Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия гомеобокс-содержащих генов в клетках женского репродуктивного тракта в пренатальном и постанатальном онтогенезе мыши

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия гомеобокс-содержащих генов в клетках женского репродуктивного тракта в пренатальном и постанатальном онтогенезе мыши"

РГ8 ОД

к з т т:.

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ

На правах рукописи

ПАВЛОВА-РЕЗАКОВА Анна Григорьевна

ЭКСПРЕССИЯ ГОМЕОБОКС-СОДЕРЖАЩИХ ГЕНОВ В КЛЕТКАХ ЖЕНСКОГО РЕПРОДУКТИВНОГО ТРАКТА В ПРЕНАТАЛЬНОМ И ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ МЫШИ

Специальность.: 03.00.25 - Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1994

Работа выполнена в Отделе Биохимических Исследований при Медицинской школе Бостонского Университета, штат Массачусетс, США

Научный руководитель: РН|), завлаб., доктор Сэссун Д.

Официальные оппоненты: 2/,№

Ведущее учереждение - Онкологический Центр РАМН, Институт Канцерогенеза.

Защита состоится „ 1994 года в

часов на заседании Специализированного совета %• С0$ при Институте Цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий Проспект, д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Цитологии РАН.

Автореферат разослан „ ^^„ 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, ^ср/п'уэ биологических наук Л.Н.Писарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Гомеобокс-содержащие гены вовлечены в контроль морфогенеза в процессе эмбрионального развития позвоночных. Maxi и Мэх2 - два близкородственных гена, гомологичных гену Msh дрозофилы. В процессе эмбриогенеза экспрессия Мзх1 и Мвх2 наблюдается в мигрирующих клетках нервного гребня, зачатках зубов, глаз, клапанов сердца и в почках конечностей. Хотя рисунок экспрессии известных генов семейства mah сложен, все области экспрессии относятся во временном и пространственном отношении к местам активного морфогенеза, где пролифериршующие клетки находятся в состоянии мезенхимо-эпителиальных взаимодействий. Например, в зачатке сердца Maxi экспрессируется в мигрирующих клетках развивающихся клапанов. В ростральной части нервной трубки и нервного гребня экспрессия Maxi и Мах2 соответствует участкам, где клетки отделяются от нервного гребня, становясь активно-мигрирующими, и снижается по мере того, как клетки достигают точки назначения. В почке конечности Maxi экспрессируется в дистальной мезенхиме, в то время как экспрессия Мзх2 локализована главным образом в эктодерме апикально-эктодермального гребня. Временная и пространственная экспрессия Maxi и Мзх2 в почке конечности хорошо изучена, тем не менее их функциональная роль в процессе морфогенеза не понятна. Предыдущие исследования продемострировали, что in vitro экспрессия гена Msxl ведет к блоку дифференцировки и онкогенной трансформации клеточной линйи, полученной из мышиных неонатальных скелетных мышц. Эти наблюдения согласуются с экспрессией Msxl в пролиферирующих недифференцированных клетках эмбриона.

В настоящее время биологической роли гомеобокс-содержащих генов в процессе эмбриогенеза посвящено большое число исследований, в то время как роль этих генов во взрослом организме обратила на себя внимание только сейчас. В большинстве случаев гомеобокс-содержащие гены не экспрессируются в тканях взрослого организма, что давало основание считать их только генами эмбрионального развития.

В отличие от большинства органов, женский репродуктивный тракт рудиментарен при рождении, и его морфологическая и функциональная дифференцировка происходит в постнатальный период. Во время неонатального периода эпителий матки и влагалища является морфологически пластическим и гетеротипная мезенхима может индуцировать экспрессию совершенно новой программы морфогенеза и цитодифференцировки клеток эпителия. Во взрослом организме эпителиальная морфология и дифференцировка драматически меняется в ответ на колебание уровня гормонов в процессе эструса. Еще более поразительными являются десидуальные изменения в эндометрии, вызываемые имплантацией эмбриона. Т.о., морфологическая пластичность является отличительной чертой как неонатального, так и взрослого женского репродуктивного тракта. Выяснение механизмов регуляции функционирования женского репродуктивного тракта с точки зрения роли гомеобокс-содёржащих генов в этом процессе открывает новые горизонты в изучении биологической роли гомеобокс-содержащих генов, а также имеет перспективное практическое значение. Учитывая данные о том, что стабильно трансфицированные геном Msxl клетки культуры миобластов, введенные подкожно бестимусным мышам, вызывали образование фибросарком (Nature, 1992), можно сделать интригующее предположение о том, что дисрегуляция этого гена может играть роль в возникновении некоторых

патологий женского репродуктивного тракта (например эндометриоз или онкологические заболевания.

Основной целью работы явилось изучение экспрессии Мзх1 (Нох-7.1) гена в клетках развивающегося и зрелого, функционирующего женского репродуктивного тракта и индуктивной роли межклеточных взаимодействий в экспрессии Msxl.

Задачи исследования

1. Выяснить тканеспецифичность экспрессии гена Msxl в матке мыши и проследить динамику экспресии Msxl в развивающемся женском репродуктивном тракте.

2. Используя модель гомотипных и гетеротипных мезенхимо-зпителиальных рекомбинантов, изучить влияние межклеточных взаимодействий на индукцию/ поддержание экспрессии Msxl.

3. Изучить индукцию Msxl гена на модельных экспериментах in vivo.

4. Проследить корреляцию между экспрессией Msxl гена и экспрессией других генов, вовлеченных в процесс морфогенеза и проявляющих пространственно-временную коэкспрессию с Msxl в эмбриогенезе мыши.

5. Изучить экспрессию Msxl гена при различных функциональных состояниях матки мыши.

6. Выяснить влияние женских половых гормонов на экспрессию Msxl в матке мыши.

7. Изучить экспрессию human Msxl (human Нох-7.1 ) В тканях женского репродуктивного тракта на разных фазах менструального цикла.

Научная новизна и значимость исследований и личный вклад автора в разработку темы. Впервые изучалась роль гомеобокс-содержащих регуляторных генов класса msh и гомеотических генов HoxD9 и HoxDll (по старой номенклатуре Нох4.4 и Нох4.6

соответственно), а также генов Wnt5A и Id в развитии и функционировании женского репродуктивного тракта.

Впервые показано, что гомеобокс-содержащие гены и ростовые факторы, играющие ключевую роль в процессе эмбрионального клеточного роста, пролиферации и мофогенеза, интенсивно экспрессируются в клетках женского репродуктивного тракта и регулируются беременностью . Установлено, что Msxl, гомеобокс-содержащий ген, экспрессирующийся в позиционно пластических клетках эмбриона, также экспрессируется в эпителиальных клетках взрослой матки небеременной мыши и его экспрессия резко падает в первую неделю беременности. Экспериментально показано, что экспрессия Msxl зависит от мезенхимо-эпителиальных клеточных взаимодействий.

В человеческой матке human Msxl интенсивно экспрессируется в железистом и выстилающем эпителии на ранней и поздней пролиферативной стадии менструального цикла, снижаясь на ранней секреторной фазе, и пропадает в середине секреторной фазы, когда уровень прогестерона достигает пика'.

Исследования пренатального Мюллерова протока дают основание выдвинуть гипотезу , что гомеотические гены ряда Hoxd (в недавнем Нох-4) и фактор роста, ген Wnt5A могут быть вовлечены в регуляторный цикл Msxl. Гены HoxD9 и HoxDl 1 ( по старой номенклатуре Нох4.4 и Нох4.6 соответственно) и ген Wnt-5A экспрессируются в эндометриальной строме матки в пренатальном и постнатальном онтогенезе мыши, уровень экспрессии Wnt5A падает во время беременности одновременно с падением уровня экспрессии Msxl. Анализ гомотипных и гетеротипных тканевых рекомбинантов показал, что экспрессия Msxl зависит от взаимодействий с подлежащей мезенхимой маточного происхождения. Способность мезенхимы матки поддерживать

или индуцировать экспрессию Maxi в Мюлперовом эпителии коррелирует с экспрессией WntSA в мезенхиме. В то время как экспрессия Maxi в эпителии является результатом взаимодействий с маточной мезенхимой, экспрессия Wnt5A не зависит от контакта с эпителием. Наблюдение, что Msxl экспрессируется в эпителии матки взрослой мыши, и, что трансформация предполагаемого вагинального эпителия в маточный может происходить только в первую неделю постнатального развития, когда клетки вагинального эпителия еще экспрессируют Msxl, дает основание предположить, что этот гомеобокс-содержащий ген не только регулирует различные аспекты маточной эпителиальной морфологии и функционирования, но и играет роль в поддержании матки в морфологически пластичном состоянии, необходимом для выполнения ее уникальной функции. На основе полученных в работе результатов, а также данных литературы нами предложена гипотеза, что цервикально-вагинальный аденозис сопровождается изменением нормального распределения экспрессии генов, включая сдвиг рострально-наудальных границ экспрессии гомеотических генов в Мюллеровом протоке. Учитывая данные о предположительной онкогенной роли Maxi, при его эктопической экспрессии, можно предположить, что рак шейки матки или другие гиперпластические патологии женского репродуктивного тракта могут отражать дисрегуляцию генов в его регуляторной цепи.

Для исследования того, каким образом клетки маточной стромы индуцируют (или поддерживают) экспрессию Maxi в эпителии, были созданы и охарактеризованы клеточные линии маточной и вагинальной мезенхимы, иммортализованные с использованием температурчувствительного Т-антигена.

Экспериментальные исследования, обработка материалов и интерпритация полученных данных проведены автором

самостоятельно.

Выращивание тканевых рекомбинантов проводилось с методической помощью сотрудников Калифорнийского университета, Сан-Франциско.

Научная и практическая значимость исследования . Один из основных спорных вопросов медицины касается ракового и/или абнормального роста клеток в женском репродуктивном тракте. К настоящему времени остается неясным, какие условия приводят к таким патологиям как эндометриоэ или рак шейки матки. Особенно интересным в этом отношении кажется наблюдение, что эстрогены, введенные новорожденным самкам мышей, вызывают цервикальный/ вагинальный аденозис, различные уродства генитального тракта, рак матки, рак шейки матки и пролиферативные поражения фаллопиевых труб (Bern et al., 1984; Anderson and Forsberg, 1988). Аденозис характеризуется наличием однослойного цилиндрического эпителия, похожего на выстилающий эпителий матки, в цервикальной области или в ростральной вагинальной части женского репродуктивного тракта. Не смотря на то, что существуют некоторые различия между индуцированным аденозисом мышей и аденозисом у людей, подвергавшимся воздействию диэтилстилбестрола (ДЭС), в общих чертах поражения, наблюдаемые у мышей удивительно похожи на таковые, наблюдаемые у дочерей женщин, которые принимали ДЭС во время беременности. Недавно было показано, что при его эктопической экспрессии, Msxl обладает онкогенным потенциалом. Ген Wnt-5A родственен гену Wnt-1/int, который в свою очередь при эктопической экспрессии индуцирует опухоли молочной железы у мышей. Нами было показано, что Msxl экспрессируется в эпителии матки небеременной мыши, и что гены Wnt-SA, HoxD9 и HoxDll ассоциированы с подлежащей маточной мезенхимой, способной поддерживать экспрессию

х1. При изменении экспрессии Нох генов, вызванной тацией или воздействием тератогенов (ретиноидная слота), наблюдаются сдвиги рострально-каудальных границ гпрессии. Заманчиво предположить, что рвикально/вагинальный аденозис является результатом эмонально индуцированных нарушений экспрессии меотических генов.

Полученные в работе результаты могут оказаться лезными при изучении причин эндометриоза. Наши зультаты свидетельствуют, что мезенхима, прилегающая к ителию матки, контролирует рост и энспрессию генов в ителии. Эндометриоз характеризуется наличием тканей дометрия (эпителия и стромы) матки вне маточной полости является распространенным гинекологическим заболеванием, ебующим хирургического и терапевтического лечения. |тературные данные свидетельствуют, что частота зникновения эндометриоза у фертильных молодых женщин оло 2-5%, в то время как у женщин, лечившихся от сплодия, эта цифра колеблется между 30 и 40%. носительно механизма возникновения эндометриоза в стоящее время наиболее популярна теория Сэмпсона, едполагающая простую трансплантацию отслоившихся во емя менструации клеток эндометрия. Тем не менее, троградный менструальный поток происходит у многих ;нщин и эндометриальные клетки были найдены в брюшной лости здоровых женщин и женщин, больных эндометриозом. о., причины эндометриоза до конца не ясны и более полное нимание молекулярной физиологии функционирования матки выявление молекулярных факторов ответственных за ддержание морфологии клеток могут пролить свет на этот прос.

На защиту выносятся следующие основные положения: Матка мыши, в тканях которой нами впервые обнаружена

экспрессия генов эмбрионального развития Maxi, Hoxd9, HoxdII, является является удобным объектом для изучения функций и механизмов регуляции гомеобокс-содержащих генов in vivo.

6. Созданная культура клеток мезенхимы матки мыши является новой клеточной моделью для изучения in vitro действия гормонов и факторов роста на регуляцию экспрессии гена Мзх1 и для изучения роли гомеотических генов ряда Hoxd в этом процессе на молекулярно-клеточном уровне. 7. Использование этой модели позволяет показать, что способность клеток мезенхимы матки индуцировать гомеотические мутации в почке конечности коррелирует со способностью экспрессировать ген Wnt-5A. 5. Использование модели гетеротипных рекомбинантов позволяет показать, что экспрессия гомеобокс-содержащего гена Msxl в эпителии матки зависит от мезенхимо-эпителиальных взаимодействий.

2 .Экспрессия Msxl в эпителии женского репродуктивного тракта связана с однослойным цилиндрическим фенотипом клеток. По мере дифференцировки Мюллеровых протоков на матку, цервикс и влагалище экспрессия Msxl сдвигается вверх и остается только в выстилающем и железистом эпителии матки.

3. Экспрессия Msxl в матке мыши резко снижается во время беременности.

4. В женском репродуктивном тракте человека Msxl экспрессируется (также как и в случае мыши) в цилиндрическом эпителии матки и не экспрессируется в многослойном эпителии влагалища и цервикса, однако уровень экспрессии колеблется в зависимости от фазы менструального цикла.

Апробация и внедрение результатов работы в практику.

Апробация работы проходила на совместном заседании

9

лабораторий Института Цитологии РАН в ноябре 1993 года. Результаты работы используются в учебном процессе отдела Биохимических Исследований Медицинской школы Бостонского Университета и отдела Молекулярной Биологии Медицинской школы им. Mount Sinai, Нью-Йорк. По материалам работы подан грант. Основные положения диссертационной работы отражены в 4 публикациях. Две статьи находятся а процессе написания.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературных данных, описания материалов и использованных методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Текст диссертации изложен на 130 страницах машинописного текста и иллюстрирован I таблицей и 36 рисунками и фотографиями. Список литературы содержит 120 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Приготовление тканей. Маточные и вагинальные ткани были выделены из мышей линии СД-1 (Charles River) и Balb/c {Раковый центр Университета Калифорнии в Беркли). Беременных мышей получали спариванием мышей линии СД-I, при этом утро появления вагинальной пробки засчитывалось как пол-дня спаривания (п.с.). Для изучения каждой стадии беременности использовалось как минимум три мыши. Ткани фиксировали, дегидратировали, заключали в парафиновые блоки , затем готовили срезы, использовавшиеся в дальнейшем для гибридизации in sity. Гибридизация in sity. Ткани фиксировали в 42 параформальдегиде/PBS в течение 16 часов, затем отмывали в PBS, 0.85Я NaCl 1ч., а затем последовательно дегидратировали

в 50%, 70S, 80%, 95%, 100% этаноле и ксилоле. Образцы тканей были заключены в парафиновые блоки. На микротоме ткани нарезали на срезы толщиной 5 мкм. Предметные стекла обрабатывали 4%-ным раствором желатина. Прегибридизация, гибридизация и отмывка тканей проводилась в соответствии с опубликованной процедурой (Sassoon and Rosental, 1992). Вкратце: предметные стекла со срезами депарафинизировали в ксилоле, гидратировали, опуская последовательно в 100%, 95%, 70%, 50%, 30%-ный этанол, а затем - в 0.85% NaCl (5 мин.), IX pbs (5 мин). Вслед за этим срезы рефиксировали в 4%-ном параформальдегиде/pbs (20 мин), PBS (10 мин), и обрабатывали 7.5 минут протеиназой К (I мкг/мл). Затем снова промывали pbs (5 мин) и фиксировали в 4%-ном параформальдегиде/pbs. После этого предметные стекла помещали в IX триэтаноламин с 0.25%-ным уксусным альдегидом на 10 мин (ацетилирование), промывали в pbs (5мин), 0.85% NaCl (5 мин) и дегидратировали в 30%, 50%, 70%, 80%, 95% и 100%-ных растворах этанола.

Гибридизацию проводили в течение 16 ч при 52 градусах Цельсия в гибридизационном буфере следующего состава: 50% формами да, 10% декстран-сульфата, О.ЗМ NaCl, ЮмМ трис рН 7.6, 5мМ ЭДТА, 1мМ ДТТ, IX раствор Денхардта и 0.5 мг/мл тотальной РНК дрожжей. Пробы разводились до конечной концентрации 35000 спм/мкл. После гибридизации покровные стекла осторожно смывали 5-кратным ssc, содержащим 10 ммоль/л Дтт при 50 градусах Цельсия. Затем срезы отмывали в 50%-ном формамиде на 2-кратном SSC с 0.1 моль/л ДТТ при 65 градусах. Затем срезы промывали в растворе 0.4 М NaCl , 10 mM/трис рН 7.5 и 5 ммоль/л ЭДТА, обрабатывали РННазой А (20 мкг/мл) в том же растворе в течение одного часа, и заканчивали отмывку при 37 градусах в 2Х и IX ssc последовательно. После дегидратирования срезы сушили и погружали в фотоимульсию ntb-2 (Kodak) и

<спонировали в течение 7 дней. Проявку проводили с эмощью проявителя Д19 при 16 градусах. Контрастное <рашивание срезов проводили толуидиновым синим, и нализировали и фотографировали их на фотосистеме Optiphot фирмы Nikon.

риготовпение проб пля гибридизяиия in aity Пробы для ^бридизации in sity синтезировали с помощью SP6- или Т7-НК полимераз в присутствии 35-s итр (1000 Ки/ммоль , New ngland Nuclear) и добавляли в гибридизационный буфер в энечной концентрации 35000 спм/мкл. Все пробы риготовлялись в одинаковых условиях. Для получения пробы зх1 (Нох-7.1) использовали EcoRI фрагмент гена Msxl в зкторе Bluescript (Blueacribe), линеаризованной рестриктазой ас 1 (Robert et al-, 1989). Комплиментарные рибопробы элучали с использованием Т7 РНК-полимеразы. Wnt-5A был понирован в Bluescript PGEM3Zf, содержал фрагмент к-ДНК от 50 до 391 аминокислоты, линеаризовался EcorI, а эмплиментарные рибопробы получали с использованием sp6 элимеразы. Рибопробы Hoxd9 и HoxdII (Нох-4.4 и Нох-4.6) эанскрибировались с использованием Т7 РНК полимеразы. агинально-маточные рдкомбинантные ткани приготовляли в эответствии с ранее описанной методикой (Boutin et al., 391). Вкратце, вагинальная и маточная ткани выделялись из оворожденных мышей линии Ва1Ь/с, после чего отмывали в осфатно-солевом буфере (PBS). Затем образцы инкубировали в % трипсине (Difco 1:250) в растворе Хэнкса в отсутствии энов магния и кальция (4 С). Затем образцы последовательно ромывались в 10% растворе бычьей сыворотки, содержащего .1% дезоксирибонуклеазы I (sigma). Образцы разделяли на чителиальные и мезенхимные компоненты с помощью инцета или пипетирования через изогнутую пипетку. Вслед i этим эпителиальные и мезенхимные ткани омбинировались на агарной подложке (0.5-ный агар Difco на

модифицированной среде Дульбекно Н-16, содержащей 0.1% глюкозы, 10% зародышевой бычьей сыворотки, 2мМ глутамина, 100 едюмл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина). Ткани оставляли слипаться на 12-16 ч и вводили под почечную капсулу сингенной самки мыши. Образцы вагинальной мезенхимы и мезенхимы матки тоже имплантировали под почечную капсулу для того, чтобы оценить контаминацию остаточной эпителиальной тканью. Трансплантаты росли in vivo в течение трех- четырех недель, после чего их удаляли, фиксировали и анализировали методом гибридизации in aity.

Зашита ОТ действия .рибонукпеаа (RHflae ErotectÍQPAaaay).npo6bi для RPA приготовляли следующим образом. Сначала синтезировали специфическую РНК. Синтез проводили в течение 60 минут при 40 градусах (SP 6 полимераза) или при 37 градусах (Т7 полимераза). Буфер для синтеза готовили смешивая 4 мкл 5Х транскрипционного буфера (200 мМ трис-НС1 , рН 7.5, 30 мМ хлорида магния, 10 мМ спермидина-HCl и 25 мМ Nací), I мкл 200 мМ ДТТ, 2 мкл смеси холодных нуклеотидтрифосфатов, 10 мкл 32-Р ЦТФ (10 мКи/мл, 400800 Ки/ммоль), I мкл РНаэина (20-40 ед), I мкл ДНК матрицы в концентрации 0.5 мг/мл (конечная концентрация 25 мкг/мл) и I мкл коммерческого препарата РНК полимеразы. После синтеза пробу обрабатывали ДНКазой rq! в течение 15 минут при 37 градусах, после чего экстрагировали' фенол-хлороформом и осаждали этиловым спиртом с использованием тРНК дрожжей в качестве носителя. Последовательным переосаждением этанолом избавлялись от невключенного ЦТФ, затем полученный осадок сушили, растворяли в гибридизационном буфере, проверяли специфическое включение и гибридизовали пробу с тотальной РНК соответствующих тканей. Для этого РНК денатурировали (5 мин., 85 °С) и инкубировали в течение 8-

16 часов при 42 С. Вслед за этим пробу переваривали РНКазами А и TI в течение 30-60 мин при 30 С. После этого, присутствующие в реакционной смеси белки удаляли путем обработки SDS и протеиназой К, после чего содержащуюся в ней РНК экстрагировали и переосаждали как указано выше. После этого полученную РНК денатурировали (3 мин., 85 гр.) и анализировалась на 6% акриламидном геле в 6 М мочевине.

Тотальную клеточную РНК получали путем очистки в СзС1 и гуанидинизоционатного метода. В качестве матрицы при синтезе проб использовали фрагмент Bluescript клона Нох-7.1, содержащий Т7 промотор, линеаризованный рестриктазой Bgl 11. Приготовление Wnt-5a пробы описано выше.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Ген Мв*1 экспрессируется в развивающемся женском репродуктивном тракте в клетках Мюллерова эпителия. Его экспрессия снижается в вагинальной области по мере дифференцировки вагинального эпителия.

Так как Мзх1 сильно экспрессируется во время начальной стадии эмбриогенеза, то представлялось интересным исследовать характер его экспрессии в процессе развития женского репродуктивного тракта. Известно, что матка развивается из урогенитального гребня, который в свою очередь, состоит из недифференцированной мезенхимы, окружающей столбик циллиндрических клеток простого эпителия. В дальнейшем (постнатально), эпителий матки дифференцируется в железистые и выстилающие клетки, морфологически остающиеся клетками однослойного эпителия. Гладкомышечные клетки эндометрия и фибробласты эндометриальной стромы образуются из мезенхимы.

Рис.1. Схема экспрессии Msxl и WntSA в ходе развития Мюллерова тракта. Слеза - Мюллеров тракт на стадии 19 дней p.c.. Msxl экспрессируется в эпителии зародышевых рогов матки и влагалища. WntSA экспрессируется в мезенхимном слое матки и влагалища. В центре показан репродуктивный тракт новорожденной мыши (5 дней p.p.). Экспрессия Msxl и WntSA значительно снижена в постериорной (нижней) части влагалища. Справа показан репродуктивный тракт после двух недель постнатального развития. На этой стадии экспрессия Msxl и Wnt5A строго ограничевается областью матки. Также, вагинальный эпителий приобрел многослойный характер, в то время как клетки эпителия матки остались цилиндрическими.

Верхняя часть влагалища образуется из Мюллеровых протоков и проходит сходную программу развития, с той разницей, что

келезы не образуются, а эпителий дифференциируется в 1ногослойный. Для определения экспрессии гена Мзх1 1СПользовали метод гибридизации in aity.

На 19 день развития эмбриона эпителий Мюллеровых ¡ротонов экспрессирует Maxi на всей протяженности, включая юстериорную (нижнюю) часть, т.е. будущую вагинальную бласть. Пренатально, все клетки Мюллерова эпителия вляются клетками однослойного цилиндрического эпителия. ' новорожденных самок мышей ген Maxi активно кспрессируется в эпителии будущих матки, цервикса и лагалища, в то время как на третий день постнатального азвития уровень экспрессии Maxi снижается в вагинальном 1юллеровом эпителии по мере его дифференцировки в 1ногослойный. В развивающейся матке высокий уровень кспрессии Maxi сохраняется на всех стадиях постнатального нтогенеза. К 4-5 дню экспрессия Мзх1 резко падает в летках вагинального эпителия, что совпадает с переходом илиндрического Мюллерова эпителия в многослойный згинальный, а в шейке матки пропадает в двухнедельном эзрасте. Таким образом, экспрессия Maxi последовательно -раничивается ростральной областью мюллеровых протоков 5удущая матка). Это дает возможность предположить, что азделение Мюллерова тракта на влагалище, матку и шейку атки представляет собой постепенный процесс антерио-зстериорной дифференцировки( рис.1 ) ~ен Wnt-5A экспрессируется в мезенхиме Мюллеровых эотоков и его экспрессия, как и в случае Msxl, падает в финальном эпителии по мере его дифференцировки. В 13витой матке экспрессия Wnt5A наблюдается в щометриальной строме, но не в миометрии.

g

i i

<

i. к

1

I

W

msxl

wn(-5a

396

298

#

Рис.2 Экспрессия генов' Msxl и Wnt5A в матке взрослой мыши снижается во время беременности. Использовали метод защиты от действия рибонуклеаз (rpa). Тотальную РНК выделяли из матки беременной (5.5 дней р.с.) и небеременной (девственной) мыши. В качестве контроля в обоих случаях использовали РНК дрожжей (Юмкг). Двойная полоса, наблюдаемая при использовании WntSA пробы, по-видимому объясняется ранее наблюдавшейся возможностью альтернативного сплайсинга. Маркеры молекулярной массы показаны слева.

2. Нлх1 зкспрессируется в эндометриальном эпителии матки взрослой мыши. Его экспрессия падает во время беременности.

Ранее не удавалось обнаружить экспрессию Мзх1 в тканях взрослого организма. Однако, удивительно сильная экспрессия Msxl наблюдается в эндометриальном эпителии матки. Для изучения уровня экспрессии Maxl в матке использовался метод rpa (см. „Материалы и методы,,). Уровень экспрессии Msxl резко падает на 4-5 сутки беременности, что совпадает по времени с имплантацией эмбриона. Уровень экспрессии Wnt-5A также падает во время беременности, но с некоторым отставанием от Msxl. Экспрессия генов Msxl и Wnt-5A начинает восстанавливаться на 2-3 сутки postpartum. Результаты исследования приведены на рис.2.

Шаг*)« МогрЬвЬци ШвЬ п»и1 еирге««1оп1

Рис 3. Схема опытов с тканевыми рекомбинантами. Тканевые рекомбинанты, составленные из мезенхимы плюс эпителий матки или влагалища новорожденной мыши развивают морфологию эпителия, соответствующую источнику мезенхимы. Мезенхима матки индуцирует однослойную цилиндрическую морфологию эпителия (нижняя панель), только в этом случае наблюдается экспрессия Мзх1.

3. Мезенхима матки поддерживают экспрессию М«х1 в клетках эпителия.

Ранее было показано, что дифференцировка клеток Мюллерова эпителия по простому или многослойному типу в матке и влагалище индуцируется и определяется подлежащей мезенхимой. Для того, чтобы исследовать роль мезенхимы в регуляции эпителиальной экспрессии Мзх1 были выращены гомо- и гетеротипные рекомбинантные ткани (см. материалы и методы).

Наибольший интерес представляют результаты, полученные при анализе гетеротипных рекомбинантов методом

гибридизации in sity. Как и ожидалось, в гомотипных рекомбинантах,. полученных из эпителия и мезенхимы матки (vut/Eut) новорожденных мышей, происходила эпителиальная дифференцировка по маточному типу, и Msxl экспрессировался в клетках однослойного цилиндрического эпителия. В гетеротипных рекомбинантах, состоявших из мезенхимы матки и вагинального эпителия (Mut/Eva) наблюдалась -.ндукция образования маточного однослойного цилиндрического эпителия из вагинального эпителия, сопровождавшаяся очевидной экспрессией Msxl. Т.о., поддержание или индукция дифференцировки по пути маточного эпителия сопровождается экспрессией Мзх1(рис 3). Трансплантаты одной мезенхимы матки не содержали эпителиальных клеток, и экспрессия Msxl отсутствовала. В том случае, когда вагинальная мезенхима комбинировалась с эпителием влагалища или матки, дифференцировка шла по пути образования многослойного вагинального эпителия и экспрессия Msxl отсутствовала .Таким образом, было установлено, что поддержание или индукция вагинального эпителия ассоциирована с отсутствием экспрессии Msxl-Экспрессия (или отсутствие экспрессии) Msxl соответствует различному пути дифференцировки эпителия Мюллерового тракта в однослойный эпителий матки или в многослойный эпителий влагалища.

Экспрессия Wnt5A наблюдалась только в мезенхиме матки как рекомбинантов, так и маточной мезенхиме контроля т.е мезенхимы,выращенной без эпителия. Т.о., экспрессия Wnt-5A в мезенхиме матки не зависит от присутствия эндометриального эпителия.

ис 4. Прививка тканей мыши в почку конечности цыпленка. ) фрагмент ткани или клеточные агрегаты, привитые под чикальную эктодерму почки конечности куриного эмбриона гтадия 19-21). Дистальный конец почки крыла окрашен Nile lue sulfate для выявления апикально-эктодермального гребня. ) Контроль. Дорзальный вид на правое крыло цыпленка, ■срашенное victoria blue для выявления скелета. Обозначена эрмальная последовательность пальцев. С) Дорзальный вид на равое крыло цыпленка через десять дней после прививки рагмента ткани матки мыши в положении anterior под чикальную эктодерму почки крыла. Наблюдается индукция -щометриальной стромой матки появления укороченного ополнительного пальца З.(п=9, в пяти случаев из девяти аблюдалась дупликация пальца 3.

. Клетки матки мыши в почке конечности цыпленка. На сновании результатов наших исследований, показавших, что гны, играющие роль в морфогенезе и проявляющие ространственно-времменную ко-экспрессию с геном Msxl в роцессе развития почки конечности эмбриона, также компрессируются в тканях матки мыши, было сделано редположение о том, что индуктор Msxl в почке конечности от же, что и в матке мыши.

Для проверки гипотезы о специфичности индуцирующего сигнала был проведен эксперимент, в котором мезенхима (матки или вагинальная) мыши хирургически трансплантировалась под апикальную эктодерму почки конечности цыпленка. Результаты показали, что прививки мезенхимы матки вызывают „гомеотические,, мутации (зеркальная дупликация пальцев или другие уродства, в зависимости от расположения прививки вдоль антерио-постериорной и проксимально-дистальной оси почки конечности), аналогичные мутациям, связанным с эктопической экспрессией Msxl (рис4). При этом вагинальная мезенхима не вызывала никаких изменений и конечности развивались нормально. Позитивным контролем служили прививки фрагментов ЗРА (зона поляризующей активности) из почки конечности одного куриного эмбриона под апикальную эктодерму почки конечности другого куриного эмбриона. Результатом трансплантации ЗПА в положении anterior является дупликация пальцев. Негативным контролем служили прививки клеток линии неонатальных миобластов ЗТЗ. В этом случае конечности развивались нормально.

Для разработки клеточной модели, позволяющей исследовать механизмы индукции и регуляции Msxl гена были созданы и охарактеризованы клеточные линии мезенхимы матки и вагинальной мезенхимы (см. материалы и методы). Исследования методом гибридизации in sity показали, что культура клеток мезенхимы матки экспрессирует гены Hoxd9 и HoxdII, но теряет способность экспрессировать ген Wnt-5A. Прививки клеток клеточной линии мезенхимы матки мыши в почку конечности цыпленка не вызывали нарушений в развитии конечности. Таким образом, отсутствие экспрессии Wnt-5A в клетках мезенхимы матки коррелирует с потерей индуцирующей активности клеток при трансплантации в почку конечности цыпленка.

Рис 5. Схема экспрессии гена Maxi в процессе морфогенеза матки.

5 .Гомеотические гены ряда Hoxd экспрессируются в развивающемся и зрелом женском репродуктивном тракте, определяя границу между маткой и цервиксом. Во всех известных случаях экспрессия Maxi сопровождается экспрессией генов Wnt-5A и Hoxd9 и Hoxd! 1 в мезенхиме. Мы предполагаем, что эти гены играют роль в эмбриональном морфогенезе и установлении мезенхимо-эпителиальных взаимодействий и могут исполнять ту же функцию в процессе региональной дифференцировки Мюллерового тракта и в регулировании функций эпителия в зрелой матке. Одним из вероятных кандидатов в индукторы Maxi является фактор роста Wnt-5A. В нашей модели допускается и возможность эпителиальной регуляции мезенхимы, хотя результаты наших наблюдений показывают, что Hoxd9, HoxdII и Wnt-5A не зависят от взаимодействия с эпителием (рис 5). Методом гибридизации in aity было показано, что гены Hoxd9 (Нох4.4) и HoxDl I (Нох4.6) экспрессируются в

эндометриальной строме матки мыши, но не в миометрии, и уровень транскрипции сравнительно выше в субэпителиальном слое. Hoxd9 hHoxdI I не зкспрессируются в клетках стромы цервикса и влагалища. В отличие от генов Wnt-5A и Msxl, во время беременности уровень экспрессии генов Hoxd9 и HoxdII не снижается.

б. Экспрессия гена Ьившп Maxi на разных фазах менструального " лкпа.

Методом гибридизации in eity было показано, что ген human Msxl экспрессируется в железистом и выстилающем эпителии эндометрия. Его экспрессия колеблется в зависимости от фазы менструального цикла (рис 5.). Уровень экспрессии Msxl резко падает в середине секреторной фазы, когда возрастает уровень прогестерона. Колебания уровня экспрессии гена human Wnt-5A во временном отношении были аналогичны колебаниям Msxl.

ВЫВОДЫ

1. Гомеобокс-содержащий ген Msxl экспрессируется в эпителии Мюллерова тракта и его экспрессия снижается в развивающемся вагинальном эпителии по мере его дифференцировки.

2. Ген Msxl экспрессируется в клетках однослойного цилиндрического эпителия зрелой матки и не экспрессируется в многослойном эпителии влагалища. Уровень экспрессии Msxl не зависит от фазы эструса. Экспрессия Msxl резко падает во время беременности в день имплантации эмбриона.

3. Экспрессия Msxl в эндометриальном эпителии зависит от мезенхимо-эпителиальных взаимодействий. При этом экспрессия Msxl не зависит от позиционного происхождения эпителия (вагинальный или матки), но зависит от происхождения мезенхимы. Поддержание или индукция

:прессии гена Msxl осуществляется через контакт клеток стелил с мезенхимой матки.

Ген human Msxl экспрессируется в железистом и стилающем эпителии матки человека. Уровень экспрессии man Msxl колеблется в зависимости от фазы менструального кла: достигая максимума на ранней и средней олиферативной стадии и резко снижаясь к середине креторной фазы.

Ген human Wnt-5A экспрессируется в клетках дометриальной стромы человеческой матки. Во процессе нструального цикла уровень его экспрессии колеблется новременно с колебаниями экспрессии human Msxl. Эндометриальная строма (мезенхима) матки мыши, рургически имплантированная под апикальную эктодерму чки конечности ципленка индуцирует образование грхчисленных пальцев. Такая же мутация наблюдается при топической экспрессии Msxl, что свидетельствует о сококонсервативной, невидоспецифичной системе регуляции х1.

1Мортализованные клетки мезенхимы матки мыши теряют особность экспрессировать ген Wnt-5A и также теряют особность вызывать мутацию в почке конечности ципленка упликацию пальцев).

Ген Wnt-5A экспрессируется в клетках эндометриальной ромы матки мыши. Во время беременности уровень Wnt-5A дает одновременно с падением уровня Msxl. Гомеотические гены Нох4.4 и Нох4.6 стабильно спрессируются в субэпителиальной эндометриальной строме тки мыши, продолжая экспрессироваться во время ременности; и не экспрессируются в цервикальной и гинальной строме. Иммортализованные клетки мезенхимы тки мыши сохраняют способность экспрессировать Нох4.4 и х4.6.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Anna Pavlova, Eugenie Boutin, Gerald Cunha and David Sa Msxl (Hox-7.1) in the adult mouse uterus: cellular interac underlying regulation of expression.//Development 120, 335 (1994).

2. John Lincecum, Karl Degenhardt, Giovanna Marazzi, Anna Pavlova, Kenning Song, Yaogi Hang, and David Sassoon. Th genes regulate Ca +2 dependent adhesion and segregation in vitro. // 1994 Northeast Regional Developmental Biology Conference. Marine Biological laboratory, Woods Hole, MA.

3. J.Lincecum, K.Degenhardt, K.Song, Y.Wang, A.Pavlova,

D.Sassoon. Role of Homeobox genes in muscle development - ! and late events.// 1993 International Developmental Biolog Meeting, Greece.

4. MasayuXi Hosoi, Isumi Takasaki, Anna Pavlova-Rezakova, 1 Himeno, Aram V.Chobanian, Peter Bresher. Selective Inductii an Embrionic Fibronectin Isoform in the Rat Aorta In Vitro Circulation Research, vol 73, No 4, 1993.