenous retroviruses is constrained by cytosine methylation. // Nat. Genet. 1998. V. 20. P. 116-117.

241. El-Osta A. DNMT cooperativity the developing links between methylation, chromatin structure and cancer. // BioEssays. 2003. V. 25. P. 1071-1084.

242. Li E„ Bestor T.H., Jaenisch R. Targeted mutation of the DNA methyltransferasc gene results in embryonic lethality. // Cell. 1992. V. 69. P. 915-926.

243. Bestor T.H., Verdin G.L. DNA methyltransferases. // Curr. Opin. Cell. Biol. 1994. V. 259. P. 946-951.

244. Okano M., Xie S., Li E. Cloning and characterization of a family of novel mammalian DNA (cytosine-5) methyltransferases. // Nat. Genet. 1998. V. 19. P. 219-220.

245. Okano M., Bell D. W., Haber D.A., Li E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. // Cell. 1999. V. 99. P. 247-257.

246. Fraga M.F. Esteller M. DNA methylation: a profile of methods and applications. IIBioTechniques. 2002. V. 33. P. 632-649.

247. Fraga M.F., Rodriguez R., Canal M.J. Rapid quantification of DNA methylation y high performance capillary electrophoresis. // Electrophoresis. 2000. V. 21. P. 2990-2994.

248. Galm O., Rountree M.R., Bachman K.E., Jair K.W., Baylin S.B., Herman J.G. Enzymatic regional methylation assay: a novel method to quantify regional CpG methylation density.// Genome Res. 2001. V. 12. P. 153-157.

249. Oakeley E.J. Quantification of 5-methylytosine in DNA by the chloroacetaldehyde reaction. II BioTechniques. 1999. V. 27. P. 744-752.

250. Cravo M., Pinto R., Fidalgo P., Chaves P., Gloria L., Nobre-Leitao C., Costa Mira F. Global DNA hypomethylation occurs in the early stages of intestinal type gastric carcinoma. II Gut. 1996. V. 39. P. 434-438.

251. Pogribny I.P., Porier L.A., James S.J. Differential sensitivity to loss of cytosine methyl groups within the hepatic p53 gene of folate/methyl deficient rats. // Carcinogenesis. 1995. V. 16. P. 2863-2867.

252. Baylin S.B., Herman J.G., Graff J.R., Vertino P.M., Issa J.-P. Alterations in DNA methylation: a fundamental aspect of neoplasia. // Adv. Cancer Res. 1998. V.72. P. 141-196.

253. Jirtl R.L. Genomic imprinting and cancer. II Exp. Cell Res. 1999. V. 248. P. 18-24.

254. Robertson K.D., Jones P.A. DNA methylation: past, present and future directions. // Carcinogenesis. 2000. V. 21. P. 461-467.

255. Hendrich B., Bird A. Identification and characterization of a family of mammalian methyl-CpG binding proteins. I I Mol. Cell. Biol. 1998. V. 18. P. 6538-6547.

256. Attwood J.T., Yung R.L., Richardson B.C. DNA methylation and the regulation of gene transcription. // Cell. Mol. Life Sci. 2002. V. 59. P. 241-257.

257. Fackler M.J., McVeigh M., Evron E., Garrett E., Mehrotra J., Polyak K., Sukumar S., Argani P. DNA Methylation of in in situ and invasive lobular breast carcinoma. // Int. J. Cancer. 2003. V. 107. P. 970-975.

258. Toyota M., Issa J.P. CpG island methylator phenotypes in aging and cancer. // Semin. Cancer Biol. 1999. V. 9. P. 349-357.

259. Robertson K.D., Uzvolngyi E., Liang G. The human DNA methyltransferases (DNMTs) 1, 3a and 3b: coordinate mRNA expression in normal tissues and overexpression in tumors. 11 Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 2291-2298.

260. Melki J.R., Clark S.J. DNA methylation changes in leukaemia. // Semin. Cancer biol. 2002. V. 12. P. 347-357.

261. Oyama K., Kawakami K., Maeda K., Ishiguro K., Watanabe G. The association between methylenetetrahydrofolate reductase polymorphism and promoter methylation in proximal colon cancer. // Anticancer Res. 2004. V. 24. P. 649-654.

262. Chiosea S., Jelezcova E., Chandran U., Acquafondata M., McHale T., Sobol R.W. Dhir R. Up-regulation of dicer, a component of the MicroRNA machinery, in prostate adenocarcinoma. II Am. J. Pathol. 2006. V. 169. P. 1812-1820.

263. Karpf A.R., Jones D.A. Reactivating the expression of methylation silenced genes in human cancer. // Oncogene. 2002. V. 21. P. 5496-5503.

264. Yan P.S., Wei S.H., Huang T.H. Differential methylation hybridization using CpG island arrays. II Methods Mol. Biol. 2002. V. 200. P. 87-100.

265. Herman J.G., Graff J.R., Myohanen S., Nelkin B.D., Baylin S.B. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 9821-9826.

266. Nuovo G.J. In situ detection of the hypermethylation- induced inactivation of the pl6 gene as an early event in oncogenesis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P.12754-12759.

267. Eads C.A., Danenberg K.D., Kawakami K., Saltz L.B., Blake C., Shibata D., Danenberg P.V., Laird P.W. MethyLight a high throughput assay to measure DNA methylaton. II Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P. E32.

268. Xiong Z., Laird P.W. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. II Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 2532-2534.

269. Gonzalgo M.L., Jones P.A. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation — sensitive single nucleotide primer extension. // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 2529-2531.

270. Bianco T., Hussey D., Dobrovic A. Methylation-sensitive, single-strand conformation analysis (MS-SSCA): A rapid method to screen for and analyze methylation. // Hum. Mutat. 1999. V. 14. P. 289-293.

271. Sirchia S.M., Ren M., Pili R., Sironi E., Somenzi G., Ghidoni R., Toma S., Nicolo G., Sacchi N. Endogenous reactivation of the RAR(32 tumor suppressor gene epigenetically silenced in breast cancer. // Cancer Res. 2002. V. 62. P. 2455-2461.

272. Widschwendter M., Berger J., Muller H.M., Zeimet A.G., Marth C. Epigenetic downregulation of the retinoic acid receptor~p2 gene in breast cancer. // J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 2001. V. 6. P. 193-201.

273. Euhus D., Bu D., Ashfag R. Atypia and DNA methylation in nipple duct lvage in relation to predicted breast cancer risk. // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2007. V. 16. P. 1812-1821.

274. Pu R.T., Laitala L.E., Alii P.M., Fackler M.J., Sukumar S., Clark D.P. Methylation profiling of benign and malignant breast lesions and its application to cytopathology. // Mod. Pathol. 2003. V.16. P. 1095-1101.

275. Hirohashi S. Inactivation of the E-cadherin mediated cell adhesion system in human cancers. II Am. J. Pathol. 1998. V. 153. P. 333-339.

276. Hasan R.B., Qiao R., Keren R., Badano I., Suyama K. Cadherin switch in tumor progression. II Ann. N. Y. Acad. Sci. 2004. V. 1014. P. 155-163.

277. Calderia J.R., Prando E., Quevedo F. CDH1 promoter hypermethylation and E-cadherin protein expression in infiltrating breast cancer. // BMC Cancer. 2006. V. 6. P. 48-56.

278. Брызгунова O.E., Власов B.B., Лактионов П.П. Современные методы диагностики рака предстательной железы. // Биомед. химия. 2007. Т. 53. С. 128-139.

279. Leung W.K., Yu J., Ng E.K., To K. F., Ma P.K., Lee T.L., Go M.Y., Chung S.C., Sung J.J. Concurrent hypermethyalation of multiple tumor-related genes in gastric carcinoma and adjacent normal tissues. // Cancer. 2001. V. 91. P. 2294-2301.

280. Lee J.H., Park S.J., Abraham S.C., Seo J.S., Nam J.H., Choi C., Juhng S.W., Rashid A., Hamilton S.R, Wu T.T. Frequent CpG island methylation in precursor lesions and early gastric adenocarcinomas. // Oncogene. 2004. V. 23. P. 4646-4654.

281. Oue N., Shigeishi H., Kuniyasu H., Yokozaki H., Kurauka K., Ito R., Yasui W. Promoter hypermethylation of MGMT is associated with protein loss in gastric carcinoma. IIInt. J. Cancer. 2001. V. 93. P. 805-809.

282. Hong S.H., Kim H.G., Chung W.B., Kim E.Y., Lee J.Y., Yoon S.M., Kwon J.G. Sohn Y.K., Kwak E.K., Kim J.W. DNA hypermethylation of tumor-related genes in gastric carcinoma. II J. Korean Med. Sei. 2005. V. 20. P. 236-241.

283. Chan A.W., Chan M.W., Lee T.L., Ng E.K., Leung W.K., Lau J.Y., Tong J.H., Chan F.K., To K.F. Promoter hypermethylation of Death-associated protein-kinase gene associated with advance stage gastric cancer. // Oncology Rep. 2005. V. 13. P. 937-941.

284. Raveh T., Kimichi A. DAP kinase- a proapoptotic gene that functions as a tumor suppressor. II Exp. Cell Res. 2001. V. 264. P. 185-192.

285. Waki T., G. Tamura, M. Sato, T. Motoyama. Age-related methylation of tumor suppressor and tumor-related genes: an analysis of autopsy samples. // Oncogene. 2003. V. 22. P. 4128-4133.

286. Kang G.H., Lee S., Kim J.S., Jung H.Y. Profile of aberrant CpG island methylation along the multistep pathway of gastric carcinogenesis. // Lab. Invest. 2003. V. 83. P. 635-641.

287. So K., Tamura G., Honda T., Homma N., Waki T., Togawa N. Nishizuka S., Motoyama T. Multiple tumor suppressor genes are increasingly methylated with age in non-neoplastic gastric epithelia. // Cancer Sci. 2006. V. 97. P. 1155-1158.

288. Kim W.S., Son H.J., Park J.O., Song S.Y., Park C. Promoter methylation and down-regulation of DAPK is associated with gastric atrophy. // Int. J. Mol. Med. 2003. V. 12. P. 827-830.

289. Sato F., Meltzer S.J. CpG island hypermethylation in progression of esophageal and gastric cancer. // Cancer. 2006. V. 106. P. 483-493.

290. Kang G.H., Lee H.J., Hwang K.S., Lee S. Aberrant CpG island hypermethylation of chronic gastritis, in relation to aging, gender, intestinal metaplasia, and chronic inflammation. II Am. J. Pathol. 2003. V. 163. P. 1551-1556.

291. Tolsma S.S., Cohen J.D., Ehrlich L.S., BouckN.P. Transformation of NIH/3T3 to anchorage independence by H-ras is accompanied by loss of suppressor activity. // Exp. Cell Res. 1993. V. 205. P. 232-239.

292. IIurK., Song S.H., LeeH.S., Ho Kim W., Bang Y .J., Yang H.K. Aberrant methylation of the specific CpG island portion regulates cyclooxygenase-2 gene expression in human gastric carcinomas. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. V. 310. P. 844-851.

293. Kikuchi T., Itoh F., Toyota M., Suzuki H., Yamamoto H., Fujita M., Hosokawa M., Imai K. Aberrant methylation and histone deacetylation of cyclooxygenasc-2 in gastric cancer. // Int. J. Cancer. 2002. V. 97. P. 272-277.

294. Lee T.L., Leung W.K., Chan M.W., Ng E.K., Tong J.H., Lo K.W., Chung S.C., Sung J.J., To K.F. Detection of gene promoter hypermethylation in the tumor and serum of patients with gastric carcinoma. // Clin. Cancer Res. 2002. V. 8. P. 1761-1766.

295. Goessl C., Muller M., Heicappell R., Krause H., Miller K. DNA-based detection of prostate cancer in blood, urine, and ejaculates. II Ann. N. Y Acad Sci. 2001. V. 945. P. 51-58.

296. Lehmann U., Langer F., Feist H., Glockner S., Hasemeier B., Kreipe H. Quantitative assessment of promoter hypermethylation during breast cancer development. II Am. J. Pathol. 2002. V. 160. P. 605-612.

297. Jeronimo C., Usadel H., Henrique R., Silva C., Oliveira J., Lopes C., Sidransky D. Quantitative GSTP1 hypermethylation in bodily fluids of patients with prostate cancer. // Urology. 2002. V. 60. P. 1131-1135

298. Kang G.H., Lee H.J., Hwang K.S., Lee S. Aberrant CpG island hypermethylation of chronic gastritis, in relation to aging, gender, intestinal metaplasia, and chronic inflammation. II Am. J. Pathol. 2003. V. 163. P. 1551-1556.

299. Goessl С., Krause H., Muller M., Heicappell R., Schrader M., Sachsinger J., Miller K. Fluorescent methylation-specific polymerase chain reaction for DNA-based detection of prostate cancer in bodily fluids. // Cancer Res. 2000. V. 60. P. 5941-5945.

300. Agrawal S., Temsamani J., Tang J.Y. Pharmacokinetics, biodistribution, and stability of oligodeoxynucleotide phosphorothioates in mice. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 7595-7599.

301. Iversen P. In vivo studies with phosphorothioatc oligonucleotides: Rationale for systemic therapy. // Antisense Research and Applications. / Eds. Crooke S.T. and Lebleu B. Boca Raton, FL: CRC Press, 1993. - P. 461-469.

302. Azim A.C., Shirin M.M., Korsgren C., Dotimas E., Cohen C.M., Chishti A.H. Human erythrocyte dematin and protein 4.2 (pallidin) are ATP binding proteins. // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 3001-3006.

303. Carraters A. Helgerson A.L. The human erytrocyte sugar transporter is also nucleotide binding protein. //Biochemistry. 1989. V. 28. P. 8337-8346.

304. Agrawal S., Temsamani J., Galbraith W., Tang G. Pharmacokinetics of antisense oligonucleotides. // Clin. Pharmacokinet. 1995. V. 28. P. 7-16.

305. Зайцева T.M., Овчинников M.B., Мазур H.A., Рулин В.А. Значение связывания белками плазмы лекарственных средств для их терапевтического эффекта. // Хим. -фарм. эюурнал. 1985. Т.19. С. 1034-1046.

306. Appelgren С., Borg К.О., Elofsson R., Johansson K.A. Binding of adrenergic Preceptor antagonists to human serum albumin. // Acta Pharm. Suec. 1974. V. 11. P. 325-332.

307. McElnay J.C., D'Arcy P.F. Protein binding displacement interactions and their clinical importance. II Drugs. 1983. V. 25. P. 495-513.

308. Olsen G.D. Methadone binding to human plasma proteins. // Clin. Pharmacol. Ther. 1973. V. 14. P. 338-343.

309. Baraka A., Gabali F. Correlation between tubocurarine requirements and plasma protein pattern. // Br. J. Anesth. 1968. V. 40. P. 89-93.

310. Власов A.B., Андриевская О.А., Канышкова Т.Г., Барановский А.Г., Наумов В.А., Бреусов А.А., Жьеже Р., Бунева В.Н., Невинский Г.А. РНК-гидролизующие антитела из крови больных системной красной волчанкой. // Биохимия. 1997. Т. 62. С. 474-479.

311. Барановский А.Г. Бунева В.Н., Невинский Г.А. Дезоксирибонуклеазы человека. // Биохимия. 2004. Т. 69. С. 725-742.

312. Tamkovich S.N, Cherepanova A.V., Kolesnikova E.V., Rykova E.Y., Pyshnyi D.V., Vlassov V.V., Laktionov P.P. Circulating DNA and DNAse activity in human blood. II Ann. N. Y. Acad. Sci. 2006. V. 1075. P. 191-196.

313. Rudolph-Owen L.A., Matrisian L.M. Matrix metalloproteinases in remodeling of the normal and neoplastic mammary gland. // J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 1998. V. 3.P. 177-189.

314. Li Y.S., Dearden-Badet M.T., Revillard J.P. Selective induction of high levels of IgA synthesis in Peyer's patch B cells by protein kinase C-activating phorbol esters. // J. Immunol. 1991. V. 147. P. 1752-1758.

315. Vora A., Stunz L.L., Kemp J.D., Ashman R.F. Two mechanisms of transferrin receptor induction by anti-Ig in B cells. H J. Immunol. 1990. V. 145. P. 2099-2104.

316. Boulé M.W., Broughton C., Mackay F. Akira S., Marshak-Rothstein A. Rifkin I. Toll-like receptor 9-dependent and -independent dendritic cell activation by chromatin-immunoglobulin G complexes. II J. Exp. Med. 2004. V. 199. P. 1631-1640.

317. Yi A-Y, Yoon J-G, Krieg A. Convergence of CpG DNA- and BCR-mediated signals at the c-Jun N-terminal kinase and NF-kB activation pathways: regulation by mitogen-activated protein kinases. // International Immunology. 2003. V. 15. P. 577591.

318. To E.W., Chan K.C., Leung S.F., Chan L.Y., To K.F., Chan A.T., Johnson P.J., Lo Y.M. Rapid clearance of plasma Epstein-Barr virus DNA after surgical treatment of nasopharyngeal carcinoma. // Clin. Cancer Res. 2003. V. 9. P. 3254-3259.

319. Diehl F., Schmidt K., Choti M.A., Romans K., Goodman S., Li M., Thornton K., Agrawal N., Sokoll L., Szabo S.A., Kinzler K.W., Vogelstein B., Diaz L.A. Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics. // Nat. Med. 2008. V. 14. P. 985-990.

320. Mashiba H., Matsunaga K., Tomoda H., Furusawa M., Jimi S., Tokunaga T. In vitro augmentation of NK activity of peripheral blood cells from cancer patients by a

321. DNA fraction from Mycobacterium bovis BCG. // Jpn. J. Med. Sci. Biol. 1988. V. 41. P. 197-202.

322. Halpern M.D., Kurlander R.J., Pisetsky D.S. Bacterial DNA induces murine interferon-y production by stimulation of interleukin-12 and tumor necrosis factor-a. // Cell. Immunol. 1996. V. 167. P. 72-78.

323. Zhou H.S., Liu D.P., Liang C.C. Challenges and strategies: the immune responses in gene therapy. // Med. Res. Rev. 2004. V. 24. P. 748-761.

324. Reyes-Sandoval A., Ertl H.C. CpG methylation of a plasmid vector results in extended transgene product expression by circumventing induction of immune responses. //Mol. Ther. 2004. V. 9. P. 249-261.

325. Zwiorek K., Bourquin C., Battiany J., Winter G., Endres S., Hartmann G., Coester C. Delivery by cationic gelatin nanoparticles strongly increases the immunostimulatory effects of CpG oligonucleotides. // Pharm. Res. 2008. V. 25. P. 551-562.

326. Лактионов П.П., Тамкович С.Н., Симонов П.А., Рыкова Е.Ю., Власов В.В. Способ выделения дезоксирибонуклеиновых кислот. Патент на изобретение №2232768. Приоритет от 2.10.2002.

327. Лактионов П.П., Тамкович С.Н., Симонов П.А., Рыкова Е.Ю., Власов В.В. Способ выделения рибонуклеиновых кислот. Патент на изобретение №2232810. Приоритет от 19.12.2002.

328. Лактионов П.П., Тамкович С.Н., Рыкова Е.Ю., Морозкин Е.С., Власов В.В. Способ выделения нуклеиновых кислот. Патент на изобретение № 2272072. Приоритет от 20.03.2006.

329. Stollar B.D. The experimental induction of antibodies to nucleic acids. // Methods Enzymol. 1980. V. 70. P. 70-85.

330. Stream M., Anker P., Maurice P., Lyautey J., Lederrey C., Beljanski M. Neoplastic characteristics of the DNA found in the plasma of cancer patients. // Oncology. 1989. V. 46. P. 318-322.

331. Allen D., Butt A., Cahill D., Wheeler M., Popert R., Swaminathan R. Role of cellfree plasma DNA as a diagnostic marker for prostate cancer. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2004. V. 1022. P. 76-80.

332. Labarca C., Paigen K. A simple, rapid, and sensitive DNA assay procedure. // Anal. Biochem. 1980. V. 102. P. 344-352.

333. Тамкович C.H. Циркулирующие внеклеточные нуклеиновые кислоты в крови здоровых доноров и онкологических больных: Дис. канд. биол. наук. Новосибирск, 2006.

334. Schmidt D.M., Ernst J.D. A fluorometric assay for the quantification of RNA in solution with nanogram sensitivity. П Anal. Biochem. 1995. V. 232. P. 144-146.

335. Radic M., Marion Т., Monestier M. Nucleosomes are exposed at the cell surface in apoptosis. // J. Immunol. 2004. V. 172. P. 6692-6700.

336. Tamkovich S.N., Bryzgunova O.E., Rykova E.Y., Permyakova V.I., Vlassov V.V., Laktionov P.P. Circulating nucleic acids in blood of healthy male and female donors. // Clin. Chem. 2005. V. 51. P. 1317-1319.

337. Herrera L.J., Raja S., Gooding W.E., El-Hefnawy Т., Kelly L., Luketich J.D., Godfrey Т.Е. Quantitative analysis of circulating plasma DNA as a tumor marker in thoracic malignancies.// Clin. Chem. 2005. V. 51. P. 113-118.

338. Ramandanis G., Agnantis N., Garas J., Spandidos D.A. Correlation between scrum and tissue deoxyribonuclease levels in breast cancer patients. // Anticancer Res. 1982. V.2. P. 213-218.

339. Клишко E.B., Кондакова И.В., Чойнозов E.JI. Матриксные металлопротеина-зы в онкогенезе. // Сиб. онкол. журн. 2003. Т. 2. С. 63-70.

340. Matrisian L .М., Sledge G.W., Mohla S . Extracellular proteolysis and cancer: meeting summary and future directions. // Cancer Res. 2003. V. 63. P. 6105-6109.

341. Okuda Т., Kinoshita Y., Tamura Т., Kato C., Kojima H., Watanabe A., Honjo H. Quantitative analysis of cellular fetal hemoglobin gamma chain messenger RNA (HbF-gamma mRNA) in maternal peripheral blood. // Prenat. Diagn. 2004. V. 24. P. 881-887.

342. Ausubel F. Short protocols in molecular biology. New York: Wiley, 1993. - P. 2-13.

343. Silva J.M., Garcia J.M., Dominguez G., Silva J., Miralles C., Cantos В., Coca S., Provencio M., España P., Bonilla F. Persistence of tumor DNA in plasma of breast cancer patients after mastectomy. II Ann. Surg. Oncol. 2002. V. 9. P. 71-76.

344. Min C.J., Tafra L., Verbanac K.M. Identification of superior markers for polymerase chain reaction detection of breast cancer metastases in sentinel lymph nodes. // Cancer Res. 1998. V. 58. P. 4581^1585.

345. Wohlgemuth S., Kiel S., Kramer A., Serrano L., Wittinghofer F., Herrmann C. Recognizing and defining true Ras binding domains I: biochemical analysis. // J. Mol. Biol. 2005. V. 348. P. 741-758.

346. Scholzen Т., Gerdes J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. // J. Cell. Physiol. 2000. V. 182. P. 311-322.

347. Falvella F.S., Manenti G., Spinola M., Pignatiello C., Conti B., Pastorino U., Dragani T.A. Identification of RASSF8 as a candidate lung tumor suppressor gene. // Oncogene. 2006. V. 25. P. 3934-3938.

348. Rood B.R., Zhang H., Weitman D.M., Cogcn P.H. Hypermethylation of IIIC-1 and 17p allelic loss in medulloblastoma. // Cancer Res. 2002. V. 62. P. 3794-3797.

349. Melki J.R., Vincent P.C., Clark S.J. Concurrent DNA hypermethylation of multiple genes in acute myeloid leukemia. // Cancer Res. 1999. V. 59. P. 3730-3740.

350. Зарытова В.Ф. Иванова E.M., Романенко В.П. Синтез олигонуклеотидов в хлороформе триэфирным методом. IIБиоорган, химия. 1983. Т. 9. С. 516-521.

351. Gilkeson G.S., Grudier J.P., Karounos D.G., Pisetsky D.S. Induction of antidouble stranded DNA antibodies in normal mice by immunization with bacterial DNA. II J. Immunol. 1989. V. 142. P. 1482-1486.

352. Маниатис Дж., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.

353. Jaffe Е.А., Nachman R.L., Becker C.G., Minick C.R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. II J. Clin. Invest. 1973. V. 52. P. 2745-2756.

354. Плохинский H. Биометрия. — Новосибирск: Наука, 1961.

355. Cantor C.R., Tinoco I. Absorption and optical rotatory dispersion of seven trinucleotide diphophates. II J. Mol. Biol. 1965. V. 13. P. 65-77.

356. Handbook of Biochemistry and Molecular Biology Nucleic Acids. / Ed. Fasman Т.Е. Cleveland: CRCPress, 1975. - V. 1.

357. Амирханов H.B., Зарытова В.Ф. Реакционноспособные производные фосфо-тиоатпых аналогов олигонуклеотидов. II Биоорган, химия. 1995. Т. 21. С. 365-375.

358. Остерман JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1981.-С. 131-135.

359. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage TAJ I Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

360. Tauskela J.S., Shoubndge E.A. Response of the Na-NMR double-quantum filtered signal to changes in Na+ ion concentration in model biological solutions and human erythrocytes. // Biochim. Biophys. Acta. 1993. V. 1158. P. 155-165.

361. Yakubov L., Khalted Z., Zhang L.-M., Truneh A., Vlassov V., Stein C. A. Oligodeoxynucleotides interact with recombinant CD4 at multiple sites. II J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 18818-18823.

362. Клаус Д. Лимфоциты. Методы. М.: Мир, 1990. - С. 286-309.

363. Burnet F.M. Practical Immunology. Oxford: Blackwell Scientific Publication, 1980. P. 227-235.

364. Lo Y.M., Zhang J., Leung T.N., Lau Т.К., Chang A.M., Hjelm N.M. Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma. II Am. J. Hum. Genet. 1999. V. 64. P. 218-224.

365. Thijssen M.A„ Swinkels D.W., Ruers T.J., de Kok J.B. Difference between free circulating plasma and serum DNA in patients with colorectal liver metastases. // Anticancer Res. 2002. V. 22. P. 421-425.

366. Шкляева О. А., Миронова H. Л., Малкова Е. М., Таранов О. С., Рябчикова Е. И., Зенкова М. А., Власов В. В. Онкосупресснвпое действие РНКазы А и ДНКазы I. II Доклады РАН 2008. Т. 420. С. 134-138.

367. Mitchell P.S., Parkin R.K., Kroh E.M., Fritz B.R., Wyman S.K., Pogosova-Agadjanyan E.L., Peterson A., Noteboom J., O'Briant K.C., Allen A., Lin D.W., Urban N., Drescher C.W., Knudsen B.S., Stirewalt D.L., Gentleman R., Vessella R.L., Nelson

368. P.S., Martin D.B., Tewari M. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V. 105. P. 10513-10518.

369. Taylor D.D., Gercel-Taylor C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. // Gynecol. Oncol. 2008. V. 110. P. 13-21.

Информация о работе

Рыкова, Елена Юрьевна
доктора биологических наук
Новосибирск, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Экзогенные и секретируемые клетками нуклеиновые кислоты, их взаимодействия с компонентами крови в норме и при онкологических заболеваниях - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы