Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия низкопороговых кальциевых каналов нейтронов мозга крыс в ооцитах Xenopus

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия низкопороговых кальциевых каналов нейтронов мозга крыс в ооцитах Xenopus"

РГ6 0а*

І ' л Я ^ . л

1‘ ' Національна академія наук України

Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця

На правах рукопису

ДЖУРА Ігор Олександрович

ЕКСПРЕСІЯ НИЗЬКОПОРОГОВИХ КАЛЬЦІЄВИХ КАНАЛІВ НЕЙРОНІВ МОЗКУ ЩУРІВ В ООЦИТАХ ХЕИОРиБ

03.00.05 — біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня • кандидата біологічних наук

Київ 1995

Дисертацією с рукопис

Роботу виконано у відділі загальної фізіології нервової системи Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України.

Науковий керівник: академік КОСТЮК П. Г.

Офіційні опоненти: академік МАГУРА І. С.,

доктор біологічних наук МАЛИШЕВА М. К.

Провідна установа: Кафедра біофізики Національного університету ім. Тараса Шевченка.

Захист відбудеться 199 3 р.

о « -¿/О» годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 01.13.01 при інституті фізіологіі ім. О. О. Богомольця НАН України за адресою:

252024 м. Київ 24, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України.

Автореферат розісланий «-

2д ,п„г

Учений секретар спеціалізованої вченої ради доктор біологічних наук

СОРОКША-МАРІНА 3. О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Останніми роками на межі молекулярної біології, біохімії, мембранної біофізики та клітинної нейрофізіології з'явився новий перспективний напрямок у вивченні іонних каналія, який базується на програмованому синтезі білків в ооцитах Xenoprs за допомогою еукаріотичних РНК, одержаних з різноманітних організмів. Метод експресії чужерідної генетичної інформації в ооцитах шпорцевої жаби Xenopus laevis, вперше описанні! Гурдоном на початку 70-х рсків (Gurdon 1971), в наш час с одним з ефективних засобів для дослідження функціональної експресії білків. За допомогою цього методу вже вивчено функціональну експресію рецепторів та каналів з різних тканин.

В останній час деякі типи каналів були виділені в чистому вигляді (Agnew 1984, Catteral 1986, Catteral 1988, Froclmer 1988, Relini 19S8, Schmidt 1988) та функціонально реконструйовані в штучних мембранах (Uinns 1989). Розшифрована амінокислотна послідовність субодиниць натрієвих, калієвих та кальцієвих каналів L та Р - типів (Noda 1986, Кауапо 1988, Trimmer 1988, Ellis 1988, Micaini 1989, Soongei.al 1993, Ellinor et. al 1994, Dolphin 1995).

Але найбільш перспективним в цьому плані є метод експресії чужерідної ген етичної інформації а ооцитах, особливо тепер, коли стало можливим здійснювати в них синтез мутантних білків після ін'єкції клонованих ДНК, з якими проводились генетичні маніпуляції (Soong et al. 1993, Wheeler et. al

1994).

Вибір ТЄ..1И наших досліджень був обумовлений тим-, що однією з недостатньо вивчених галузей € функціональна експресія пстеїшіалзалежнії*' низькопорогових кальцієвих каналів. Це дало б змогу для більш легального вивчення їх структури, електрофізіологічних атаопшостей та їх фармакологічної модулі; іj'i.

!

Afema роботи полягала в тому, щоб експресувати г. ооцитах потенціалкеровані ннзькопорогові кальцієві канали нейронів таламо-гіпот.ик>.чічного комплексу можу щурів та вивчити їх біофізичні та фармакологічні властивості.

Задачі роботи: І. Виділення препарату функціонально активної

сумарної матричної РНК :і нейронів таламо-гіпотпламічного комплексу мозку шурів.

2. Вивчення електрофізіологічних та фармакологічних властивостей експресованих пизьконорогових кальні' них каналів.

Наукова новизна. Вперше встановлено, шо в результаті ін'єкції сумарної мРНК. нейронів таламо-гіпоталамічною комплексу мозку щурів (мРНКт), в мембрані ооцитів проходить експресія низькопорогових кальцієвих, каналів.

Експресозані канапи не чутливі до природніх токсинів: о> конотоксину G.VIA та со-агатоксину IVA, а також вераламілу. В той же час експресоеані канати блокуються амілоридом. флунаризином, ніфедипіном та іонами лантану і нікелю.

Практична ціннісг •. Одержані дані вносять суі гений вклад в розвиток уявлень про біогенез мембранних іонних канатів та їх молеку; риу сіруктуру. Представлені результати можуть бути використані для вивчення специфічних фармакологічних впливів на кхпьчііізхтежні нейроиальні процеси.

Апробація робот... Матеріали диссертлції доповідались на міжнародному симпозіумі Meeting ol Ешорсап Neuroscience (Амстердам,

1995), а також на засіданні Вченої ради Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України.

Об'єм та структура дисертації. Диссергаїїіи складаться з введення, лігературного огляду, опчеання методів та експериментальної частини.

обговорення, 7 висновків га списку літератури з 163 найменувань. Робота викладена на 126 сторінках друкованого тексту, іллюстрована 25 малюнками. За тематикою дисертації опубліковано 6 робіт.

М ЕТОД И КА ДОСЛ І Д Ж Е Н Ь.

Експресію іютенциїлзалежннх низькопорогових кальцієвих каналів викликали ін'єкцією сумарної мРНК, яка була виділена за методикою (Chomczinski and Sacclii, 1987). Для одержання мРНК використовували таламо-гіпоталамічний комплекс мозку 18-22 денних'щурів.

Ізоляцію, культивування та ін'єкцію ооцнтів проводили за методом Колмепа (Colmen 1984). З метою тривалого зберігання життєздатності оочигів. фрагменти яєчника ретельно промивапи у модифікованому сольовому розчині Варта одразу після одержання їх з жаби та розділяли на окремі ооцити. На наступний день ооцнти обробляли ферментним розчином: 0,2% колагеналі ("Sigma", Туре 1) та 0,1% інгібігора трипсину ("Reanal") на протязі І години при температурі 34°С з метою вивільнення їх від шару фолікулярних клітин. Далі клітини культивували протягом 4-10 днів в чашках Нетрі зі щільністю приблизно 30 клітин на 5 мл розчину Барга в інкубаторі, який підтримує температуру 18~20°С;

Для мікроін'єкціи мРНКт використовувалася оригінальна установка з пневматичною подачею дозоаоного об'єму РНК в ооцити. В кожен ооцит вводили приблизно 50 нл водного розчину мРНКт в концентрації Імкг/мкл. Електрофізіологічні експерименти проводились на четвертин день ПІСЛЯ ін'єкції мгНК з використанням стандартної методики двохелектродної

з

фіксації потенціалу. Потенціальний електрод виготовлявся з скляних трубок Рігех, мав опір 2-3 Мом, струмовий мікроелектрод виготовлявся з боросилікатного скла, мав опір 0,5-1 Мом. Обидва мікроелектроди заповнювались розчином ЗМ CsCI. Трансмембранні струми реєструвались в розчині Рінгера, який містив (в мілімолях на літр): NaCl-U5, КСІ-2.5, СаСІ2-1.8, HEPES-10. значення рН-7.4. Струми через кальцієві канали вимірювались у барієвому розчині, який містив ( в міллімолях на літр): NaOH-50, Ва(ОН)2-40. КОН-2, HEPES-10, значення pH 7.3 доводили ме тансульфокислотою ("Sigma",США). З метою усунення натрієвих струмів до наведенного розчину додавали 1 мкмоль/л тетродотоксину (ТТХ) або еквімолнрно замінювали NaOH на гідроксид тетраетил амонію- ТЭД-ОН ("Sigma", США).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ.

Біофізичні характеристики експресованих низькопорогових кальцієвих каналів.

Як було показано , ініше, натікший неіп'єкований ооцнт Хепорш laevis у відповідь на деполяризацію мембрани . генерує три компоненти трансмембранної« струму - вхідний кальцієвий, та вихідні: залежний від Са хлорний та калієвий (Barish 1983, Milcdi 1984). При підтримуючому мембранному потенціалі Vt,) -120 мВ в нормальному розчині Рінгера при деполяризації мембрани в ооцитах netстпувався трансмембранний струм. У оонитів інжектованих мРНКг трансмембранні струми, в порівнянні з контрольними оошггами, мали значно більшу амплітуду та максимум при -20 мВ (м.іл.1), що свідчить саме про експресію низькопорогових каналів, бо

бо для ооцитів інжектованих мРНК з інших структур мочку (мозочок, кора великих півкуль) максимум спостерігався в диапазоні від 0 до +30 мН (Naгgeot ес.аі 1992, Любанова и др. 1993).

V, raV

Мал.1 ГранскчмЬранні струми та їх вольт-амперні характеристик» « розчині Рінгера: (А,

Б) лля контрольних оошітів та (В, Г) для ооциті» інжектованих мРНКл.

Еішоїеш lit кальціевиіі струм можна було виявити при заміні розчину Рінгера на барієвим росині, в якому іонії хлору замінені на метнлеульфонат

В результаті такої заміни вихідний струм суттєво знижувався, шо давало можливість виявити струм, який мав досить "повільну" кінетику і незначну амплітуду, яка не перевищувала 50 нА, що збігається з літературними даними. Власний кальцієвий струм ооцитів характеризується високим порогом активації (-40 мВ), а максимуму досягає приблизно при +20 мВ, та амплітудою 30+15 нА (ц—60). Дія ооцитів, які інжектовані мІ’НКт, картина струмів, які реєструються в барієвому розчині суттєво змінювалась. Амплітуда зростала до 130 ± 20 нА, струм активувався при -80—70 мВ та максимум волы-амперної характеристику струму змішувався до -30—20 мВ (мал.2).

Мал.2 Барієві струми інжектопаних оошпін (А), біля рсгстщшіі тестуючі___________

ІіотенційліїГЇБ) во;їьт-алпе|'н:і хцрііктсріїетіїкії іианнх три шіх стрі.чі». Пілтріїм)ючіііі поіснціал -120 мВ.

Ми оцінювати це як появу в мембрані ооцитів нових кальцієвих канатів. Такті низькопоіюговий струм був зареєстрований у 58 і 122 іііжекіованпх

ь

попитів. У решти оопчтів п(іа і "хструтіався високопороговий струм або експресія додаткових кальцієвих каналів не проходила взагалі. Ми будугоіли вольт-амперні характеристики при різних підтримуючих потенціалах (-120 мВ та -50 мВ), зсув підтримуючого потенціалу де -50 мВ призводив до зникнення іінзькоиороіового компоненту, а струм яки залишався за своїми характеристикам був схожим на струм нативних Са-каналів ооцьта. Інактиваційні. зрактерпетики барісвих струмів.

Для очіпки параметрів стаціонарної інактивації нами була проведена серія експериментів, в яких після преімпульсу тривалістю 5 сек, в диапазоні значень від -120 мВ до +20 мВ з кроком 10 мВ. ¡ішов тестуючий імпульс тривалістю 500 мс та амплітудою -20 м3. Одержану в результаті вимірів криву, можна розглядати як криву стаціонарної інактивації популяції ншькопорогошіх каїьції вих каналів. Експериментальні точки задовільно лягають на теоретичну криву стаціонарної інактивації, одержану з модифікованої формули Больцмана:

ІВа/Ї 3;ліпах=( 1 - ІОо/І І +ЄХр((VU-V i/l)/k) ['1 +1 <ю/ІВатах- Д« V,/2 - ИОТеїШІал

половинної інактивації, a k - фактор кругизни Розрахунки показали, що найкращі співвідношення для експресова їх кальцієвих каналів при V|/2 = -7.S мВ та k = 15 мВ (мал. 3). На цій же довжині імпульсу (5 сек) вимірювалась і постійна часу, т= 1.55¿0.05 сек. Струм був повільним, порівнючи з природніми Т-каналами нейронів тхзамусу, для них т-20-40 мсек (Dolphin 1995). Як видно з малюнка 3 барієвий струм не інактивувавси до кінця і завжди залишався компонент струму, який складав біля 30% від максимальної амплітуди. (ми враховували не у формулі Больцмана, це

компонент loo). Поскільки в інжєктованому ооцигі завжди присутні і власні ■ Са канали (високонорогові схожі на L-тип), то ймовірно, іцо цей неінактивуючий компонент належить саме їм.

Holding potential (mV)

^тахИ*-!« ^mex)il+exp((V“V|/2/k)3“®tle /Ітвх

Мал.З Імакіипаиійні характеристики барієвих струміїі в інжектоианих ооишлх. (А) petчі рації улвохімиульсному-режимі (прсімпулигііід ^120 мВ до20мВз"кроком-! ЇГмВГ триьилісім 5 сек ти тестуючим імпульс тривалістю 500 мсек І депо'іярпіаиією до -20 мВ). (В) кринсі стаціонарної ¡активації барієвих струмі».

Фармакологія експресовлних иизькопорогових каналів. '

Для оцінки фармакологічної чутливості кальцієвих каналів, експресованих в оошітах, використовувались агенти, які мають специфічну дію на різні піни кальцієвих каналів: іони С 12+, Ni2*" La3*; амілорид, фпунари пін. ніфеднпіи, вераиаміл та природні іоксиии: пептидний

блокагор м-кожпоксин GVIA з морського равлика Conus geográficas, фракція отрути американською павука AgelenopsLs apella со - агатоксин IVA.

Вплив неорганічних катіонів.

Виявилось, що іони Cd2+ ефективно блокують барієвий струм в попитах, інжектопаних мІ’НКт. На 4 малюнку представлена крива доза-ефект блокування барієвого струму іонами кадмію (К,і~ 0.52 мМ).

Катіони нікелю, які вважаються специфічним блокатором низькопорогових катьиієвих канатів, блокувати експресовані канати дещо гірше ніж іони кадмію. Крива зо і.і-сфскт блокування барієвого струму іонами Ni2t показана на мат. 4 (К,|= 0.62 мМ).

Найбільш ефективно з неорганічних катіонів на експресованні низькопорогові канати діяли іони La-,+, які замітно блокувати струм в концентрації 0.1 мк.М (струм блокувався на 20%). Kj для іонів лантану

складала 0.48 мкМ; крива доза-ефект представлена на мал.4

<С

>

і-)

са

а

V

>

са

GJ

к

10-8 ю-7 ю-6 10-5 ю-4 ю-3

Concentration (М)

Мал.4 Кршіі доза-сфект блокування 6apitimx струмії» інжектошіних ооцитів для іонів La,f, ГИ-*, Nii+. Константи дисоціації вказані біля ишповідннх криішх.

Ми застосували іони лантану діл розділенні! компонентів барієвого струму, заблокувавши його низькопорогову частину (як згадувалося раніше це вдалось зробити за допомогою зсуву підгримуючого потенціалу до -50 мВ).

Дія органічних блокаторів.

Верапаміл, відомий як блокатор L-типу кальцієвих каналів нейронів, в досить високій концентрації (10 мкМ) майже не впливав на барієвий струм, це ііидпо з 5 малюнка. Амілорид - відомий специфічний блокатор

ншьііопорогопих каналій (Soong et al. 1993, Dolphin 19°'5) в концентрації 500

мкМ блокував струм на 70% (май. 5) при цьому амілорид добре відмиваної.

А

co-Aga-IVA 20/хМ +

co-CgTx 10/гМ

control

50 nA

150 ms

Мал.5 Фармакологія скспресованих ніиькопорогових каналі». (А) дія токсішін га-конотоксину GV1A та оі-агатоксину IVA, (Б) дім амілориду, та (В) дія псрапамілу. Біля струмів fik.ti.íífí концентрації діючих речовин. Реєстрації проводились при юстуючому потенціалі -20 ми та підтримуючому-120 мВ. -

За даними Акаіке та співавторів (Akaike et al. 1989), також ефективним

та специфічним блокатором низьк^юрогових кальцієвих каналів t

флуїтризин. Ми иикорнстовували різні концентрації цієї речовини, яка виявилась ефективним блокатором експресованих низькопорогових каналів (К<)= 0.ч2 мкМ). ТІри цьому флунаризин майже не відмивався. Крива доза-ефект дії флунаризину на барієвий струм представлена на 6 малюнку. Ми також вивчали дію піфедииіну на ексиресовані низькопороюві канали. Ніфединін блокував барієві струми з К<|= 10 мкМ, подібно до флунаризину він теж майже не відмивався. Кривая доза-ефект дії ніфедипіна на барієві

струми

!>

-З

0)

>

СІ

%

02

представлена

6.

10-6 кг? Ю"6 ю-5 ю-4 ю-3

Сопсепігаїіоп (М)

Мал.6 Криві доза-ефект блокування барієвих струмі» інжсктонанич оошпік для флунпрнзину ти ніфсдиліну. Константи дисоціації вказані біля нілповілнич кривих.

______Всі реєстрації по впливу речовин______проводились___на__максимумі

амплітуди струму (при тестуючому потенціалі -20 мВ та підтримуючому -120 мВ). Криві доза-ефект дії речовин побудовані на основі тестування 5-10

ооіипів.

Вплив природні* токсинів.

Для того, щоб підтвердити належг'сть експресованих в наших експериментах каналів до низькопорогових, ми також вивчали дію іоксинів, які є специфічними блокаторами високопорогових кальцієвих каналів: N-типу (oj-Cglx GVIA) та P-типу (o-Aga IVA) (Dolphin 1995). Ми застосовували спільну аплікацію 20 мкМ w-Aga IVA та 10 мкМ ш-СуГч GVIA; ніяких суттєвих змій впливу цих токсинів на барієвий струм ми не спостерігали (мал.5).

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Цікаво співставити наші результати по експресії суммарно! і, 2НКі іа результати експресії клонованої субодиниці гЬЕ-11 (Sooiig et al. 1993). Експресований авторами канал буь нечутливим до Вау К 8644, до u-коиотоксину, в той же час w-Aga IVA в концентрації 200 нМ блокував ііого приблизно на 50 % (експрссованиіі нами низькопороговий канал був не чутливим до цього навіть в концентрації 2000 нМ). Він блокувався також іонами нікелю (50 мкМ нікеля блокували струм на 80%).

Проте максимум вольт-амперної характеристики барієвого струму ’’нашого" каналу був суттєво зсунутий у від’ємну область потенціалів (у нас він приходив». на -30--20 мВ, а у Сунга та співавторів -10-0 мВ). Дані по стаціонарній інактивації струмів виявились дуже схожими - у “наших’’ потенціал половинної інактивації складав -78 мВ та фактор крутизни 15 мВ, а у ‘ їхніх” -78 мВ та 18 мВ відповідно.

із

В ціп роботі автори не вивчали чутливість канала до флунаризину, верапамілу і до іонів лантану. Дивлячись, на вище сказане, можна сказати, що “наш" експресований низькспороговий канал за своїми характеристикам більше схожий на природній Т-тнп кальцієвих каналів, можливо, шо канал експресований Сунгом та співавторами, відповідає R-типу кальцієвих каналів (Dolphin 1995).

Порівнюючи характеристики експресованного нами низькопорогового каналу з характеристиками Т-каналу нейронів таламусу, в роботі Акаіке та співавторів (Akaike et al. 1989), ми знайшли значну схожість фармакологічних та біофізичних характеристик. Так, потенціал половинної інактивації барієвого струму експресованих нами каналів складав -7S мВ, а у Акаіке та співавторів -93 мВ, поріг активації струму був однаковим -80—70 мВ. В своїй роботі ми використовували ті ж речовини та неорганічні іони, що і Акаіке та співавтори, тому цікаво порівняти К<і дії різних речовин на низькопорогові канали отримані нами та Акаіке: La1 *40.48 мкМ та 0.7 мкМ), Ni’+(0.62 мМ та l.6 мМ), Cd24‘(0.52 мМ та 0.3 мМ), флунаризин (0.42 мкМ та 0.4 мкМ), ніфедииін (10 мкМ га 5 мкМ) (першими вказані характеристики експресоианого нами низькопорогового каналу). Фармакологічні властивості цих каналів маііже співпадають, проте між ними є суттєві відмінності по . інетнчним характеристикам. Як відомо, природній

Т-канал має постійну часу інактивації т приблизно 20-40 мсск, а наш експресовашшй канал - т=1.55 се1'.

Можливі два чинники цих відмінностей. З одного боку, на кінетику експресованого низькопорогового каналу може впливати система трансляції

ооцпгп, яка пристосов на ло сшоренни іомпх каналів з дуже ночі'імпімн кінетичними характеристик іми. Друге припушенії» поляїас п тому, що нам вдалося експрссувати повільний ни зькопорогопиіі канал, що був описаний ше в 1985 році (Chesnoy-Marchais І9!>5) п нейроі.лх Aplysici та зовсім недавно в нейронах спинальних гангліїв ссавців (Kohrinsky, Pearson, Dolphin, 1994). В ній роботі автори знайшли в нейронах DRG лвухкомпонентний ніпькопорогопіііі струм. Цеіі ни іькопороіоиий струм блокувався 100 мкМ Ni-4 та фенітоніном (10 мкМ). Два компоненти цього тпі.копороговоіо струму значно відрізнялись по кінетиці інактивації (один компонент цього струму мав постійну часу інактивації т = 20 мсск, а друпні більше - 50 мсек), а відповідні канали мали і річні провідності - 7.9 пС та 23.1 пС відповідно. ,

Поскільки відсутні ознаки гетерогенності кальцієвих каналів, то експресуюгься в ооціпі у відповідь на введення сумарної мРНКт, виникає питання відносно молекулярних механізмів цього явища в нативному нейроні та неможливості його проявлення в ооцпті. Мабуть процес формування іонних каналів в ооииті відрі іняєтьси від того, який має місце в нагнвному нейроні. Різноманітність каналів реалізується на ріпні іюсттрамсляиійних молпфікаціїі окремих суГюлтшіь та їх подальшого включення н мембрану за рахунок масної системи трансляції оониту. При цьому експресонані кг.ііллн впяаіяють більше схожість з природними каналами за своїми фармакологічними ніж за кінетичними характеристиками. Як відомо. погепиіалзалежні кальцієві канали складаюіьси з п яги суболннішь («і б, р, у), «і -формує нору каналу і вона

і'

ж визначає і тип кальцієвого каналу (Sinyer-Lahat et al. 1992). Ця . субодиниця має багато форм та відповідно і різні прояви; так,' при інжекції в ооцити клонованої ос,ц-субоднііиці експресовувався N-тип кальцієвого каналу (ЕНіпог ct al. 1994); аід -субодиннці - Q-тип (Zhang et al. 1993) аіс -субодиниці R-тип (Soong et al. 1993). р-субодиниця визначає кінетичні властивості та впливає на амплітуду кальцієвого струму, на сьогоднішній час відомі чотири типи цієї субодиниці та декілька підтипів. В роботі Сінгера та співавторів (Singer et зі. 1991) при інжекції в ооцити р-суболиниці разом з а, ,а; ,6, та у, дуже вповільнювалась кінетика вхідною барієвого струму та різко збільшувалась амплітуда.

Берроу та співавтори (Berrow et al. 1995) інжектували в нейрони DRCJ Р-субодиннцю та спостерігали при цьому збільшення струму на 47% та максимум вольт-амперної характеристики зсовувався на +7 мВ.

Цікаво відмітити, що при інжекції р-субодишші Вау К 8644 не впливав на амплітуду струму, тоді як в контрольних нейронах струм збільшувався на 30%. Вивчення фізіологічної ролі Т-типу кальцієвих каналів являє собою надзвичайно важливе з фізіологічної га фармакологічної точок зору питання. Так, Колтер та співавтори відмічають важливість існування низькопорогових кальцієвих каналів в нейронах мозку. Невелика деполяризація клітин (-80—70 мВ) уже викликає активацію Т-типу каналів, які в свою чергу можуїьлцкднкатіиннзькопороговнй спайк (за аналогієкп^ натрій-'залежним високопороіовим спайком), що приводить до активації інших luma іонних каналів (не тільки кальцієвих) (Coulter et al. 1989).

Т-канали відіграї гь суггі ну роль в диференціюванні н^ичонів та впливають на ріст нейритів т клітинах нейробластомн (Сонтаїт еі аі. 1941). Оскільки в нашій сумарній РНК присутні всі класи субодинпць, то подальшою задачею наших наукових пошуків оже бути клонування аг субодиніші із нейронів таламо-гіпоталпмі'шого комплексу мозку турів га експресування клонованого низькопорогового каналу.

ВИСНОВКИ

1. Виділений препарат інтактної, функціонально активної, розділенної в градієнті сахарози сумарної РНК з таламо-гіпоталамічного комплексу нейронів мо жу щурів.

2. Вперше знайдена експресія низькопорогових кальцієвих каналів в ооцита.х жаби \etiopns після ін’єкції сумарної РНК з таламо-гіпоталамічного комплексу неііронів мозку щурів.

3. За допомогою методу двухмікроелектродної фіксації потенціалу на мембрані дослідженні електрофізіологічні та фармакологічні властивості експресованнх низькопорогових кальцієвих погенціалкерованих каналів .

■4 Струм через експресовані низькоїюрогові канали активувався при потенціалах -80—70 мВ, максимум вольт-амперної характеристики спостерігався при -30—20 мВ та потенціал реверсії струму був в районі +60 мВ.

5. Встановлено, що за своїми фармакологічними та електрофізіологічними характеристиками експресовані низькопорогові канали найбільш схожі на Т-тип кальцієвих каналів. Іікспрссовані

низькопорогоні канали блокуються флунарнзином (K,j—0.42 мкМ),

. имілорндом (500 мкМ блокують струм на 70%) та іііфедипіном (К^-10 мкМ), а також іонами La3+(Kti=0,4íí мкМ), Ni2T(Ka-0.62 мМ) та Cd¿f (fvi-0.52 мМ). В той же час струми не чутливі до верапамілу та ириродніх токсинів (о -конотоксину GVIA та w -агатоксииу IVA).

6. Показано» що крива стаціонарної інактивації експресованих кальцієвих каналів задовільно описуються формулою Вольимана. ГІри цьому значення потенціалу половинної інактивації та фактора крутизни були рівними -78 мВ та 15 мВ відповідно. Експресованин струм має постійну часу інактивації т=1.55 сек.

7. Одержані результати можуть буги корисні для вияснення специфічних фармакологічних впливів на каяьційзалежні нейрональні процеси.

Перелік робіт, опублікованих за тематикою дисертації,

1. Любаиова О.П., Герасимснко О.В., Джура U.A., Гсрасимснко Ю В., Шуба ЯМ. Интснсифнкацмя жспрсссіш гкпенц.іалуправлмемьіх кальинсиьіх и натрисішх каналои в ооцигах лмгушюі Xenopus. шіьсцироьамльїх суммарной РНК и:і моіга крик.//I/túpixftuшо.югия.-ХУЧЗ, №(>, с.433-437.

2. Гсраспмсмко О., Джура І,, Коетмк II., Лмбанова О, Шуба Я. Відтворення біофілічішх характеристик ріжих типі» нсйрональних кальцісішх каналін при експресії ь ооцтах ж:»6и.//1“й Гї'ід Українського біофізичного нжарисгиа, Кніи, 20-24 червня 1994 р.

3. D/Jiur.t І., Kosiyuk P., L>ubai»ova O., Geusimcnko O., Shuba Ya. Pharmacology of calcium cb-tnikcts fióm r.trccrcbeIla’roocyicsT//FiistTiücnialioiial'Mecti»ig'OH'loirChai¡ncí'Pluinnacoiogyr Alicante (Spain), ? 1-23 April, 1994.

4. I D¿!uau. P.Kostyuk, O.Lyubanov.t, V.Naidcnov and Va.Shuba íixpicssiou at low-voitagc aciivaioú CVT channels Гіош ral biaii» ncuioiies iu Xenopus oocytci»/ >' SíuroRí'potf, ¡994 voi.f p

Ib

5,Dzhura I., Kostyuk P., Lyv'umovu ()., Naidenov V. and Shuha Y. l:\pression ■ow-voJtage-activated Ca2+ channels fjom nit subeonical nuclei in Xcnopus oocytes. The WecHag of Neumscicncc 1-7 September 1995, Amsterdam (Ncthcfkmds).

6. I Dzhuia, V.Naidcnov P.Kostyuk, O.Lyubanova and Ya.Shuha Charactei¡ration of hypothalamic low-voltagc*activatcd Ca channels based on thcii finvAariil expression in Xcnopu« oncyXcs.// Neuroscience, 1995 (in press).

В ооииш UMi.cujipoiuuui матричную РНК полученную и’і таламо-гигіоталамического комплекса mojh* крыс. Входящие токи через кальциевые каналы щучали с помощью техники двухмикро>лектроднои фиксации потенциала. Регистрации проводились в бесхлорном растворе содержащем 40 мМ бария. Токи а*тиі.провались при -80 мВ, максимум наблюдался при -30-20 «В и потенциал реверсии составлял около +60 мВ. все регистрации проводились при поддерживаемом потенциале -120 мВ. Посюинная времени тока при деполяризации от -120 мВ до -20 мВ составила 1550 мс, ток полностью не инактивировался и остающаяся компонента составляла Зі і% от максимальной амплитуды. Как и и шикопорогоьых кхіьииевьіх каналов, кривая стационарной инактивации была сильно сдвинута в отрицательную область. Потенциал половинной инактивации составлял -7Х мВ и фактор крутизны 15 мВ. Экспрессированный бариевый ток бломцюмлея ф.'}унп()іпнном с 42 шМ, нп<1>сднпино\і с = 10 гпМ, а также амилерндом в концентрации 500 тМ. Экспрессированные бариевые токи подавлялись также и неорганическими ионами La3f (К^- 0.48 тМ) и нонами Cd2* и Ni2+(K«j - 0.52мМ и K<j= 0.62м М соответственно).

Наши данные показывают, что в ооцитах после инъекиии в лих мРНК выделенной ш галамо-гнпоталамнчсского комплекса мозга крыс, зкспресснрумтся ннзкопороговиїс кальциевые каналы, которые по своим потенциалзависимым и фармакологическим характсрнстиісім очень похожи на Г-тнп кальциевых штатов в натгвных нейрона* гипоталамуса, хотя кинетические параметры экспрессированных и природных токов отличаются.

Ca-chamic! сшгешч e.xp/evscd in Xrtmpus oocytes by means of inRNA extracted from rut thnlamo-hypotbalamie complex were studied using double micmclettjode technique. Currents

were lecorded in Cl'-fiee extracellular solutions with 40 mM Ba^+ as u chaigc carrier, hi ic^por.sc to depolarizations from a very negative holding potential (Vj, - -120 inV) inward Ba^ "cunent activated at around -80 inV, peaked at -30 - -20 inV and reversed at +60 niV indicating that it may be' transferred through the low voltage-activated calcium channels. The time-dependent inactivation of tlie cuircnt during prolonged depolai ization to -20 inV w;u> quite slow and followed a single exponential decay with a time constant of (550 ms and maintained a component constituting 30% of llie maximal amplitude. The current could not be completely inactivated at any holding potential. As expected foi low voltugc-uctivatcd currcnt, steady-state inactivation curve was shifted towards negative potentials. It could be c'esciibed by the Boltzmann equation with half inactivation potential -78 mV, slope factor 15 inV and maintained level 0.3. Expressed Ba^ cuirent could be blocked by fiunatizine with Kj = 0.42 mkM, nifedipine« Kj - 10 mkM, and amiloride at 500 mkM coucentiation. Among inorganic Ca-channel blockers tlic most potent was La^f (Kj — 0.48 mM) while Cd^ and Ni^+ were not veiy discriminative and almost a thousand fold less effective than (Kj = 0.52 niM and — 0.62 mM respectively*. Our data show tliat mRNA purified from tlialamo-hypothalamic complex induces expression in the oocytes of almost exclusively low voltage-activated calcium channels with voltage-dependent and pharmacological properties very similai to those observed for T-type calcium current in native hypotlialamic ncuions, though kinetic pioperties of the expressed and natural curients are somewhat diffeient.