Экспрессия маркеров клеток-предшественников и факторов ангиогенеза стромальными клетками жировой ткани

Трактуев, Дмитрий Олегович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экспрессия маркеров клеток-предшественников и факторов ангиогенеза стромальными клетками жировой ткани
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия маркеров клеток-предшественников и факторов ангиогенеза стромальными клетками жировой ткани"

На правах рукописи

Трактуев Дмитрий Олегович

ЭКСПРЕССИЯ МАРКЕРОВ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ И ФАКТОРОВ АНГИОГЕНЕЗА СТРОМАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ ЖИРОВОЙ ТКАНИ

03.00.04-Биохимия 14.00.06 - Кардиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2005

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной эндокринологии Института экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗСР РФ и в Центре сосудистой биологии и медицины Университета Индианы, США.

Научный руководитель: доктор медицинских наук

Е. В. Парфёнова

Научный консультант: доктор биологических наук,

академик РАМН, член-корр. РАН профессор В. А. Ткачук

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Ю. А. Романов

доктор биологических наук Н. Н. Белушкина

Ведущая организация: Биологический факультет

Московского Государственного Университета им. М. В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 3 июня 2005 года в 11 часов на заседании Диссертационного совета К 208.073.02 в РК НПК МЗСР РФ по адресу: Москва, 121552, Зя Черепковская ул., д 15а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗСР РФ

Автореферат разослан 7/ 2005 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Т. И. Венгерова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сердечно-сосудистые заболевания являются наиболее частой причиной смертности во всем мире. Традиционные методы лечения данных заболеваний - медикаментозная терапия, эндоваскулярная и хирургическая реваскуляризация (ангиопластика и аортокоронарное шунтирование). Каждый из этих подходов не лишен недостатков: медикаментозное лечение характеризуется недостаточной эффективностью, ангиопластика - развитием рестенозов, необходимостью повторения процедуры через каждые три-пять лет, аортокоронарное шунтирование - проведением операции на открытом сердце.

Клеточная и тканевая трансплантология представляет собой одно из наиболее приоритетных направлений современной биомедицины и биотехнологии. Исследования последних лет показали огромный потенциал клеточной трансплантологии для восстановления повреждений тканей сердца и мозга, вызванных инфарктами, инсультами и дегенеративными заболеваниями, для лечения ишемических болезней сердца и нижних конечностей, для восстановления функций печени и стимуляции кроветворения.

По данным лабораторных и клинических исследований в области клеточной терапии наиболее изученными на данный момент являются эмбриональные стволовые клетки [Yamashita et al., 2000; Smith et al., 2001; Hug et al., 1996], скелетные миобласты [Menasche et al., 2003; Menasche et al., 2003; Pagani et al., 2003], мезенхимальные клетки костного мозга [Perin et al., 2003; Assmus et al., 2002] и культивированные предшественники эндотелиальных клеток [Assmus et al., 2002; Masuda et al., 2000; Kawamoto et al., 2001]. Хотя терапевтический эффект продемонстрирован для всех этих типов клеток, сложность их получения в достаточном количестве и невозможность рутинного использования по этическим причинам (для эмбриональных стволовых клеток), болезненность процедуры получения клеток у пациентов (в случае мезенхимальных клеток

костного мозга и миобластов), развитие тяжелых побочных эффектов (аритмий)

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ ЬЙМНОТЕКА ([¡¡Петербург

авоцрк

при использовании скелетных миобластов приводит к необходимости поиска других источников мультипотентных/стволовых клеток.

Ранее при гистологическом исследовании жировой ткани человека было обнаружено, что в ней содержится популяция клеток, позитивных по антигену CD34 [Stashower et al., 1999]. Экспрессия антигена CD34 характерна для гематопоэтических клеток-предшественников [Civin et al., 1984; Katz et al., 1985; Andrews et al., 1986], субпопуляций эндотелиальных клеток [Fina et al., 1990; Baumheter et al., 1993; Delia et al., 1993], а также для субпопуляций стромальных клеток и их предшественников в костном мозге и ряде других органов [Simmons et al., 1991; Garcia-Pacheco et al., 2001; Kuroda et al., 2004]. Обнаружено, что CD34+ клетки костномозгового происхождения способны дифференцироваться в эндотелиальные [Wijelath et al., 2004; Yeh et al., 2003], гладкомышечные клетки [Yeh et al., 2003], а также в эпителиальные и нейрональные клетки [Zhao et al., 2003].

Популяцию клеток, обогащенную С034-позитивными клетками удается выделить из образцов жировой ткани, полученных при косметической липосакции или в ходе хирургического удаления жирового отложения. Ферментативная обработка образцов жировой ткани раствором коллагеназы, с последующим центрифугированием полученной суспензии клеток, приводит к формированию осадочной фракции клеток стромально-васкулярного фенотипа (с примесью клеток крови), содержащей высокий процент CD34+ клеток [Rehman et al., 2004; Planat-Benard et al., 2004].

Работы, проведенные группами исследователей в США, Германии, Франции и Японии, продемонстрировали, что часть выделенных таким способом клеток, относящихся к стромальной, а не к адипоцитарной фракции жировой ткани, при культивировании в специально подобранных условиях способна дифференцироваться в адипоциты, хондроциты, в клетки костной и нервной тканей, эндотелиальные клетки и ряд других типов клеток [Safford et al, 2002; Zuk et al, 2002; Gronthos et al, 2001; Wickham et al, 2003; Mizuno et al, 2002; Planat-Benard

et.al., 2004; Ogawa et.al., 2004]. Весьма вероятно, что фракция клеток, полученная в результате ферментативной обработки жировой ткани, содержит мульти-потентные клетки стромы, принимающие участие в формировании жирового отложения [Ailhaud et al., 1992]. На сегодняшний день не существует общепринятого названия этой фракции клеток. В разных работах ее называют по разному: стромальными клетками жировой ткани (СКЖТ) [Gronthos et al., 2001; Planat-Benard et al., 2004; Rehman et al., 2004], клетками процессированного липо-аспирата [De Ugarte et.al., 2003], стромально-васкулярной фракцией жировой ткани [Miranville et.al., 2004], мезенхимальными клетками жировой ткани [Lee etaL, 2004 ].

Важным преимуществом использования СКЖТ в терапевтических целях является то, что эти клетки относительно легко и в достаточно большом количестве могут быть получены из жировой ткани. К настоящему времени СКЖТ были выделены из жировой ткани человека [Gronthos et al., 2001], свиньи [Tchoukalova et al., 2001], крысы [Huang et al., 2002; Tholpady et al., 2003; Huang, 2002; Huang et al., 2002] и мыши [Cousin et al., 2003]. Все эти клетки, хотя и отличаются по набору основных антигенов, представленных на их мембранах, обладают схожей дифференцировочной способностью.

Цель данной работы заключалась в изучении проангиогенных свойств стромальных клеток жировой ткани и возможности их использования для стимуляции ангиогенеза при ишемии тканей в экспериментах на животных.

В рамках реализации этой цели были поставлены и решены следующие экспериментальные задачи:

• Подобрать оптимальную методику выделения и культивирования СКЖТ*

человека и мыши.

* Список используемых сокращений - см. на последней странице.

• Проанализировать уровень экспрессии маркерных антигенов клеток-предшественников и эндотелиальных клеток на поверхности СКЖТ человека и мыши, а также динамику экспрессии этих антигенов в процессе культивирования с помощью метода иммунофлуоресценции.

• Провести оценку экспрессии и секреции СКЖТ ряда ангиогенных факторов роста в условиях нормоксии и гипоксии с помощью ПЦР в реальном времени и ИФА.

• Исследовать влияние культуральной среды СКЖТ, культивировавшихся в условиях нормоксии и гипоксии, на жизнеспособность и пролиферацию эндотелиальных клеток.

• Подобрать оптимальный метод трансфекции СКЖТ генетическими векторами различных типов и определить динамику экспрессии трансгенов после различных методов трансфекции.

• Изучить способность СКЖТ стимулировать ангиогенез на моделях подкожного имплантанта и ишемии задней конечности мыши.

• Исследовать влияние высококалорийной диеты на аккумуляцию мульти-потентных клеток в жировой ткани мыши.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые показано, что гетерогенная популяция свежевыделенных СКЖТ содержит высокий процент клеток, экспрессирующих антигены клеток-предшественников (СОЭ4 для человека и 8са-1 для мыши); проведен анализ динамики экспрессии маркеров клеток-предшественников в процессе культивирования СКЖТ и показано обогащение популяции клетками, несущими маркеры мезенхимальных клеток костного мозга и уменьшение клеток, экспрессирующих антигены клеток-предшественников. Установлено, что СКЖТ человека секретируют в значительном количестве такие ангиогенные факторы, как УЕСБ, НОР, ЬЕОБ и др.; экспрессия и секреция этих факторов усиливается в 2-5 раз при культивировании клеток в условиях гипоксии. Показано, что продукты секреции СКЖТ человека

способствуют выживанию и пролиферации эндотелиальных клеток, а также стимулируют развитие сосудистой сети в подкожных имплантантах матригеля у мыши. Внутривенное введение иммунодефицитным мышам СКЖТ человека способствует восстановлению кровотока и предотвращению развития некроза стопы в ишемизированной конечности мыши. Установлено, что СКЖТ человека поддаются трансфекции с высокой эффективностью вне зависимости от используемого вектора (плазмида, адено- или лентивирус). Показано, что высококалорийная диета вызывает аккумуляцию СКЖТ мыши в жировом отложении.

Результаты данной работы могут служить основой для разработки новых технологий использования стромальных клеток жировой ткани для аутологичес-кой клеточной трансплантации с целью стимуляции ангиогенеза при заболеваниях сердечно-сосудистой системы, связанных с нарушением кровоснабжения тканей, а также для использования их как переносчиков терапевтических генов.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на конференциях Sixth Annual Meeting of the American Society of Gene Therapy (Вашингтон, США, 2003), 53rd Annual Scientific Session of American College of Cardiology (Новый Орлеан, США, 2004), International Fat Applied Technology. (Питтсбург, США, 2004), 54rd Annual Scientific Session of American College of Cardiology (Орландо, США, 2005), на межлабораторном семинаре ИЭК PK НПК МЗСЗ РФ (Москва, сентябрь 2004).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано две статьи и тезисы 3 докладов, одна статья принята в печать.

Структура работы: Диссертация состоит из введения, обзора литературных данных, описания методов и материалов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 28 рисунками. Список литературы включает 280 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Выделение стромальных клеток жировой ткани

Стромальные клетки жировой ткани были выделены из продуктов липосакции человека (чСКЖТ) и жировых отложений у мышей линий С57ВЬ/61 и СЗНеВ/Ре1 (мСКЖТ). Образцы «гомогенизированной» жировой ткани подвергали ферментативной обработке при 37 °С в течение 45-90 мин в растворе коллагеназы I типа (200 ед/мл) в случае человека, или в растворе коллагеназы I типа и диспазы (25 ед/мл) в случае мыши. После серии последовательных процессов фильтрования и центрифугирования полученный осадок клеток, состоящий из отдельных нежировых клеток, дополнительно обрабатывали лизирующим буфером «красных клеток крови» (154 мМ МН4С1, 10 мМ КНС03, 0,1 мМ ЭДТА) в течение 5 мин при 37 °С с последующим центрифугированием. Полученную осадочную фракцию клеток ресуспендировали в ФСБ или в среде культивирования.

Культивирование СКЖТ

После выделения клетки культивировали в пластиковых флаконах в инкубаторе при 37 °С и при 5%-ой концентрации С02. По достижении конфлюента монослой клеток обрабатывали раствором 0,25%трипсина/0,02% ЭДТА/ФСБ. СКЖТ человека культивировали в средах: 1) ЕСМ—2ту (СатЬгех) или 2) БМЕМ/10% ЭСБ/100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина. СКЖТ мыши культивировали в средах: 1) Муе1оСиИ (81ешсе11) или 2) ОМЕМ/10% ЭСБ/100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина.

Анализ экспрессии антигенов на поверхности клеток

Анализ экспрессии антигенов на поверхности клеток проводили на свежевыделенных, предкультивированных (в течение 24 часов) и конфлюентных клетках. Клетки открепляли от поверхности культурального пластика, обрабатывая их раствором 2 мМ ЭДТА/ФСБ (5 мин, 37 °С).

100 мкл СКЖТ человека и мыши в ФСБ (1-10х10б клеток/мл) инкубировали с флуоресцентно мечеными моноклональными мышиными антителами против

человеческих антигенов (в случае человека) или с флуоресцентно мечеными моноклональными крысиными антителами против мышиных антигенов (в случае мыши) в концентрации 10 мкг/мл в течение 20-30 мин во льду. Клетки отмывали от антител добавлением в пробирки 2 мл ФСБ/1%ЭБС с последующим центрифугированием клеток в течение 5 мин при 300 g при 4 °С. Осадок клеток ресуспендировали в 200 мкл ФСБ и фиксировали в 200 мкл 2% формальдегида. Процент клеток, экспрессирующих соответствующие маркеры, оценивали с помощью проточного флуориметра Calibur (Becton-Dickinson).

Культивирование клеток в условиях гипоксии

чСКЖТ второго пассажа за 15-18 часов до начала эксперимента сажали на

пластик с плотностью 5х104 клеток/см2 в среде ЕВМ-2/5%ЭСБ. Перед началом эксперимента среду культивирования повторно заменяли на ЕВМ-2/5%ЭСБ и клетки культивировали 24—72 часа либо в стандартных условиях (21% 02), либо в условиях гипоксии (1% Ог).

Анализ содержания ангиогенных факторов в среде культивирования СКЖТ

Анализ накопления в среде культивирования СКЖТ факторов VEGF, HGF и урокиназы проводили с помощью ИФА. Для оценки количества VEGF и HGF использовали наборы-реагенты компании R&D Systems, а для оценки концентрации урокиназы в образцах - набор реактивов IMUBIND uPA ELISA Kit (American Diagnostica Inc.).

Анализ экспрессии мРНК ангиогенных факторов в СКЖТ

Тотальная РНК была выделена из СКЖТ человека (пассаж 2), культивированных в среде ЕВМ/5%ЭСБ в стандартных условиях и в условиях гипоксии в течение 24 часов. Для выделения РНК был использован набор реактивов RNase Miniprep Kit (Qiagen). Концентрацию РНК в полученных образцах определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 260 нм. После выделения/очистки РНК 2 мкг полученный материал (2 мкг) подвергали

реакции обратной транскрипции с использованием набора реагентов «Omniscript RT Kit» (Qiagen).

Экспрессию мРНК ряда ростовых факторов оценивали методом ПЦР в реальном времени, измеряя накопление продукта ПЦР после каждого цикла с помощью прибора ABI 7700 Sequence Detection System (Apply Bioscience Inc.). Используемая методика основана на способности реагента SYBR Green при связывании с двухцепочечными молекулами ДНК испускать флуоресцентный сигнал, интенсивность которого измеряется детекторами прибора.

Анализ влияния среды культивирования чСКЖТ на рост эндотелиальных клеток

За 24 часа до начала эксперимента микрососудистые эндотелиальные клетки человека (5-7 пассажей) сажали на пластик с плотностью 5000 клеток/см2 в EGM-2mv среде. За 15-18 часов до начала эксперимента среду заменяли на ЕВМ-2/5%ЭСБ. Перед началом эксперимента среда в лунках заменялась на одну из следующих: 1) ЕВМ-2/5%ЭСБ; 2) 50%(ЕВМ-2/5% ЭСБ) + 50% среды, собранной с чСКЖТ, культивированных 72 часа в стандартных условиях (21% 02); 3) 50%(ЕВМ-2/5%ЭСБ) + 50% среды собранной с чСКЖТ, культивированных в течение 72 часов в условиях гипоксии (1% 02). Клетки культивировали в стандартных условиях. Через четыре дня клетки снимали с пластика и подсчитывали с помощью гемоцитометра.

Трансфекция чСКЖТ

Эффективность трансфекции чСКЖТ оценивали с испольюванием плазмидных и вирусных генетических консгруктов, кодирующих ген зеленого флуоресцентного белка (GFP). В эксперименте использовали чСКЖТ пассажа 2. Эффективность трансфекции определяли по процентному содержанию GFP-позитивных клеток в культуре, оцененному на проточном флуориметре Calibur (Becton-Dickinson).

Плазмидная трансфекция клеток. Клетки сажали в лунки с плотностью 5x104 клеток/см2 за 4 часа до трансфекции в среде EGM-2mv. Трансфекцию

проводили плазмидой pGF-1032 с использованием реагента LipofectAmine 2000 (Invitrogen). Для определения оптимальной среды трансфевсции клетки помещались в следующие типы сред: 1) DMEM с содержанием ЭСБ в пределах 0-10%; 2) ЕВМ с содержанием ЭСБ в диапазоне 5-10%.

Трансфекция клеток аденовирусом. Клетки наращивали до достижения 60% конфлюента в среде EGM-2mv, после чего среду заменяли на ЕВМ-2 и в нее добавляли концентрированный раствор аденовируса RAd CMV ТК IRES hrGFP из расчета 100 вирусных частиц на клетку. Клетки культивировали с вирусом в течение 2 часов, после чего среду заменяли на ЕВМ-2/5%ЭСБ.

Трансфекция клеток лентивирусом. Клетки наращивали до достижения 40% конфлюента, после чего среду замещали на 100% среду, собранную с клеток «293», трансфецированных лентивирусными плазмидами. Конечный титр вируса (pcDNA HIV CS-CGW) в наносимой среде - 106 вирусных частиц/мл, а наносимый объем рассчитывался из принципа, что на каждую трансфецируемую клетку приходилось по 10 вирусных частиц. Для повышения эффективности связывания вирусных частиц с поверхностью клеток в среду добавляли полубрин в концентрации 8 мкг/мл. Клетки инкубировали в присутствии вируса 15 часов, после чего среду заменяли на EGM-2mV.

Имплантация человеческих СКЖТ в матригеле под кожу мыши

Для данного эксперимента были использованы СКЖТ человека пассажа 1.

Мыши линии Nude получали инъекцию раствора матригеля подкожно в области паха. Мыши были разделены на три группы, каждая из которых получила инъекцию 400 мкл матригеля (Growth Factor Reduced Matrigel, BD Biosciences), смешанного со 100 мкл одного из следующих растворов: 1) ФСБ; 2) 250 мкг/мл bFGF/60 Ед гепарина; 3) чСКЖТ, пасс. 1 (2x106 клеток/мл) в ФСБ. Через 14 дней после начала эксперимента имплантанты матригелей были выделены, заморожены и проанализированы иммуногистохимическим методом на развитие капиллярной сети.

Оценка выживаемости и миграции клеток

Оценка выживаемости СКЖТ и способности их мигрировать внутри ткани после локального введения в мышцу проводили на мышах линии NOD/SCID. 105 DAPI-меченых клеток в 20 мкл ФСБ были локально введены в т. tibialis anterior. На седьмой день после введения из мышц были приготовлены серии замороженных срезов (10 мкм) через каждые 500 мкм. Выживаемость клеток в ткани оценивалась путем подсчета количества DAPI-позитивных клеток.

105 GFP-позитивных СКЖТ (пассаж 1) в 20 мкл ФСБ были локально введены в т. tibialis anterior. Для оценки миграции клеток внутри мышечной ткани проводили взятие материала для гистологического анализа через три часа, а затем через трое и семь суток после введения.

Модель ишемии задней конечности мыши и трансплантация СКЖТ человека

Ишемию нижней конечности создавали у мышей самцов 8-12 недельного возраста линии Nude. Операции проводили под общей анестезией. На коже средней части левого бедра делали продольный разрез длиной 8 мм, соединительную и жировую ткань расчищали в стороны от пучка бедренной артерии, вены и нерва, выделяли бедренную артерию (а также все ее веточки), а затем артерию перевязывали в области паховой связки сверху и снизу после бифуркации ее на подкожную и подколенную артерии. Все веточки артерии, находящиеся между основными лигатурами, также перевязывали, после чего сосуд вырезали. По окончании операции кожу на бедре зашивали.

На следующий день после проведения операции непосредственно после проведения первого измерения кровотока (базальный кровоток) мышам через хвостовую вену вводили в 200 мкл среды ЕВМ/5%ЭСБ 5x105 СКЖТ двух типов: 1) свежевыделенные, предкультивированные на пластике в течение 12-18 часов в среде EGM-2mv; 2) клетки пассажа 2, культивированные в среде EGM-2mv.

Измерение кровотока

Влияние введенных клеток на стимуляцию ангиогенеза оценивали по восстановлению кровотока в подошвенной области лапы мышей. Оценку кровотока проводили с использованием лазер-допплеровского имиджера (Laser Doppler Imaging System, Moor) по методике Т. Couffinhal et al., 1998. Измерения кровотока проводили на 1-ый, 5-ый и 10-ый день после проведения операции. Животное анестезировали газовой смесью 1,5% изофлорана/02 и поддерживали на этой анестезии в течение всего измерения.

Иммуногистохимический анализ

Образцы мышц и матригеля замораживали в жидком азоте в среде О.С.Т. Tissue-Tek. Стекла со срезами тканей (толщиной 10 мкм) фиксировали в течение двух минут в ацетоне, охлажденном до -20 °С. Активность эндогенной пероксидазы блокировали инкубацией срезов в растворе 0,3% Н2О2/ФСБ (10 мин), а неспецифическое связывание антител с образцами на стеклах блокировали инкубацией срезов в растворе БР: 2%БСА/5% кроличьей сыворотки/ФСБ (30 мин). После удаления излишка БР срезы инкубировали с крысиными моноклональными антителами против мышиного CD31 антигена (BD Pharmingen) в соотношении 1:50 в БР (60 мин). Для контроля на специфическое связывание антител с CD31 использовали неиммунные антитела крысы - IgG2a,k R35-95 (BD Pharmingen). В дальнейшем для детектирования антител, связавшихся с антигеном CD31, срезы последовательно инкубировали (30 мин) с конъюгированными с биотином кроличьими антителами против крысиных IgG и 30 мин с комплексом авидин/биотин-пероксидаза хрена (набор реактивов компании Vector Lab, РК-6104). Локализацию комплексов антител (ферментативную активность) выявляли с помощью субстрата 3,3-диаминобензидин (Sigma).

Подсчет капилляров

Для каждого среза т. tibialis anterior с окрашенными CD31+ клетками с помощью цифровой фотокамеры получали серию снимков, охватывающих более 80% поверхности среза. Подсчет количества CD31+ клеток и миофибрилл

проводили с использованием компьютерной программы, любезно предоставленной М. Крымским (РКНПК МЗ РФ, Москва).

Статистическая обработка данных

Полученные данные обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента и теста для межгрупповых сравнений при многократных измерениях - one way ANOVA с использованием программ Prism 4 и Instat Software.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение и культивирование СЮКТ человека

При визуальном исследовании свежевыделенных клеток, всю популяцию можно было разделить на две фракции - «крупные» клетки (большого диаметра), составляющие до 20-30% от общего числа клеток, и «мелкие» клетки (малого диаметра) абсолютно правильной формы, относящиеся, как мы предполагаем, к лейкоцитарной фракции и составляющие до 70-80% от общего числа выделенных клеток. Выход клеток при использованном методе выделения составлял 1—10х105 «крупных» клеток на 1 грамм ткани. Нами было отмечено, что только 20-30% посаженных клеток было способно прикрепляться к пластику.

Культивирование чСКЖТ в среде EGM-2mv, содержащей широкий набор ростовых факторов, стимулировало высокоактивную пролиферацию клеток. После 2—4-дневного лаг-периода клетки начинали активно делиться с временем удвоения каждые 18-24 часа.

Выделение и культивирование СКЖТ мыши

СКЖТ мыши выделяли из подкожного жирового отложения (ПЖО), располагающегося по бокам в нижней части туловища, и из висцерального жирового отложения (ВЖО), находящегося непосредственно под широкой мышцей живота. Как и в случае чСКЖТ, свежевыделенные мышиные клетки можно было разделить на две фракции (рис. 1) - клетки с малым диаметром

полностью округлой формы и в то же время С045-позитивные (лейкоциты) и клетки с относительно большим диаметром («крупные» клетки). Выход «крупных» клеток при данном типе выделения составлял 3,6±0,6 х 106 и 3,2±0,2 х 106 на 1 грамм ПЖО и ВЖО ткани, соответственно. Только 15-25% посаженных клеток были способны прикрепляться к пластику, и при культивировании в среде Муе1оСиИ, после краткого лаг-периода (24—48 часов), начинали делиться с временем удвоения каждые 24 часа.

«Крупны«» клетки

ю' 1(Г 10-FL4+4

Рис. 1. Фотография свежевыделенных мСКЖТ подкожного жирового отложения в камере Горяева и данные их цнтофлуориметрического анализа

Экспрессия антигенов на поверхности СКЖТ человека

На рис. 2 представлены результаты анализа экспрессии ряда антигенов на клеточных мембранах СКЖТ человека методом проточной цитофлуориметрии: популяция свежевыделенных чСКЖТ содержит высокий процент (более 25%) клеток, экспрессирующих антиген CD34. CD34 - 115 кДа гликопротеин, экспрессия которого детектируется на гематопоэтаческих стволовых клетках [Civin et al, 1984; Katz et al, 1985], на субпопуляциях сосудистых эндотелиальных клеток [Fina et al, 1990; Baumheter et al., 1993; Delia et al., 1993], на субпопуляциях стромальных клеток в костном мозге и других органах [Simmons et al, 1991; Garcia-Pacheco et al., 2001; Kuroda et al., 2004].

Наша работа была одной из первых, в которой было показано, что уровень CD34+ клеток в выделяемой популяции клеток жировой ткани значителен.

>9 KXh

CD14 CD45 CD31 CD144 Kdr CD34 CD117

Антиген

Н-свежевыделенные клетки H- предкультивированные клетки H - клетки пассажа 1

Ё 75

+ 50

S »

СОЮ С013 С049(1 С049е СР90 С0105

Антиген

■■ - свежевыделенные клетки ■■ - предкультивированные клетки М - клетки пассажа 1

А Б

Рис. 2. Анализ экспрессии антигенов на поверхности СКЖТ человека

(А) Экспрессия антигенов лейкоцитов, эндотелнальных и клеток-предшественников на чСКЖТ в процессе культивирования. (Б) Динамика экспрессии антигенов «мезенхималь-ных клеток» чСКЖТ в процессе культивирования.

превышает все на данный момент известные источники получения С034 клеток, такие как кровь и костный мозг. Для подтверждения этого результата нами был поставлен ряд контрольных тестов на специфичность связывания антител против антигена СБ34 с СКЖТ. Проведенный анализ по влиянию титрования антител против СБ34 на эффективность их связывания с СКЖТ, а также по эффективности связывания антител с клетками крови (описанный подробно в диссертации) свидетельствует о специфичном связывании их с СКЖТ.

По экспрессии таких антигенов, как С031, СО 144 и к<1г можно предположить, что свежевыделенная популяция содержит 5-30% эндотелнальных клеток. Большая часть популяции свежевыделенных клеток также экспрессирует антиген С045 (10-60%), что говорит о «примеси» во фракции СКЖТ клеток крови.

Анализ фракций клеток, предкультивированных в течение 18-24 часов, а также клеток первого пассажа выявил несколько тенденций. 1) Постепенное обогащение популяции клетками, экспрессирующими маркеры стромальных и

мезенхимальных клеток костного мозга (рис. 2Б) - СОЮ, С013, С090, СОЮ5 (до уровня 98%). Ранее было показано, что СОЮ5+ клетки костного мозга способны к дифференцировке в различные типы мезенхимальных клеток [Ма^тскг е1 а1., 1998; Ма_)итс1аг й а1., 2000]. 2) Значительное снижение концентрации клеток моноцитарно-лейкоцитарной фракции, характеризующейся экспрессией С014 и СБ45. 3) Кратковременное предкультивирование клеток ведет к обогащению популяции СКЖТ клетками, экспрессирущими маркер СБ34 (вплоть до 90%), однако дальнейшее культивирование приводит к его разбавлению вплоть до полного исчезновения на клетках четвертого пассажа. 4) Постепенное снижение присутствия эндотелиальных клеток, экспресси-рующих антигены СВ31 и С0144. Наибольший процент этих клеток наблюдается в популяциях свежевыделенных и предкультивированных клеток (рис. 2Б), в то время, как продолжительное культивирование клеток в среде ЕОМ-2шу приводит к уменьшению этой субпопуляции.

Проведенный нами анализ распределения С034+ и СОЗ1+ клеток в жировой ткани иммуногистохимическим методом выявил, что С034-позитивные клетки распределяются равномерно между адиоцитами в виде отдельных клеток, а также вовлечены в формирование стенок мелких сосудов. Идентификация локализации СБ31 -позитивных клеток выявила схожий с СБ34 клетками характер их распределения в жировой ткани. Дополнительный анализ колокализации антигенов СБ31 и СБ34 с использованием конфокальной микроскопии выявил, что во многих случаях наблюдалась колокализация этих антигенов на клетках располагающихся как между адипоцитами, так и в структурах мелких сосудов (данные подробно представлены в диссертации).

Экспрессия антигенов на поверхности СКЖТ мыши

На рис. 3 представлены результаты анализа экспрессии ряда антигенов на клеточной мембране СКЖТ мыши, выделенных из висцерального и подкожного жировых отложений, проведенного методом проточной цитофлуориметрии.

С013 С034 Эса-1 СМ5 С0105 СР31 С0117

Антиген

- свежевыделенные клетки

- предкультивированные клетки

- клетки пассажа 1

СР13 Сй34 Эса-1 С1М5С0105С031 СЭ117

Антиген

I- свежевыделенные клетки !- предкультивированные клетки I - клетки пассажа 1

А Б

Рис. 3. Динамика экспрессии антигенов на мембранной поверхности мышиных СКЖТ в процессе культивирования

Клетки выделены: (А) из подкожного ЖО, (Б) - из висцерального ЖО

В отличие от СКЖТ человека, процент мышиных клеток, экспрессирующих С034, ниже и составляет 10-35%. Так же, как и в случае чСКЖТ кратковременное предкультивирование мышиных клеток приводит к относительному обогащению популяции, а длительное - к снижению экспрессии данного маркера.

Экспрессия другого .маркера клеток-предшественников - БсаЛ (специфичный антиген клеток мыши) изначально высока (30-60%), и, в отличие от СБ34, экспрессия БсаЛ не снижается даже после трехкратного пассирования клеток.

Как и в случае клеток человека, в свежевыделенной фракции СКЖТ мыши высок процент клеток, экспрессирующих антиген С045; при культивировании клеток их доля постепенно снижается до нуля.

Анализ экспрессии ряда антигенов в популяциях СКЖТ мыши, выделенных из подкожных и висцеральных жировых отложений, выявил некоторое их различие. Доля клеток, экспрессирующих антиген СБ45, выше в клетках, выделенных из подкожного жирового отложения, в то время, как фракция

клеток, выделенная из висцерального жирового отложения, больше обогащена 8са-1 и СБ31-позитивными клетками (последнее может свидетельствовать о более высоком содержании эндотелиальных клеток). Экспрессия СБ 105 на мСКЖТ отличается от его экспрессии на чСКЖТ - на пассированных мСКЖТ этот антиген экспрессируют только 35% клеток из подкожного и 65% клеток из висцерального жирового отложения.

Независимо от типа жирового отложения во фракциях свежевыделенных мСКЖТ отсутствуют клетки, экспрессирующие маркеры эндотелиальных клеток - УЕ-кадгерин и Ак-1 и маркер стволовых клеток - с-кк (СБ117).

Экспрессия ангиогенных факторов роста СКЖТ человека

Результаты экспериментов демонстрируют, что клетки, культивированные в среде ЕВМ-2/5%ЭСБ в условиях гипоксии, обладали более высокой пролиферативной активностью по сравнению с клетками, культивированными в стандартных условиях (рис. 4). В то время, как в нормальных условиях наблюю-дался только 73+7-процентный прирост клеток, в условиях гипоксии прирост составлял 135+15%. Мы предполагаем, что данный эффект обусловлен аутокринным влиянием ростовых факторов, секретируемых чСКЖТ.

-р<0.01

21%Рг

1%рг

Рис. 4. Стимулирующее влияние гипоксии на пролиферацию СКЖТ человека.

СКЖТ были посажены на пластик с плотностью 0,5x105 клеток/см2 в среде ЕВМ/5%ЭСБ. Через 3 часа часть флаконов с клетками переносили в инкубатор с содержанием кислорода 1%, а вторую половину флаконов инкубировали при стандартных условиях - 21 %02 Через 72 часов эксперимент был остановлен и было подсчитано количество клеток во флаконах.

Культуральные среды, собранные с чСКЖТ через 48 часов после начала эксперимента, были проанализированы на секрецию УЕвЕ, 1ЮЕ и урокиназы. В эксперименте исследовался как эффект гипоксии, так и влияние уровня сыворотки в среде на секрецию факторов. Данные, представленные на рис. 5, показывают, что процентное содержание сыворотки в среде культивирования существенно влияет на накопление в ней таких факторов, как УЕвЕ и урокиназа, что, возможно, отражает общую активность клеток в данных условиях. Тем не менее, независимо от количества сыворотки, наблюдалось значительно усиление секреции УЕвЕ и НвЕ в условия гипоксии. При культивировании клеток в среде с 5% ЭСБ уровень секреции изменялся с 5±2 нг/106 клеток до 37,4+7,8 нг/106 клеток в случае УЕвЕ (рис. 6А) и с 28,5+3,7 нг/106 до 41,6+5,4 нг/106 клеток в случае НвЕ (рис. 5Б).

Рис. 5. Влияние сыворотки и гипоксии на накопление белков ряда проангиогенных факторов в среде культивирования СКЖТ человека.

Клетки культивировали в среде ЕВМ/5%ЭСБ или ЕВМ/1%БСА в стандартных (21% Ог) или гипоксических (1% 02) условиях Методом ИФА проведена оценка накопления факторов в «48-часовой» среде культивирования. А, Б и В - накопление факторов УЕОР, НОР и урокиназы в расчете на 106 клеток соответственно.

Оценка накопления урокиназы (рис. 5В) в культуральной среде, содержащей 5% ЭСБ выявила, что, концентрация урокиназы в среде при помещении клеток в условия гипоксии снижалась более чем в 10 раз (с 6,71 ±0,3 нг/106 клеток до 0,66+0,44 нг/106 клеток). Данный факт может свидетельствовать не столько о снижении экспрессии самого фактора, сколько об усилении его утилизации

клетками. Наиболее вероятным механизмом этой утилизации может быть связывание урокиназы со своим рецептором и с дальнейшим эндоцитозом комплекса в цитоплазму клетки. Проведенный нами дополнительный эксперимент выявил, что в условиях гипоксии экспрессия рецептора урокиназы на клеточной поверхности чСКЖТ увеличивается более чем в 2 раза.

Методом количественного ПЦР были подтверждены данные, полученные методом ИФА, а также проведена оценка экспрессии чСКЖТ ряда других факторов. Обнаружено, что чСКЖТ экспрессируют УЕвР, НСБ, ЬРОБ, Тврр, ОМ-СБР и ангиопоэтин-2 (рис. 6). В условиях гипоксии наблюдается усиление экспрессии всех факторов; тем не менее, только для УЕОР, НОР, ЬРОР было отмечено их статистически достоверное увеличение. Уровень экспрессии УЕвР в условиях гипоксии повышался в 5,3+0,6 раз (р<0,001), для НвР - в 3,2+1 раза (р<0,05), а для ЬРвР - практически в два раза (1,9±0,1, р<0,05).

УЕвР НвР

ЬРвР Апд ЮРр вМ-СвР фактор

Рис. 6. Увеличение экспрессии мРНК проангиогенных факторов чСКЖТ в условиях гипоксии

СКЖТ культивировали 24 часа в среде ЕВМ/5%ЭСБ при стандартных условиях (21% 02) и в условиях гипоксии (1% 02). Экспрессию мРНК факторов определяли методом количественного ПЦР и выражали как отношение экспрессии исследуемого фактора к уровню экспрессии бета-актина. Данные представлены как отношение экспрессии фактора в гипоксических условиях к стандартным условиям.

Стимуляция пролиферации эндотелиальных клеток средой чСКЖТ

Культивирование микрососудистых эндотелиальных клеток человека в течение четырех дней в обедненной ростовыми факторами среде ЕВМ-2/5%ЭСБ приводило к выживанию только 31,75 + 3,97% от числа посаженных клеток (рис. 7). Помещение клеток в среду, содержащую 50% среды СКЖТ, культи-

вированных в стандартных условиях (21% Ог), приводило к полному выживанию клеток (115,38±10,57%), а в случае среды, содержащей 50% среды СКЖТ, культивированных в условиях гипоксии (1 % Ог) - к значительной пролиферации клеток (161,5±13,9%).

р<0.001

Рис. 7. Стимуляториое влияние культуральной среды чСКЖТ на выживание и пролиферацию микрососудистых эндотелиальных клеток

Микрососудистые клетки человека культивировали в следующих средах: (1) 100%(ЕВМ-2/5%ЭСБ); (2) 50%(ЕВМ-2/5%ЭСБ) + 50% среды, собранной с чСКЖТ, культивированных 72 часа при 21% 02; (3) 50%(ЕВМ-2/5%ЭСБ) + 50% среды инкубации чСКЖТ, культивированных 72 часа при 1% 02. Эксперимент продолжался 96 часов, после чего подсчитывали количество клеток в лунках.

Стимуляция чСКЖТ развития сосудистой сети в подкожном имплантанте

Введение «пустого» матригеля под кожу мыши на 14 дней показало низкую степень его капилляризации (рис. 8); в то же время в матригеле, содержащем сильный ангиогенный фактор ЬЕОБ («положительный» контроль), наблюдалось развитие сосудистой сети. Тем не менее, срезы образцов матригеля, содержавшего чСКЖТ, характеризовались более значительным развитием сосудистой сети с более высокой плотностью капилляров, а также более крупными размерами капилляров и мелких сосудов. Данный факт, вероятнее всего, свидетельствует о том, что в условиях, созданных в матригеле, СКЖТ сохраняют способность поддерживать достаточно высокий уровень секреции ростовых факторов для стимуляции ангиогенеза.

А Б В

Рис. 8. Развитие сосудистой сети в матригеле под влиянием СКЖТ

Мыши линии Nude получили введение под кожу 400 мкл матригеля, смешанного со 100 мкл: (А) ФСБ; (Б) 250 мкг/мл bFGF/60 Ед гепарина/ФСБ; (В) чСКЖТ, 2х106/мл в ФСБ. Эксперимент продолжался две недели, после чего проводили выделение матригелей с последующим приготовлением из них замороженных срезов и окрашиванием последних против мышиного антигена CD31 (CD31 +клетки - эндотелиальные клетки - окрашены в коричневый цвет).

Оценка выживания и миграции клеток в мышечной ткани после локальной трансплантации

На 7-ой день после инъекции чСКЖТ в т. tibialis anterior уровень выживания клеток составлял 21,3+4,7% от числа инъекцированных клеток. Введение клеток в мышечную ткань приводило к их первоначальной кластеризации (рис. 9А). На протяжение следующей недели клетки постепенно расползались по ткани (рис. 9Б,В). Эти результаты свидетельствуют о том, что после локального введения в скелетные мышцы СКЖТ обладают высоким уровнем выживания и способны мигрировать внутри ткани.

А Б В

Рис. 9. Динамика миграции чСКЖТ в мышечной ткани мыши после локальной трансплантации

СКЖТ человека, трансфецированные GFP кодирующим аденовирусом, были инъекцированы в т. tibialise3 anterior. Через 3 часа (А), а затем через 3 (Б) и 7 суток (В) мышцы выделяли и проводили оценку распределения введенных чСКЖТ (зеленого цвета) на их замороженных срезах.

Восстановление кровотока в ишемизированной конечности мыши после системного введения чСКЖТ

Динамику восстановления кровотока и развития некроза в ишемизированной конечности анализировали в трех группах тимус-дефицитных мышей, которым внутривенно вводили свежевыделенные, либо пассированные СКЖТ, либо среду культивирования (контрольная группа). При введении мышам контрольной среды наблюдалось развитие некроза в ишемизированной конечности, в то время, как у мышей, получивших инъекции как свежевыделенных, так и пассированных чСКЖТ, данного эффекта не наблюдалось (рис. 10А-В).

- ы

^■^ааст.....л -I |

Контрольная среда

-♦■чСКЖГ,^^, -»-Контрольная среда

10 35 &0 &5 11.0 ВрФМЯ, дни

1Л 15 &D &5 11.0 g у^1 Время, дни

г Д Е

Рис. 10. Влияние трансплантации чСКЖТ на восстановление кровотока в ишемизированной конечности мыши

Мыши линии NUDE через 18-24 часа после создания ишемии задней конечности получили инъекцию 5x10 чСКЖТ в хвостовую вену. А, Б, В - подошвенная часть нижних конечностей мышей, получивших введение контрольной среды, предкультивированных клеток и клеток пассажа 1, соответственно; Г, Д - графики восстановления кровотока в ишемизированных конечностях мышей, получивших введение свежевыделенных клеток и клеток 1 пассажа, соответственно. Е - плотность капилляризации (CD31-позитивные клетки) в ш. tibialis anterior мышей, получивших введение контрольной среды, предкультивированных клеток и клеток пассажа 1. Плотность капилляров на срезе представлена как отношение CD31+клеток к миофибриллам.

Измерения кровотока в подошвенной области (рис. 10Г,Д) показали, что в контрольной группе нет явно выраженного восстановления кровотока в оставшейся «живой» части подошвы, и кровоток к 10-му дню эксперимента не превышал 20% от уровня в интактной конечности. Системное введение клеток стимулировало прирост кровоснабжения в ишемизированной конечности, и к 10-му дню у мышей, получивших свежевыделенные и пассированные клетки, кровоток достигал 50% и 60% от его уровня в интактной конечности соответственно (р<0,05).

Оценка плотности капилляров в ишемизированной т. tibialis anterior выявила, что в группе, получившей инъекцию контрольной среды, отношение капилляров к миофибриллам составляло 1,1+0,1, а в группах, получивших трансплантацию свежевыделенных предкультивированных клеток и пассированных клеток, это отношение достигало 1,6±0,1 (р<0,05) и 2,2+0,3 (р<0,01), соответственно (рис. 10Е).

Анализ эффективности трансфекции СКЖТ человека

Исследование способности чСКЖТ трансфецироваться выявило высокую эффективность этого процесса. Эффективность трансфекции клеток плазмидой с использованием липидного реагента LipofectAmine 2000 в среде DMEM/1%3CB превышала 50% (рис. IIA).

Адено- и лентивирусные трансфекции давали более 98% трансфецированных клеток без явно выраженных признаков токсичности (рис. 11 Б, В). Трансфекция клеток плазмидой, кодирующей VEGF, приводило к повышению экспрессии фактора в 20 и 7 раз по сравнению с его уровнем в интактных клетках, культивированных в стандартных и гипоксических условиях, соответственно (рис. 12).

10° Ю1 10* ю3 ю4 _анмам_

О 10 20 30 40 ВО «О * ОРР полтмиых кютм

Рис. 11. Эффективность трансфекции чСЮКТ при использовании плазмидного, аденовирусного и лентивирусного методов трансфекции

Эксперимент проводился на чСЮКТ пассажа 2. Процент трансфицированных клеток и уровень экспрессии трансгена определяли методом проточной цитофлуориметрии. (А) эффективность трансфекции чСЮКТ в различных средах плазмидой, кодирующей вРР (рвР-КШ с использованием липофильного реагента LipofectAmine 2000); (Б) эффективность трансфекции чСКЖТ ОИР кодирующим аденовирусом. По оси X -интенсивность экспрессии ОБР, по оси У - количество клеток, обладающих соответствующим уровнем экспрессии; (В) динамика экспрессии трансгена после трансфекции чСЮКТ ОРР кодирующим ретровирусом.

Анализ влияния высококалорийной диеты на аккумуляцию СКЖТ в жировой ткани мыши

Помещение мышей на высококалорийную диету приводит к значительному приросту их веса: к 30-му дню эксперимента мыши набрали до 25% от первоначального веса, в то время, как животные в контрольной группе набрали в среднем 5% (рис. 13А). Было выявлено статистически достоверное значительное

Норма Гипоксия рвРР рУЕДО

■

Рис. 12. Влияние трансфекции СКЖТ плазмидой, кодирующей УЕвР, на его секрецию

Оценка накопления УЕвР, секретирумого чСКЖТ за 48 часов в культуральной среде ЕВМ/5%ЭСБ: культивированных (1) в стандартных условиях, (2) в условиях гипоксии, (3) трансфицированных плазмидой, кодирующей СБР или (4) плазмидой, кодирующей УЕСР.

увеличение ЖО в паховой области, подкожных, висцеральных и почечных ЖО в диапазоне от 2,3 до 5,7 раз (рис. 13Б).

Подсчет выделенных мСКЖТ из подкожных и висцеральных жировых отложений выявил увеличение как общего числа клеток, так и отдельно субпопуляций «крупных» и «мелких» (лейкоцитов) клеток (рис. 14 А, Б). Следует отметить, что высококалорийная диета не влияла на плотность «крупных» клеток в подкожном ЖО, в то время, как в висцеральном ЖО наблюдалось достоверное снижение их плотности (рис. 14В).

30-

* 25

1 20-

I 15-

5. X £ 10

10 15 20 25 Время, дни

ПЖО ВЖО ПчЖО шжо

Область выделения ЖО

Рис. 13. Прирост веса мышей и увеличение жировых отложений в условиях высококалорийной диеты.

Мышей линии С57ВЬ/61 содержали на высококалорийной (ВКД) или стандартной (СД) диете. Эксперимент продолжался 30 дней А - прирост веса мышей при содержании на соответствующих диетах; Б - сравнительный анализ веса жировых отложений, выделенных из мышей, содержащихся на соответствующих диетах.

Анализ способности клеток прикрепляться к пластику (рис. 14Г) показал, что количество клеток, выделенных из индивидуальных ЖО и способных прикрепляться, увеличивается в результате высококалорийной диеты от полутора (в висцеральном) до трех раз в подкожном жировом отложении (р<0,05 и р<0,01, соответственно).

Дополнительно был проведен анализ изменения экспрессии ряда антигенов СКЖТ, выделенных из различных ЖО, в ответ на высококалорийную диету. Методом проточной цитофлуориметрии было показано, что, за исключением двукратного снижения доли С031+/С045+ и С034+/СБ45+ клеток в подкожном

ЖО (р<0,05) и незначительного снижения процента С045+ и 8са-1+/С045" клеток в висцеральном ЖО, не наблюдается существенных изменений в соотношении большинства субпопуляций СКЖТ мыши в ответ на высококалорийную диету.

пжо вжо пжо вжо

В Г

Рис. 14. Влияние диеты на аккумуляцию СКЖТ в жировом отложении

А количество клеток, выделенных из ПЖО, и их распределение по фракциям; Б -количество клеток, выделенных из ВЖО, и их распределение по фракциям; В - плотность свежевыделенных мСКЖТ в соответствующих ЖО; Г - количество клеток, выделенных из ПЖО и ВЖО, способных прикрепляться к пластику (* - р<0.05;** - р<0.01).

ВЫВОДЫ

1. Отработана методика выделения и культивирования стромальных клеток жировой ткани человека и мыши.

2. Популяции свежевыделенных СКЖТ гетерогенны и характеризуются высоким содержанием клеток, экспрессирующих антигены низкодиф-ференцированных клеток-предшественников - СБ34 в случае клеток человека и 8са-1 - в случае мыши. По мере культивирования СКЖТ человека наблюдается обогащение популяции клетками, несущими маркеры мезен-химальных клеток костного мозга (>90%), и снижение доли С034-пози-

тивных клеток. Продолжительное культивирование СКЖТ мыши приводит к обогащению популяции 8са-1 позитивными клетками, вплоть до 98%.

3. Стромальные клетки жировой ткани человека секретируют широкий набор проангиогенных факторов, таких как УЕвР, ЬРвР, НвР и др., экспрессия которых усиливается в условиях гипоксии.

4. Гипоксия стимулирует пролиферацию СКЖТ человека, а среда культивирования СКЖТ обеспечивает выживаемость эндотелиальных клеток и стимулирует их пролиферацию в обедненной ростовыми факторами среде.

5. Имплантация СКЖТ человека в матригеле под кожу иммунодефицитным мышам стимулирует развитие капиллярной сети в имплантанте, а внутривенное введение этих клеток мышам с ишемией задней конечности стимулирует ангиогенез в ишемизированных скелетных мышцах, что приводит к восстановлению кровотока в конечности.

6. При введении СКЖТ человека в мышцы задней конечности иммунодефицитных мышей до 20% клеток выживают в течение первой недели и мигрируют из области введения.

7. Стромальные клетки жировой ткани человека поддаются плазмидной, адено-и лентивирусным трансфекциям с высокой эффективностью, сохраняют высокую экспрессию трансгена до 14-30 дней. СКЖТ, трансфецированные плазмидой, кодирующей УЕвР, секретируют в среду культивирования в 20 раз больше УЕвР, чем интактные клетки.

8. Высококалорийная диета, приводящая к развитию жирового отложения, повышает общее количество выделяемых СКЖТ, но не оказывает значительного влияния на соотношение популяций клеток в выделяемых образцах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Rehman J, Traktuev D, Li J, Merfeld-Clauss S, Temm-Grove CJ, Bovenkerk JE, Pell CL, Johnstone BH, Considine RV, March KL. "Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells". Circulation. 2004, 16; 109 (10): 1292-8.

2. E.B. Парфенова, O.C. Плеханова, B.B. Степанова, М.Ю. Меньшиков, З.И. Цоколаева, К.А. Талицкий, Т.М. Рахмат-заде, Д.О. Трактуев, Н.А. Торосян, Н.И. Рогунова, Е.И. Ратнер, В.А. Ткачук. «Урокиназный активатор плазминогена: механизмы участия в ремоделировании сосудов и ангиогенезе, генно-терапевтические подходы к лечению ишемии». Российский Физиологический Журнал им. Сеченова, 2004, 90(5): 547-568.

3. Трактуев Д.О., Парфенова Е.В., Ткачук В.А., Марч K.JI. «Стромальные клетки жировой ткани - терапевтически полифункциональные клетки организма». Цитология, 2005, №7 (в печати)

4. D. Traktuev, J. Rehman, J. Li, E. Judy, C. Slavens, R. Considine, K. March. "Use of Adipose Stromal Cells as Autologous Cell Vectors for Nonviral Cardiovascular Gene Therapy". Sixth Annual Meeting of the American Society of Gene Therapy .Washington, USA, June 4-8,2003. // Molecular Therapy 2003, 7(5):S234.

5. J. Rehman, R. Siddigui, J. Li, D. Traktuev, S. Merfeld-Clauss, K. March. "Cultured Adipose-Derived Stromal Cell Express the Stem Cell Marker CD34 and Show Evidence of Differentiation into a Cardiomyocyte Phenotype". American Collage of Cardiology. 53rd Annual Scientific session. New Orleans, USA, March 7-10, 2004.// J. of the American Collage of Cardiology 2004,43(5): 177A.

6. D. Traktuev, C. Temm, C. A. Pell, J. Li, B.H. Johnstone, M.C. Yoder, Jr., K.L. March. "A High-Fat Western Diet Induces Recruitment of Bone Marrow-Derived Cells to Expanding Adipose Tissue Compartments". American Collage of Cardiology. 54rd Annual Scientific session. Orlando, USA, March 6-9, 2005.// J. of the American Collage of Cardiology 2005.

БСА бычий сывороточный альбумин мСКЖТ стромальные клетки жировой

Список используемых сокращений

ВЖО висцеральное жировое

отложение ВКД высококалорийная диета ЖО жировое отложение ИФА иммунно-ферментный анализ ПЖО подкожное жировое отложение ПЦР полимеразная цепная реакция РНК рибонуклеиновая кислота СД стандартная диета СКЖТ стромальные клетки жировой ткани

чСКЖТ стромальные клетки жировой ткани человека

ткани мыши ЭСБ эмбриональная сыворотка быка ЭДТА этилендиаминтетраацетат ФСБ фосфатно-солевой буфер ЬРСР основной фактор роста

фибробластов ЕОР эпидермальный фактор роста ОРР зеленый флуоресцентный белок вМ-БСР колоние-стимулирующий фактор

гранулоцитов и макрофагов НОР фактор роста гепатоцитов VEGF фактор роста эндотелиальных клеток

ТвРр трансформирующий фактор роста Р

РНБ Русский фонд

2005-4 45448

у; ! t

I ÏÎU]

\v4tS8

07 МАЙ 2005

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Трактуев, Дмитрий Олегович

Список сокращений.

Введение.

Обзор литературы.

Концепция роста и развития сосудистой сети.

Васкулогенез. Предшественники эндотелиальных клеток.

Гипоксия - механизм запуска ангиогенеза.

Ангиогенез. Стабилизация стенки сосуда.

Артериогенез. Ремоделирование стенки сосуда.

Лейкоциты и тромбоциты в ангиогенезе.

Протеазы в ангиогенезе и артериогенезе.

Генная терапия.

Генетические векторы.

Факторы, используемые для стимуляции ангиогенеза.

Клетки организма как основа клеточной терапии.

Представление о терапевтическом воздействии клеток.

Эмбриональные стволовые клетки.

Моноядерные клетки костного мозга.

Мезенхимальные стволовые клетки.

Предшественнники эндотелиальных клеток.

Миобласты.

Зрелые дифференцированные клетки взрослого организма.

Стромальные клетки жировой ткани.

Нейрональная дифференциация.

Дифференциация СКЖТ в клетки соединительной ткани.

Дифференциация СКЖТ в жировую ткань.

Дифференциация СКЖТ в костную ткань.

Дифференциация СКЖТ в хрящевую ткань.

Дифференциация СКЖТ в миогенную ткань.

Дифференциация СКЖТ в кардиомиоциты.

Клональный анализ клеток СКЖТ.

СКЖТ и гематопоэз.

Материал и методы исследования.

Эксперименты с культурами клеток.

Выделение стромальных клеток жировой ткани.

Выделение клеток из жировой ткани человека.

Выделение клеток из жирового отложения мыши.

Культивирование СКЖТ.

Анализ экспрессии антигенов на поверхности клеток.

Культивирование СКЖТ человека в условиях гипоксии.

Анализ способности СКЖТ человека к адипоцитарной дифференциации.

Молекулярные и биохимические эксперименты.

Анализ накопления факторов, секретируемых СКЖТ человека, в среде культивирования.

Определение активности бета-галактозидазы.

Анализ экспрессии мРНК СКЖТ человека.

Выделение РНК.

Реакция обратной транскрипции и полимеразно-цепная реакция в реальном времени.

Анализ влияния среды культивирования СКЖТ человека на рост ЭК.

Трансфекция СКЖТ человека.

Плазмидная трансфекция клеток.

Трансфекция клеток аденовирусом.

Трансфекция клеток лентивирусом.

Эксперименты на животных.

Имплантация чСКЖТ в матригеле.

Оценка выживаемости и миграции клеток.

Модель ишемии нижней конечности мыши и трансплантация СКЖТ.

Измерение кровотока.

Иммуногистохимический анализ.

Подготовка тканей.

Детектирование антигена мыши СЭ31 на срезах мышц и матригелей.

Детектирование антигенов человека СЭЗ1 и СЭ34 на срезах жировой ткани и щитовидной железы.

Подсчет капилляров.

Статистическая обработка данных.

Результаты исследования.

Выделение и культивирование СКЖТ человека.

Выделение и культивирование СКЖТ мыши.

Экспрессия антигенов на поверхности СКЖТ человека.

Экспрессия антигенов на поверхности СКЖТ мыши.

Влияние среды культивирования СКЖТ человека на способность клеток к адипоцитарной дифференциации.

Экспрессия факторов роста СКЖТ человека.

Влияние среды культивирования СКЖТ человека на пролиферацию эндотелиальных клеток.

Развитие сосудистой сети в клеточном имплантате.

Влияние системного введения СКЖТ человека на ангиогенез и восстановление кровотока в конечности мыши.

Анализ эффективности трансфекции СКЖТ человека.

Оценка выживания и миграции в мышечной ткани локально введенных чСКЖТ

Анализ влияния высокалорийной диеты на аккумуляцию СКЖТ в жировой ткани мыши.

Обсуждение результатов.

СКЖТ: анализ антигенов.

Влияние диеты на аккумуляцию СКЖТ.

Терапевтический потенциал СКЖТ.

Повышение терапевтического эффекта СКЖТ.

Возможные побочные эффекты использования СКЖТ.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспрессия маркеров клеток-предшественников и факторов ангиогенеза стромальными клетками жировой ткани"

Сердечно-сосудистые заболевания являются наиболее частой причиной смертности во всем мире. Традиционные методы лечения данных заболеваний - медикаментозная терапия и хирургическое вмешательство (ангиопластика и аортокоронарное шунтирование). Каждый из этих подходов имеет свои недостатки: медикаментозное лечение - низкую эффективность, ангиопластика - необходимость повторения процедуры каждые три-пять лет, аортокоронарное шунтирование - необходимость проведения операции на открытом сердце. Кроме того, перечисленные методы лечения являются весьма дорогостоящими.

Одними из наиболее приоритетных направлений современной биомедицины и биотехнологии являются клеточная и тканевая трансплантологии. Огромное значение для пластической и восстановительной хирургии имеет аутологическая трансплантация клеток и тканей. Они всё шире применяются для восстановления тканей после удаления раковых образований, для замещения костных и хрящевых дефектов, а также для восстановления кожного покрова после ожогов. Исследования последних лет показали огромный потенциал клеточной трансплантологии для восстановления повреждений тканей сердца и мозга, вызванных инфарктами, инсультами и дегенеративными заболеваниями, а также при лечении ишемических болезней нижних конечностей и восстановлении функций печени и стимуляции кроветворения.

С точки зрения лабораторных и клинических испытаний в клеточной терапии наиболее изученными на данный момент являются эмбриональные стволовые клетки [13], скелетные миобласты [4-6], мезенхимальные клетки костного мозга (МККМ) [7, 8] и культивированные предшественники эндотелиальных клеток [7, 9, 10].

Несмотря на наличие терапевтического эффекта для многих типов клеток, сложность их получения в достаточном количестве и невозможность рутинного использования по этическим причинам (в случае эмбриональных стволовых клеток), а также болезненность процедуры получения клеток у пациентов (например, скелетных миобластов и МККМ), приводят к необходимости поиска других источников мультипотентных клеток.

Недавно было обнаружено, что в жировой ткани человека сконцентрирована популяция С034-позитивных (СЭ34+) клеток [11]. Экспрессия антигена С034 характерна для гематопоэтических клеток-предшественников [12-14], субпопуляций эндотелиальных клеток мелких сосудов [15-17], а также для субпопуляций стомальных клеток и их предшественников в костном мозге и ряде других органов [18-20]. Ранее было показано, что С034+ клетки способны дифференцироваться в эндотелиальные [21, 22] игладкомышечные клетки [22], а также в эпителиальные и нейрональные клетки [23]. Весьма вероятно, что клетки, полученные при обработке жировой ткани, представляют собой мультипотентные клетки стромы, принимающие участие в формировании жирового отложения [24].

Одним из наиболее важных преимуществ стромальных клеток жировой ткани при возможном их использовании в терапевтических целях является относительная легкость их выделения из ткани в значительном количестве. В результате ферментативной обработки коллагеназой образцов жировой ткани, полученной в результате косметической липосакции или в ходе хирургического удаления жирового отложения, выделяется суспензия отдельных клеток. Последующее центрифугирование полученной суспензии приводит к формированию осадочной фракции клеток, содержащей высокий процент СБ34+ клеток [25, 26].

Работы, проведенные группами иследователей в США, Германии, Франции и Японии, продемонстрировали, что популяция клеток, выделенная с помощью коллагеназной обработки жировой ткани, обладает способностью дифференцироваться в различные типы клеток. При культивировании в специально подобранных условиях клетки, относящиеся к стромальной, а не к адипоцитарной фракции жировой ткани, были способны дифференцироваться в адипоциты, хондроциты, в клетки костной ткани и другие типы клеток [27, 28].

К настоящему времени стромальные клетки жировой ткани (СКЖТ) были выделены из таких биологических видов, как человек [28], свинья [29], крыса [30, 31] и мышь [32]. Все популяции клеток, выделенные из разных видов, хотя и отличаются по набору основных маркеров, представленных на их мембранах, тем не менее содержат высокий процент клеток, обладающих схожей способностью дифференцироваться в различные типы клеток.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие экспериментальные задачи:• подобрать оптимальную методику выделения и культивирования СКЖТ человека и мыши;• проанализировать уровень экспрессии маркерных антигенов клеток-предшественников и эндотелиальных клеток на поверхности СКЖТ человека имыши, а также динамику экспрессии этих антигенов в процессе культивирования с помощью метода иммунофлюоресценции;• оценить экспрессию и секрецию СКЖТ ряда ангиогенных факторов роста в условиях нормоксии и гипоксии с помощью ПЦР в реальном времени и ИФА;• исследовать влияние культуральной среды СКЖТ, культивировавшихся в условиях нормоксии и гипоксии, на жизнеспособность и пролиферацию эндотелиальных клеток;• подобрать оптимальный метод трансфекции СКЖТ генетическими векторами различных типов и оценить динамику экспрессии трансгенов после различных методов трансфекции;• изучить способность СКЖТ стимулировать ангиогенез на моделях подкожного имплантанта и ишемии задней конечности мыши;• изучить влияние высококалорийной диеты на аккумуляцию мультипотентных клеток в жировой ткани.

В ходе данной работы впервые было показано, что гетерогенная популяция свежевыделенных СКЖТ содержит высокий процент клеток, экспрессирующих антигены клеток-предшественников (СБ34 для человека и 8са-1 для мыши); проведен анализ динамики экспрессии маркеров клеток-предшественников в процессе культивирования СКЖТ и показано обогащение популяции СКЖТ человека клетками, несущими маркеры мезенхимальных клеток костного мозга и уменьшение клеток, экспрессирующих антиген СЭ34.

Установлено, что СКЖТ человека секретируют в значительном количестве такие ангиогенные факторы, как УБвР, НОР, ЪРСР и др.; экспрессия и секреция этих факторов усиливается в 2-5 раз при культивировании клеток в условиях гипоксии.

Показано, что продукты секреции СКЖТ человека способствуют выживанию и пролиферации эндотелиальных клеток, а также стимулируют развитие сосудистой сети в подкожных имплантантах матригеля у мыши. Внутривенное введение иммунодефицитным мышам СКЖТ человека способствует восстановлению кровотока и предотвращению развития некроза стопы в ишемизированной конечности мыши.

Установлено, что СКЖТ человека поддаются трансфекции с высокой эффективностью вне зависимости от используемого вектора (плазмида, адено- или лентивирус). Показано, что высококалорийная диета вызывает аккумуляцию СКЖТ мыши в жировом отложении.

Результаты данной работы могут служить основой для разработки новых технологий использования стромальных клеток жировой ткани для аутологической клеточной трансплантации с целью стимуляции ангиогенеза при заболеваниях сердечно-сосудистой системы, связанных с нарушением кровоснабжения тканей, а также для их использования в качестве переносчиков терапевтических генов.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Трактуев, Дмитрий Олегович

выводы

1. Отработана методика выделения и культивирования стромальных клеток жировой ткани человека и мыши.

2. Популяции свежевыделенных СКЖТ гетерогенны и характеризуются высоким содержанием клеток, экспрессирующих антигены низкодифференцированных клеток-предшественников — СБ34 в случае клеток человека и 8са-1 — в случае мыши. По мере культивирования СКЖТ человека наблюдается обогащение популяции клетками, несущими маркеры мезен-химальных клеток костного мозга (>90%), и снижение доли С034-позитивных клеток. Продолжительное культивирование СКЖТ мыши приводит к обогащению популяции 8са-1 позитивными клетками, вплоть до 98%.

3. Стромальные клетки жировой ткани человека секретируют широкий набор проангиогенных факторов, таких как УЕСР, ЬРвР, РЮР и др., экспрессия которых усиливается в условиях гипоксии.

5. Имплантация СКЖТ человека в матригеле под кожу иммунодефицитным мышам стимулирует развитие капиллярной сети в имплантате, а внутривенное введение этих клеток мышам с ишемией задней конечности стимулирует ангиогенез в ишемизированных скелетных мышцах, что приводит к восстановлению кровотока в конечности.

7. Стромальные клетки жировой ткани человека поддаются плазмидной, адено- и лентивирусным трансфекциям с высокой эффективностью, сохраняют высокую экспрессию трансгена до 14 - 30 дней. СКЖТ, трансфицированные плазмидой, кодирующей УЕвР, секретируют в среду культивирования в 20 раз больше УЕвР, чем интактные клетки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Трактуев, Дмитрий Олегович, Москва

1. Klug MG, Soonpaa MH, Koh GY, Field LJ: Genetically selected cardiomyocytes from differentiating embronic stem cells form stable intracardiac grafts. J Clin Invest 1996;98:216-224.

2. Smith AG: Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol 2001;17:435-462.

3. Yamashita J, Itoh H, Hirashima M, Ogawa M, Nishikawa S, Yurugi T, Naito M, Nakao K: Flkl-positive cells derived from embryonic stem cells serve as vascular progenitors. Nature 2000;408:92-96.

4. Menasche P: Skeletal muscle satellite cell transplantation. Cardiovasc Res 2003;58:351357.

5. Kawamoto A, Gwon HC, Iwaguro H, Yamaguchi JI, Uchida S, Masuda H, Silver M, Ma H, Kearney M, Isner JM, Asahara T: Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia. Circulation 2001;103:634-637.

6. Masuda H, Kalka C, Asahara T: Endothelial progenitor cells for regeneration. Hum Cell 2000; 13:153-160.

7. Stashower M, Smith K, Williams J, Skelton H: Stromal progenitor cells present within liposuction and reduction abdominoplasty fat for autologous transfer to aged skin. Dermatol Surg 1999;25:945-949.

8. Andrews RG, Singer JW, Bernstein ID: Monoclonal antibody 12-8 recognizes a115.kd molecule present on both unipotent and multipotent hematopoietic colony-forming cells and their precursors. Blood 1986;67:842-845.

9. Civin CI, Strauss LC, Brovall C, Fackler MJ, Schwartz JF, Shaper JH: Antigenic analysis of hematopoiesis. III. A hematopoietic progenitor cell surface antigen defined by a monoclonal antibody raised against KG-la cells. J Immunol 1984;133:157-165.

10. Katz FE, Tindle R, Sutherland DR, Greaves MF: Identification of a membrane glycoprotein associated with haemopoietic progenitor cells. Leuk Res 1985;9:191-198.

11. Baumheter S, Singer MS, Henzel W, Hemmerich S, Renz M, Rosen SD, Lasky LA: Binding of L-selectin to the vascular sialomucin CD34. Science 1993;262:436-438.

12. Delia D, Lampugnani MG, Resnati M, Dejana E, Aiello A, Fontanella E, Soligo D, Pierotti MA, Greaves MF: CD34 expression is regulated reciprocally with adhesion molecules in vascular endothelial cells in vitro. Blood 1993;81:1001-1008.

13. Fina L, Molgaard HV, Robertson D, Bradley NJ, Monaghan P, Delia D, Sutherland DR, Baker MA, Greaves MF: Expression of the CD34 gene in vascular endothelial cells. Blood 1990;75:2417-2426.

14. Garcia-Pacheco JM, Oliver C, Kimatrai M, Blanco FJ, Olivares EG: Human decidual stromal cells express CD34 and STRO-1 and are related to bone marrow stromal precursors. Mol Hum Reprod 2001 ;7:1151-1157.

15. Kuroda N, Nakayama H, Miyazaki E, Hayashi Y, Toi M, Hiroi M, Enzan H: Distribution and role of CD34-positive stromal cells and myofibroblasts in human normal testicular stroma. Histol Histopathol 2004;19:743-751.

16. Simmons PJ, Torok-Storb B: CD34 expression by stromal precursors in normal human adult bone marrow. Blood 1991;78:2848-2853.

17. Wijelath ES, Rahman S, Murray J, Patel Y, Savidge G, Sobel M: Fibronectin promotes VEGF-induced CD34 cell differentiation into endothelial cells. J Vase Surg 2004;39:655-660.

18. Yeh ET, Zhang S, Wu HD, Korbling M, Willerson JT, Estrov Z: Transdifferentiation of human peripheral blood CD34+-enriched cell population into cardiomyocytes, endothelial cells, and smooth muscle cells in vivo. Circulation 2003; 108:20702073.

19. Zhao Y, Glesne D, Huberman E: A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100:2426-2431.

20. Ailhaud G, Grimaldi P, Negrel R: Cellular and molecular aspects of adipose tissue development. Annu Rev Nutr 1992;12:207-233.

21. Rehman J, Traktuev D, Li J, Merfeld-Clauss S, Temm-Grove CJ, Bovenkerk JE, Pell CL, Johnstone BH, Considine RV, March KL: Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells. Circulation 2004;109:1292-1298.

22. Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, De Ugarte DA, Huang JI, Mizuno H, Alfonso ZC, Fraser JK, Benhaim P, Hedrick MH: Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell 2002;13:4279-4295.

23. Gronthos S, Franklin DM, Leddy HA, Robey PG, Storms RW, Gimble JM: Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells. J Cell Physiol 2001;189:54-63.

24. Tchoukalova YD, Hausman DB, Angelova K, Hausman GJ: Tumor necrosis factor-alpha binding in porcine primary stromal-vascular cell cultures. In Vitro Cell Dev Biol Anim 2001;37:303-309.

25. Huang JI, Beanes SR, Zhu M, Lorenz HP, Hedrick MH, Benhaim P: Rat extramedullary adipose tissue as a source of osteochondrogenic progenitor cells. Plast Reconstr Surg 2002;109:1033-1041; discussion 1042-1033.

26. Tholpady SS, Katz AJ, Ogle RC: Mesenchymal stem cells from rat visceral fat exhibit multipotential differentiation in vitro. Anat Rec 2003;272A:398-402.

27. Cousin B, Andre M, Arnaud E, Penicaud L, Casteilla L: Reconstitution of lethally irradiated mice by cells isolated from adipose tissue. Biochem Biophys Res Commun 2003;301:1016-1022.

28. Noden DM: Embryonic origins and assembly of blood vessels. Am Rev Respir Dis 1989;140:1097-1103.

29. Asahara T, Takahashi T, Masuda H, Kalka C, Chen D, Iwaguro H, Inai Y, Silver M, Isner JM: VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells. Embo J 1999;18:3964-3972.

30. Rafii S: Circulating endothelial precursors: mystery, reality, and promise. J Clin Invest 2000;105:17-19.

31. Lin Y, Weisdorf DJ, Solovey A, Hebbel RP: Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest 2000;105:71-77.

32. McBride JL, Ruiz JC: Ephrin-Al is expressed at sites of vascular development in the mouse. Mech Dev 1998;77:201-204.

33. Takahashi T, Kalka C, Masuda H, Chen D, Silver M, Kearney M, Magner M, Isner JM, Asahara T: Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nat Med 1999;5:434-438.

34. Asahara T, Isner JM: Endothelial progenitor cells for vascular regeneration. J Hematother Stem Cell Res 2002; 11:171-178.

35. Murayama T, Asahara T: Bone marrow-derived endothelial progenitor cells for vascular regeneration. Curr Opin Mol Ther 2002;4:395-402.

36. Reyes M, Dudek A, Jahagirdar B, Koodie L, Marker PH, Verfaillie CM: Origin of endothelial progenitors in human postnatal bone marrow. J Clin Invest 2002;109:337-346.

37. Ferrara N: Role of vascular endothelial growth factor in the regulation of angiogenesis. Kidney Int 1999;56:794-814.

38. Ferrara N, Carver-Moore K, Chen H, Dowd M, Lu L, O'Shea KS, Powell-Braxton L, Hillan KJ, Moore MW: Heterozygous embryonic lethality induced by targeted inactivation of the VEGF gene. Nature 1996;380:439-442.

39. Shalaby F, Ho J, Stanford WL, Fischer KD, Schuh AC, Schwartz L, Bernstein A, Rossant J: A requirement for Flkl in primitive and definitive hematopoiesis and vasculogenesis. Cell 1997;89:981-990.

40. Fong GH, Zhang L, Bryce DM, Peng J: Increased hemangioblast commitment, not vascular disorganization, is the primary defect in flt-1 knock-out mice. Development 1999;126:3015-3025.

41. Rehman J, Li J, Orschell CM, March KL: Peripheral blood "endothelial progenitor cells" are derived from monocyte/macrophages and secrete angiogenic growth factors. Circulation 2003;107:1164-1169.

42. Mikkola HK, Orkin SH: The search for the hemangioblast. J Hematother Stem Cell Res 2002;11:9-17.

43. Suda T, Takakura N, Oike Y: Hematopoiesis and angiogenesis. Int J Hematol 2000;71:99-107.

44. Takakura N, Watanabe T, Suenobu S, Yamada Y, Nöda T, Ito Y, Satake M, Suda T: A role for hematopoietic stem cells in promoting angiogenesis. Cell 2000;102:199-209.

45. Salven P, Hattori K, Heissig B, Rafii S: Interleukin-1 alpha promotes angiogenesis in vivo via VEGFR-2 pathway by inducing inflammatory cell VEGF synthesis and secretion. Faseb J 2002;16:1471-1473.

46. Banai S, Shweiki D, Pinson A, Chandra M, Lazarovici G, Keshet E: Upregulation of vascular endothelial growth factor expression induced by myocardial ischaemia: implications for coronary angiogenesis. Cardiovasc Res 1994;28:1176-1179.

47. Jiang BH, Rue E, Wang GL, Roe R, Semenza GL: Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem 1996;271:17771-17778.

48. Semenza GL: HIF-1 and human disease: one highly involved factor. Genes Dev 2000;14:1983-1991.

49. Cormier-Regard S, Nguyen SV, Claycomb WC: Adrenomedullin gene expression is developmentally regulated and induced by hypoxia in rat ventricular cardiac myocytes. J Biol Chem 1998;273:17787-17792.

50. Feldser D, Agani F, Iyer NV, Pak B, Ferreira G, Semenza GL: Reciprocal positive regulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha and insulin-like growth factor 2. Cancer Res 1999;59:3915-3918.

51. Liu Y, Cox SR, Morita T, Kourembanas S: Hypoxia regulates vascular endothelial growth factor gene expression in endothelial cells. Identification of a 5' enhancer. Circ Res 1995;77:638-643.

52. Maxwell PH, Wiesener MS, Chang GW, Clifford SC, Vaux EC, Cockman ME, Wykoff CC, Pugh CW, Mäher ER, Ratcliffe PJ: The tumour suppressor protein VHL targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis. Nature 1999;399:271-275.

53. Iyer NV, Kotch LE, Agani F, Leung SW, Laughner E, Wenger RH, Gassmann M, Gearhart JD, Lawler AM, Yu AY, Semenza GL: Cellular and developmental control of 02 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1 alpha. Genes Dev 1998;12:149-162.

54. Palmer LA, Semenza GL, Stoler MH, Johns RA: Hypoxia induces type II NOS gene expression in pulmonary artery endothelial cells via HIF-1. Am J Physiol 1998;274:L212-219.

55. Six I, Kureishi Y, Luo Z, Walsh K: Akt signaling mediates VEGF/VPF vascular permeability in vivo. FEBS Lett 2002;532:67-69.

56. Eliceiri BP, Paul R, Schwartzberg PL, Hood JD, Leng J, Cheresh DA: Selective requirement for Src kinases during VEGF-induced angiogenesis and vascular permeability. Mol Cell 1999;4:915-924.

57. Gale NW, Yancopoulos GD: Growth factors acting via endothelial cell-specific receptor tyrosine kinases: VEGFs, angiopoietins, and ephrins in vascular development. Genes Dev 1999;13:1055-1066.

58. Flaumenhaft R, Rifkin DB: The extracellular regulation of growth factor action. Mol Biol Cell 1992;3:1057-1065.

59. Houck KA, Leung DW, Rowland AM, Winer J, Ferrara N: Dual regulation of vascular endothelial growth factor bioavailability by genetic and proteolytic mechanisms. J Biol Chem 1992;267:26031-26037.

60. Naldini L, Vigna E, Bardelli A, Follenzi A, Galimi F, Comoglio PM: Biological activation of pro-HGF (hepatocyte growth factor) by urokinase is controlled by a stoichiometric reaction. J Biol Chem 1995;270:603-611.

61. Carmeliet P: Fibroblast growth factor-1 stimulates branching and survival of myocardial arteries: a goal for therapeutic angiogenesis? Circ Res 2000;87:176-178.

62. Suri C, Jones PF, Patan S, Bartunkova S, Maisonpierre PC, Davis S, Sato TN, Yancopoulos GD: Requisite role of angiopoietin-1, a ligand for the TIE2 receptor, during embryonic angiogenesis. Cell 1996;87:1171-1180.

63. Holash J, Maisonpierre PC, Compton D, Boland P, Alexander CR, Zagzag D, Yancopoulos GD, Wiegand SJ: Vessel cooption, regression, and growth in tumors mediated by angiopoietins and VEGF. Science 1999;284:1994-1998.

64. Papapetropoulos A, Fulton D, Mahboubi K, Kalb RG, O'Connor DS, Li F, Altieri DC, Sessa WC: Angiopoietin-1 inhibits endothelial cell apoptosis via the Akt/survivin pathway. J Biol Chem 2000;275:9102-9105.

65. Suri C, McClain J, Thurston G, McDonald DM, Zhou H, Oldmixon EH, Sato TN, Yancopoulos GD: Increased vascularization in mice overexpressing angiopoietin-1. Science 1998;282:468-471.

66. Ilan N, Mahooti S, Rimra DL, Madri JA: PEC AM-1 (CD31) functions as a reservoir for and a modulator of tyrosine-phosphorylated beta-catenin. J Cell Sei 1999; 112 Pt 18:3005-3014.

67. Huynh-Do U, Stein E, Lane AA, Liu H, Cerretti DP, Daniel TO: Surface densities of ephrin-Bl determine EphB 1-coupled activation of cell attachment through alphavbeta3 and alpha5betal integrins. Embo J 1999;18:2165-2173.

68. Shima DT, Mailhos C: Vascular developmental biology: getting nervous. Curr Opin Genet Dev 2000;10:536-542.

69. Wilkinson DG: Eph receptors and ephrins: regulators of guidance and assembly. Int Rev Cytol 2000;196:177-244.

70. Knudsen KA, Frankowski C, Johnson KR, Wheelock MJ: A role for Cadherins in cellular signaling and differentiation. J Cell Biochem Suppl 1998;30-31:168-176.

71. Brooks PC, Clark RA, Cheresh DA: Requirement of vascular integrin alpha v beta 3 for angiogenesis. Science 1994;264:569-571.

72. Brooks PC, Montgomery AM, Rosenfeld M, Reisfeld RA, Hu T, Klier G, Cheresh DA: Integrin alpha v beta 3 antagonists promote tumor regression by inducing apoptosis of angiogenic blood vessels. Cell 1994;79:1157-1164.

73. Sottile J: Regulation of angiogenesis by extracellular matrix. Biochim Biophys Acta 2004;1654:13-22.

74. Benjamin LE, Hemo I, Keshet E: A plasticity window for blood vessel remodelling is defined by pericyte coverage of the preformed endothelial network and is regulated by PDGF-B and VEGF. Development 1998;125:1591-1598.

75. Jain RK: Molecular regulation of vessel maturation. Nat Med 2003;9:685-693.

76. Lindahl P, Bostrom H, Karlsson L, Hellstrom M, Kaien M, Betsholtz C: Role of platelet-derived growth factors in angiogenesis and alveogenesis. Curr Top Pathol 1999;93:27-33.

77. Carmeliet P: Developmental biology. One cell, two fates. Nature 2000;408:43, 45.

78. Dettman RW, Denetclaw W, Jr., Ordahl CP, Bristow J: Common epicardial origin of coronary vascular smooth muscle, perivascular fibroblasts, and intermyocardial fibroblasts in the avian heart. Dev Biol 1998;193:169-181.

79. Carmeliet P: Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med 2000;6:389-395.

80. Carmeliet P, Jain RK: Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature 2000;407:249-257.

81. O'Reilly MS, Boehm T, Shing Y, Fukai N, Vasios G, Lane WS, Flynn E, Birkhead JR, Olsen BR, Folkman J: Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell 1997;88:277-285.

82. O'Reilly MS, Holmgren L, Shing Y, Chen C, Rosenthal RA, Moses M, Lane WS, Cao Y, Sage EH, Folkman J: Angiostatin: a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma. Cell 1994;79:315-328.

83. Hellstrom M, Gerhardt H, Kaien M, Li X, Eriksson U, Wo Iburg H, Betsholtz C: Lack of pericytes leads to endothelial hyperplasia and abnormal vascular morphogenesis. J Cell Biol 2001;153:543-553.

84. Lindahl P, Hellstrom M, Kaien M, Betsholtz C: Endothelial-perivascular cell signaling in vascular development: lessons from knockout mice. Curr Opin Lipidol 1998;9:407-411.

85. Gohongi T, Fukumura D, Boucher Y, Yun CO, Soff GA, Compton C, Todoroki T, Jain RK: Tumor-host interactions in the gallbladder suppress distal angiogenesis and tumor growth: involvement of transforming growth factor betal. Nat Med 1999;5:1203-1208.

86. Kamiya A, Togawa T: Adaptive regulation of wall shear stress to flow change in the canine carotid artery. Am J Physiol 1980;239:H14-21.

87. Zarins CK, Zatina MA, Giddens DP, Ku DN, Glagov S: Shear stress regulation of artery lumen diameter in experimental atherogenesis. J Vase Surg 1987;5:413-420.

88. Helisch A, Schaper W: Arteriogenesis: the development and growth of collateral arteries. Microcirculation 2003;10:83-97.

89. Scholz D, Ito W, Fleming I, Deindl E, Sauer A, Wiesnet M, Busse R, Schaper J, Schaper W: Ultrastructure and molecular histology of rabbit hind-limb collateral artery growth (arteriogenesis). Virchows Arch 2000;436:257-270.

90. Shyy YJ, Hsieh HJ, Usami S, Chien S: Fluid shear stress induces a biphasic response of human monocyte chemotactic protein 1 gene expression in vascular endothelium. Proc Natl Acad Sri U S A 1994;91:4678-4682.

91. Heil M, Ziegelhoeffer T, Pipp F, Kostin S, Martin S, Clauss M, Schaper W: Blood monocyte concentration is critical for enhancement of collateral artery growth. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2002;283:H2411-2419.

92. Buschmann IR, Hoefer IE, van Royen N, Katzer E, Braun-Dulleaus R, Heil M, Kostin S, Bode C, Schaper W: GM-CSF: a strong arteriogenic factor acting by amplification of monocyte function. Atherosclerosis 2001; 159:343-356.

93. Voskuil M, van Royen N, Hoefer IE, Seidler R, Guth BD, Bode C, Schaper W, Piek JJ, Buschmann IR: Modulation of collateral artery growth in a porcine hindlimb ligation model using MCP-1. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2003;284:H1422-1428.

94. Arras M, I to WD, Scholz D, Winkler B, Schaper J, Schaper W: Monocyte activation in angiogenesis and collateral growth in the rabbit hindlimb. J Clin Invest 1998;101:40-50.

95. Arras M, Strasser R, Mohri M, Doll R, Eckert P, Schaper W, Schaper J: Tumor necrosis factor-alpha is expressed by monocytes/macrophages following cardiac microembolization and is antagonized by cyclosporine. Basic Res Cardiol 1998;93:97-107.

96. Li DY, Brooke B, Davis EC, Mecham RP, Sorensen LK, Boak BB, Eichwald E, Keating MT: Elastin is an essential determinant of arterial morphogenesis. Nature 1998;393:276-280.

97. Pereira L, Andrikopoulos K, Tian J, Lee SY, Keene DR, Ono R, Reinhardt DP, Sakai LY, Biery NJ, Bunton T, Dietz HC, Ramirez F: Targetting of the gene encoding fibrillin-1 recapitulates the vascular aspect of Marfan syndrome. Nat Genet 1997;17:218-222.

98. Norrby K: Mast cells and angiogenesis. Apmis 2002;110:355-371.

99. Li XF, Charnock-Jones DS, Zhang E, Hiby S, Malik S, Day K, Licence D, Bowen JM, Gardner L, King A, Loke YW, Smith SK: Angiogenic growth factor messenger ribonucleic acids in uterine natural killer cells. J Clin Endocrinol Metab 2001;86:1823-1834.

100. Sica A, Saccani A, Mantovani A: Tumor-associated macrophages: a molecular perspective. Int Immunopharmacol 2002;2:1045-1054.

101. Coussens LM, Raymond WW, Bergers G, Laig-Webster M, Behrendtsen O, Werb Z, Caughey GH, Hanahan D: Inflammatory mast cells up-regulate angiogenesis during squamous epithelial carcinogenesis. Genes Dev 1999;13:1382-1397.

102. Banchereau J, Steinman RM: Dendritic cells and the control of immunity. Nature 1998;392:245-252.

103. Schmeisser A, Strasser RH: Phenotypic overlap between hematopoietic cells with suggested angioblastic potential and vascular endothelial cells. J Hematother Stem Cell Res 2002;11:69-79.

104. Carmeliet P: Biomedicine. Clotting factors build blood vessels. Science 2001;293:1602-1604.

105. Trikha M, Nakada MT: Platelets and cancer: implications for antiangiogenic therapy. Semin Thromb Hemost 2002;28:39-44.

106. Carmeliet P, Collen D: Development and disease in proteinase-deficient mice: role of the plasminogen, matrix metalloproteinase and coagulation system. Thromb Res 1998;91:255-285.

107. Jackson C: Matrix metalloproteinases and angiogenesis. Curr Opin Nephrol Hypertens 2002; 11:295-299.

108. Pepper MS: Role of the matrix metalloproteinase and plasminogen activator-plasmin systems in angiogenesis. Arterioscler Thromb Vase Biol 2001 ;21:1104-1117.

109. Pepper MS: Extracellular proteolysis and angiogenesis. Thromb Haemost 2001;86:346-355.

110. Luttun A, Dewerchin M, Collen D, Carmeliet P: The role of proteinases in angiogenesis, heart development, restenosis, atherosclerosis, myocardial ischemia, and stroke: insights from genetic studies. Curr Atheroscler Rep 2000;2:407-416.

111. Keyt BA, Berleau LT, Nguyen HV, Chen H, Heinsohn H, Vandlen R, Ferrara N: The carboxyl-terminal domain (111-165) of vascular endothelial growth factor is critical for its mitogenic potency. J Biol Chem 1996;271:7788-7795.

112. Plouet J, Moro F, Bertagnolli S, Coldeboeuf N, Mazarguil H, Clamens S, Bayard F: Extracellular cleavage of the vascular endothelial growth factor 189-amino acid form by urokinase is required for its mitogenic effect. J Biol Chem 1997;272:13390-13396.

113. Bajou K, Noel A, Gerard RD, Masson V, Brunner N, Holst-Hansen C, Skobe M, Fusenig NE, Carmeliet P, Collen D, Foidart JM: Absence of host plasminogen activator inhibitor 1 prevents cancer invasion and vascularization. Nat Med 1998;4:923-928.

114. Nelson AR, Fingleton B, Rothenberg ML, Matrisian LM: Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications. J Clin Oncol 2000;18:1135-1149.

115. Brew K, Dinakarpandian D, Nagase H: Tissue inhibitors of metalloproteinases: evolution, structure and function. Biochim Biophys Acta 2000;1477:267-283.

116. Pozzi A, Moberg PE, Miles LA, Wagner S, Soloway P, Gardner HA: Elevated matrix metalloprotease and angiostatin levels in integrin alpha 1 knockout mice cause reduced tumor vascularization. Proc Natl Acad Sci U S A 2000;97:2202-2207.

117. Bein K, Simons M: Thrombospondin type 1 repeats interact with matrix metalloproteinase 2. Regulation of metalloproteinase activity. J Biol Chem 2000;275:32167-32173.

118. Yla-Herttuala S, Martin JF: Cardiovascular gene therapy. Lancet 2000;355:213222.

119. Kootstra NA, Verma IM: Gene therapy with viral vectors. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2003;43:413-439.

120. Yang Y, Nunes FA, Berencsi K, Furth EE, Gonczol E, Wilson JM: Cellular immunity to viral antigens limits El-deleted adenoviruses for gene therapy. Proc Natl Acad Sci USA 1994;91:4407-4411.

121. Muruve DA, Barnes MJ, Stillman IE, Libermann TA: Adenoviral gene therapy leads to rapid induction of multiple chemokines and acute neutrophil-dependent hepatic injury in vivo. Hum Gene Ther 1999;10:965-976.

122. Zhang Y, Chirmule N, Gao GP, Qian R, Croyle M, Joshi B, Tazelaar J, Wilson JM: Acute cytokine response to systemic adenoviral vectors in mice is mediated by dendritic cells and macrophages. Mol Ther 2001;3:697-707.

123. Naldini L, Blomer U, Gallay P, Ory D, Mulligan R, Gage FH, Verma IM, Trono D: In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science 1996;272:263-267.

124. Trono D: Lentiviral vectors: turning a deadly foe into a therapeutic agent. Gene Ther 2000;7:20-23.

125. Monahan PE, Samulski RJ: AAV vectors: is clinical success on the horizon? Gene Ther 2000;7:24-30.

126. Springer ML, Chen AS, Kraft PE, Bednarski M, Blau HM: VEGF gene delivery to muscle: potential role for vasculogenesis in adults. Mol Cell 1998;2:549-558.

127. Marshall E: Gene therapy. Second child in French trial is found to have leukemia. Science 2003;299:320.

128. Silvestre JS, Tamarat R, Ebrahimian TG, Le-Roux A, Clergue M, Emmanuel F, Duriez M, Schwartz B, Branellec D, Levy BI: Vascular endothelial growth factor-B promotes in vivo angiogenesis. Circ Res 2003;93:114-123.

129. Park JE, Chen HH, Winer J, Houck KA, Ferrara N: Placenta growth factor. Potentiation of vascular endothelial growth factor bioactivity, in vitro and in vivo, and high affinity binding to Flt-1 but not to Flk-l/KDR. J Biol Chem 1994;269:25646-25654.

130. Davis S, Aldrich TH, Jones PF, Acheson A, Compton DL, Jain V, Ryan TE, Bruno J, Radziejewski C, Maisonpierre PC, Yancopoulos GD: Isolation of angiopoietin-1, a ligand for the TIE2 receptor, by secretion-trap expression cloning. Cell 1996;87:1161-1169.

131. Shyu KG, Manor O, Magner M, Yancopoulos GD, Isner JM: Direct intramuscular injection of plasmid DNA encoding angiopoietin-1 but not angiopoietin-2 augments revascularization in the rabbit ischemic hindlimb. Circulation 1998;98:2081-2087.

132. Arsic N, Zentilin L, Zacchigna S, Santoro D, Stanta G, Salvi A, Sinagra G, Giacca M: Induction of functional neovascularization by combined VEGF and angiopoietin-1 gene transfer using AAV vectors. Mol Ther 2003;7:450-459.

133. Chae JK, Kim I, Lim ST, Chung MJ, Kim WH, Kim HG, Ko JK, Koh GY: Coadministration of angiopoietin-1 and vascular endothelial growth factor enhances collateral vascularization. Arterioscler Thromb Vase Biol 2000;20:2573-2578.

134. Javerzat S, Auguste P, Bikfalvi A: The role of fibroblast growth factors in vascular development. Trends Mol Med 2002;8:483-489.

135. Galzie Z, Kinsella AR, Smith J A: Fibroblast growth factors and their receptors. Biochem Cell Biol 1997;75:669-685.

136. Grines CL, Watkins MW, Helmer G, Penny W, Brinker J, Marmur JD, West A, Rade JJ, Marrott P, Hammond HK, Engler RL: Angiogenic Gene Therapy (AGENT) trial in patients with stable angina pectoris. Circulation 2002;105:1291-1297.

137. Rosen EM, Grant DS, Kleinman HK, Goldberg ID, Bhargava MM, Nickoloff BJ, Kinsella JL, Polverini P: Scatter factor (hepatocyte growth factor) is a potent angiogenesis factor in vivo. Symp Soc Exp Biol 1993;47:227-234.

138. Camussi G, Montrucchio G, Lupia E, Soldi R, Comoglio PM, Bussolino F: Angiogenesis induced in vivo by hepatocyte growth factor is mediated by platelet-activating factor synthesis from macrophages. J Immunol 1997;158:1302-1309.

139. Sengupta S, Gherardi E, Sellers LA, Wood JM, Sasisekharan R, Fan TP: Hepatocyte growth factor/scatter factor can induce angiogenesis independently of vascular endothelial growth factor. Arterioscler Thromb Vase Biol 2003;23:69-75.

140. Zhang YW, Su Y, Volpert OV, Vande Woude GF: Hepatocyte growth factor/scatter factor mediates angiogenesis through positive VEGF and negative thrombospondin 1 regulation. Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100:12718-12723.

141. Ito WD, Arras M, Winkler B, Scholz D, Schaper J, Schaper W: Monocyte chemotactic protein-1 increases collateral and peripheral conductance after femoral artery occlusion. Circ Res 1997;80:829-837.

142. Nabel EG: Stem cells combined with gene transfer for therapeutic vasculogenesis: magic bullets? Circulation 2002;105:672-674.

143. Iwaguro H, Yamaguchi J, Kalka C, Murasawa S, Masuda H, Hayashi S, Silver M, Li T, Isner JM, Asahara T: Endothelial progenitor cell vascular endothelial growth factor gene transfer for vascular regeneration. Circulation 2002;105:732-738.

144. Levenberg S, Golub JS, Amit M, Itskovitz-Eldor J, Langer R: Endothelial cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2002;99:4391-4396.

145. Shintani S, Murohara T, Ikeda H, Ueno T, Sasaki K, Duan J, Imaizumi T: Augmentation of postnatal neovascularization with autologous bone marrow transplantation. Circulation 2001 ; 103:897-903.

146. Tomita S, Li RK, Weisel RD, Mickle DA, Kim EJ, Sakai T, Jia ZQ: Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart function. Circulation 1999;100:11247-256.

147. Strauer BE, Brehm M, Zeus T, Kostering M, Hernandez A, Sorg RV, Kogler G, Wernet P: Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans. Circulation 2002;106:1913-1918.

148. Conget PA, Minguell JJ: Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cells. J Cell Physiol 1999;181:67-73.

149. Minguell JJ, Erices A, Conget P: Mesenchymal stem cells. Exp Biol Med (Maywood) 2001;226:507-520.

150. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, Moorman MA, Simonetti DW, Craig S, Marshak DR: Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999;284:143-147.

151. Fukuda K: Development of regenerative cardiomyocytes from mesenchymal stem cells for cardiovascular tissue engineering. Artif Organs 2001;25:187-193.

152. Torna C, Pittenger MF, Cahill KS, Byrne BJ, Kessler PD: Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Circulation 2002;105:93-98.

153. Asahara T, Murohara T, Sullivan A, Silver M, van der Zee R, Li T, Witzenbichler B, Schatteman G, Isner JM: Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science 1997;275:964-967.

154. Kalka C, Masuda H, Takahashi T, Kalka-Moll WM, Silver M, Kearney M, Li T, Isner JM, Asahara T: Transplantation of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization. Proc Natl Acad Sei U S A 2000;97:3422-3427.

155. Kang HJ, Kim SC, Kim YJ, Kim CW, Kim JG, Ahn HS, Park SI, Jung MH, Choi BC, Kimm K: Short-term phytohaemagglutinin-activated mononuclear cells induce endothelial progenitor cells from cord blood CD34+ cells. Br J Haematol 2001 ;113:962-969.

156. Shi Q, Rafii S, Wu MH, Wijelath ES, Yu C, Ishida A, Fujita Y, Kothari S, Mohle R, Sauvage LR, Moore MA, Storb RF, Hammond WP: Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood 1998;92:362-367.

157. Quirici N, Soligo D, Caneva L, Servida F, Bossolasco P, Deliliers GL: Differentiation and expansion of endothelial cells from human bone marrow CD133(+) cells. Br J Haematol 2001; 115:186-194.

158. Murohara T, Ikeda H, Duan J, Shintani S, Sasaki K, Eguchi H, Onitsuka I, Matsui K, Imaizumi T: Transplanted cord blood-derived endothelial precursor cells augment postnatal neovascularization. J Clin Invest 2000;105:1527-1536.

159. Campion DR: The muscle satellite cell: a review. Int Rev Cytol 1984;87:225-251.

160. Menasche P, Hagege AA, Scorsin M, Pouzet B, Desnos M, Duboc D, Schwartz K, Vilquin JT, Marolleau JP: Myoblast transplantation for heart failure. Lancet 2001;357:279-280.

161. Koh GY, Klug MG, Soonpaa MH, Field LJ: Differentiation and long-term survival of C2C12 myoblast grafts in heart. J Clin Invest 1993;92:1548-1554.

162. Murry CE, Wiseman RW, Schwartz SM, Hauschka SD: Skeletal myoblast transplantation for repair of myocardial necrosis. J Clin Invest 1996;98:2512-2523.

163. Atkins BZ, Lewis CW, Kraus WE, Hutcheson KA, Glower DD, Taylor DA: Intracardiac transplantation of skeletal myoblasts yields two populations of striated cells in situ. Ann Thorac Surg 1999;67:124-129.

164. Suzuki K, Murtuza B, Smolenski RT, Sammut IA, Suzuki N, Kaneda Y, Yacoub MH: Cell transplantation for the treatment of acute myocardial infarction using vascular endothelial growth factor-expressing skeletal myoblasts. Circulation 2001;104:1207-212.

165. Reinlib L, Field L: Cell transplantation as future therapy for cardiovascular disease? A workshop of the National Heart, Lurig, and Blood Institute. Circulation 2000; 101 :E182-187.

166. Koh GY, Soonpaa MH, Klug MG, Pride HP, Cooper BJ, Zipes DP, Field LJ: Stable fetal cardiomyocyte grafts in the hearts of dystrophic mice and dogs. J Clin Invest 1995;96:2034-2042.

167. Li RK, Jia ZQ, Weisel RD, Merante F, Mickle DA: Smooth muscle cell transplantation into myocardial scar tissue improves heart function. J Mol Cell Cardiol 1999;31:513-522.

168. Rajnoch C, Chachques JC, Berrebi A, Bruneval P, Benoit MO, Carpentier A: Cellular therapy reverses myocardial dysfunction. J Thorac Cardiovasc Surg 2001;121:871-878.

169. Taylor DA, Atkins BZ, Hungspreugs P, Jones TR, Reedy MC, Hutcheson KA, Glower DD, Kraus WE: Regenerating functional myocardium: improved performance after skeletal myoblast transplantation. Nat Med 1998;4:929-933.

170. Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, Benhaim P, Lorenz HP, Hedrick MH: Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng 2001;7:211-228.

171. Wickham MQ, Erickson GR, Gimble JM, Vail TP, Guilak F: Multipotent stromal cells derived from the infrapatellar fat pad of the knee. Clin Orthop 2003:196-212.

172. Barry FP, Boynton RE, Haynesworth S, Murphy JM, Zaia J: The monoclonal antibody SH-2, raised against human mesenchymal stem cells, recognizes an epitope on endoglin (CD 105). Biochem Biophys Res Commun 1999;265:134-139.

173. Bruder SP, Kurth AA, Shea M, Hayes WC, Jaiswal N, Kadiyala S: Bone regeneration by implantation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells. J Orthop Res 1998;16:155-162.

174. Haynesworth SE, Baber MA, Caplan AI: Cell surface antigens on human marrow-derived mesenchymal cells are detected by monoclonal antibodies. Bone 1992;13:69-80.

175. Kuznetsov SA, Friedenstein AJ, Robey PG: Factors required for bone marrow stromal fibroblast colony formation in vitro. Br J Haematol 1997;97:561-570.

176. Majumdar MK, Thiede MA, Mosca JD, Moorman M, Gerson SL: Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells. J Cell Physiol 1998;176:57-66.

177. Safford KM, Hicok KC, Safford SD, Halvorsen YD, Wilkison WO, Gimble JM, Rice HE: Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells. Biochem Biophys Res Commun 2002;294:371-379.

178. Kang SK, Jun ES, Bae YC, Jung JS: Interactions between human adipose stromal cells and mouse neural stem cells in vitro. Brain Res Dev Brain Res 2003;145:141-149.

179. Kang SK, Lee DH, Bae YC, Kim HK, Baik SY, Jung JS: Improvement of neurological deficits by intracerebral transplantation of human adipose tissue-derived stromal cells after cerebral ischemia in rats. Exp Neurol 2003;183:355-366.

180. Kawasaki H, Mizuseki K, Nishikawa S, Kaneko S, Kuwana Y, Nakanishi S, Nishikawa SI, Sasai Y: Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron 2000;28:31-40.

181. Chen X, Katakowski M, Li Y, Lu D, Wang L, Zhang L, Chen J, Xu Y, Gautam S, Mahmood A, Chopp M: Human bone marrow stromal cell cultures conditioned by traumatic brain tissue extracts: growth factor production. J Neurosci Res 2002;69:687-691.

182. Li Y, Chen J, Chen XG, Wang L, Gautam SC, Xu YX, Katakowski M, Zhang LJ, Lu M, Janakiraman N, Chopp M: Human marrow stromal cell therapy for stroke in rat: neurotrophins and functional recovery. Neurology 2002;59:514-523.

183. Jonasson L, Hansson GK, Bondjers G, Bengtsson G, Olivecrona T: Immunohistochemical localization of lipoprotein lipase in human adipose tissue. Atherosclerosis 1984;51:313-326.

184. Ducy P, Zhang R, Geoffroy V, Ridall AL, Karsenty G: Osf2/Cbfal: a transcriptional activator of osteoblast differentiation. Cell 1997;89:747-754.

185. Benson MD, Bargeon JL, Xiao G, Thomas PE, Kim A, Cui Y, Franceschi RT: Identification of a homeodomain binding element in the bone sialoprotein gene promoter that is required for its osteoblast-selective expression. J Biol Chem 2000;275:13907-13917.

186. Lieberman JR, Le LQ, Wu L, Finerman GA, Berk A, Witte ON, Stevenson S: Regional gene therapy with a BMP-2-producing murine stromal cell line induces heterotopic and orthotopic bone formation in rodents. J Orthop Res 1998;16:330-339.

187. Mizuno H, Zuk PA, Zhu M, Lorenz HP, Benhaim P, Hedrick MH: Myogenic differentiation by human processed lipoaspirate cells. Plast Reconstr Surg 2002;109:199-209; discussion 210-191.

188. Abderrahim-Ferkoune A, Bezy O, Astri-Roques S, Elabd C, Ailhaud G, Amri EZ: Transdifferentiation of preadipose cells into smooth muscle-like cells: role of aortic carboxypeptidase-like protein. Exp Cell Res 2004;293:219-228.

189. Pfeffer MA, Braunwald E: Ventricular remodeling after myocardial infarction. Experimental observations and clinical implications. Circulation 1990;81:1161-1172.

190. Orlic D: Adult bone marrow stem cells regenerate myocardium in ischemic heart disease. Ann N Y Acad Sei 2003;996:152-157.

191. Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, Bodine DM, Leri A, Anversa P: Bone marrow stem cells regenerate infarcted myocardium. Pediatr Transplant 2003;7 Suppl 3:86-88.

192. Reffelmann T, Dow JS, Dai W, Hale SL, Simkhovich BZ, Kloner RA: Transplantation of neonatal cardiomyocytes after permanent coronary artery occlusion increases regional blood flow of infarcted myocardium. J Mol Cell Cardiol 2003;35:607-613.

193. Yao M, Dieterle T, Hale SL, Dow JS, Kedes LH, Peterson KL, Kloner RA: Long-term outcome of fetal cell transplantation on postinfarction ventricular remodeling and function. J Mol Cell Cardiol 2003;35:661-670.

194. Hutcheson KA, Atkins BZ, Hueman MT, Hopkins MB, Glower DD, Taylor DA: Comparison of benefits on myocardial performance of cellular cardiomyoplasty with skeletal myoblasts and fibroblasts. Cell Transplant 2000;9:359-368.

195. Dib N, Diethrich EB, Campbell A, Goodwin N, Robinson B, Gilbert J, Hobohm DW, Taylor DA: Endoventricular transplantation of allogenic skeletal myoblasts in a porcine model of myocardial infarction. J Endovasc Ther 2002;9:313-319.

196. Pouzet B, Vilquin JT, Hagege AA, Scorsin M, Messas E, Fiszman M, Schwartz K, Menasche P: Factors affecting functional outcome after autologous skeletal myoblast transplantation. Ann Thorac Surg 2001;71:844-850; discussion 850-841.

197. Planat-Benard V, Menard C, Andre M, Puceat M, Perez A, Garcia-Verdugo JM, Penicaud L, Casteilla L: Spontaneous cardiomyocyte differentiation from adipose tissue stroma cells. Circ Res 2004;94:223-229.

198. Ho IC, Kim JH, Rooney JW, Spiegelman BM, Glimcher LH: A potential role for the nuclear factor of activated T cells family of transcriptional regulatory proteins in adipogenesis. ProcNatl Acad Sei U S A 1998;95:15537-15541.

199. Moore KJ, Rosen ED, Fitzgerald ML, Randow F, Andersson LP, Altshuler D, Milstone DS, Mortensen RM, Spiegelman BM, Freeman MW: The role of PPAR-gamma in macrophage differentiation and cholesterol uptake. Nat Med 2001;7:41-47.

200. Pelton PD, Zhou L, Demarest KT, Burns TP: PPARgamma activation induces the expression of the adipocyte fatty acid binding protein gene in human monocytes. Biochem Biophys Res Commun 1999;261:456-458.

201. Cousin B, Munoz O, Andre M, Fontanilles AM, Dani C, Cousin JL, Laharrague P, Casteilla L, Penicaud L: A role for preadipocytes as macrophage-like cells. Faseb J 1999; 13:305312.

202. Gimble JM, Robinson CE, Wu X, Kelly KA: The function of adipocytes in the bone marrow stroma: an update. Bone 1996;19:421-428.

203. Lorenz E, Uphoff D, Reid TR, Shelton E: Modification of irradiation injury in mice and guinea pigs by bone marrow injections. J Natl Cancer Inst 1951;12:197-201.

204. Kodama HA, Amagai Y, Koyama H, Kasai S: A new preadipose cell line derived from newborn mouse calvaria can promote the proliferation of pluripotent hemopoietic stem cells in vitro. J Cell Physiol 1982;112:89-95.

205. Couffinhal T, Silver M, Zheng LP, Kearney M, Witzenbichler B, Isner JM: Mouse model of angiogenesis. Am J Pathol 1998;152:1667-1679.

206. Howell JC, Lee WH, Morrison P, Zhong J, Yoder MC, Srour EF: Pluripotent stem cells identified in multiple murine tissues. Ann N Y Acad Sci 2003;996:158-173.

207. Miranville A, Heeschen C, Sengenes C, Curat CA, Busse R, Bouloumie A: Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation 2004; 110:349-355.

208. Majumdar MK, Banks V, Peluso DP, Morris EA: Isolation, characterization, and chondrogenic potential of human bone marrow-derived multipotential stromal cells. J Cell Physiol 2000;185:98-106.

209. Graham CH, Fitzpatrick TE, McCrae KR: Hypoxia stimulates urokinase receptor expression through a heme protein-dependent pathway. Blood 1998;91:3300-3307.

210. Young HE, Steele TA, Bray RA, Detmer K, Blake LW, Lucas PW, Black AC, Jr.: Human pluripotent and progenitor cells display cell surface cluster differentiation markers

211. CD 10, CD 13, CD56, and MHC class-I. Proc Soc Exp Biol Med 1999;221:63-71.

212. Majdic O, Stockl J, Pickl WF, Bohuslav J, Strobl H, Scheinecker C, Stockinger H, Knapp W: Signaling and induction of enhanced cytoadhesiveness via the hematopoietic progenitor cell surface molecule CD34. Blood 1994;83:1226-1234.

213. Levine JA, Jensen MD, Eberhardt NL, O'Brien T: Adipocyte macrophage colony-stimulating factor is a mediator of adipose tissue growth. J Clin Invest 1998;101:1557-1564.

214. Li J, Yu X, Pan W, Unger RH: Gene expression profile of rat adipose tissue at the onset of high-fat-diet obesity. Am J Physiol Endocrinol Metab 2002;282:E1334-1341.

215. Weisberg SP, McCann D, Desai M, Rosenbaum M, Leibel RL, Ferrante AW, Jr.: Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. J Clin Invest 2003;112:1796-1808.

216. Curat CA, Miranville A, Sengenes C, Diehl M, Tonus C, Busse R, Bouloumie A: From blood monocytes to adipose tissue-resident macrophages: induction of diapedesis by human mature adipocytes. Diabetes 2004;53:1285-1292.

217. Morrison SJ, Wandycz AM, Hemmati HD, Wright DE, Weissman IL: Identification of a lineage of multipotent hematopoietic progenitors. Development 1997;124:1929-1939.

218. Okada S, Nakauchi H, Nagayoshi K, Nishikawa S, Miura Y, Suda T: In vivo and in vitro stem cell function of c-kit- and Sea-1-positive murine hematopoietic cells. Blood 1992;80:3044-3050.

219. Spangrude GJ, Heimfeld S, Weissman IL: Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science 1988;241:58-62.

220. Huang H, Auerbach R: Identification and characterization of hematopoietic stem cells from the yolk sac of the early mouse embryo. Proc Natl Acad Sci U S A 1993;90:10110-10114.

221. Izon DJ, Oritani K, Hamel M, Calvo CR, Boyd RL, Kincade PW, Kruisbeek AM: Identification and functional analysis of Ly-6A/E as a thymic and bone marrow stromal antigen. J Immunol 1996;156:2391-2399.

222. Welm BE, Tepera SB, Venezia T, Graubert TA, Rosen JM, Goodell MA: Sca-l(pos) cells in the mouse mammary gland represent an enriched progenitor cell population. Dev Biol 2002;245:42-56.

223. Al-Khaldi A, Eliopoulos N, Martineau D, Lejeune L, Lachapelle K, Galipeau J: Postnatal bone marrow stromal cells elicit a potent VEGF-dependent neoangiogenic response in vivo. Gene Ther 2003;10:621-629.

224. Kinnaird T, Stabile E, Burnett MS, Shou M, Lee CW, Barr S, Fuchs S, Epstein SE: Local delivery of marrow-derived stromal cells augments collateral perfusion through paracrine mechanisms. Circulation 2004;109:1543-1549.

225. Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, Bodine DM, Leri A, Anversa P: Transplanted adult bone marrow cells repair myocardial infarcts in mice. Ann N Y Acad Sci 2001;938:221-229; discussion 229-230.

226. Kern PA, Svoboda ME, Eckel RH, Van Wyk JJ: Insulinlike growth factor action and production in adipocytes and endothelial cells from human adipose tissue. Diabetes 1989;38:710-717.

227. Wilkison WO, Choy L, Spiegelman BM: Biosynthetic regulation of monobutyrin, an adipocyte-secreted lipid with angiogenic activity. J Biol Chem 1991;266:16886-16891.

228. Yoon YS, Park JS, Tkebuchava T, Luedeman C, Losordo DW: Unexpected severe calcification after transplantation of bone marrow cells in acute myocardial infarction. Circulation 2004;109:3154-3157.

Информация о работе

Трактуев, Дмитрий Олегович
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.04

Диссертация

Экспрессия маркеров клеток-предшественников и факторов ангиогенеза стромальными клетками жировой ткани - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы