Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия маркерного антигена мелкоклеточного рака легких - ганглиозида FucGM1: иммуноморфологическое и иммунохимическое исследование с помощью моноклональных антител

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия маркерного антигена мелкоклеточного рака легких - ганглиозида FucGM1: иммуноморфологическое и иммунохимическое исследование с помощью моноклональных антител"

На правах рукописи

ЗАРАЙСКИЙ ЕВГЕНИЙ ИЛЬИЧ

ЭКСПРЕССИЯ МАРКЕРНОГО АНТИГЕНА МЕЛКОКЛЕТОЧНОГО РАКА

ЛЕГКИХ - ГАНГЛИОЗИДА FucGMl: ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКОЕ И ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ С ПОМОЩЬЮ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2004

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте морфологии человека Российской академии медицинских наук

Научный руководитель: Профессор, доктор медицинских наук, Заслуженный деятель науки РФ Б.Б. Фукс.

Официальные оппоненты: Профессор, доктор медицинских наук, Заслуженный деятель науки РФ Л.К Романова. Доктор биологических наук, Л.Е.Гуревич.

Ведущее научное учреждение:

Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова

исследовательского института морфологии человека РАМН по адресу: 117418, Москва, ул. Цюрупы, д. 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ морфологии человека РАМН

Защита диссертации состоится

_часов на заседании диссертационного совета ( Д.001.004.01) Научно

в

Автореферат разослан

года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

Л. П. Михайлова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

В последние годы пристальное внимание исследователей, занимающихся молекулярной диагностикой и терапией различных патологических процессов привлекает обширный класс химических соединений - гликоконыогатов. Эти соединения объединяет то, что их молекулы состоят из двух компонентов - углеводного и неуглеводного.

Интерес к этим веществам вызван тем, что показано их присутствие в качестве специфических антигенов в тканях и биологических жидкостях организма животных и человека при ряде заболеваний, в том числе онкологических (Hakomoii et al.2002 г.) и соматических (Sail et al 2002 г). Успешные работы по созданию диагностических систем на основе моноспецифических и моноклональных антител (МАТ) к гликоконьюгатам (Ota et al. 2000 г.) и использованию таких антител в клинической практике показали перспективность этого направления исследований.

Наше внимание привлек гликоконыогат с мало исследованными свойствами -ганглиозид FucGMl, обнаруженный в ткани мелкоклеточного рака легких (МРЛ) человека (Nilsson, 1986). Интерес к МРЛ обусловлен тем, что рак легких занимает одно из первых мест в структуре заболеваемости злокачественными образованиями среди населения России. Примерно 25% из этих больных составляют больные МРЛ (Двойрин В.В., 1996). В связи с быстрым метастазированием - более 66% (De Vita, 1993) два года живут 10-20% больных, а излеченными могут быть 5-10% (Smit, 1995). Поэтому для МРЛ чрезвычайно важна ранняя диагностика.

Создание моноклональных антител к этому антигену поможет изучить его свойства и даст возможность исследовать наличие ганглиозида FucGMl и антител к нему у больных МРЛ, что поможет решению задач по скрининговой и дифференциальной диагностике этого заболевания.

»>ОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ

БИБЛИОТЕКА СПе О»

Цель и задачи исследования.

Целью исследования являлось иммунохроматографическое и иммунохимическое изучение экспрессии маркерного антигена мелкоклеточного рака легких путем получения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к ганглиозиду FucGMl, изучение свойств этих гибридом и продуцируемых ими антител. В связи с этим были определены задачи исследования:

1.Получение гибридом, продуцирующих МАТ к ганглиозиду

FucGMl.

2. Патогенетическая характеристика гибридом и определение свойств моноклональных антител.

3. Разработка на основе полученных моноклональных антител тест-систем для иммунодетекции ганглиозида FucGMl в тканях и биологических жидкостях. Оценка перспективы их применения в клинико-лабораторных исследованиях.

Научная новизна работы. Получены гибридомы, продуцирующие МАТ к FucGMl. С их помощью впервые показано наличие FucGMl в сыворотке крови больных мелкоклеточным раком легких. Принципиальное значение имеет обнаруженный факт наличия ганглиозида FucGMl в сыворотке крови больных мелкоклеточным раком легких. Теоретическая ценность этого наблюдения состоит в том, что до сих пор не были известны специфические гликозидные маркеры мелкоклеточного рака легких в сыворотке крови.

Новым фактом является обнаружение антител к антигенам, содержащим терминальную фукозу в сыворотке крови 85 % онкологических пациентов. Это указывает на связь злокачественной трансформации с аномальным фукозилированием, что в свою очередь может

быть обусловлено изменением активности (возможно связанной с мутациями) специфических фукозилтрансфераз.

Методом иммунофлуоресцентного окрашивания показана экспрессия FucGMl в ткани мелкоклеточного рака легких человека.

Впервые идентифицированы маркерные хромосомы родительской миеломы X63-Ag8.653, Изучен кариотип полученных гибридом. Обнаружена новая маркерная хромосома в гибридоме F-10. Показана связь сегрегации хромосом с изменением активности продукции МАТ гибридомными клетками.

Научно - практическая значимость.

Практическая ценность работы заключается в получении МАТ против FucGMl, которые являются инструментом для создания серологических и иммуноморфологических тест-систем для ранней диагностики и подтверждения диагноза мелкоклеточного рака легких, разработан метод идентификации гибридом, который может быть применен для их паспортизации.

Разработана иммуноферментная тест-система для определения FucGMl и антител к нему в сыворотке крови.

Создана модельная система клеточного иммуноферментного анализа для выявления ганглиозида FucGMl в мембране клеток.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на: Всесоюзном симпозиуме "Клеточные основы противоопухолевого иммунитета. Гибридомы", Москва 1985 ; конференции « Актуальные вопросы современной гистопатологии» Москва, 2004; Всесоюзный симпозиум по биохимии липидов, Алма-Ата, 1987; Всесоюзной научной конференции «Актуальные вопросы биотехнологии», Ленинград 1987; конференции « Актуальные вопросы современной гистопатологии», Москва, 1988; XVIIIth Meeting oflSOBM, Abstr., Moskow, 1990; Расширенном заседании Ученого совета НИИ МЧ РАМН, 2004 г.

Публикации

Основные положения диссертации изложены в 12 печатных работах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзор литературы (3 главы), материалы и методы (1 глава), результаты собственных исследований (2 главы), обсуждение полученных результатов, выводы и список литературы. Диссертация написана на русском языке, на 164 страницах машинописного текста и иллюстрирована 31 рисунком и 5 таблицами. Указатель литературы содержит 193 источника, из них 10 отечественных и 183 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе был использован операционный материал мелкоклеточного рака легких - от 14 пациентов, плоскоклеточного рака легких — 3, аденокарциномы легких - 2, рака молочной железы - 4, рака желудка - 3, рака печени - 2, непораженной ткани легких - от 14 пациентов, а также 86 образцов сыворотки крови, 14 из которых принадлежали больным мелкоклеточным раком легких. Для иммуноморфологического исследования использовали мозг и семенники свиней (не позже 2х часов после забоя) и мышей линии Ба1Ъ/е.

1.Культуральнь1е методы. Клетки несекретирующей миеломы и реклонированных гибридом культивировали на среде КРМГ-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (БС8). Все манипуляции с клетками проводили в стерильных условиях. Культивирование проводили в СО2-инкубаторе при 6 % СО2. 2. Получение гибридом.

Иммунизация. Мышей линии Ба1Ъ/с иммунизировали чистым препаратом РисОМ1, выделенным из мозга свиньи и сорбированного на убитых клетках 8а1топе11а тупето1а.Сорбцию ганглиозида проводили из расчета 1мкг 8Л на 100мкг клеток бактерий.

Гибридомы получали по модифицированному методу Келера и Мильшгейна(КоЫег et al. 1975г.).

Отбор положительных клонов проводили с помощью непрямого ИФА (Fazecas, 1980).

3. FucGMl я другие ганглнозвды. Ганглиозиды FucGMl, GM2, GM3, GDlb и нейтральный гликолипид GA1, использовавшиеся для тестирования антител в твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА), были выделены из мозга свиньи и быка в лаборатории нейрохимии Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова АН СССР и любезно предоставленные нам д.б.н. Н.Ф.Авровой. Содержание НейАц ганглиозидов в ткани опухолей и нормального легких определяли по реакции с резорцином.

4. Очистка моноклоиальных (МАТ) антител.

МАТ из асцитной жидкости осаждали добавлением 50 % насыщенного раствора сульфата аммония. После диализа антитела дочищали методом аффиннной хроматографии на колонке с октилсефарозой, на которой был иммобилизован FucGM 1.

5. Процедура иммуноферментного анализа (ИФА).

Использовали прямой, трех- и четырехслойный непрямой, ингибиционный, "сэндвич" и клеточный ИФА. Для ганглиозидов, белковых антигенов (в т.ч. и ИГ) и клеток использовали различные процедуры нанесения 1 слоя на плашки. Белковые антигены наносили инкубацией в карбонатном буфере. Ганглиозиды наносили, выпаривая из раствора в этаноле, обычно в смеси с дилауриллецитином и холестерином. Перитонеальные макрофаги мышей наносили на плашки для ИФА в стерильных условиях и использовали после прилипания и распластывания на дне лунок Для блокирования сайтов неспецифической сорбции использовали растворы BSA, желатина и овальбумина.

Антивидовые коныогаты против иммуноглобулинов получали ковалентным связыванием предварительно выделенных аффинных антител с пероксидазой хрена. Реакцию проявляли

раствором субстрата пероксидазы - Н2О2 добавлением в качестве хромогена орто-фенилендиамин (ОФД). Учет результатов проводили на плашечном фотометре при длине волны 492 нм.

Изотшшрование МАТ проводили методом 4-слойного непрямого твердофазного ИФА

6. Радиоиммунологическое выявление гликолипидного антигена на тонкослойных силикагельных пластинкам.

Выявление гликолипидного антигена в образцах тканей и сывороток крови, выделенного по методу, описанному ранее (Hakomoii 1980) на тонкослойных пластинках методом иммунорадиографии с использованием МАТ проводили на пластинках Kieselgel-60 с предварительно разогнанными на них ганглиозидами. На пластинку наносили МАТ против FucGMl, инкубировали и проявляли I 125 - меченными кроличьими AT против ИГ мыши. Реакцию визуализировали с помощью рентгеновской пленки.

7. Хромосомный анализ гибридом против FucGMl.

Для накопления метафаз к культуре клеток добавляли колцемид. Клетки фиксировали смесью метанола с уксусной кислотой.Затем готовили мазок и после обработки трипсином окрашивали красителем Гимза. (Шей и др. 1985) Подсчитывали хромосомы в 50 метафазных пластинах для каждой клеточной культуры.

8. Иммуноморфологические исследования.

Исследуемые ткани замораживали в жидком азоте не позднее 2-х часов после их получения от больных или животных. В дальнейшем образцы хранили при -70°С. Готовили 10-15 мкм серийные срезы и монтировали на стекле. На срезах проводили реакцию непрямой иммунофлуоресценции.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью компьютерной программы Sigma-plot. Version 3.10. Достоверными считали различия опыта и контроля при Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Первым этапом в создании гибридом против ганглиозида FucGMl являлось получение спленоцитов, производящих AT нужной специфичности. Для этого мышей линии BALB/C иммунизировали чистым препаратом FucGMl из расчета 13мкг на мышь, сорбированным на поверхности бактерий Salmonella minnesota в качестве адьюванта. Проводили 4 внутривенные иммунизации в течении 2-х недель. Спленоциты мышей с титром AT в сыворотке большим, чем на порядок по сравнению с контролем использовали для гибридизации. Когда колонии первичных гибридом достигали диаметра 1-2 мм, их скринировали на наличие продукции МАТ против FucGMl методом ИФА.

Всего было получено 800 первичных гибридом. Первый скрининг методом ИФА показал, что 20 из них (12,5%) производят МАТ, реагирующие с FucGMl. Были отобраны и в дальнейшем подробно охарактеризованы 4 клона, обозначенные нами как D5, F10, В4 и D12. Культуральную жидкость гибридом использовали для дальнейших исследований в качестве источника МАТ. Гибридомные клетки адаптировали к росту в мышах BALB/c в виде асцитной опухоли. Из полученной от этих мышей асцитной жидкости выделяли чистые антитела.

Тестирование МАТ на всех стадиях получения гибридом проводили методом ИФА в модификации Фукуши(Fucuhi et al.1966).

Наиболее стабильные результаты были получены при посадке в качестве I слоя не чистого ганглиозида, а смешанного с лецитином и холестерином. Этот способ был использован нами в качестве метода тестирования гибридом и исследования МАТ. Его высокая чувствительность, стабильность и низкие фоновые значения можно объяснить образованием лецитином и холестерином липидной пленки, которая заякоривает молекулу ганглиозида на поверхности плат за счет гидрофобной связи с церамидной частью молекулы. Гидрофильная углеводная

часть ганглиозида, на которой располагаются сайты связывания МАТ, выступает из липидного слоя аналогично тому, как это происходит в нативных клеточных мембранах.

Чувствительность ИФА с полученными МАТ составила 0,2 нг/мл, что указывает на их высокую аффинность.

Характеристика моиокловальвых аитивал против FucGMl .

Изотипирование МАТ проводили с использованием четырехслойного непрямого твердофазного ИФА. Все четыре моклональных антитела, продуцируемые исследованными клонами, принадлежали к классу IgG3.

Определение концентрации МАТ в супернатантах гибридом, неочищенных и полуочищенных асцитах проводили в помощью ингибиционного твердофазного ИФА. Их концентрация в культуральной жидкости составляла 14-100 мкг/мл, а в асцитах - 0,5-6 мкг/мл.

Специфичность МАТ по отношению к ганглиозиду FucGMl определяли в ИФА путем оценки связывания МАТ с набором стандартных ганглиозидов методом ИФА и методом авторадиографии (Fuchs et al .1988) с экстрактом гликолшшдов, выделенных из ткани мелкоклеточного рака легких человека и мозга свиньи. Проведены также опыты по ингибированию МАТ ганглиозидом FucGMl. Результаты типичного опыта по определению специфичности клонов В4, DS, D12 и F10 приведены на рис.1. Все четыре исследованных клона реагировали только с FucGMl и не давали перекрестной реакции с сиалосодержащими ганглиозидами GM1, GM2, GM, GDla, GD1B, GD3,GT1B, а также с асиало-GM 1 и цереброзидом.

Полученные данные и, в особенности, отсутствие перекрестной реакции с GM1, отличающимся от FucGMl на один терминальный фукозильный остаток, свидетельствуют о высокой специфичности полученных МАТ. Кроме того, подтверждается определяющее значение терминальной фукозы ганглиозида, как части антигенной детерминанты, взаимодействующей с антигенсвязывающим центром МАТ. Исследование связывания МАТ со

смесью ганглиозидов методом радиоавтографии также показало отсутствие перекрестной реакции с другими ганглиозидами. Этим методом было подтверждено отсутствие реакции исследованных МАТ с ганглиозидами GM1.GM2, GM3, GDlb, GTlb, GDla, GQlb, а также с фукозилсодержишим ганглиозидом Fuc-Lm-1, имеющим в своем составе лактозилтетраозильную углеводную последовательность. Этот ганглиозид практически отсутствовал в нормальном легком, но был обнаружен в небольших количествах в мелкоклеточных карциномах (Fuchs et al.1988).

Совокупность результатов ИФА, радиоиммуннодетекпии на тонкослойных пластинках и данных по ингибированию связывания МАТ АГ свидетельствует о высокой специфичности полученных МАТ.

Хромосомный анализ гибридом. Резко возросшее количество стабильных гибридных линий соматических клеток ставит проблему их идентификации. В связи с этим проводили кариологическое изучение трех перевиваемых линий гибридных клеток и сравнение их с родительской линией миеломных клеток при помоши G-метода окраски хромосом. Типичные метафазные пластинки для исследованных линий приведены на рис.2. В ходе исследования хромосомных наборов мышиной миеломы X-63-Ag8.653 мы обнаружили редукцию значительной части хромосом с 58 до 40 (т.е. на 16% по сравнению с ее первым описанием )

Анализ кариотипов трех гибридом В4, D5, F10 проводили на 50 метафазных пластинках каждой гибридомы. Теоретически число хромосом в гибридомах должно было бы равняться суммарному количеству хромосом родителей, т.е. 88. Однако в результате сегрегации части хромосом гибриды приобрели специфические генотипы, отличные от обеих родительских линий. Данные о распределении клеток изученных линий по количеству хромосом представлены в виде гистограмм на рис.4. Эти данные свидетельствуют о неоднородности популяций клеток внутри каждой линии. Вариабельность числа хромосом в клетках гибридом

Рис. 1 Характеристика субстратной специфичности МКА против ганглиозида FucGMl методом твердофазного ИФА

По оси абсцисс - набор стандартных ганглиозидов в смеси с лецитином и холестерином (60:100:60 щ на лунку); контроль - смесь лецитина и холестерина без ганглиозида.

12

значительно выше, чем в клетках родительской линии. Распределение клеток по числу хромосом существенно отличается от нормального, на гистограммах выделяются несколько пиков.

В линии Р10 на гистограмме наблюдаются два пика. Используя критерий х2 мы провели анализ соответствия распределения клеток по числу хромосом закону нормального распределения. Таким образом, для линии Р10 нами было выделено две субпопуляции. Модальное число хромосом для первой из них лежит в интервале 62-63 хромосомы, для второй - 68 хромосом (рис.4б). Различия между двумя субпопуляциями гибридомы Р10 достоверны по ^критерию Стьюдента и Б-критерию. На гистограмме распределения клеток по числу хромосом, построенной для гибридомы В4, четко выделяются три пика. Анализируя данную гистограмму аналогично гистограмме для Б10, мы установили наличие трех субпопуляций с модальными числами 76-77, 80 и 85 хромосом, соответственно. Распределение клеток по числу хромосом внутри каждой субпопуляции соответствует закону нормального распределения ( рис.4в). Различия между субпопуляциями статистически достоверны. Анализ данных, полученных для гибридомы Б5, позволяет выделить две субпопуляции с модальными числами 80 и 85 хромосом, соответственно. Распределение клеток по числу хромосом внутри субпопуляций также подчиняется закону нормального распределения (рис.4г). Различия между субпопуляциями статистически достоверны.

Были обнаружены не свойственные для кариотипа мыши метацентрики, телоцентрики и микроцентрики в хромосомных наборах клеток миеломы и гибридомы. Их схематическое изображение приведено на рис.2.

Используя их в качестве маркерных хромосом после О-окрашивания исследовали частоты встречаемости этих маркеров в миеломе X63-Ag 8.653 и гибридомах Б10, В4 и Б5 (рис.3). В результате исследования распределения клеток по числу хромосом у гибридом было отмечено следующее:

метафазная пластинка гибридомы d5(О-окраска) x15 0 0

Метафазная пластинка гибридомы f10 ( G-окраска) х1500

Метафазная пластинка гибридомы в4 ( О-окраска) х1500

Схематическое изображение маркерных хромосом миеломы X63-Ag8.653 и гибридом Р10,В4,Б5

Рис. 2 Метафазные пластинки гибридом против ганглиозида FucGMl

рис. 3 Частота встречаемости маркерных хромосом в миеломе Х63-ЛС8.653 и гибридомах

Клеточные лижи

Маркерные хромосомы

рис. 4 Гистограмма распределения клеток по числу хромосом.

иелома x68-Лg8 б-гибридома ПО в- гибридома В4 г-гибридома Б5

1. Среднее количество хромосом в гибридомных клетках меньше теоретически ожидаемого.

2. Так как популяции гибридом Б10 и Б5 статистически достоверно разбиваются на две субпопуляции, а гибридомы В4 - на три, можно предположить более выраженную стабилизацию хромосомных наборов гибридом Б10 и Б5. Это предположение хорошо согласуется с данными о большей стабильности продукции моноклональных антител гибридомами ЫР10.

3. Исходя из приведенных гистограмм (рис.4) следует, что нельзя определить модальное число хромосом для гибридомы, так как ее клетки не принадлежат к одной генеральной совокупности. Возможно лишь определение модального числа хромосом внутри каждой субпопуляции.

Гистограммы распределения клеток по числу хромосом достаточно индивидуальны как для родительской ЛИНИИ, так и для гибридом. Анализ препаратов метафазных пластинок клеток миеломы Х-63-Л§8653, окрашенных для выявления О-полос, выявил четыре маркерные хромосомы.

При исследовании препаратов метафазных пластинок гибридом В4, Б5 и Б10 после О-окрашивания мы обнаружили три маркерные хромосомы: А,В,М с разной частотой встречаемости (рис.3). Хромосома С не встречалась ни в одном клоне. Таким образом, можно легко отличить все три гибридомы от родительской миеломы X63-Ag8.653 по наличию или отсутствию у нее маркерной хромосомы Т и присутствию маркерной хромосомы М.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что сочетание исследования количественного распределения хромосом в субпопуляциях миеломных и гибридомных клеток и анализа их маркерных хромосом дает возможность идентифицировать как родительские миеломы, так и гибридомы.

Анализ ганглиозидного состава опухолей легких.

Верифицированный операционный материал был любезно предоставлен д.м.н. А.Х.Трахтенбергом, зав. отделением НИИ Онкологии им. Герцена.

Исследован ганглиозидный состав ткани мелкоклеточного рака легких человека от 7 пациентов. Определяли как химический состав смеси ганглиозидов, выделенных из этих опухолей, так и их взаимодействие с МАТ к БисОМ1. Суммарное содержание ганглиозидов в ткани МРЛ (350+30 нмолей/г веса ткани) оказалось примерно в 3 раза более высоким, чем в ткани нормального легких (115,5+5 нмолей/г веса ткани). Содержание ганглиозидов в двух исследованных случаях аденокарциномы легких (220+30 нмолей/г веса ткани) было выше, чем в нормальном легком, но ниже, чем в обследованных случаях мелкоклеточного рака ( рис.5)

Во всех 7 изученных нами случаях мелкоклеточного рака легких наличие БисОМ1 было установлено методом иммунодетекции на тонкослойных пластинках.

Разработка клеточного ИФА с МАТ против ганглиозида FucGMl. В связи с большой вероятностью экранирования углеводной части мембранного ганглиозида углеводными цепями гликопротеинов гликокаликса была разработана модельная система для выяснения принципиальной возможности связывания антител с БисОМ1, интегрированным в клеточную мембран)'. Модельная система представляла из себя монослой перитонеальных макрофагов мыши линии Ва1Ь/с, которые обрабатывали ганглиозидом БисОМ1 для интеграции его в мембрану. Трехчасовая инкубация раствора, содержащего 60 нт/мл ганглиозида приводила к встраиванию его в мембраны макрофагов, что подтверждалось дальнейшей окраской модифицированной культуры с помощью МАТ против БисОМ1 методом ИФА. Для исключения неспецифической реакции на эндогенную пероксидазу перед внесением коныоганта лунки обрабатывали 3% перекисью водорода (рис. 7). Из рисунка видно, что БисОМ1 сорбируется на клетках не хуже, чем на полистироле и экспрессирован таким образом, что доступен для моноклональных антител. Успех модельных опытов дал нам возможность

Рис. 5 Содержание ганглиозидов в опухолях и нормальной ткани легких человека ( нМ на 1 гр сырой ткани)

I. Радиоимуннограммы двух препаратов ганглиозидов, выделенных из опухолей пациентов с МРЛ. П. Хроматограмма стандартной смеси ганглиозидов.

Рис. 6 Радиоиммунологическое выявление ганглиозида FucGMl, выделенного из ткани мелкоклеточного рака легких, с помощью моноклональных антител

Рис.7 Клеточный ИФА на макрофагах со встроенным в мембрану FucGMl с помощью МАТ против этого ганглиозида.

Светлые столбики - опыт ( макрофаги обработаны РиеОМ1).

Темные столбики - контроль (макрофаги не обработаны РиеОМ1).

1 - лунки не обработаны перекисью водорода

2 - лунки обработаны перекисью водорода

3 - лунки без макрофагов, обработаны РиеОМ1.

20

Рак печени Рак желудка Рак молочной железы Плоскоклеточный рак легких Аденокарцинома легких Мелкоклеточный рак легких 1 Непораженная ткань легких

Рис. 8 Иммунофлуоресцентное окрашивание криостатных срезов тканей онкологических больных. Препараты окрашены с использованием МАТ

Б10 против ганглиозида БисОМ1 По оси абсцисс - количество пациентов

ИНеслецифическое свечение

■Отрицательная реакция ■Положительная реакция

перейти к попыткам иммуноокрашивания опухолей и других тканей с помощью полученных антител.

Иммунофлуоресцентное исследование опухолей и других FucGMl содержащих тканей.

Иммунофлуоресцентные исследования проводили на криостатных срезах. Образцы тканей замораживали в жидком азоте не позднее 2-х часов после операции по удалению опухоли у онкологических больных или забоя у животных (для тканей свиньи и мыши). С помощью полученных нами МАТ удалось окрасить ткань мозга и семенника свиньи, животного, послужившего источником для получения ганглиозида (позитивный контроль). Негативным контролем послужили аналогичные ткани мыши, в которой FucGMl отсутствовал. Было отмечено специфическое свечение клеток Сертоли в семенниках свиньи при окраске МКА и неспецифическое свечение интерстициальной ткани в обоих препаратах.

В ткани мозга свиньи отмечено интенсивное диффузное свечение в отличие от контроля. С помощью MAT F10 методом ИФЛА были окрашены препараты мелкоклеточною рака легких (7 случаев), опухали другой локализации (7 случаев) и 7 препаратов непораженных участков легких от пациентов с МРЛ. Результаты исследования предоставлены на рис.8. 78,6% препаратов мелкоклеточного рака легких дали специфическую реакцию.

На большинстве препаратов видна четкая граница пораженного (окрашенный) и непораженного (темное поле с неспецифически светящимися волокнами) участков легких, В двух исследованных препаратах виден типичный для мелкоклегочного рака легких перибронхиальный рост опухоли..

Радиоиммунохроматографическое исследование наличия FucGMl в сыворотке больных МРЛ.

Было проведено исследование хлороформ-этанольных экстрактов сывороток 13 больных МРЛ с помощью МАТ В4 методом тонкослойной иммунорадиографии. В 7 случаях была получена четко позитивная реакция, в 1 - реакция была нечеткой и в 6 - четко отрицательной.

Таким образом, данный метод показал наличие БисОМ1 в сыворотке примерно 50% больных МРЛ. Ни в одной сыворотке доноров и больных другими онкологическими заболеваниями БисОМ1 обнаружен не был. Таким образом, впервые показан шеддинг ( слущивание ) БисОМ1 из мембран опухолевых клеток в сыворотку крови, что является важным фактом, позволяющим проводить работы по обнаружению этого ганглиозида с целью ранней диагностики МРЛ.

Выводы.

1. С помощью оригинальных методов гибридомной биотехнологии созданы гибридомы, продуцирующие моноклинальные антитела против гликолипидного антигена мелкоклеточного рака легких человека - ганглиозида Рис0М1.

2. В результате кариотипирования клеток миеломы линии P3X63.Ag8.653 и клеток гибридом впервые описаны маркерные хромосомы, позволяющие идентифицировать и паспортизировать гибридомные клоны.

3. Методами твердофазного иммуноферментного анализа и иммуноавторадиографии на тонкослойных пластинах продемонстрирована высокая специфичность моноклональных антител, реагирующих с Рис0М1 и не дающих перекрестной реакции с широкой панелью ганглиозидов, в т.ч. с ганглиозидом 0М1 -универсальным компонентом мембраны клеток млекопитающих. Моноклональные антитела охарактеризованы по аффинности и классовой принадлежности (^03).

4. Сочетанием методов тонкослойной хроматографии и иммуноавторадиографии показано присутствие антигена Рис0М1 в экстрактах ткани мелкоклеточного рака легких во всех исследованных случаях и его отсутствие в тканях нормальных легких и аденокарциномы легких.

5. В сыворотке крови больных мелкоклеточным раком легких присутствует ганглиозид Рис0М 1.

6. Иммунофлуоресцентное окрашивание криостатных срезов образцов мелкоклеточного рака легких продемонстрировало экспрессию ганглиозида Рис0М1 в 85% иследований. Данный антиген не выявлен в тканях нормальных легких, аденокарциноме легких и опухолях другой локализации.

7. Показана возможность выявления экспрессии ганглиозида Рис0М1 интегрированного в клеточную мембрану с помощью разработанной модельной системы.

8. Высокоспецифичекие моноклональные антитела против ганглиозида Рис0М1 могут быть использованы для разработки тест-систем в диагностике мелкоклеточного рака легких и создании иммунотоксических препаратов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Фукс Б.Б., Стерлина АХ., Зарайский Е.И. Степанов А.А. Сравнительный анализ действия тимусного и мозгового ганглиозидов на чувствительность опухолевых клеток к естественным селезеночным эффекторам. //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.Москва,1985.-№4.- С. 474-476.

2. Аврова Н.Ф., Болтовская М. Н., Дурманов Н.Д., Зарайский Б.И. Получение и характеристика моноклональных антител к ганглиозиду клеточной поверхиости.//Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума "Клеточные основы противоопухолевого иммунитета. Гибридомы"- 1985.-С.14-16.

3. Фукс Б.Б., Аврова Н.Ф., Ванько Л.В., Зарайский Е.И., Старосветская Н.А., Болтовская М.Н. и др. Получение и исследование моноклональных антител против некоторых ганглиозидов.//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.- 1986.-№1.- С.66-68.

4. Фукс Б.Б., Аврова Н.Ф., Старосветская Н.А., Болтовская М.Н., Зарайский Е.И. .Карпова О.Б., Солдатова Л.Н., Степанов А.А. Исследование ганглиозида Бис ОМ1 в мелкоклеточном раке легкого человека с помощью моноклональных антител.// Биотехнология, Москва, 1987.- N6.- Т.З.- С. 743-755.

5. Зарайский Е.И.,Старосветская Н.А., Аврова Н.Ф., Болтовская М.Н., Солдатова Л.Н., Карпова О.Б., Степанов А.А., Фукс Б.Б. Новое перспективное направление в диагностике мелкоклеточных неоплазм легкого человека: получение и исследование моноклональных антител против ганглиозида БисОМ1.// Актуальные вопросы биотехнологии, материалы Всесоюзной научной конференции (14-16 января 1987г., Ленинград), Москва, 1987.- С. 117-119

6. Зарайский Е.И., Аврова Н.Ф., Карпова О.Б., Фукс Б.Б. Детекция антигенов гликолипидной природы с помощью моноклональных антител.// Всесоюзный симпозиум по биохимии липидов, Алма-Ата, 1987.- С. 104.

7. Болтовская М.Н., Резникова Е.В., Резников М.В., Старосветская Н.А. Применение хромосомного анализа для исследования идентификации и стабильности гибридом.//Биотехнология.-1987, Т.З, N 6.- С. 784-788.

8. Зарайский Е.И.,Старосветская НА, Болтовская М.Н., Солдатова Л.Н., Степанов А.А. О новых биотехнологических подходах к созданию, скринингу и выделению моноклональных антител против глихолилидного антигена мелкоклеточного рака легких человека.// Актуальные вопросы современной гистопатологии. (Сб. научных трудов),.Москва, 1988.- С. 39

9. Фукс Б.Б., Старосветская Н.А., Болтовская М.Н., Зарайский Е.И, и др. Штамм гибридных культивированных клеток Mus musculus, используемые для получения моноклональных антител к ганглиозиду FucGMl, автора заявки на патент №4934401/13 (038786) 6.05.1991 Получено решение о выдаче патента

10. Е.И.Зарайский. Получение и перспективы использования моноклональных антител к маркерному антигену мелкоклеточного рака легкого-ганглиозида FucGMiy/НИИ Морфологии человека РАМН, «Актуальные вопросы современной гистопатологии», Москва. 2004.

11. Fuchs B.B., Avrova N.F., Starosvetskaya N.A., Boltovskaya M.N., Karpova O.B., Zaraisky E.I. Reznikova E.V., Soldatova L.N., Stepanov A.A., Biochemical and immnnochemical Analysis ofHuman Small Cell Lung: Production of Monoclonal Antibodies against a Unigue Marker of Small Cell Lung Carcinoma, Ganglioside Fuc GM1.// Biotechnology and applied biochemistry.-1988.- N10.- P. 273-286.

12. Avrova N.F., Karpova O.B.,Zaraisky E.I. Stepanov A.A. New method for immunoenzyme detection of ganglioside Fuc GM - the marker of small cell lung carcinoma - in blood serum.// Abstr. XVIIIth Meeting ofISOBM, Abstr., Moskow, September, 1990.-P. 91.

Список сокращений.

МАТ - моноклональные антитела.

МРЛ - мелкоклеточный рак легких.

ИФА - иммуноферментный анализ.

ИГ- иммуноглобулин.

АГ-антиген.

AT- антитела.

ОФД - ортофенилендиамин.

- бычин сывороточный альбумин. IgG - иммуноглобулины класса G. ИФЛА - иммунофлуоресцентный анализ.

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 18.10.04 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,56 Печать авторефератов (095) 730-47-74,778-45-60

»19645

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зарайский, Евгений Ильич

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Гликолипиды и гликоконъюгаты как маркеры опухолей человека. Ганглиозид ГисСМ 1.

Глава 2. Роль ганглиозидов в межклеточных взаимодействиях.

2 .1. Гликосинапс первого типа.

2.2 Гликосинапс второго типа.

2.3 Гликосинапс третьего типа

Глава 3. Моноклональные антитела для диагностики опухолей

3.1. Опухолеассоциированные антигены в сыворотке.

3.2. Локализация опухолей и метастазов.

3.3 Патогистологическая диагностика опухолей

3.4. Иммунотерапия опухолей

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Глава 4.

4.1. Культивирование клеток.

4.2. Среды и реактивы.

4.2.2.Антигены и моноспецифические антитела к ним.

4.2.2.1. ГисСМ-1 и другие ганглиозиды.

4.2.2.2. Очистка моноклональных антител.

4.3. Процедура иммуноферментного анализа (ИФА).

4.3.1. Непрямой ИФА.

4.3.2. Процедура прямого ИФА.

4.3.3. Процедура "сэндвич" ИФА.

4.4. Определение константы связывания МАТ.

4.5. Изотипирование МАТ.

4.6. Получение гибридом

4.7. Радиоиммунологическое выявление гликолипидного антигена на тонкослойных пластинах

4.8. Хромосомный анализ гибридом против FucGM 1.

4.8.1. Использованные клеточные линии.

4.8.2. Культивирование клеток.

4.8.3. Сбор клеток и приготовление хромосомных препаратов

4.8.4. Окраска хромосомных препаратов.

4.9. Иммуноморфологические исследования.

4.10. Статистическая обработка результатов

IV. Результаты собственных исследований.

Глава 5. Получение и исследование МАТ против ганглиозида FucGMl.

5.1. Тестирование иммунного ответа мышей.

5.2. Получение гибридом.

5.3.Тестирование моноклональных антител методом ИФА.

5.4. Характеристика моноклональных антител.

5.4.1. Изотипирование МАТ.

5.4.2. Измерение концентрации МАТ.

5.4.3. Определение специфичности МАТ против FucGM

5.5. Хромосомный анализ гибридом.

Глава б. Выявление ГисСМ-1 в сыворотке крови и тканях онкологических больных.

6.1. Выявление ГисСМ-1 в опухолях легкого.

6.1.1. Анализ ганглиозидного состава опухолей легкого.

6.1.2. Иммунофлуоресцентное исследование опухолей и других ГисСМ-1 содержащих тканей.

6.2. Исследование ГисСМ1 в сыворотке больных раком легкого.

6.2.1. Радиоиммунохроматографический анализ ЕисСМ-1 в сыворотке больных мелкоклеточным раком легких.

6.2.2. Фукозилтрансферазная активность сывороток больных мелкоклеточным раком легких.

6.3. Разработка клеточного ИФА с МАТ против ганглиозида ГисСМ-1.

6.3.1. Антилипидные и анти-ГисСМ-1 антитела в сыворотке больных мелкоклеточным раком легкого.

V. ОБСУЖДЕНИЕ.

VI. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспрессия маркерного антигена мелкоклеточного рака легких - ганглиозида FucGM1: иммуноморфологическое и иммунохимическое исследование с помощью моноклональных антител"

Актуальность темы.

В последние годы пристальное внимание исследователей, занимающихся молекулярной диагностикой и терапией различных патологических процессов, привлекает обширный класс химических соединений - гликоконьюгатов. Эти соединения объединяет то, что их молекулы состоят из двух компонентов - углеводного и неуглеводного.

Интерес к этим веществам вызван тем, что показано их присутствие в качестве специфических антигенов в тканях и биологических жидкостях организма животных и челозека при ряде заболеваний, в т.ч. онкологических (16), соматических (103). Успешные работы по созданию диагностических систем на основе моноспецифических (11,12,13,36) и моноклональных (12 6,127,181) антител к гликоконьюгатам и использованию таких антител в клинической практике (26) показали перспективность этого направления исследований.

Наше внимание привлек гликоконьюгат с мало исследованными свойствами - ганглиозид Fuc GM1, обнаруженный в ткани мелкоклеточного рака легкого (118).

Мы предположили, что создание моноклональных антител к этому антигену поможет изучить его свойства и даст возможность исследовать наличие ганглиозида FucGMl и антител к нему в тканях и биологических жидкостях больных мелкоклеточным раком легкого.

Цель и задачи исследований.

Целью исследования являлось кммукохроматографичесхое и иммунохимическое изучение экспрессии маркерного антигена мелкоклеточного рака легких путем получения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к ганглиозиду Е\1сСМ1, изучение свойств этих гибридом и продуцируемых ими антител. В связи с этим были определены задачи исследования:

1.Получение гибридом, продуцирующих МАТ к ганглиозиду

ЕисОУИ.

2. Цитогенетическая характеристика гибридом и определение свойств моноклональных антител .

3. Разработка на основе полученных моноклональных антител тест-систем для иммунодетекции ганглиозида ГисСМ1 в тканях и биологических жидкостях. Оценка перспективы их применения в клинико-лабораторных исследованиях.

Научная новизна работы.

Впервые получены МАТ к ганглиозиду ГисСМ1. С их помощью показано наличие ГисСМ1 в сыворотке крови больных мелкоклеточным раком легкого.

Впервые показано наличие антител против Е'исСМ1 в сыворотке крови онкологических больных.

Разработана ИФА тест-система для определения АТ к ЕисСМ1 в сыворотке крови.

Разработана модельная система клеточного ИФА для выявления ганглиозидов и, в частности, ГисСМ!.

Разработан метод иммунофлуоресцентного окрашивания тканей для выявления ГисСМ1. Показана экспрессия ГисСМ1 в ткани мелкоклеточного рака легкого человека.

Изучен хромосомный состав полученных гибридом. Показана связь сегрегации хромосом с изменением активности продукции моноклональных антител.

Теоретическая и практическая ценность проведенного исследования.

Принципиальное значение имеет обнаруженный факт наличия ганглиозида ЕисСМ1 в сыворотке крови больных мелкоклеточным раком легкого. Теоретическая ценность этого наблюдения состоит в том, что до сих пор неизвестны специфические маркеры мелкоклеточного рака легкого в сыворотке крови.

Новым фактом является обнаружение антител к антигенам, содержащим терминальную фукозу, в сыворотке крови 8 5 обследованных онкологических пациентов. Это указывает на связь злокачественной трансформации с аномальным фукозилированием, что в свою очередь может быть обусловлено изменением активности (возможно связанной с мутациями) специфических фукозилтрансфераз.

Практическая ценность работы заключается в получении МАТ против ЕисСМ1, которые могут служить инструментом для создания серологических и иммуноморфологических диагностикумоз для выявления мелкоклеточного рака легкого. Разработанный метод идентификации гибридом может быть применен для их паспортизации.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на: Всесоюзном симпозиуме "Клеточные основы противоопухолевого иммунитета. Гибридомы", Москва 1985 ; конференции « Актуальные вопросы современной гистопатологии» Москва, 2004; Всесоюзный симпозиум по биохимии липидов, Алма-Ата, 1987; Всесоюзной научной конференции «Актуальные вопросы биотехнологии», Ленинград 1987; конференции « Актуальные вопросы современной гистопатологии», Москва, 1988; XVIIIth Meeting of ISOBM, Abstr., Moskow, 1990;

Расширенном заседании Ученого совета НИИ МЧ РАМН, 2004 г.

Публикации.

Основные положения диссертации изложены в 12 печатных работах.

Структура диссертации.

Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы (3 главы), материал и методы (1 глава), результаты собственных исследований (2 главы), обсуждение полученных результатов, выводы и список литературы. Диссертация написана на русском языке, на 156 страницах машинописного текста и иллюстрирована 31 рисунком и 5 таблицами. Указатель литературы содержит 190 источников, из них 10 отечественных и 180 иностранных.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Зарайский, Евгений Ильич

Выводы.

1. С помощью оригинальных методов гибридомной биотехнологии созданы гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела против гликолипидного антигена мелкоклеточного рака легких человека - ганглиозида ГисСМ1.

2. В результате кариотипирования клеток миеломы линии РЗХбЗ.Ад8.653 и клеток гибридом впервые описаны маркерные хромосомы, позволяющие идентифицировать и паспортизировать гибридомные клоны.

3. Методами твердофазного иммуноферментного анализа и иммуноавторадиографии на тонкослойных пластинах продемонстрирована высокая специфичность моноклональных антител, реагирующих с ЕисСМ1 и не дающих перекрестной реакции с широкой панелью ганглиозидов, в т.ч. с ганглиозидом СМ1 - универсальным компонентом мембраны клеток млекопитающих. Моноклональные антитела охарактеризованы по аффинности и классовой принадлежности (1дСЗ).

4. Сочетанием методов тонкослойной хроматографии и иммуноавторадиографии показано присутствие антигена ГисСМ1 в экстрактах ткани мелкоклеточного рака легких во всех исследованных случаях и его отсутствие в тканях нормальных легких и аденокарциномы легких.

5. В сыворотке крови больных мелкоклеточным раком легких присутствует ганглиозид ГисСМ1.

6. Иммунофлуоресцентное окрашивание криостатных срезов образцов мелкоклеточного рака легких продемонстрировало экспрессию ганглиозида ГисСМ1 в 85% иследований. Данный антиген не выявлен в тканях нормальных легких, аденокарциноме легких и опухолях другой локализации.

7. Показана возможность выявления экспрессии ганглиозида ЕисСМ1 интегрированного в клеточную мембрану с помощью разработанной модельной системы.

8. Высокоспецифичекие моноклональные антитела против ганглиозида ЕисСМ1 могут быть использованы для разработки тест-систем в диагностике мелкоклеточного рака легких и создании иммунотоксических препаратов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зарайский, Евгений Ильич, Москва

1. Аврова Н. Ф. Структура и функции ганглиозидов. //Нейрохимия.-198 9.-Т.8.-№ 3.-С.433-451.

2. Гусева М.Р. Изменения органа зрения у детей при общих заболеваниях КОФ.-2001.-Т.2.- № 4.-С.14-24.

3. Дятловицкая Э. В. Ганглиозиды и антитела к ганглиозидам сыворотки крови.//Биохимия-1992.-Т.57.~ № 7.-С.1004-1010.

4. Дятловицкая Э. В. Ганглиозидный "шеддинг" опухолевых клеток.//ДАН.-198 3.-Т.271.-№ 6.-С.1511-1513.

5. Дятловицкая Э. В., Текиева Е. А., Леменовская А. Ф., Сомова О. Г., Бергельсон Л. Д. Ганглиозиды GM3 и GD3 в опухолях желудка и молочной железы человека.//Биохимия.-1995.-№ 3.-С.560-564.

6. Ерышев О.Ф., Аркадьев В.В. Современные тенденции фармакотерапии больных алкогольной зависимостью.//Журнал « Психиатрия и психофармакотерапия».-2003.-Т.05.-№ 4.-С.7-9.

7. Фукс Б.Б., Аврова Н.Ф., Ванько Л.В., Зарайский Е.И.,. и др.Получение и исследование моноклональных антител против некоторых ганглиозидов.//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-1986.-№1.-С.66-68.

8. Abbadi М El, Seyfried Т N, Yates A J, Orosz С and Lee МС. Ganglioside composition and histology of a spontaneous metastatic brain tumour in the VM mouse. //British Journal of Cancer.-2001.-V.85-P.285-292.

9. Acquotti D. fie Sonnino S. Use of nuclear magnetic resonance spectroscopy in evaluation of ganglioside structure, conformation and dynamics.//Method Enzyology.-2000.-V.312.-P.247-272.

10. Bassi Rosaria, Viani Paola, Tettamanti Guido, Riboni Laura.Effect of GM3 ganglioside on endothelin-mediated signal transduction in C6 glioma cells; Joint Symposia I.B.C.S.Y.// Biochemical S.-2000.-P.101-104 .

11. Bast R.C. Editorial:Progress in radioimmunotherapy. //New Engl.J.Med.-1993.-P.1266.

12. Bast R.C., De Fabritiis, Lipton J. . Elimination of malignant clonogenic cells from human bone marrow using multiple monoclonal antibodies and complement// Cancer Res.-1985.-V.45.-P.499-503.

13. Bast R.C., Feeney M., Lazarus H. . Reactivity of a monoclonal antibody with human ovarian carcinoma. //J. Clin. Invest.-198l.-V.68.-№5.-P.1331-1337.

14. Bernardi A., Arosio D. and Sonnino S. Mimicking gangliosides by design: mimics of GM1 headgroup. //Neurochem.-2002.-V.27.-P.539-545.

15. Bernardi A., Carrettoni L., Grosso Ciponte A., Monti D. and Sonnino S. Second generation mimics of ganglioside GM1 as artificial receptors for cholera toxin: replacement of the sialic acid moiety.//Bioorg.-2000.-Med. Chem. Letters.-V.10.-P.2197-2200.

16. Brocca P., Bernardi A., Raimondi,L. and Sonnino,S. Modeling Ganglioside Headgroups by Conformational Analysis and Molecular Dynamics.//Glycoconjugate J.-2000.-V.17.-P.289-299.

17. Brockhaus M., Magnani J.C., Blaszczyk M., Stepkevski Z., Koprowski H., Karlsson K.A., Larsson G., Ginsburg V. Monoclonal antibodies directed against the human Le blood group antigen.//Biol. Chem.-V.256.-P.12223-13225.

18. Brockhausen I., Lehotay M., Yang J.-M. et.al. Glycoprotein biosynthesis in porcine aortic endothelial cells and changes in the apoptotic cell population. //Glycobiology.-2002.-V.12(1).-P.33-45.

19. Carey D. Cancer Therapy Despite Therapeutic Benefit -Physicians and patients alike are the accumulation of certain fats (gangliosides) in the brain and othertishue.//Cancer. -2004.-3(30).-P.125-136.

20. Chen X.-P.,Enioutina E.Y. and Daynis R.A. The control of IL-4 gene expression in activated murine T lymphocytes: a novel rol for neu-1 sialidase.// J. Immunol.-1997.-V.158.-P.3070-3080.

21. Cheresh D.A., Honsir C. J., Statfileno L.K et.al. Disialoganglioside G03 on human melanoma serves as a relevant targets antigen for monoclonal antibody-mediated tumor cytolys is.//PNAS USA.-1985.- V.82.-P.5155-5159.

22. Chia D., Terasari P.I., Suyama N. et.al.Use of monoclonal antibodies to sialylated Le and sialylated Le for serological tests of cancer.//Cancer Res.-1985.-V.45.-P.435-437.

23. Chigorno, V., Palestini,P., Sciannamblo,M.T et.al. Evidence that ganglioside domains are distinct from and caveolae in MDCK and human fibroblast cells in culture. //Eur. J. Biochem.- 2000.-V.267.-P.4187-4197.

24. Coombes R.Ch., Buckeman R., Ferrester J.A. et.al//. In vitro and in vivo effects of a monoclonal antibody-toxin conjugate for use in autologous bone marrow transplantation for patients with breast cancer. //Cancer Res.-1986.- V.46.-P.4217-4220.

25. Delvillano B, Zuzawski W. The carboghydrat antigenic determinant 19-9 (CA 19-9):a monoclonal antibody defined tumor marker.//Immunodiagnostika.-1983.-P.269-282.

26. Dettke M., P&aacute G.;lfi, and Loibner H. Activation-dependent expression of the blood grouprelated Lewis Y antigen on peripheral blood granulocytes J. Leukoc.//Biol.-2000.-V.68.-№4.-P.511-514.

27. Dippold W.G., Dienes H.P., Knuth A. Immunohistochemical localization of ganglioside GD3 in human malignant melanoma, epithelial tumors, and normal tissues. //Cancer Res.-1985.-V.45.-P.3699-3705.

28. Dippold W.G., Knuth A, Buschenfeide K. Ynhibition of Human melanoma Cell Growth in vitro by monoclonal anti-GD3-ganglioside antibody.//Cancer Research.- 1984.-V.44.-P.806-810.

29. Dohi-T, Hashiguchi-M. Fucosyltransferase producing sialyl Le(a) and sialyl Le(x) carbohydrate antigen in gastrointestinal cancer.//Nippon-Rinsho.-1995.-V.53.-№7.-P.1781-1785.

30. Douillard J.Y., Lehur P.A., Aillet G. Immunohistochemical antigenic expression and in vivo tumor uptake of monoclonal antibodies with specificity for tumors of the gastrointestinal tract. //Cancer Res.-1986.-V.46.-P.4221-4224.

31. Drivsholm L. Vangsted A. PallesenT. Fucosyl-GMl in small-cell lung cancer. A comparison with the tumour marker neuron-specific enolase. //Ann-Oncol.-1994.-V.5.-№7.-P.623-626.

32. Engval E., Porlman P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), quantitative assay for immunoglobulin G.//Immunochem.-1971.-V.8.-P.871-874.

33. Epenetos A.A., Kosmas C. Monoclonal antibodies for imaging and theray. //Brit.I.Cancer.-198 9.-V.59.-№2.-P.152-155.

34. Fazecas de St. Groth, S., Scheidegger D. Production of monoclonal antibody. Strategy and tactics. //Immunol. Meth.-1980.-V.35.-P.1-21.

35. Feld K., Gerrit D., Sacman N. Prognostic factors for small cell carcinoma of the lung. Evr. J. Clin. //Oncol.- 1988.-V.42.-P.353-355.

36. Fredman P., Brezicka THolmgrenJ. Binding specificity of monoclonal antibodies to ganglioside,FucGMl.//Biochimica et Biophysica acta.-1986.-V.875.-P.316-323.

37. Fucushi V, Hakomori S, Nudelman E, Cochran N.

38. Novel fucolipids accumulating in human adenocarcinoma. 11

39. Selective isolation of hibridoma antibodies thatdifferentially recognize mono, di and tri fucosylated type2 chain. J.//Biol. Chem.-1984.-V.259.-№7.-P.4681-4685.

40. Fukushi J., Nudelman E., Levery S.B. Novel fucolipids accumulating in human adenocarcinoma. III. A hybridoma antibody (FH6) defining a human cancer-associated difucoganglioside (VI3NeuAcV3III3Fuc2nLc6). //Biol. Chem.-1984.-V.259.-P.10511-10517.

41. Guegan C. and Przedborski S. Programmed cell death in amyotrophic lateral sclerosis.//J. Clin. Invest.-January 15, 2003.-V.111.-»2.-P.153-161.

42. Hakomori S. Glycosylation defining cancer malignancy: New wine in an old bottle. //PNAS.-2002.-V.99.- №16.-P.10231-10233.

43. Hakomori S. Glycosylation defining cancer malignancy.//J. Biol. Chem.-2002.-V.259.-P.4672-4680.

44. Hakomori S. Gangliozids configuration durind cancermalignancy: New wine in an old bottle.//J. Natl.Cancer Inst.-2002.-V.71.-P.231-251.

45. Hakomori S. Tumor-associated glycolipid antigens detined by monoclonal antibodies.//Bull Canar.-1983.-V.70.- №2.-P.118-126.

46. Hakomori S.-i. Inaugural Article: The glycosynapse. //PNAS.-2002.-V.99.-№l.-P.225 -232.

47. Hakomori S.I. Tumor-associated glycolipid their metabolism and organization. //Chemistry and Physics of lipids.-1986.-V.42.-P.209-231.

48. Hakomori S. Glycosylation defining cancer malignancy: New wine in an old bottle. //PNAS.-2002.-V.99.-№.16.-P.10231-10233.

49. Hakomori S-I.,Kannagi R. Glycosphingolipids as tumor-associated and differentiation markers.//"J. Nat. Cancer Inst.".-1983.-V.71.-№2.-P.231-251.

50. Hakomori S. Aberrant glycosylation in tumors and tumor-associated carbohydrate antigens. //Adv. Cancer Res.-1989.-V.52.-P.257-331

51. Hakomori S. Kannagi R. Glycoshingolipids as tumor-associated and differentiation markers.//J. Natl. Cancer Inst.-1983.-V.71.-P.231-251.

52. Hanai N. . Generation of monoclonal antibodies against human lung squamous cell carcinoma and adenocarcinoma using mice rendered tolerant to normal human lung.//Cancer Res.-1986.-V.46.-P.4438-44 43.

53. Hayashi I., Amano H., Yoshida S.et.al. Suppressed Angiogenesis in Kininogen-Deficiencies Lab.//Invest.-2002.-V.82.-№7.-P.871-880.

54. Herr Ingrid, Debatin B. Cellular Klaus-Michael stress response and apoptosis in cancer therapy.//Blood.- 2001.-V.98.-P.2603-2614.

55. Hiraishi K, Suzuki K, Hakomori S and Adachi M Le(y). Antigen expression is correlated with apoptosis (programmed cell death).//Glycobiology.-1993.-V.3.1. P.381-390.

56. Hiraiwa N. Gangliosides and sialoglycoproteins carrying a rare blood group antigen determinant, Cad, associated with human cancers as detected by specific monoclonal antibodies.//Cancer Res.-1990.-V.50.-P.5497-5503.

57. Hirashima, G. High idiotypic connectivity of the VH7183-encoded antibodies directed to a murine embryonic carbohydrate antigen, Lewis Y, as ascertained by syngenic anti-idiotype monoclonal antibodies.//J. Immunol.-1990.- V.145.-P.224-232.

58. Hirota M., Fukushima K., Terasaki P.J. . Detection of tumor-associated antigens in the sera of lung cancer patients by three monoclonal antibodies. //Cancer Res.1985.-V.45.-P.6453-64 56.

59. Houghton A.N., Scheinberg D.A. A Heteroclitic Peptide Vaccine Induces CD8+ T-Cell Responses to CD20.//Seminars in Oncology.-1986.-V.13.-№ 2.-P.165-179.

60. Houghton A.N. Gangliosides in the oncological studies.//Oncology.-1985.-V.12.-№ 3.-P.24.

61. Iliopoulos D., Ernst C., Steplewski Z. Inhibition of metastases of a human melanoma xenograft by monoclonal antibody to the GD2/GD3gangliosides.//Journal Of The National Cancer Institute.-2004.-V.81.-P.440-444.

62. Inaudi P., Pasqui G., Torre G.C. et.al. CA 125 and CA 19-9 in peritoneal, cyst and amniotic fluids.//Med. Oncol, and Tumor Abarmacofher.-1988.- V.5.- №4.-P.233-238.

63. Irie R.F., Morton D.L. Regression of cutaneous metastatic melanoma by intralesional injection with human monoclonal antibody to ganglioside GD2 //Proc. Natl. Acad. Sci. US.-1986.-V.83.-№22.-P.8 694-8698.

64. Iwai K.,Ishikura H., Kaji M., . Importance of E-selectin (ELAM-1) and sialyl Lewis A in the adhesion of pancreatic carcinoma cells to activated endothelium.//Int. J. Cancer.-1993.- V.54.-P.972-977.

65. Kanda N., Nakai K., and Watanabe S. Gangliosides GDlb, GTlb, and GQlb Suppress the Growth of Human Melanoma by Inhibiting Interleukin-8 Production: the Inhibition of Adenylate Cyclase.//J. Invest. Dermatol.-2001.-V.117.-№2.-P.284-293.

66. Kaneko T. Preparation of mouse-human chimeric antibody to an embryonic carbohydrate antigen, Lewis Y. //J. Biochem.-1993.-V.113.-P.114-117.

67. Kawashima I. H. Ozawa, M. Kotani. Characterizationof ganglioside expression in human melanoma cells : Immunological and biochemical analysis.//J.Biochem.-1993.-V.114.-P.186-193.

68. Kawashima I. Immunocytochemical analysis of gangliosides in rat primary cerebellar cultures using specific monoclonal antibodies.//Brain Res.-1996,-V.732.-P.75-86.

69. Kawashima I. Identification of HLA-A3-restricted Cytotoxic T Lymphocyte Epitopes from Carcinoembryonic Antigen and HER-2/neu by Primary in Vitro Immunization with Peptide-pulsed Dendritic Cells.//J.Biochem.-1993.-V.114.-P.186-193.

70. Kawashima I. Ganglioside in human melanoma cells.//J.Biochem.-1992.-V.113.-P.123-125.

71. Kawashima I. Telomerase-Specific Replication-Selective Virotherapy for Human Cancer.//Brain Res.-1996.-V.732.-P. 75-86.

72. Kohler G., Milstein C. Continious cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. //Nature.-1975.-V.256.- №55.- P.495-497.

73. Koprowski H., Steplewski Z., Mitchel K et.al Colorectal carcinoma antigens detected by hybridoma antibodies.//Cell Genet.- 1979.-V.5.-P.957-972.

74. Kotani M. Developmental changes of ganglioside expressions in postnatal rat cerebellar cortex.//Brain Res.-1995.-V.700.-P.40-58.

75. Kotani M. Generation of one set of monoclonal antibodies specific for a-pathway ganglio-series gangliosides.//Biochim. Biophys. Acta.-1992.- V.1117.-P.97-103.

76. Kotani M, Hosoya H, Kubo H,et.al.Evidence for direct binding of intracellularly distributed ganglioside GM2 to isolated vimentin intermediate filaments in normal and Tay-Sachs disease human fibroblasts.//CellStruct.Funct.-l994,Apr.-V.19(2).-P.81.

77. Kotani M, Kawashiraa I, Ozawa H et.al.Differential distribution of major gangliosides in rat central nervous system detected by specific monoclonal antibodies.// Glycobiology.-1993- V.3.-P.137-146.

78. Kotani K., Kotani K., Hara K.,et.al.Normal Activation of P70 S6 Kinase by Insulin in Cells Overexpressing Dominant Negative 85-kDa Subunit of Phosphoinositide 3-Kinase.// Biochemical and Biophysical Research Communications.-1995 .-V.208.- P.735-741.

79. KotaniY., Matsuda S., Sakanaka, M.et.al. Prosaposin facilitates sciatic nerve regeneration in vivo.// J. Neurochem.-1996.-V.66.-P.2019-2025.

80. Kotani, M. Immunohistocehmical localization of minor gangliosides in the rat central nervous system. //Glycobiology.-1994.-V.4.-P.855-8 65

81. Kubo, H. Differential distribution of ganglioside GM1 and sulfatide during the development of Xenopus embryos.//Develop.Growth.Differ.-1995.-V.37.-P.243-255.

82. Larson S.M. Radiolabeled monoclonal anti-tumor antibodies in diagnosis and therapy, nucl. //Med.-1985.-V.26-P.538-545

83. Leahy J.L. Vanderkerkhove K. M. Insulin-like growth factor-I at physiological concentrations is a potent inhibitor of insulin secretion. // Endocrinology.-1990 .-V.126, N3.-P.1593-1598

84. Ledermann J. A., Begent R.H.J., Keep P.A. et.al. The human antibody response to radiolarelled antibodies for tunour therapy. //6th Int. Congr. Immunol., Toronto,1. July 6-11, 1986.-P.545.

85. Loberto N, Prioni S, Ottico E. et.al. The adesion protein TAG-1 has a ganglioside environment in the sphingolipid enriched membrane domains of neuronal cells in culture. //J. Neurochem.- 2003.- V.85.-P.224-233.

86. M&uuml J.,Burg M., M&ouml B, et.al. Preferential binding of the anticancer drug rViscumin (recombinant mistletoe lectin) to terminally 2-6-sialylated neolacto-series gangliosides.//Glycobiology Abstracts: M&uumlathing.-2001.-V.8.-P.485

87. Marechal F., Berthiot G., Deltour G. Sezam levels of CA-50, CA-125, CA15.3, enolas and carcino-embryonic antigen in non neoplastic diseases of the lung. //Anticancer Res.- 1988.-V.8, №4.-P.677-680.

88. Martino S, Cavalieri C., Emiliani C. et.al. Restoration of the GM2 ganglioside metabolism in bone marrow-derived stromal cells from a Tay-Sachs disease animal model. //Neurochem. Res.- 2002.-V.2.-P.793-800.

89. Martino S, Emiliani C, Tancini B. et.al. Absence of metabolic cross-correction in Tay-Sachs cells: implications for gene therapy.//J Biol Chem.- 2002.-V.277.- P.20177-20184.

90. Masserini M, Palestini P, Pitto M, Chigorno V and Sonnino S Preparation and use of liposomes for the study of sphingolipid segregation in membrane model systems. //Methods in Molecular Biology.-2002.-V.199.-P.17-27.

91. Masserini M., Ravasi D. and Sonnino S. Role of glycosphingolipids in formation and function of membrane microdomains . //Trends Glycosc. Glycotech.- 2001.-V.13.-P.239-250.

92. Maura N. Dickler, Govindaswami Ragupathi, Nancy X. Liu et.al. Grant Immunogenicity of a Fucosyl-GMl

93. Keyhole Limpet Hemocyanin Conjugate Vaccine in Patients with Small Cell Lung. //Cancer Clinical Cancer Research.- October 1999.- V.5.- P.2773-2779

94. Mauri L, Prioni S, Loberto N. et.al. Synthesis of radioactive and photoactivable ganglioside derivatives for the study of ganglioside-protein interactions. //Glycoconjugate J.- 2003.- in press.

95. Mauri L, Valsecchi M, Casellato R. et.al. Procedure for the separation of the GM2 ganglioside species with different ceramide structures by flash reversed-phase silica gel liquid chromatography. //J. Chromatog B.- 2003.- in press.

96. Miljan E. A., Meuillet E. J., Mania-Farnell B. et.al. Interaction of the Extracellular Domain of the Epidermal Growth Factor Receptor with Gangliosides. //J. Biol. Chem.- March 22, 2002.- V.277,№12.-P.10108 -10113.

97. Minasian-LM, Yao-TJ, Steffens-TA. et.al.A phase I study of anti-GD3 ganglioside monoclonal antibody R24 and recombinant human macrophage-colony stimulating factor in patients with metastatic melanoma. //Cancer.-1995 May 1.- V.75,№ 9.- P.2251-2257.

98. Miyake M. . Generation of two murine monoclonal antibodies that can discriminate N-acetyl neuraminic acid residues of GM2 ganglioside. //Cancer Res.- 1988.-V.48.- P.6154-6160.

99. Miyake M Adachi M, Taki T, et.al.Correlation of KAI1/CD82 gene expression with good prognosis in patients with non-small cell lung cancer.// Cancer Research.- 2002 .-V.56.- .P.1751-1755.

100. Miyake M.The abnormal occurrence and the differentiation-dependent distribution of N-acetyl and N-glycolyl species of the ganglioside GM2 in human germ cell tumors.//Cancer.-1990.- V.65.-P.499-505.

101. Miyake Y., Nakamura S., Kozutsumi Y. Dual roles of sphingolipids in signaling of the escape from and onset of apoptosis in a mouse cytotoxic T-cell line, CTLL-2.//J. Biol. Chem.-1996.-V.271.-P.1255-1257.

102. Mulchine J.L., Cuttitta F., Bibro M. Identification of vasoactive nonpeptidic positive and negative modulators of adrenomedullin using a neutralizing antibody-based screening strategy.//J. Immunol.- 1983.- V. 131.- P.497-502.

103. Munck-Wikland E., Kuylenstierna R., Wahren B. Prognostic and predictive markers for cancer and dysplasias of the head and neck //Cancer.- 1988.-V. 62.-P.2281-2286.

104. NaKane P, Hiroshi Nakane; Francis JHeis et.al. Gene Transfer of Endothelial Nitric Oxide Synthase Reduces Angiotensin II-Induced Endothelial Dysfunction Hypertension. // J. Biol. Chem.- 2000.-V.35.-595.-P.7-9.

105. Nakane P.K., Kawaoi A. Enzyme-labeled antibodies preparation and application for the localization of antigens.//J.Histochem.Cytochem.-1974.-V.22.-P.1084-1091.

106. Nilsson 0., Brezicka T.,Holmgren. Detection of gangliosideantigen associated with small cell . carcinomas using monoclonal antibodies directed agaj Fucosyl-GMl.//Cancer Research.-1986.-V.48.-P.14 03-14 07.

107. Nojiri Hisao, PhD , Yamana Hideaki, MD , Shirouzu Genzan, MD. et.al. Glycotherapy for cancer: remodeling of ganglioside pattern as an effective approach for cancer therapy. //Cancer Detection and Prevention.-2002.-V.26(2).-P.75-76.

108. North P. E., Waner M. , Mizeracki A. et.al. Jr A Unique Microvascular Phenotype Shared by Juvenile Hemangiomas and Human Placenta Arch Dermatol.// Cancer.

109. May 1, 2001.-V.137(5)P.559 570.

110. Ogata S., Ho I., Chen A. T et.al. umor-associated sialylated antigens are constitutively expressed in normal human colonic mucosa. //Cancer-Res.- 1995 May 1.-V.55 (9) .- P.1869-74.

111. Ohta S., Tsukamoto H., Watanabe K. et.al. Tumor-associated glycoantigen, sialyl Lewis(a) as a target for bispecific antibody-directed adoptive tumor immunotherapy. //Immunol-Lett.-1995 Jan.-V.44(1).-P.35-40

112. Ono M., Handa K., Sonnino S. et.al. GM3 ganglioside inhibits CD9-facilitated haptotactic cell motility: co-expression of GM3 and CD9 is essential in down-regulation of tumor cell motility and malignancy. //Biochemistry.- 2001.- V.40.- P.6414-6421.

113. Ottico E, Prinetti A, Prioni S Dy et.al.

114. Namics of lipid membrane domains in cultured cells.// J.Lipid Res.- 2003.- in press.

115. Posmus P.E., CJ Hirschler-Schulte, BS Hylkema, and RW Meyer. Mechanical ventilation for acute postoperative respiratory failure after surgery for bronchial carcinoma. //Thorax.- May 1985.-V.40.-P. 387 390.

116. Posmus P.E., Hirschler-Schulte T.J.W., De Leij L. Mechanical ventilation for acute postoperative respiratory failure after surgery for bronchial carcinoma //Cancer.- 1986.- V.57.- P.60-63.

117. Prinetti A., Chigorno V., Prioni S. et.al. Changesin the lipid turnover, composition and organization, as sphingolipid-enriched membrane domains, in rat cerebellar granule cells developing in vitro. //J. Biol. Chem.- 2001.-V.276.- P.21136-21145.

118. Prinetti A., Marano N., Prioni S. et.al. Association of Src-family protein tyrosine kinases with sphingolipids in rat cerebellar granule cells differentiated in culture. //Glycoconjugate J.-2000.-V.17.- P.223-232.

119. Prinetti, A., Chigorno, V., Tettamanti, G. and Sonnino, S. Sphingolipid-enriched membrane domains from rat cerebellar granule cells differentiated in culture: a compositional study. //J. Biol. Chem.- 2000.-V.275.-P.11658-11665.

120. Prinetti,A., Basso,L., Appierto,V. et.al. Altered sphingolipid metabolism in N-(4-hydroxyphenyl)retinamide-resistant A2780 human ovarian carcinoma cells. //J.Biol.Chem.- 2003.-V.278.-P.5574-5583.

121. Prioni S., Loberto N., Prinetti A.et.al. Sphingolipid metabolism and caveolin expression in gonadotropin-releasing hormone-expressing GNU and gonadotropin-releasing hormone-secreting GT1-7 neuronal cells. //Neurochem. Res.- 2002.-V.27.- P.831-840.

122. Ranes M.K., El-Abbadi M., Manfredi M.G.et.al. Nbutyldeoxynojirimycin reduces growth and ganglioside content of experimental mouse brain tumours. //British Journal of Cancer.- 2001.-V.84.- P.1107-1114.

123. Reisfeld Ralph A., Cheresh David A. Human tumor antigens.//Immunol. -1987.- V.40.- P.323-377.

124. Rizzo A.M., Rossi F., Guerra A. et.al. Exogenous sphingosine is taken up and metabolised by Xenopus laevis embryos grown in Petri dishes. //Bioscience Rep.-2001.-In press

125. Rizzo AM, Berra B, Rossi F. et.al. Structure of the main ganglioside from the brain of Xenopus Laevis. //Glycoconjugate J.-2002.-V.19.- P.53-57.

126. Rubenstein K.F., Schneidein K.E., Huisjen J., Ullman E.F. Mechanism by immunoassay. New Immunochemical technique Biochem. //Biophis. Res. Commun.- 1972.-V.47.- P.846-851.

127. A. H. Rubenstein,PM Blix, D.L. Horwitz, D.F. Steiner. Cell Cycle Regulation of Menin Expression. //Diabetes.- 1977.-V.26.-P. 22-29.

128. Satoh, M;Ito, A;Nojiri et.al. GM3 expression, associated with decreased invasiveness, is induced by brefeldin A in bladder cancer cells. //INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY.- OCT 2001.-V.19(4).-P.723-731.

129. Schultz G., Cheresh D.A., Varki N.M. et.al Detection of ganglioside GD2 in tumor tissue and sera of neuroblastoma patients. //Cancer Res.- 1984.-V.44.-P.5914-5920.

130. Sciannamblo M., Chigorno V., Passi A. et.al. Changes of the ganglioside pattern and content in human fibroblasts by high density cell population subculture progression. //Glycoconjugate J.- 2002.-V.19.- P.181-186.

131. Sears H.F., Herlyn D., Steplewsli Z. Identificationof the gastrointestinal and pancreatic cancer-associated antigen detected by monoclonal antibody 19-9 in the sera of patients as a mucin . //Cancer Res.- 1985.-V. 45.-P.5910-5913.

132. Senger Donald R., Claffey Kevin P., Benes Julie E. et.al Angiogenesis promoted by vascular endothelialgrowth factor: Regulation through <XiPi and (X2Pi integrins Proc. //Natl. Acad. Sci. USA.- December 1997. V. 94.-P.13612-13617.

133. Seppala M., Taylor R. N., Koistinen H. et.al Glycodelin: A Major Lipocalin Protein of the Reproductive Axis with Diverse Actions in Cell Recognition and Differentiation Endocr. //Rev.- August 1, 2002.-V.23(4).- P.401 430.

134. Seppo Antti, Matani Parul, Sharrow Mary and Tiemeyer Michael.Induction of neuron-specific glycosylation by Tollo/Toll-8, a Drosophila Toll-like receptor expressed in non-neural cells. //Development.-2003.-V.130.- P.1439-1448.

135. Shamshiev A., Donda A., Prigozy T.I.et.al.The Pa T cells response to self-glycosphingolipids shows a novel mechanism of CDlb loading and requirement for complex oligosaccharides. //Immunity.- 2000.-V.13.-P.255-264.

136. Shitara, K. Distribution of lung adenocarcinoma-associated antigens in human tissues and sera defined by monoclonal antibodies KM-52 and KM-93. //Cancer Res.-1987.-V.47.-P.1267-1272.

137. Shurin G. V., Shurin M. R., Bykovskaia S.A et.al. Neuroblastoma-derived Gangliosides Inhibit Dendritic Cell Generation and Function. //Cancer Research.-January 1, 2001.-V.61.- P.363-369.

138. Sieri K., Kiruchi Y., Uesato K. , Kato K Yncreased sezam CA 125 levels daring the first trimester ofpregnansy. //Acta obstet. gynaecol. Scand.- 1986.-V.65.-P.583-585.

139. Smets Lou A. Tumor cell curfasecarbohydrates: genetic control and phenotypic implications.//"Membranes Tumor Growth. Proc. Int. workshop, Rome, June 14-18, 1982". Amsterdam e.a.- 1982.- P.139-147.

140. Sonnino S. Forward. Special issue on sphingolipids dedicated to Professor Guido Tettamanti, Neurochem. //Res.- 2002.-V.27.- P.537-538.

141. Sonnino S. and Chigorno V. Ganglioside molecular species containing C18- and C20-sphingosine in mammalian nervous tissue and neuronal cell cultures. //Biochim. Biophys.- 2000.- V.469.- P.63-77.

142. Sonnino,S. and Tettamanti,G. (Guest Editors). Glycosphingolipids and membrane domains. //Glycoconjugate J.- 2000.-V.17.- P.141.

143. Sonnino, S., Chigorno,V. and Tettamanti G. Preparation of radioactive gangliosides, 3H. or [14C] isotopically labeled at the oligosaccharide or ceramide moieties. //Method Enzym.- 2000.-V.311.- P.639-656.

144. Steplewsri Z., Spira G., Blaszczyr M. et.al. Scharff Isolation and characterization of anti-monosialoganglioside monoclonal antibody IS-9 class-switch variants. //PNAS.- 1985. V.82.-P.8653-8657.

145. Suikkari A., Koivisto U., Rutanen Insulin regulates the serum levels of low molecular weight insulin-like growth factor-binding protein //E.Ibid.-1988.-V.66.-P.266-272.

146. Sun P., Wang X.Q., Lopatka K., Bangash S., and Paller A. S. Ganglioside Loss Promotes Survival Primarily by Activating Integrin-Linked Kinase/Akt Without Phosphoinositide 3-OH Kinase Signaling //J. Invest. Dermatol.- July 1, 2002.-V.119(1).-P.107-117.

147. Sung-C.C., Pearl D.K., Coons S.W., Scheithauer B.W., Johnson P.C., Yates A.J. Gangliosides as diagnostic markers of human astrocytomas and primitive neuroectodermal tumors. //Cancer.-1994 Dec l.-V.74(11).-P.3010-22.

148. Tai T. Cell type-specific expression of ganglioside antigens in the central nervous system. Pure and Appl. //Chem.- 1997.-V.69.- P.1903-1910.

149. Tai, T. Head, Department of Tumor Immunology. //The Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science.-1999.-P.34-37.

150. Tai, T. Generation of a monoclonal antibody specific for ganglioside GM4. //PudMed.-1993.-P.123-141.

151. Takada, A. . : Adhesion of human cancer cells to vascular endothelium mediated by a carbohydrate antigen, sialyl Lewis A. //Biochem. Biophys. Res. Commun.-1991.-V.179.-P.713-719.

152. Takada A. Epstein-Barr Virus and Cancer. //Clin Cancer Res.-2004.-V.10.-P.803.

153. Takada A. Contribution of carbohydrate antigens sialyl Lewis A and sialyl Lewis X to adhesion of human cancer cells to vascular endothelium. //Cancer Res.-1993.-V.53.-P.354-361.

154. Takada, A. Therefore, antibodies against carbohydrate antigens of donor kidney can be presented in the recipient's blood //Nature.1994.—V.372.-P.7.

155. Tockman M., Gupta R.K., Myers J.D. Prospective detection of preclinical lung cancer: results from two studies of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1 overexpression . //J. Clin. Oncol.- 1988.-V. 6(11).-P.1685-1693.

156. Tong A.W., Lee J., Stone M.J. Quantitative Epstein-Barr Virus DNA Analysis and Detection of Gene Promoter Hypermethylation in Nasopharyngeal (NP) Brushing Samples from Patients with NP Carcinoma//Cancer Res.- 1984.-V.44.- P.4987-4992.

157. Treleaven J. G., Gibson F. M., Ugelstad J. et.al.Removal of neuroblastoma cells from bone marrow with monoclonal antibodies conjugated to magnetic microspheres. J., Philip T. . //Lancet.- 1984.- p.70-73.

158. Tsuji, T. Prognostic Significance of CEA, CA 19-9 and CA 72-4 Preoperative Serum Levels in Gastric Carcinoma//Anticancer Res.- 1989.-V.9.- P.327-340.

159. Ugur 0, Scott A.M, Kostakoglu L,et.al.Calculated and TLD-based absorbed dose estimates for I-131-labeled 3F8 monoclonal antibody in a human neuroblastoma xenograft nude mouse model. //Nucl-Med-Biol.- 1995 Jan.-V.22(1).- P.87-93.

160. Valiente 0., Mauri L. , Casellato R.,. Fernandez L.E and Sonnino S. The preparation of deacetyl-, lyso-and deacetyl-lyso-GM3 by selective alkaline hydrolysis of GM3 ganglioside. //J. Lipid Res.- 2001.-V.42.-P.1318-1324.

161. Vangsted Annette, Drivsholm Lars, Andersen Elo, Pallesen Tina, Zeuthen Jesper, Wallin Hakan, New Serum Markers for Small-Cell Lung Cancer I. The Ganglioside Fucosyl-GM(l). //Published in Cancer Detection and Prevention.- 1994 .-V.18 (3).-P.221-230.

162. Vangsted A.J. Serological tumor markers for small cell lung cancer and their therapeutic implications. //APMIS.-1994 Aug.-V.102(8) .-P.561-80

163. Vangsted A.J. Correlation with bladder cancer risk.

164. Cancer Res.- 1991.-V.51.-P.2762.

165. Wang X.Q., Sun P. and Paller A. S. Ganglioside GM3 Inhibits Matrix Metalloproteinase-9Activation and Disrupts Its Association with Integrin. //J. Biol. Chem.- July 11, 2003.-V.278(28).- P.25591 25599.

166. Wang X.Q., Sun P. and Paller A. S. Ganglioside Induces Caveolin-1 Redistribution and Interaction with the Epidermal Growth Factor Receptor. //J. Biol. Chem.-December 6, 2002.-V.277(49).-P.47028-47034.

167. Wang X.Q., Sun P. and Paller A. S. Ganglioside Modulation Regulates Epithelial Cell Adhesion and Spreading via Ganglioside-specific Effects on Signaling. //J. Biol. Chem.- October 25, 2002.-V.277(43).- P.40410-40419.

168. Wang X.Q., Sun P. and Paller A. S. Inhibition of Integrin-linked Kinase/Protein Kinase B/Akt Signaling. MECHANISM FOR GANGLIOSIDE-INDUCED APOPTOSIS. //J. Biol. Chem.- November 30, 2001.-V.276(48).-P.44504-44511.

169. Watari, S. Application of liposomes to generation of monoclonal antibody to glycosphingolipid : Production of monoclonal antibody to GgOse4Cer. //J. Biochem.-1987 .- V. 102.- P.59-67.

170. Watty A. and Burden S. J. MuSK Glycosylation Restrains

171. MuSK Activation and Acetylcholine Receptor Clustering. //

172. J. Biol. Chem.-December 27,2002. V. 277(52).- P.5045750462.

173. Weiss M., Hettmer S., Smith P., and Ladisch S. Inhibition of Melanoma Tumor Growth by a Novel Inhibitor of Glucosylceramide Synthase.//Cancer Res.-July 1,2003,1. V.63(13).- P.3654-3658.

174. Wilkins J.R., D'Ercole A.J. Affinity-labeled plasma somatomedin-C/Ynsulinlike growth factor 1 binding proteins. //J. Clin. Chim. Invest.- 1985.- V.75(4).-P.1350-1358.

175. Yamanda-T., Haniuda-M., Iida-F., Kannagi-R. Immunohistochemical expression of sialyl-Lewis antigens in lung cancer. //Nippon-Rinsho.- 1995 Jul.- V.53(7).-P.1776-1780.

176. Yamashina I. Carbohydrate-directed monoclonal antibodies and their use in cancer diagnosis. //Published in Cancer Detection and Prevention.-1995.-V.19(1).-P.4.

177. Zecca L., Costi P., Mecacci C et.al.Interaction of human substantia nigra neuromelanin with lipids and peptides. //J. Neurochem.- 2000.-V.74.-P.1758-1765.