Экспрессия гена CTR1 у млекопитающих при разных состояниях метаболизма меди и IN SILICO анализ его белкового продукта

Самсонов, Сергей Алексеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экспрессия гена CTR1 у млекопитающих при разных состояниях метаболизма меди и IN SILICO анализ его белкового продукта
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия гена CTR1 у млекопитающих при разных состояниях метаболизма меди и IN SILICO анализ его белкового продукта"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

САМСОНОВ Сергей Алексеевич

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА СТЯ1 у МЛЕКОПИТАЮЩИХ ПРИ РАЗНЫХ СОСТОЯНИЯХ МЕТАБОЛИЗМА МЕДИ И Ш БШСО АНАЛИЗ ЕГО БЕЛКОВОГО ПРОДУКТА

03.01.04 - биохимия 03.01.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2010

СЮ34Э3221

003493221

Работа выполнена в Отделе молекулярной генетики Учреждения Российской академии медицинских наук «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН» и на кафедре биофизики Физико-Механического факультета Государственного образовательного учреждения «Санкт-Петербургский государственный политехнический университет»

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Людмила Валентиновна Пучкова

кандидат физико-математических наук Алексей Николаевич Скворцов

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Владимир Владимирович Морозов

Кандидат биологических наук Владимир Александрович Карасев

Ведущее научное учреяедение: Институт цитологии Российской академии наук

Защита состоится « 3 » апреля 2010 г. в часов на заседании совета Д 212.232.09 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская набережная, д. 7/9.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. А. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета (199034 Санкт-Петербург, Университетская набережная, д. 7/9).

Автореферат разослан «_»_2010 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 212.232.09

Курилова Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В живых системах медь в составе активных центров ряда ферментов участвует в реализации жизненно важных функций в клетках всех типов (Karlin, 1993; Turnlund et al., 1998). В то же время вследствие изменения степени окисления Cu(I)<->Cu(II) ионы меди могут вызывать образование гидроксильных радикалов (Linder, 2001). Безопасное поступление меди в клетки, ее перенос к местам образования купроэнзимов и выведение из клеток обеспечивает специальная система белков, метаболическая система меди (МСМ). Некоторые гены этой системы клонированы и изучены основные принципы ее работы. МСМ всех эукариотов сходны, они включают интегральные мембранные и растворимые цитозольные белки, кодируемые ортологичными генами, их структуры и функции характеризуются высокой консервативностью. Перенос ионов меди белками этой системы к местам образования купроэнзимов происходит однонаправленно и последовательно при прямых белок-белковых взаимодействиях (Репа et al., 1999; Пучкова, Платонова, 2004; Kim et al., 2008). Благодаря этому в клетках нет свободных ионов меди (Rae et al., 1999). Мутации в генах МСМ, экологический избыток или недостаток меди, приводят к развитию тяжелых заболеваний (анемия, сердечно-сосудистые болезни, остеопороз, рак, нейродегенеративные заболевания) (Gaggelli et al., 2006). Медь также участвует и в регуляции апоптоза. Так, ионы меди специфически связываются с Х-сцепленным ингибитором апоптоза (XIAP) и вызывают освобождение из комплекса с ним каспазу 3, которая инициирует апоптоз (Mufti, et al., 2007).

В реализации всех этих биологических ролей меди ключевым событием является перенос меди в клетку. Он осуществляется белком семейства CTR1 (copper transporter 1) высокоаффинных импортеров меди (Sharp, 2003). Нокаут гена CTR1 у мышей приводит к ранней гибели эмбрионов-гомозигот, а у гетерозигот содержание меди изменяется тканеспецифично (Lee, 2000). На ранних этапах эмбрионального развития амфибий и млекопитающих белок CTR1 участвует также в морфогенезе и дифференцировке клеток (Haremaki, et al., 2007; Haremalci, et al., 2009). К тому же белок CTR1 участвует в импорте цисплатина, противоопухолевого платинового препарата (Safaei, 2006). Несмотря на интенсивные исследования, многие аспекты функционирования гена CTR1 и его белкового продукта остаются невыясненными. В частности, неясно, связана ли экспрессия гена CTR1 с изменением метаболизма меди в клетках и статусом меди у млекопитающих, как устроена купрофильная пора белка CTR1, какой внеклеточный переносчик транспортирует медь к N-концевому домену CTR1, локализованному на поверхности клетки у млекопитающих. Внутриклеточный акцептор ионов меди от CTR1 также пока не установлен. Ответы на эти вопросы важны для понимания общего механизма транспорта меди в клетке. Представленная диссертация выполнена с учетом актуальности изложенных проблем. Ее цель состоит в сравнительном анализе тканеспецифической активности гена CTR1 у млекопитающих и in silico анализе белковых продуктов генов CTR1.

Для достижения заявленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Сопоставить уровень CTRl-мРНК, определенный методом полуколичественного ОТ-ПЦР анализа, в органах, отличающихся типами метаболизма меди.

2. Проанализировать тканеспецифическую экспрессию гена CTR1 при различных статусах меди: при сниженной и повышенной оксидазной активности церулоплазмина (ЦП) и концентрации меди в сыворотке.

3. Сравнить аминокислотные (а.к.) последовательности CTR1 разных видов, оценить потенциальную функциональную роль доменов и аминокислотных остатков (а.о.) в формировании купрофильной поры, образования функционирующего гомотримера CTR1 и участков взаимодействия с потенциальными донорами меди.

4. Оценить металлосвязывающую способность консервативного С-концевого мотива His-Cys-His позвоночных.

Научная новизна полученных результатов. Все представленные в работе результаты являются новыми. Показано, что экспрессия гена CTR1 в онтогенезе изменяется органоспецифически, зависит от уровня меди в клетке и ее статуса во внеклеточной среде. На основе полученных экспериментальных данных предложены модели регуляции тканеспецифической экспрессии гена CTR1, которые дополнены анализом цис-регуляторной области гена CTR1. Охарактеризована экспрессия гена CTR1 в опухолевых тканях, а также при недостатке оксидазного ЦП, предполагаемого донора меди для CTR1, дефицит которого был искусственно вызван добавлением в пищу ионов серебра. Эти данные дополнены анализом докинг-взаимодействия между ЦП и CTRL В результате этого анализа выявлены участки этих белков, вероятно, участвующих в осуществлении белок-белковых взаимодействий. Теоретический анализ аминокислотной последовательности белка CTR1 позволил создать одну из первых моделей тримерного комплексе CTR1 в мембране, принципиальная верность которой позже была подтверждена экспериментальными методами (Unger et al., 2009). Медьсвязывающая способность мотивов CTR1, предположительно участвующих в осуществлении транспорта меди через плазматическую мембрану и в клетке, проанализированы на уровне квантово-химической теории и молекулярной механики и рассмотрены в контексте белок-белковых взаимодействий, лежащих в основе МСМ.

Научно-практическое значение полученных результатов состоит в том, что они углубляют знания о механизмах, лежащих в основе нарушения метаболизма меди, ведущих к развитию нейродегенеративных болезней, а также расширяют общие представления о метаболизме металлов в организме млекопитающих. В практическом плане, использование данных о тканеспецифическом изменении статуса меди в онтогенезе млекопитающих и экспрессии генов, участвующих в метаболизме меди, в частности, CTR1, способствует как более эффективному лечению, так и предотвращению заболеваний, связанных с повреждением путей гомеостаза меди. Выявление связи между статусом меди во внеклеточной среде и токсическим эффектом цисплатина на рост клеток открывает путь для оптимизации протоколов применения этого противоопухолевого препарата в клинике.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Активность гена CTR1 связана с метаболизмом меди.

2. Транскрипционная активность гена CTR1 млекопитающих регулируется, по крайней мере, двумя различными механизмами: репрессируется при высоком содержании меди в ядре и активируется/инактивируется при низком содержании меди в зависимости от требуемого физиологическими условиями уровня синтеза купроэнзимов.

3. Активность гена CTR1 связана с уровнем меди и оксидазного ЦП, основного источника меди для клеток негепатоцитарных рядов. Точно также уровень оксидазного ЦП во внеклеточных жидкостях (кровь, ликвор, молоко) пропорционален активности гена CTR1.

4. По данным моделирования на основе анализа а.к. последовательностей филогенетически консервативные ТМД2 и ТМДЗ белка CTR1, содержащие 21 а.о., способные координировать медь, образуют амфипатичную поверхность. На основе этого предложена модель гомотримера CTR1, в которой ТМД2 и ТМДЗ образуют купрофильный канал, а ТМД1 не участвует в образовании медьпроводящей поры. Теоретически рассчитанный максимальный радиус поры равен 4.4 Ä.

5. Медь, связанная мотивами His-Cys-His в цитозольном домене гомотримера CTR1, может быть передана Си(1)-шаперонам, имеющим медьсвязывающий мотив Cys-X-X-Cys. Количество атомов меди, связанных с цитозольным доменом, влияет на возможность их передачи цитозольным шаперонам.

Апробация результатов работы. По теме диссертации опубликовано две статьи в рецензируемых журналах. Результаты работы были представлены на: Европейской Конференции по генетике человека (Мюнхен, Германия, 2004); Международной конференции BIFI «От физики к биологии: интерфейс между экспериментом и вычислениями» (Сарагоса, Испания, 2006); 31-м Конгрессе FEBS (Стамбул, Турция, 2006); 8-й, 9-й и 10-й Путинской школе-конференции молодых учёных «Биология — наука XXI века» (Пущино-на-Оке, Московская область, 2004, 2005 и 2006); Международной конференции по системной биологии, биоинформатике и синтетической биологии (Манчестер, Великобритания, 2007) и V съезде ВОГИС (Москва, июль, 2009).

Личный вклад соискателя. Анализ нуклеотидных и а.к. последовательностей, выполнение всех расчетов, получение основной части экспериментальных результатов, участие в написании статей.

Структура диссертации. Рукопись содержит «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и их обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список цитируемой литературы», включающий 138 иностранных и 11 отечественных источников. Диссертация изложена на 136 страницах. Результаты представлены в 11 табл. и иллюстрированы 34 рис.

Работа поддержана грантами РФФИ № 03-04-48748, 06-04-49786 и 09-04-01165.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы: крысы линии Вистар и их потомство, полученное в виварии НПИЭМ РАМН, 7-недельные самцы мышиной линии CD-I (иммунодефицитные мыши), мыши линии C57BI/6J, Min мыши, культивируемые клетки линии НСТ116 и SKOV3, антитела к ЦП крысы и человека, антитела к CTR1, полученные к 15-членному синтетическому пептиду, соответствующему последовательности 17Т...Н31 (нумерация по базе данных Uniprot). Реактивы для электрофореза - фирмы «Sigma».

Экспериментальные методы. Тотальную РНК изолировали с использованием реактива "TRIzol Reagent". Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически. Гель-электрофорез ПЦР-продуктов проводили в 1% агарозном геле. Гели окрашивали бромистым этидием (Sambrook et al., 1989). В качестве маркеров использовали ДНК-маркеры молекулярных весов 100—1000 п. н. и 250—10000 п. н. фирмы «Сибэнзим» (Новосибирск). Синтез кДНК в реакции обратной транскрипции (ОТ) проводили на тотальной РНК со случайными праймерами, как описано ранее (Васин и др., 2004). ПЦР па полученной кДНК проводили со специфическими праймерами: для амплификации транскриптов CTR1

717 ino АЛЛ АЗП

использовали прямой 5'- tgcctatgaccttctactttgg -3' и обратный 5'- atgaagatgagcatgaggaag -3' праймеры. Последовательности праймеров для выявления ЦП, ГФИ-ЦП (ЦП, связанного с плазматической мембраной через гликозилфосфатидилинозитоловый якорь) и ß -актина

использовали, как описано ранее (Васин и др., 2005). Праймеры и условия для ПЦР подбирали с помощью программы "Gene Runner 3.0". Для полуколичественной характеристики экспрессии генов использовали соотношение между уровнем мРНК исследуемого гена и мРНК ß-актина (Marone et al., 2001). Выделение субклеточных фракций из гомогената клеток, приготовленного в буфере, содержащем 0,25 М сахарозу, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 100 мМ KCl, 8 mM MgCl2, 0,04% ß-меркаптоэтанол, смесь ингибиторов протеаз фирмы "Sigma" (США) проводили методом дифференциального или равновесного центрифугирования (Васин и др., 2005). Электрофорез белков проводили в 8%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) в неденатурирующих условиях, или в присутствии 0.1%-ного додецилсульфата натрия (ДЦС) по методу Laemmli (1970). Перенос белков из ПААГ на нитроцеллюлозную мембрану осуществляли полусухим методом. Специфические иммунные комплексы выявляли после гибридизации со вторыми антителами, конъюгированными с пероксидазой, с помощью хемилюменисцентных проявителей. Концентрацию меди измеряли методом атомно-абсорбционной спектрометрии с электротермической атомизацией и зеемановской коррекцией неселективного поглощения на спектрометре «Perkin-Elmer», Model 4100ZL, США. Концентрацию ЦП определяли методом количественного иммуноэлектрофореза (Kroll, 1973), который проводили в 1% агарозном геле, содержащем 100 мкг/мл специфических поликлональных антител (фракция IgG), полученных к электрофоретически чистому препарату ЦП (Абю/280=0.046). Компьютерные методы. При выполнении работы использовали базы данных открытого доступа для нуклеотидных и аминокислотных последовательностей GenBank и RefSeq и для пространственных структур биомолекул PDB. Для анализа аминокислотных и нуклеотидных последовательностей использовали программы ClustalX, UCSC Proteome Browser, Multalin, Spidey, PsiPred, GOR4, DiAlign, пакет программ PHYLIP, пакет программ GEMS Launcher, Vista Tools, MultTF и другие продукты, представленные на сайтах DCODE.org и ExPASy Proteomics Server, базы данных TraFac и SwissProt. Расчеты геометрии молекулярных структур и энергий взаимодействия были выполнены в программе HyperChem 7.01 (HyperCube) с использованием методов молекулярной механики ММ+, полуэмпирического квантово-химического метода ZINDO/1 и ab initio расчетов. Визуализация молекулярных структур осуществлялась в программах RasMol 2.7, VMD 1.8.6. Для молекулярного докинга использовали программу Hex 4.5.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В работе изучена экспрессия гена CTR1 на фоне различных типов метаболизма меди, а также при искусственно сниженном и повышенном статусе меди. В ней используются два понятия: метаболизм меди и статус меди. Под метаболизмом меди понимается уровень экспрессии генов медьтранспортных белков, внутриклеточное содержание меди и ее распределение в клеточных компартментах. Понятие «статус меди» использован для оценки внеклеточного баланса меди, о котором судят по соотношению между общей концентрацией сывороточной меди, концентрацией меди, ассоциированной с ЦП, оксидазной активностью ЦП и содержанием иммунореактивного ЦП в крови. Вторая часть является теоретической. В работе также проведен анализ а.к. и нуклеотидных последовательностей членов семейства CTR1, и in silico оценены медьсвязывающие свойства мотивов белка CTR1, предложена его модель в мембране.

Экспрессия гена CTR1 при различных типах метаболизма меди В качестве моделей метаболизма меди использованы печень и мозг новорожденных и взрослых крыс, а также растущая, дифференцирующаяся и инволирующая молочная железа.

Экспрессия гена CTR1 в печени.

Метаболизм меди в печени в период эмбрионального и раннего постнатального развития (у крыс до 13 дня жизни) соответствует эмбриональному типу (Hurley et а/., 1980; Пучкова и др.. 1994). В этот период медь, поступающая в печень, накапливается в гепатоцитах до концентраций, на порядок больших, чем у взрослых млекопитающих. Активность гена ЦП в печени низка, концентрация ЦП и меди в крови в несколько раз ниже, чем у взрослых.

Рис. 1. Изменения концентрации меди в клетках печени крысы при сменс типа метаболизма медн. Ядра ( ),

лизосомы ( * ), сыворотка крови ( ® ),

концентрация ЦП ( ^ ), мг/100 мл сыворотки. Ось абсцисс: возраст, дни. Ось ординат: [Си] в лизосомах и ядрах, мкг/мг белка; [Си] в сыворотке крови, мкг/л. Субклеточные фракции получены методом равновесного центрифугирования в ступенчатом градиенте концентраций сахарозы.

Переход на взрослый тип метаболизма меди сопровождается резким снижением содержания меди в печени, повышением активности гена ЦП в гепатоцитах и увеличением концентрации меди и ЦП в крови. Детальных исследований, посвященных изучению распределения меди в клетках печени, не проводилось. Результаты соответствующих измерений для крыс, проведенные в данной работе, представлены на рисунке 1. Видно, что вначале медь аккумулируется в ядрах, к 6-ому дню концентрация меди в них падает и повышается в лизосомах, где она растет до 12-дневного возраста и затем резко падает. При этом при достижении высоких концентраций меди в ядрах, определенная полуколичественным ОТ-ПЦР, активность гена CTR1 снижается в 8 раз, а накопление меди в лизосомах продолжается.

ctr1

5 12 20 120

20 120

Рис. 2. Квазистационарный уровень СТМ-мРНК

( ) и ЦП-мРНК ( ® ) в печени крыс разного возраста. Ось абсцисс: возраст, ординат содержание мРНК, отн. ед.

Внутриклеточное перераспределение меди осуществляется при низкой активности гена ЦП, которая потом возрастает у взрослых на порядок. На фоне высокого содержания ЦП в крови взрослых животных экспрессия гена С77?/ вновь устанавливается на высоком уровне (рис. 2).

Экспрессия гена СТШ и статус меди в отделах мозга. В мозгу новорожденных содержание меди ниже, чем у взрослых млекопитающих, а повышение концентрации меди различных отделах мозга происходит неравномерно. Мы сопоставили содержание меди с экспрессией генов СТЯ1 и ЦП в 7 различных отделах мозга крысы: коре, мозжечке, гиппокампе, миндалевидном теле, гипофизе, гипоталамусе и в сосудистом сплетении в 5-й, 10-й, 20-й, 30-й и 120-й день жизни. Результаты показали, что 1) в коре и гиппокампе происходит незначительное, но

прогрессивное увеличение концентрации меди; 2) в миндалевидном теле содержание меди практически одинаковое на 5-е и 120-е сутки, но заметно увеличивается в течение первых 20 дней жизни, а затем снижается; 3) в мозжечке оно достоверно возрастает примерно в два раза. Концентрация меди в коре, мозжечке и гиппокампе между собой различаются мало. В этих отделах она ниже в 2 раза, чем в гипофизе. Самая высокая концентрация меди определяется в гипоталамусе новорожденных крыс. Затем она снижается почти в два раза. В сосудистом сплетении у новорожденных крыс концентрация меди при рождении почти в 20 раз выше, чем у взрослых, и медь продолжает накапливаться до 20-го дня. Затем она падает, достигая у взрослых самого низкого уровня по мозгу. Таким образом, самые существенные изменения концентрации меди наблюдаются гипофизе, гипоталамусе и сосудистом сплетении. В этих отделах мозга была измерена относительная концентрация мРНК, кодирующих СТШ, ЦП и ГФИ-ЦП (рис. 3).

Рис. 3. Квазистацнонарнмп уровень СТКI мРНК, ЦП-мРНК и мРНК ГФИ-ЦП в

гипофизе (1), гипоталамусе (2) и сосудистом сплетении (3). Ось ординат: содержание мРНК, отн. ед. (п) — 10-дневные и (■) — взрослые крысы (данные получены совместно с Бабич П.С.).

Представленные данные

показывают, что в гипоталамо-гипофизарной системе активность гена СТШ существенно повышается в течение развития. В сосудистом сплетении, которое играет ведущую роль в поддержании баланса меди в мозгу, как и в печени с возрастом уровень СТШ-мРНК повышается. У новорожденных в гипофизе и гипоталамусе преимущественной изоформой продукта транскрипции гена ЦП является секреторный ЦП. У взрослых животных - мРНК ГФИ-ЦП. В сосудистом сплетении соотношение изоформ примерно равное. Учитывая, что обе изоформы ЦП содержат одинаковое количество атомов меди, можно заключить, что активность экспрессии гена СТШ и ЦП коррелируют между собой.

Экспрессия гена СТШ и статус меди в дампирующей молочной железе. В течение беременности увеличивающаяся клеточная масса молочной железы нуждается в меди, необходимой для образования купроэнзимов. После родов единственным источником меди для новорожденных является молоко матери, которое содержит сбалансированное количество ионов меди, упакованных в безопасную оболочку — ЦП молока (РШопома й а/, 2007). Содержание меди в молоке регулируется активностью гена ЦП молочной железы и снижается по мере лактации. Мы обнаружили, что в процессе лактации активность гена СТШ коррелирует с активностью гена ЦП, с которого в течение беременности образуются обе изоформы, но ГФИ-ЦП мРНК формируется в течение беременности, а в период лактации — мРНК секреторного ЦП. Активность гена СТШ также пропорциональна содержанию меди в молоке, основная часть которой включена в ЦП.

с ш1 н цп гфи-цп н

ППп^1 А

1.0

1.4

1.2

CTR-

Рис. 4. Квазистациомарный уровень СТШ, ЦП, ГФИ-ЦП мРНК в лактирующей молочной железе. Ось абсцисс: дни после родов. Ось ординат: Уровень мРНК, отн. ед.

0.8

НпгЬ

Экспрессия гена CTR1 и статус меди в cepdi/e. В сердце концентрация меди не меняется в течение онтогенеза, ген ЦП не экспрессируется, а источником меди является экстрацеллюлярный ЦП (Linder et а!., 1974). Результаты, полученные в работе, показывают, что

0.6

0.4

0.2

0.0

0 1 10 20 0 1 10 20 0 1 10 20

периоду увеличения массы сердца соответствует высокий относительный уровень CTRl-мРНК, который к 120-му дню жизни падает в 5 раз.

Экспрессия гена CTR1 в печени и мозге крыс с низким статусом меди

У лабораторных крыс можно вызвать снижение концентрации меди, ассоциированной с ЦП, добавлением ионов серебра в корм - Ag-крысы (Pribyl et ai, 1981). Ag([), будучи изоэлектронным аналогом Cu(I), использует белки МСМ для собственного транспорта (Srivaslava et а!., 1995). Ионы серебра переносятся по цепи CTR1—>АТОХ!-»АТР7В и встраиваются в ЦП. Это предотвращает включение ионов меди в активные центры ЦП, но не влияет на синтез и секрецию ЦП. Так как у крыс с ЦП ассоциировано примерно 90% неклеточной меди, в сыворотке крови концентрация меди падает в 10 раз (Клотченко и др., 2008). Ни физиологическая функция серебра, ни его токсическое действие на молекулярном уровне пока не описаны. В работе Ag-крысы были использованы как модель животных с низким статусом меди.

Экспрессия гена CTR1 в печени и мозгу взрослых крыс при дефиците оксидазного ЦП в крови. У взрослых крыс, получавших серебро 4 недели из расчета 50 мг на 1 кг массы в сутки (естественное потребление серебра на 5 порядков ниже), уровни экспрессии CTR1 и ЦП в печени не меняются. Содержание иммунореактивного ЦП в крови не изменяется, но его основная часть представлена апо-формой ЦП. В то же время, в мозгу взрослых Ag-крыс экспрессия генов CTR1 и ЦП почти полностью подавляется, при достоверном уменьшении концентрации меди только в гипоталамусе и в гипофизе. Эти данные позволяют думать, что:

1) активность гена CTR1 в печени не меняется, так как медь к клеткам печени доставляется альбумином, а пул этой меди (около 10% от общего количества) у Ag-животных не меняется;

2) источником меди для клеток мозга является ЦП.

Экспрессия гена CTR1 при повышенном статусе меди

В работе проанализирована экспрессия гена CTR1 и ЦП в печени и в опухолевых клетках. Использованы три животные модели: иммунодефицитные мыши с растущими опухолями человека, мыши линии C57B1/6J с растущими мышиными меланомами и Min мыши (генетически обусловленный рост множественных аденом кишечника). Результаты показали, что у всех животных опухолевый рост вызывает повышение оксидазной активности ЦП в сыворотке крови примерно в 2 раза. Повышение содержания ЦП в крови совпадает с 2-кратным увеличением содержания ЦП-мРНК и CTRl-мРНК в печени. Содержание CTRl-мРНК достоверно

увеличивается также и в опухолях по сравнению с нормальной тканью, или с клетками этой же линии, находящимися в культуре. Таким образом, при опухолевом росте экспрессия генов CTR1 и ЦП повышается в печени, и это, по-видимому, обеспечивает повышение статуса меди, необходимое для обеспечения роста опухолей, метаболизм меди в которых также интенсифицируется.

В целом все данные представленные в экспериментальной части работы указывают на центральную роль белка CTR1 как в контроле над метаболизмом меди в клетках, так и в поддержании ее статуса в крови.

Доказательства существования связи между уровнем серебра в среде культивирования и эффектом цисплвтина на культивируемые клетки линии SKOV3

Представленные данные иллюстрируют связь между уровнем экспрессии гена CTR1, метаболизмом меди и ее статусом. Они также показывают, что ионы серебра используют путь переноса меди из внеклеточного пространства к месту встраивания их в ЦП, и в этом процессе центральное место принадлежит белку CTR1. В 2002 году было впервые показано, что цисплатин, широко используемый противоопухолевый платиновый препарат, поступает в клетки с помощью CTR1 (Safaei, 2002). При этом продемонстрировано, что цисплатин и ионы меди переносятся в клетки конкурентно. Однако трудно представить, что платина(П), координационная химия которой принципиально отличается от химии меди(1), связывается и передается в клетку по идентичному с Cu(I) ионами механизму. N-концевой внеклеточный домен CTR1 длиной 66 аминокислотных остатков содержит три мотива, обогащенных гистидином и/или метионином (мотив 1: 'MDHSHHMGMSYMD13, мотив 2: "QPSHHHPT26 и мотив 3: 39SMMMMPMT46). Все мотивы важны для переноса Cu(I). Какие из них принимают участие в переносе платины, остается не изученным. В нашей группе разработана рабочая гипотеза, предусматривающая, что критическую роль в связывании платины играют метионин-богатые мотивы CTR1 и в особенности ближайший к плазматической мембране мотив 3 (рис. 5).

Рис. 5. Гипотетическая схема импорта цисплатина в клетки через CTR1 с участием ионов меди. А — платиновый препарат связывается с кинетически-предпочтительными SCH3-rpynnaMH остатков Met в мотиве М2, Б - медь, получаемая от внеклеточного донора (ЦП) связывается с мотивом Н2, В - медь облегчает диссоциацию метионина из платинового комплекса и происходит перенос платины в клетку.

Это происходит благодаря способности платины образовывать кинетически предпочтительные комплексы с серой. Вероятно, на следующем этапе ионы меди, находящиеся в составе гистидин-богатого мотива 2, вытесняют платину из комплекса с атомами серы и таким образом способствуют ее попаданию в купрофильную пору, формируемую трансмембранными доменами гомотримера CTR1. Это предположение основывается на данных, продемонстрировавших, что in vitro ионы меди могут в определенных условиях вытеснять платину из ее комплексов с S-донорами (Cheng&Pai. 1989). С позиций этого предположения для изучения механизма импорта

CTR1

платины с участием CTR! были использованы Ag-животные. Три группы крыс (п=10), контрольная (1), Ag-крысы, сохранившие Уг оксидазной активности (2), и Ag-крысы, были обработаны ЛД50 цисгшатина. Оказалось, что у Ag-животных цисплатин вызывает отложенный токсический эффект, возможно, связанный с нефротоксичсским действием, но не с цитостатическим. Влияние серебра на токсический эффект цисплатина было также испытано на культивируемых клетках. В этом эксперименте в каждую лунку %-членной платы высевали клетки линии SKOV3, первично полученные из карциномы яичника человека. Клетки росли в присутствии разных количеств Ag-среды без цисплатина и с цисплатином постоянной концентрации. Через 24-часовые интервалы с помощью МТТ-теста определяли количество выживших клеток, относили к количеству клеток в контрольных лунках. Результаты показывают, что среда, насыщенная Ag, является токсической, однако, разведенная в 2 раза, через сутки проявляет лишь 30% токсичности, которая нарастает во времени. В присутствии 25% Ag-среды токсический эффект не наблюдается. Цисплатин вызывает прогрессивную, в зависимости от времени культивирования, гибель клеток. Через 24 и 48 часов в 25% Ag-среде повышается гибель клеток, вызванная цисплатином. Это однозначно демонстрирует связь между транспортом Cu/Ag и цисплатином.

In silica анализ продуктов гена CTR1 разных видов Методами компьютерного анализа построена молекулярная модель функционирования CTR1, оценена способность цитозольного домена CTR1 связывать ионы меди, проанализирована потенциальная способность доноров и акцепторов меди для CTR1 взаимодействовать с этим белком.

Экзон-интронная организация генов семейства CTR1 была проанализирована для 5 генов CTR1: человека, мыши, крысы, D. Rerio и дрожжей S. cerevisae. Все гены позвоночных, содержат 1-й некодирующий и 4 кодирующих экзона (2-5). У дрожжевого гена нет интронов, кроме того, он самый короткий (1221 н.п.). Самый длинный ген (42905 н.п.) и мРНК у человека.

Филогенетический анализ белков семейства CTR1.

Для аминокислотных последовательностей CTR1 было построено неукорененное филогенетическое дерево, которое демонстрирует, что они образуют две группы (рис. 6).

Рис. 6. Филогенетическое дерево для CTR1, вычисленное по методу наименьших квадратов Фитча (программа F1TCH).

Первая группа включает в себя CTR1 высших эукариотов, в ней четко выделяется кластер, образованный последовательностями CTR1 позвоночных, а также кластеры насекомых, растений и нематод. Вторая группа включает последовательности CTR1 филогенетически низших эукариот. Топология эволюционного дерева для CTR1 согласуется с топологией видового дерева для эукариогических организмов.

Филогенетический анализ отдельных топологических доменов белков семейства CTR1 показал, что ТМД2 и ТМДЗ характеризуются наименьшим числом замен в эволюции, а наибольшую вариабельность в эволюции проявляют N-концевые последовательности.

Анализ аминокислотных последовательностей белков семейства CTR1. Выравнивание продуктов гена CTR1 показывает 68% гомологии у позвоночных, что говорит о высокой консервативности белка. Все белки семейства CTR1 имеют потенциальные медьсвязывающие мотивы: на N-конце у позвоночных присутствуют два М/Н-богатых мотива, а у дрожжей - M/S богатые мотивы; на С-конце, за исключением дрожжей, имеются С/Н богатые мотивы. У позвоночных и дрозофилы С-конец представляет собой консервативную последовательность из 14 а.о. (WKKAVVVDITEHCH) с медьсвязывающим мотивом НСН.

Анализ аминокислотной последовательности CTR1 человека. Длина последовательности белка CTR1 человека существенно меньше, чем у дрожжей (190 а.о. против 406 а.о.), только за счет более коротких N- и С-концов. По сравнению со среднестатистическим белком CTR1 обогащен Н и М (в N-конце) и обеднен R.

Анализ N-концевого экстрацеллюлярного домена CTR1 человека и дрожжей. В N-концевой последовательности CTR1 человека присутствуют три остатка Р, находящиеся непосредственно в Н2 и М2 мотивах, и разрушающие любую потенциальную стереорегулярную структуру. Кроме того, N-конец CTR1 гликозилирован как минимум в одной позиции между мотивами Н1М1 и Н2. Поэтому, скорее всего, представляет собой динамически подвижную М/Н «липкую ленту» для получения Си(1) от внеклеточного донора. При тримеризации N-концы молекулы CTR1 должны ориентироваться под углом 120° друг относительно друга, образуя воронку, через которую транспортируются ионы меди.

В предсказанной вторичной структуре для дрожжевой а.к. последовательности N-домена CTR1 присутствует длинный а-спиральный участок, на котором частично локализован один из M/S-богатых участков, причем остатки М находятся с одной стороны а-спирали. Другой медьевязывающий мотив находится на участке с неупорядоченной вторичной структурой. Существенные отличия в структуре для N-конца CTR1 дрожжей и человека, могут отражать тот факт, что CTR1 дрожжей транспортирует из окружающей среды несвязанные ионы меди, тогда как для CTR1 млекопитающих нет свободных ионов меди во внеклеточной среде. Это также может объяснять отсутствие остатков Н в N-конце CTR1 дрожжей. CTR1 млекопитающих функционирует в среде с постоянным значением рН, тогда как дрожжевой CTR1 функционирует в окружающей среде, рН которой может меняться, поэтому наличие Н делало бы его структуру, а также реализацию медьевязывающей функции N-конца зависимой от рН.

Модель олигомерного комплекса CTR1 в мембране. Модель молекулы CTR1 согласно гидропатическому профилю (Sharp, 2003), сходна у всех организмов и включает экстрацеллюлярный, три трансмембранных (ТМД) и цитозольный домены. Предсказания вторичной структуры указывают преимущественно а-спиральную конформацию для всех ТМД. При этом ТМД2 и ТМДЗ теоретически способны образовывать гидрофильный канал, так как ориентация потенциально медьевязывающих а.о. в этих доменах при а-спиральной конформации предполагает образование этими двумя доменами амфипатической поверхности. Гидрофобность

ТМД1 и его удаленность от ТМД2 на 54 а.о. позволяют предположить, что ТМД1 не участвует непосредственно в образовании купрофильного канала.

Биохимические исследования показали, что у дрожжей и у млекопитающих CTR1 на плазматической мембране существует в виде гомогримера (Lee, 2000; Danois et al., 1994). На основе этих данных принята модель канала, образованного девятью ТМД гомотримера (Pitig and Thiele, 2002) (рис. 7а). Мы же, основываясь на амфипатичности ТМД2 и ТМДЗ, а также гидрофобное™ ТМД1, предположили образование тримерного канала из шести ТМД (рис. 76). В такой модели, в полость канала обращены R-группы 21 а.о., способные к координации атома меди. В сторону фосфолипидного бислоя из гидрофильных а.о. ориентированы только Т170 ТМД2 (рис. 7в). Учитывая, что радиус типичной a-спирали составляет 2.3 Â, радиус поры, сформированной девятью ТМД составляет не менее 6.6 Â, а шестью ТМД - 4.4 Â. В работе (Aller, Linger, 2006) но изучению структуры белка CTR1 методом двумерной кристаллизации было показано, что радиус «поры» составляет 4.5 Â. Другим важным предсказанием, подтвержденным авторами, является локальная С3 симметрия медной «поры». Таким образом, теоретически предложенная нами модель поры хорошо согласуется с этими экспериментальными данными.

Еще одним аргументом в пользу ключевой роли ТМДЗ и ТМД2 в транспорте меди является присутствие в них высоко консервативных по сравнению с другими участками CTR1 G-XXX-G (GG4) и М-ХХХ-М (ММ4) мотивов, соответственно (De Feo et al., 2007). Первый мотив, по-видимому, участвует в димеризации CTR1, при этом два остатка G находятся с одной и той же стороны a-спирали, обеспечивая белок-белковое взаимодействие (Aller et al., 2004). Подобный мотив димеризации ранее был найден в мембранных белках, образующих транспортные каналы (Kim et al., 2005; Edwards et al., 2005).

Рис. 7. Модель трансмембранного канала, образуемого доменами белка CTR1 человека, а.

Относительное расположение трансмембранных доменов в предполагаемом гомотримере (вид в плоскости мембраны); б. Альтернативное относительное расположение трансмембранных доменов в предполагаемом гомотримере (предлагаемая нами модель, вид в плоскости мембраны); Радиусы пор обозначены R. в. Ориентация гидрофильных а.о. ТМД2 и ТМДЗ, образующих купрофильный канал-гомо гример (вверху - экстрацеллюлярное пространство, внизу - цитоплазма).

Мотив ММ4 в ТМД2 выполняет центральную функцию в связывании меди, что тоже указывает на его ориентацию внутрь поры канала, и, соответственно, на участие ТМД2 в создание купрофильной поры. Удаленность остатков М друг от друга позволяет связанным ионам меди находиться на расстоянии, препятствующем реакции диспропорционирования (Nose et al., 2006). В недавно появившемся исследовании с помощью электронной микроскопии была получена структура медной

поры CTR1 с разрешением 7 Ä (De Feo et al., 2009). Авторами была построена модель CTR1 в мембране, согласно которой пора имеет коническую форму: с внеклеточной стороны пора образуется ТМД2 тримера, и ее радиус составляет 4 Ä; с внутриклеточной стороны конус образован всеми 9 ТМД и имеет радиус 11 А. Такая большая ширина поры с внутриклеточной стороны, однако, кажется противоречивой с точки зрения высокой специфичности канала для ионов меди, даже с учетом пространственных размеров боковых цепей а.о., формирующих эту пору. Данная модель канала в «средней» части очень напоминает нашу модель по расположению ТМД белка. У дрожжей наиболее структурно консервативные участки ТМД2 и ТМДЗ также содержат 21 а.о., способные координировать атом меди и ориентированные внутрь канала, а ТМД1 - высоко гидрофобен. Таким образом, трансмембранная организация канала консервативна в эволюции.

Связывание меди НСН С-концевым мотивом CTR1 млекопитающих. У всех позвоночных на С-конце CTR1 локализован медьевязывающий мотив НСН. С помощью метода молекулярной механики ММ+, полуэмпирического метода квантовой химии ZINDO/1 мы оценили способность трипептида НСН связывать Cu(I). Подобные, ранее проделанные нами, расчеты совпадали по геометрии со структурными экспериментальными данными (Васин и др., 2005). В использованной для расчетов модели N-концы НСН были блокированы Л'-метильными группами. Рассчитанная координация Cu(I) показана на рисунке 7. Видно, что имидазольные группы Н играют ключевую роль в образовании координационного комплекса, а С189 не участвует в координации меди (также были расчитаны комплексы с другими а.о. в позиции 189), что согласуется с данными сайт-направленного мутагенеза, показавшими, что замена C189S не влияет на функциональную активность CTR1 (Eisses, Kaplan, 2002), и данными электронной микроскопии, подтверждающими координацию меди С-концевыми остатками Н независимо от остатка X в мотиве Н-Х-Н (De Feo et al., 2009).

Согласно нашим расчетам для свободных и медькоординирующих ди- и тримерных мотивов НСН, в отсутствии меди мотивы НСН разделены пространственно, их взаимодействие энергетически невыгодно и канал открыт с цитозольной стороны. При внесении Cu(I) в модель димера образуются координационные комплексы, в которых участвуют атомы трипептидов, канал сужается. Тримерные комплексы были стабильнее димерных, а С189 не участвует в координации меди. Внесение в модель комплекса нескольких ионов меди, показывает, что энергия связывания каждого последующего иона снижается, что объясняется, прежде всего, электростатическими взаимодействиями. Максимальное число атомов Cu(I), связывание которых еще энергетически выгодно, составляет 4 и 5 для димеров и тримеров, соответственно (рис. 8). Комплексы с олигомерными С-концами CTR1 также сопоставлены по расчетной энергии с мотивом С-ХХ-С, характерным для Си(1)-шаперонов (АТР7А, АТР7В и белка СОХ), где Cu(I) координируется SH-группами С (модель построена на основе структуры для АТР7А, PDB ID: 1KVJ). Наши расчеты допускают, что димер и тример CTR1 также способны передать Cu(I) на шаперон, если с ними уже связано 2 или 3 иона меди.

Рис. 8. Энергии, выделяющиеся при присоединении к системе мономеров каждою последующего иона Си(1) (номер указан над столбцом) в сравнении с энергией, выделяющейся при связывании иона меди Си(1) первым медьевязывающим сайтом АТФазы Мепкеса.

Сравнение способностей С-концевого мотива CTR1 НСН связывать ионы Cu(I) и Ag(I). Для сравнительной оценки способностей С-концевого мотива CTR1 НСН связывать Cu(I) и Ag(I) - другой ион, специфически переносимый CTR1 через мембрану {Sharp, 2003) — мы провели расчеты, подобные описанным в предыдущем разделе. Полученные результаты показывают, что связь серебра с мотивами во всех случаях энергетически менее выгодна, чем связь меди. В расчетах по связыванию Cu(I) и Ag(I) М-богатыми мотивами, группа боковой цепи М была промоделирована молекулой CHjSCHi. Связь иона меди во всех рассчитанных комплексах прочнее, чем связь иона серебра примерно на 20%.

Докинг N- и С-концевых медьевязывающих мотивов CTR1 млекопитающих с их предполагаемыми донорами и акцепторами меди.

Докинг N-KOHifeebix медьевязывающих мотивов CTR1. В качестве молекулы-рецептора (потенциального донора меди) использовалась молекула ЦП (PDB ID: 1KCW) и сывороточного альбумина (PDB ID: 1А06), а в качестве лигандов (потенциального акцептора меди) - мотивы из N-конца белка CTR1 с координатами 113, 19-26, 39-46 в конформациях a-спирали и (3-тяжа. Для всех трех мотивов были найдены решения, при которых мотивы являются сближенными с участками молекулы ЦП, координирующими лабильную медь. Для альбумина докинг не обнаружил выгодного сближения медьевязывающих мотивов N-конца CTR1 с физиологически активным медным сайтом в молекуле альбумина. Возможно, это говорит о том, что альбумин является менее вероятным кандидатом для передачи меди для CTR1, чем ЦП.

Докинг С-концевого медьевязывающего мотива CTR1. В качестве молекулы-рецептора (потенциального акцептора меди) использовался четвертый металл-связывающий домен АТФазы Менкеса (PDB структура 1AW0), содержащий медьевязывающий мотив СХХС, а в качестве лигандов (донора меди) - расчетные структуры moho-, ди- и тримера С-концевого мотива НСН белка CTR1. Одним из наиболее энергетически выгодных решений, полученных докингом, стал участок, содержащий мотив СХХС, что подтверждает наше предположение о передачи Cu(I) от НСН мотива на медьевязывающий сайт СХХС в цитозольных медных шаперонах.

Поиск регуляторных цис-элементов в промоторной области гена CTR1. Анализ последовательности длиной 3000 нуклеотидов upstream области

транскрибируемой части гена CTR1 показал, что в этой области генома у человека, мыши и крысы присутствуют 5 консервативных участков, в которых обнаружено 40 сайтов связывания для транскрипционных факторов, из них 25 - неперекрывающихся. Кроме сайтов для общих транскрипционных факторов, обнаружены сайты связывания факторов, участвующих в дифференцировке ЦНС, гепатоцитов, а также для транскрипционных факторов, секвестрируемых цисплатином (SP1F). В то же время не были идентифицированы MRE (metal responsive elements) последовательности, через которые экспрессия гена может регулироваться изменением концентрации металлов. Не обнаружены также сайты связывания для HIFI (Hypoxia inducible factor 1), от активности которого зависит уровень транскрипции ряда генов, участвующих в метаболизме меди.

ВЫВОДЫ

1. При повышении продукции секреторной формы церулоплазмина (высокий статус меди в сыворотке крови при взрослом типе метаболизма меди, опухолевый рост, высокая концентрация церулоплазмина в молоке в первые дни лактации) экспрессия гена CTR1 положительно коррелирует с затратами меди на формирование холо-церулоплазмина. Увеличение клеточной массы (рост сердечной мышцы и рост опухолей) сопровождается повышением активности гена CTR1.

2. В отделах развивающегося мозга синтез секреторной формы церулоплазмина сменяется на синтез ГФИ-заякоренной изоформы, при этом уровень экспрессии CTR1 не меняется.

3. Снижение статуса меди, вызванное Ag(I), которое координируется медьевязывающими мотивами CTR1 и переносится в клетки по тому же пути, что и медь, не влияет на уровень экспрессии гена CTR1.

4. N-концевые медьевязывающие мотивы, амфипатичные купрофильные поверхности спиралей трансмембранных доменов 2 и 3, а также С-концевые НСН-мотивы в гомотримере белка CTR1 образуют единую медьпроводящую систему. Купрофильный канал имеет симметрию С} и диаметр 8.8 Á. Трансмсмбранный домен 1 непосредственно не участвует в образовании медьпроводящей поры, но за счет длинной консервативной цитозольной петли может обеспечивать подвижность структуры.

5. Медь, связанная мотивами His-Cys-His в цитозольном домене гомотрпмера CTR1, может быть передана непосредственно Си(1)-шапсронам, имеющим медь связывающий мотив Cys-X-X-Cys. Докинг пептидных медьевязывающих мотивов N-и С-концевых доменов CTR1 выявляет участки взаимодействия CTRI с предполагаемыми донорами (ЦП, альбумин) и акцепторами (медьевязываюший сайт АТФазы Менкеса) меди. Комплекс CTR1 может переносить медь от внеклеточного донора к Си(1)-шаперонам по градиенту свободной энергии без дополнительных посредников.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Samsonov S.A., Vasin А.V., Platonova N.A., Puchkova L.V., Tsymbalenko N.V. Brain region specific expression of Ctrl gene coded putative Cu(I)-importer of mammals // European Journal of Human Genetics. 2005, Vol. 12, Suppl. 1, p. 319.

2. Васин A.B., Платонова H.A., Повалихнн Р.Г., Клотченко С.А., Самсонов С.А.. Цымбаленко Н.В., Пучкова Л.В. Мнтохондриальный церулоплазмин млекопитающих // Молекулярная биология, 2005, 39 (1): 48—60.

3. Samsonov S.A., Platonova N.A., Vasin A.V., Skvortsov A.N., Tsymbalenko N.V., Puchkova L.V. Organ-specific mammalian Ctrl gene expression and in silico analysis of its putative protein product //31 FEBS Congress (Istanbul, Turkey). Abstracts. 2006. p. 229.

4. Samsonov S.A.. Platonova N.A., Skvortsov A.N, Tsymbalenko N.V., Vasin A.V, Puchkova L.V. In vivo mammalian Ctrl gene expression and in silico analysis of its protein product. BIFI 2006 - II International Conference, Zaragoza (Spain). From Physics to Biology: the interface between experiment and computation. Abstracts. 2006, p. 153.

5. Самсонов С. А.. Платонова H. А., Скворцов A. H., Цымбаленко Н. В., Васин А. В., Пучкова JI. В. Экспрессия гена CTR1 крысы и in silico анализ его предполагаемого белкового продукта II Молекулярная биология, 2006, 40(2): 1— 13.

6. Samsonov S. A., Nordlund Е., Vasin А. V., Platonova N. A., Skvortsov A. N., Tsymbalenko N. V., Puchkova L. V. Tissue-specific Ctrl Gene Expression and in silico Analysis of Its Putative Protein Product // FROM PHYSICS TO BIOLOGY: BIFI 2006 II International Congress. AIP Conference Proceedings, 2006, 851: 185-191.

7. Zatulovskiy E., Samsonov S., Skvortsov A. Docking study on mammalian CTR1 copper importer motifs // BMC Systems Biology, 1 (Suppl 1): 54, 2007. The electronic version of this article is the complete one and can be found online at: http://www.bi0medcentral.c0m/l 752-0509/l?issue=S 1

8. Затуловский E.A.. Ильичева E.A., Скворцов A.H., Самсонов С.А.. Цымбаленко Н.В., Пучкова Л.В. Распределение микроэлементов и экспрессия генов Си-транспортных белков и купроэнзимов в печени мышей, получавших ионы Ag. Сборник материалов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. 11-15 мая 2008 г., Новосибирск. С. 448.

9. Самсонов С.А.. Скворцов А.Н., Затуловский Е.А., Бабич П.С., Ильичева У.Ю., Цымбаленко Н.В., Пучкова Л.В. Экспрессия гена Ctrl, кодирующего высокоаффинный импортер меди, в органах крыс при различных состояниях обмена меди // Материалы V съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГИС), Москва, июнь, 2009, стр. 88.

Sergey Samsonov

Summary of the thesis "Mammalian CTR1 gene expression under different copper metabolism conditions and in silico analysis of its protein product" (carried out at the Department of Molecular Genetics, Research Institute of Experimental Medicine, and at the Biophysics Department, the Faculty of Physics and Mechanics at Saint-Petersburg State Polytechnical University; defended at Saint-Petersburg State University)

Introduction. Cu(I) is imported through plasma membrane by high affinity Cu(I) transporter CTR1, which is also responsible for cisplatin (antitumor platinum containing drug) uptake. However, many aspects of its function and underlying molecular mechanisms remain unclear. In this thesis, we analyze tissue-specific expression of CTR1 gene in vivo under normal physiological conditions as well as under Cu depletion and Cu excess. In addition, we propose a model of CTR1 in plasma membrane, estimate its Cu-binding abilities and point out potential partners for interactions based on bioinfomatic approaches. Methods. RNA extraction, spectrometry, electrophoresis of nucleic acids in agarose and PAGE, RT-PCR, subcellular fractions extraction by differential centrifugation, immunoblotting, FAAS, immunoelectrophoresis, use of GenBank, RefSeq, TraFac, SwissProt, PDB databases and computer programs Gene Runner 3.0, Clustal X, HyperChem 7.01, RasMol 2.7, ClustalX, Hex 4.5, UCSC Proteome Browser, Multalin, Spidey, PsiPred, GOR4, DiAlign, PHYLIP and GEMS Launcher packages.

Results and conclusions. Semi-quantitative PCR data show that mammalian CTR1 expression is highly tissue-specific and tightly interconnected with copper status. We find two types of relations between CTR1 expression and Cu status: 1. CTR1 activity level decreases under Cu accumulation in nuclei (liver, choroid plexus); 2. CTRl activity is associated with the level of cuproenzymes requirement (brain departments, mammary gland, cancer tissues). As it is shown both by our experimental and computational data, Ag(I) competes with Cu(I)-specific binding motifs, inducing decrease of Cu status and increasing cells sensitivity to cisplatin, but not influencing CTRl expression.

Modeling results propose that homotrimer CTRl forms a copper channel by TMD 2 and 3, through which Cu(I), after being accepted from Cu(I)-donor at extracellular side is transferred to HCH C-terminal copper binding motif, and then to cytoplasmic Cu(I)-chaperons down the free energy gradient. In the absence of Cu(I) the channel is open at the cytosolic side. Addition of Cu(I) to the system leads to the Cu(I)-coordination complex formation, in which side-chains of His play crucial role. The spatial proximity of monomers in the presence of Cu(I) is energetically favored, the channel is closed. Docking together with binding energy calculations by MM and QM approaches supports the assumption that ceruloplamin could be Cu(I)-donor for N-terminal domain of CTRl, while CXXC motif of cytosolic Cu(I)-chaperons could accept Cu(I) for its further transport in the cell.

Лицензия ЛР № 020593 от 07.08.97

Подписано в печать 11.02.2010. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 5578Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812)550-40-14 Тел./факс: (812)297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Самсонов, Сергей Алексеевич

Введение

1. Обзор литературы.

1.1. Физико-химические свойства и биологическая роль ионов меди.

1.1.1. Медь как химический элемент.

1.1.2. Ионы меди Си+ и Си2т.

1.1.3. Биохимические процессы, протекающие с участием ионов меди.

1.1.4. Метаболическая система меди

1.2. Роль CTR1 в метаболизме меди.

1.2.1. Импорт ионов меди через плазматическую мембрану клетки.

1.2.2. Семейство белков CTR

1.2.3. Экспрессия гена CTR1 млекопитающих в клеточных культурах

1.2.4. Биохимическая характеристика и внутриклеточная локализация белка CTR1 млекопитающих.

1.2.5. Функция и экспрессия гена CTR1 позвоночных.

1.2.6. Регуляция экспрессии гена CTR1.

1.2.7. Изучение связывания ионов меди с доменами CTR1.

1.2.8. Участие CTR1 в транспорте платиносодержащих противоопухолевых препаратов (ППП).

2. Материалы и методы.;.

2.1. Оборудование.

2.2. Материалы.

2.3. Компьютерные методы.

2.4. Экспериментальные методы

2.4.1. Получение материала для выделения тотальной РНК.

2.4.2. Выделение тотальной РНК.

2.4.3. Обратная транскрипция, сопряжённая с полимеразной цепной реакцией.

2.4.4. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот.

2.4.5. Полуколичественный метод определения квазистационарного уровня мРНК.

2.4.6. Иммуноблотинг.

2.4.7. Измерение концентрации меди.

2.4.8. Измерение концентрации церулоплазмина.

3. Результаты и их обсуждение.

3.1. Связь экспрессии гена CTR1 с метаболизмом меди в различных органах крысы и статусом меди в крови.

3.1.1. Экспрессия гена CTRI и статус меди в печени.

3.1.2. Экспрессия гена CTR1 и статус меди в отделах мозга.

3.1.3. Экспрессия гена CTR1 и статус меди в лактирующей молочной железе.

3.1.4. Экспрессия гена CTR1 и статус меди в сердце.

3.1.5. Экспрессии гена CTR1 в печени и мозгу новорожденных и взрослых крыс при дефиците оксидазного ЦП в крови.

3.1.6. Возможная роль меди в импорте цисплатина с участием CTR1.

3.1.7. Экспрессии гена CTR1 в опухолях и в печени животных с растущими опухолями 73 3.2. In silico анализ продуктов гена CTR1 разных видов.

3.2.1. Экзон-интронная организация генов семейства CTR1.

3.2.2. Филогенетический анализ белков семейства CTR1.

3.2.3. Анализ аминокислотных последовательностей белков семейства CTR1.

3.2.4. Анализ аминокислотной последовательности CTR1 человека.

3.2.5 Анализ N-концевого экстрацеллюлярного домена CTR1 человека и дрожжей.

3.2.6. Модель олигомерного комплекса CTR1 в мембране.

3.2.7. Связывание меди НСН С-концевым мотивом CTR1 млекопитающих

3.2.8. Сравнение способностей С-концевого мотива CTR1 НСН связывать ионы Cu(I) и Ag(I)

3.2.9. Докинг N- и С-концевых медьевязывающих мотивов CTR1 млекопитающих с их предполагаемыми донорами и акцепторами меди.

3.2.10. Анализ регуляторных г/мс-элементов гена CTR1.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспрессия гена CTR1 у млекопитающих при разных состояниях метаболизма меди и IN SILICO анализ его белкового продукта"

Актуальность исследования. В живых системах медь в составе активных центров ряда ферментов участвует в реализации жизненно важных функций в клетках всех типов (Karlin, 1993; Turnlund et al., 1998). В то же время вследствие изменения степени окисления Cu(I)<-»Cu(II) ионы меди могут вызывать образование гидроксильных радикалов (binder, 2001). Безопасное поступление меди в клетки, ее перенос к местам образования купроэнзимов и выведение из клеток обеспечивает специальная система белков, метаболическая система меди (МСМ). Некоторые гены этой системы клонированы и изучены основные принципы ее работы. МСМ всех эукариотов сходны, они включают интегральные мембранные и растворимые цитозольные белки, кодируемые ортологичными генами, их структуры и функции характеризуются высокой консервативностью. Перенос ионов меди белками этой системы к местам образования купроэнзимов происходит однонаправленно и последовательно при прямых белок-белковых взаимодействиях (Репа et al., 1999; Пучкова, Платонова, 2004; Kim et al, 2008). Благодаря этому в клетках нет свободных ионов меди (Rae et al., 1999). Мутации в генах МСМ, экологический избыток или недостаток меди, приводят к развитию тяжелых заболеваний (анемия, сердечно-сосудистые болезни, остеопороз, рак, нейродегенеративные заболевания) (Gaggelli et al., 2006). Медь также участвует и в регуляции апоптоза. Так, ионы меди специфически связываются с Х-сцепленным ингибитором апоптоза (XIAP) и вызывают освобождение из комплекса с ним каспазу 3, которая инициирует апоптоз (Mufti, et al., 2007).

В реализации всех этих биологических ролей меди, ключевым событием является перенос меди в клетку. Он осуществляется белком семейства CTR1 (copper transporter 1) высокоаффинных импортеров меди (Sharp, 2003). Нокаут гена CTR1 у мышей приводит к ранней гибели эмбрионов-гомозигот, а у гетерозигот содержание меди изменяется тканеспецифично (Lee, 2000). На ранних этапах эмбрионального развития амфибий и млекопитающих белок CTR1 участвует также в морфогенезе и дифференцировке клеток (Haremaki et al., 2007; Haremaki et al, 2009). К тому же белок CTR1 участвует в импорте цисплатина, противоопухолевого платинового препарата (Safaei, 2006). Несмотря на интенсивные исследования, многие аспекты функционирования гена CTR1 и его белкового продукта остаются невыясненными. В частности, неясно, связана ли экспрессия гена CTR1 с изменением метаболизма меди в клетках и статусом меди у млекопитающих, как устроена купрофильная пора белка CTR1, какой внеклеточный переносчик транспортирует медь к N-концевому домену CTR1, локализованному на поверхности клетки у млекопитающих. Внутриклеточный акцептор ионов меди от CTR1 также пока не установлен. Ответы на эти вопросы важны для понимания общего механизма транспорта меди в клетке.

Представленная диссертация выполнена с учетом актуальности изложенных проблем. Ее цель состоит в сравнительном анализе тканеспецифической активности гена CTR1 у млекопитающих и in silico анализе белковых продуктов генов CTR1.

Для достижения заявленной цели были поставлены следующие задачи:

3. Сравнить аминокислотные (а.к.) последовательности CTR1 разных видов,. оценить потенциальную функциональную роль доменов и аминокислотных остатков (а.о.) в формировании купрофильной поры, образования функционирующего гомотримера CTR1 и участков взаимодействия с потенциальными донорами меди.

4. Оценить металлосвязывающую способность консервативного С-концевого мотива His-Cys-His позвоночных.

Научная новизна полученных результатов. Все представленные в работе результаты являются новыми. Показано, что экспрессия гена CTR1 в онтогенезе изменяется органоспецифически, зависит от уровня меди в клетке и ее статуса во внеклеточной среде. На основе полученных экспериментальных данных предложены модели регуляции тканеспецифической экспрессии гена CTR1, которые дополнены анализом цис-регуляторной области гена CTR1. Охарактеризована экспрессия гена CTR1 в опухолевых тканях, а также при недостатке оксидазного ЦП, предполагаемого донора меди для CTR1, дефицит которого был искусственно вызван добавлением в пищу ионов серебра. Эти данные дополнены анализом докинг-взаимодействия между ЦП и CTR1. В результате этого анализа выявлены участки этих белков, вероятно, участвующих в осуществлении белок-белковых взаимодействий. Теоретический анализ аминокислотной последовательности белка CTR1 позволил создать одну из первых моделей тримерного комплексе CTR1 в мембране, принципиальная верность которой позже была подтверждена экспериментальными методами (Unger et al, 2009). Медьсвязывающая способность мотивов CTR1, предположительно участвующих в осуществлении транспорта меди через плазматическую мембрану и в клетке, проанализированы на уровне квантово-химической теории и молекулярной механики и рассмотрены в контексте белок-белковых взаимодействий, лежащих в основе МСМ.

Научно-нрактическое значение полученных результатов состоит в том, что они углубляют знания о механизмах, лежащих в основе нарушения метаболизма меди, ведущих к развитию нейродегенеративных болезней, а также расширяют общие представления о метаболизме металлов в организме млекопитающих. В практическом плане, использование данных о тканеспецифическом изменении статуса меди в онтогенезе млекопитающих и экспрессии генов, участвующих в метаболизме меди, в частности, CTR1, способствует как более эффективному лечению, так и предотвращению заболеваний, связанных с повреждением путей гомеостаза меди. Выявление связи между статусом меди во внеклеточной среде и токсическим эффектом цисплатина на рост клеток открывает путь для оптимизации протоколов применения этого противоопухолевого препарата в клинике. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Активность гена CTR1 связана с метаболизмом меди.

4. По данным моделирования на основе анализа а.к. последовательностей филогенетически консервативные ТМД2 и ТМДЗ белка CTR1, содержащие 21 а.о., способный координировать медь, образуют амфипатичную поверхность. На основе этого предложена модель гомотримера CTR1, в которой ТМД2 и ТМДЗ образуют купрофильный канал, а ТМД1 не участвует в образовании медьпроводящей поры. Теоретически рассчитанный максимальный радиус поры равен 4.4 А.

5. Медь, связанная мотивами His-Cys-His в цитозольном домене гомотримера CTR1, может быть передана. Си(1)-шаперонам, имеющим медьсвязывающий мотив Cys-X-X-Cys. Количество атомов меди, связанных с цитозольным доменом, влияет на возможность их передачи цитозольным шаперонам.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Самсонов, Сергей Алексеевич

ВЫВОДЫ

3. Снижение статуса меди, вызванное Ag(I), которое координируется медьсвязывающими мотивами CTR1 и переносится в клетки по тому же пути, что и медь, не влияет на уровень экспрессии гена CTRL

4. N-концевые медьсвязывающие мотивы, амфипатичные купрофильные поверхности спиралей трансмембранных доменов 2 и 3, а также с-концевые НСН-мотивы в гомотримере белка CTR1 образуют единую медьпроводящую систему. Купрофильный канал имеет симметрию Сз и диаметр 8.8 А. Трансмембранный домен 1 непосредственно не участвует в образовании медьпроводящей поры, но за счет длинной консервативной цитозольной петли может обеспечивать подвижность структуры.

5. Медь, связанная мотивами His-Cys-His в цитозольном домене гомотримера CTR1, может быть передана непосредственно Си(1)-шаперонам, имеющим медь связывающий мотив Cys-X-X-Cys. Докинг пептидных медьсвязывающих мотивов N- и С-концевых доменов CTR1 выявляет участки взаимодействия CTR1 с предполагаемыми донорами (ЦП, альбумин) и акцепторами (медьсвязывающий сайт АТФазы Менкеса) меди. Комплекс CTR1 может переносить медь от внеклеточного донора к Си(1)-шаперонам по градиенту свободной энергии без дополнительных посредников.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Белки семейства высокоаффинных транспортеров Cu(I) через плазматическую мембрану клетки — CTR1 — занимают центральное место в метаболизме меди для организмов всех типов. Помимо своей основной функции в импорте меди, привлекательным для исследователей является и тот факт, что белки семейства CTR1 могут участвовать в импорте серебра и платино содержащих противоопухолевых препаратов у млекопитающих. Несмотря на большой интерес к CTR1 на уровне гена и белка, детальная информация об экспрессии гена CTR1, а также о механизмах функционирования кодируемого им белка по-прежнему остается неизвестной. В частности, не определена структура мембранного белка, предположительно являющегося гомотримером. Существует несколько моделей организации трансмембранных доменов белка, в том числе и представленная в нашей работе. Также отсутствует информация о структуре N-концевого внеклеточного домена, который предположительно первым связывает ионы меди в процессе их переноса через мембрану. Другим важным вопросом, стоящим перед исследователями, является сам механизм работы белка-импортера. Ни точная стехиометрия процесса, ни кинетика связывания и передачи ионов меди через мембрану на молекулярном уровне неизвестны. И, наконец, высокая тканеспецифичность активности гена CTR1 создает трудности для понимания процессов, управляющих регуляцией его экспрессии. Представленная диссертация посвящена рассмотрению всех этих аспектов в изучении гена CTR1 и кодируемого им белка.

Анализ экспрессии гена CTR1 и статуса меди в печени, отделах мозга, лактирующей молочной железе и в сердце в онтогенезе крыс полностью подтверждает ключевую роль, CTR1 как универсального импортера меди в клетках млекопитающих. Мы обнаружили регуляторные механизмы активности гена CTR1, которые несмотря на тканеспецифичность можно обобщить в две группы:

1. Активность репрессируется при высоком содержании меди в ядре

2. Активность активируется/инактивируется при низком содержании меди в зависимости от требуемого физиологическими условиями уровня синтеза купроэнзимов (в частности, изоформ ЦП). Первый тип регуляции характерен для печени и сосудистого сплетения, второй- для мозга и молочной железы. Также в мозгу был обнаружен пониженный уровень экспрессии гена CTR1 при искусственном дефиците его предполагаемого донора меди- ЦП.

Важная роль CTR1 также была проанализирована в модельных организмах для изучения болезни Альцгеймера (БА) и при образовании опухолей. Было показано, что экспрессия гена существенно снижается при фибриллогенезе клеток мозга, что создает возможность использовать ген CTR1 в качестве одного из маркеров БА. В клетах печени и стенки кишечника экспрессии гена CTR1 существенно повышалась при опухолеобразующих процессах, что делает ген также подходящим биомаркером для опухолей. С другой стороны, в промотерной области гена были обнаружены нуклеотидные последовательности, соответствующие сайтам связывания транскрипционных факторов, секвестрируемых цисплатином. Таким образом, наши данные подчеркивают важность изучения гена CTR1 в рамках исследований процессов, связанных с опухолеобразованием.

У позвоночных наблюдается высокая консервативность в аминокислотной последовательности CTR1, которая предполагает сходную структуру для всех соотвествующих белков семейства. N-концевой внеклеточный домен- самый вариабельный из топологических доменов при сравнении позвоночных и одноклеточных эукариот. Это, по-видимому, объясняется тем, что низшие эукариоты потребляют ионы меди в свободном виде из окружающей среды, тогда как позвоночные (в частности, млекопитающие) не имеют в своих клетках свободных ионов меди, и CTR1 должен принимать медь от внеклеточных переносчиков, причем этот процесс тканеспецифичен. Мы считаем церулоплазмин (ЦП) основным кандидатом на роль донора ионов меди для CTR1 на поверхности мембраны клетки. Интересно, что несмотря на факт, что ЦП связывает Cu(II), он может сам выполнять роль редуктазы для меди, восстанавливая ее до Cu(I), которая далее может быть высокоспецифично связана с Met-богатыми мотивами N-концевого домена CTR1. Методом молекулярного докинга мы проанализировали предположительные сайты связывания этих мотивов с ЦП. Для этого использовалось несколько конформаций мотивов и структура ЦП, определенная по данным рентгеноструктурного анализа. В работе было показано, что Met-богатые мотивы энергетически наиболее выгодно взаимодействуют с участками, соответствующими сайтам связывания лабильной меди в ЦП. Аналогичные расчеты были проведены и для альбумина- другого предположительного донора меди для CTR1. В этом случае также были выявлены участки взаимодействия на поверхности альбумина, в состав которых входят способные к координации меди аминокислотные мотивы.

На основе гидропатического профиля, основываясь на предположении, что трансмембранные домены (ТМД) находятся в мембране в конформации а-спирали, была построена модель расположения ТМД, при котором гомотримерный канал образуется 6 ТМД (ТМД2 и ТМДЗ), тогда как оставшиеся ТМД1, будучи существенно более гидрофобными, не участвуют в образовании медьпроводящей поры. Рассчитанные размеры поры совпадают с данными по 2Б-кристаллографии (Aller and Unger, 2006) и также не противоречат данным по структуре расположения ТМД для внеклеточной и части трансмембранных доменов белка, полученным методом электронной микроскопии, (.De Feo et al., 2009). В последней работе, однако, предполагают отличающуюся от нашей модель белкового комплекса, при которой форма тримера в мембране-коническая, а-спирали пронизывают мембрану под углом, и с разных сторон мембраны канал имеет различную ширину за счет участия именно гидрофобного ТМД1 в формировании поры с цитозольной стороны.

С-концевой домен CTR1 участвует в дальнейшей передаче меди в клетку, после связывания ее с внеклеточной стороны N-концом и транспорта через мембрану ТМД. Механизм передачи, а также способ координирования меди для белка млекопитающих неизвестен. В работе с помощью методов молекулярной механики и квантовой химии были проанализированы способности С-концевого медьсвязывающего мотива НСН координировать один и несколько ионов меди, а также передавать его на цитозольные медные шапероны. Докинг мотива НСН позволил проанализировать возможное связывание С-конца CTR1 с медьсвязывающим сайтом его предположительного акцептора меди - в АТФазе Менкеса. Таким образом, теоретическая часть работа помогает частично промоделировать механизм связывания и передачи меди через канал, образованный CTR1.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Самсонов, Сергей Алексеевич, Санкт-Петербург

1. Aller S., Eng Е., De Feo С., Unger V. Eukaryotic CTR copper uptake transporters require two faces of the third transmembrane domain for helix packing, oligomerization, and function // J Biol Chem, 279(51): 53435-53441, 2004.

2. Aller S., Unger V. Projection structure of the human copper transporter CTR1 at 6-A resolution reveals a compact trimer with a novel channel-like architecture // Proc Nat Acad Sci USA, 103(10): 3627-3632, 2006.

3. Arredondo M., Munoz P., Мига С. V., Nunez M.T. DMT1, a physiologically relevant apical Cul+ transporter of intestinal cells // Am Journal Physiol. Cell physiology, 284(6): C1525-C1530 ,2003.

4. Bauerly K.A., Kelleher S.L., Lonnerdal B. Functional and molecular responses of suckling rat pups and human intestinal Caco-2 cells to copper treatment // Journal Nutr Biochem, 15(3): 155-162,2004.

5. Burstein E., Ganesh L., Dick R.D., van De Sluis В., Wilkinson J.S. Klomp L.W.J. Wijmenga C., Brewer G.J.3, Nabel G.J., Duckett C.S. A novel role for XIAP in copper homeostasis through regulation of MURR1 // EMBO J, 23(1): 244-254, 2004.

6. Bertinato J., Swisl E„ Plouffe L.J., Brooks S.P., L'abbe M.R. Ctr2 is partially localized to the plasma membrane and stimulates copper uptake in COS-7 cells // Biochem J, 409(3): 731-740, 2008.

7. Binks S., Dobrota M. Kinetics and mechanism of uptake of platinum-based pharmaceuticals by the rat small intestine // Biochem Pharm, 40(6): 1329-1336, 1990.

8. Cooper E.H. Plasma protein profile in neoplastic diseases. Ric Clin Lab, 13:57-69, 1983.

9. Crisp R.J., Adkins E.M., Kimmel E., Kaplan J. Recruitment of Tuplp and Cti6p regulates heme-deficient expression of Aftlp target genes // EMBO J, 25, 512-521,2006.

10. Dancis A., Haile D., Yuan D.S., Klausner R.D. The Saccharomyces cerevisiae copper transport protein (Ctrlp). Biochemical characterization, regulation by copper, and physiologic role in copper uptake // J Biol Chem, 269(41): 25660-25667, 1994.

11. De Feo C., Aller S., Unger V. A structural perspective on copper uptake in eukaryotes // BioMetals, 20(3-4): 716, 705, 2007.

12. De Feo C., Aller S., Sulivae G., Blackburn N., Unger V. Three-dimensional structure of the human copper transporter hCTRl // Proc Nat Acad Sci USA, 106(11): 4237-4242, 2009.

13. Deschamps P., Kulkarni P.P., Sarkar B. X-ray Structure of Physiological Copper(II)-Bis(l-histidinato) Complex // Inorg Chem, 43(11): 3338-3340, 2004.

14. Edwards M.D., Li Y, Kim S., Miller S., Bartlett W., Black S., Dennison S., Iscla L, Blount P., Bowie J. U., Booth I.R. Pivotal role of the glycine-rich TM3 helix in gating the MscS mechanosensitive channel // Nat Struct Mol Biol, 12(2): 113-119, 2005.

15. Eisses J.F., Kaplan J.H. Molecular characterization of hCTRl, the human copper uptake protein // J Biol Chem, 277(32): 29162-29171, 2002.

16. Eisses J.F., Kaplan J.H. The mechanism of copper uptake mediated by human CTR1: a mutational analysis // J Biol Chem, 280(44): 37159-37168, 2005.

17. Ettinger M.J., Darwish H.M., Schmitt R.C. Mechanism of copper transport from plasma to hepatocytes // Fed. Proc., 45(12): 2800-2804, 1986.

18. Fifkova E., Marsala J. Stereotaxic atlas for the cat, rabbit and rat // Praga, St. zdravnicke nakald. 105,1960.

19. Frezza C., Gottlieb E. Mitochondria in cancer: Not just innocent bystanders // Seminars in Cancer Biology, 19(1): 4-11, 2009.

20. Furukawa Т., Komatsu M., Lkeda R., Tsujikawa K., Akiyama S. Copper transport systems are involved in multidrug resistance and drug transport // Curr Med Chem, 15(30): 3268-3278, 2008.

21. Gaggelli E. Kozlowski H., Valensin D., Valensin G. Copper homeostasis and neurodegenerative disorders (Alzheimer's, Prion, and Parkinson's diseases and amyotrophic lateral sclerosis) // Chem Rev, 106: 1995-2044, 2006.

22. Gogvadze V., Orrenius S., Zhivotovsky B. Mitochondria in cancer cells: what is so special about them? // Tren. Cell Biol. 18(4): 165-173, 2008.

23. Gunshin H., Mackenzie В., Berger U.V., Gunshin Y., Romero M.F., Boron W.F., Nussberger S., Gollan J.L., Hediger M.A. Cloning and characterization of a mammalian proton-coupled metal-ion transporter // Nature, 388(6641): 482488, 1997.

24. Guo Y., Smith K., Lee J., Thiele D.J., Petris M.J. Identification of Methionine-rich Clusters That Regulate Copper-stimulated Endocytosis of the Human Ctrl Copper Transporter// J Biol Chem, 279(17): 17428-17433, 2004a.

25. Guo Y., Smith K., Petris M.J. Cisplatin Stabilizes a Multimeric Complex of the Human Ctrl Copper Transporter: requirement for the extracellular methionine-rich clusters // J Biol Chem, 279(45): 46393-46399, 2004b.

26. Han H., Archibeque S., Engle T. Characterization and Identification of Hepatic mRNA Related to Copper Metabolism and Homeostasis in Cattle // Biol Trace Elem Res, 129(1-3): 130-6, 2009.

27. Haremaki Т., Fraser S.T., Kuo Y.M., Baron M.H., Weinstein D.C. Vertebrate Ctrl coordinates morphogenesis and progenitor cell fate and regulates embryonic stem cell differentiation // Proc Nat Acad Sci USA, 104(29): 12029-12034, 2007.

28. Haremaki N., Weinstein D.C. Xmc mediates Xctrl-independent morphogenesis inXenopus laevis // Dev Dyn, 238(9): 2382-2387, 2009.

29. Hassett R., Dix D.R., Eide D.J., Kosman D.J. The Fe(II) permease Fet4p functions as a low affinity copper transporter and supports normal copper trafficking in Saccharomyces cerevisiae // Biochem J, 351(2): 477-484, 2000.

30. Hilton M., Spenser D.C., Ross P., Ramsey A., McArdle H.J. Characterisation of the copper uptake mechanism and isolation of the ceruloplasmin receptor/coppertransporter in human placental vesicles // Biochim Biophys Acta, 1245(2): 153-160, 1995.

31. Holzer A.K, Manorek G.H., Howell S.B. Contribution of the major copper influx transporter CTR1 to the cellular accumulation of cisplatin, carboplatin, and oxaliplatin // Mol Pharmacol, 70(4): 1390-1394, 2006.

32. Hurley L., Keen C., Lonnerdal B. Copper in fetal and neonatal development // Ciba Foundation symposium, 79: 227-245, 1980.

33. Jiang J., Nadas I.A., Kim A.M., Franz K.J. A Mets Motif Peptide Found in Copper Transport Proteins Selectively Binds Cu(I) with Methionine-Only Coordination // Inorg Chem, 44(26): 9787-9794, 2005.

34. Karl in K.D. Metalloenzymes, structural motifs, and inorganic models // Science, 261(5122): 701-708, 1993.

35. Kataoka M., Tavassoli M., Ceruloplasmin receptors in liver cell suspensions are limited to the endothelium // Exper Gell Res, 155(2): 232-240, 1984.

36. Kelleher S.L., Lonnerdal B. Mammary gland copper transport is stimulated by prolactin through alterations in Ctrl and Atp7A localization // American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology, 291(4): R1181-R1191, 2006.

37. Kim B.-E., Nevitt Т., Thiele D.J. Mechanisms for copper acquisition, distribution and regulation // Nat Chem Biol, 4(3): 176-185, 2008.

38. Kim H., Son H.Y., Bailey S.M., Lee J. Deletion of hepatic Ctrl reveals its function in copper acquisition and compensatory mechanisms for copper homeostasis // Am J Physiol. Gastrointestinal and liver physiology, 296(2): E-pub, 2009.

39. Kim S., Jeon Т., Oberai A., Yang D., Schmidt J.J., Bowie J.U. Transmembrane glycine zippers: Physiological and pathological roles in membrane proteins // Proc Nat Acad Sci. USA, 102(40): 14278-14283, 2005.

40. Kirchman P.A., Botta G. Copper supplementation increases yeast life span under conditions requiring respiratory metabolism // Mech Ageing Dev, 128(2): 187-195, 2007.

41. Klomp A.E., Juijn J.A., van der Gun L. Т., van den Berg I.E., Berger R., Klomp L.W. The N-terminus of the human copper transporter 1 (hCTRl) is localized extracellularly, and interacts with itself// Biochem J, 370(Pt 3): 881-889, 2003.

42. Klomp A.E., Tops B.B., Van Denberg I.E., Berger R., Klomp L. W. Biochemical characterization and subcellular localization of human copper transporter 1 (hCTRl) // Biochem J, 364(Pt 2): 497-505, 2002.

43. Klomp L.W., Farhangrazi Z.S., Dugan L.L., Gitlin J.D. Ceruloplasmin gene expression in the murine central nervous system // J Clin Invest, 98(1): 207-215, 1996.

44. Knutson M.D. Steap Proteins: Implications for Iron and Copper Metabolism // NutrRev, 65(7): 335-340, 2007.

45. Kozma M., Ferke A. Trace element localization and changes in zinc and copper concentrations during postnatal development of the rat CNS // Acta Histochem, 65(2): 219-227, 1979.

46. Kroll I. A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis Methods and Applications. 157pp, 1973.

47. Kulawiec M., Ayyasamy V., Singh K.K. p53 regulates mtDNA copy number and mitocheckpoint pathway//J.Carcinogen. 8: 1-9,2009.

48. К no M., Chen H., Song I., Savaraj N. Ishikawa T.The roles of copper transporters in cisplatin resistance // Cancer Metastasis Rev, 26(1): 71-83, 2007.

49. Kuo Y.M., Gybina A.A., Pyatskowit J. W., Gitschier J., Prohaska J.R. Copper transport protein (Ctrl) levels in mice are tissue specific and dependent on copper status // J Nutr, 136(1): 21-26, 2006.

50. Kuo Y., Zhou В., Cosco D., Gitschier J. The copper transporter CTR1 provides an essential function in mammalian embryonic development // Proc Nat Acad Sci USA, 98(12): 6836-6841, 2001.

51. Larson C.A., Blair B.G., Safaei R., Howell S.B. The role of the mammalian copper transporter 1 in the cellular accumulation of platinum-based drugs // Mol Pharmacol, 75(2): 324-330, 2009.

52. Lee J. Isolation of a murine copper transporter gene, tissue specific expression and functional complementation of a yeast copper transport mutant // Gene, 254(1-2): 87-96, 2000.

53. Lee J., Pe\ па M.M., Nose Y., Thiele D.J. Biochemical characterization of the human copper transporter Ctrl // J Biol Chem, 277(6): 4380^387, 2002.

54. Lin X., Okuda Т., Holzer A., Howell S.B. The Copper Transporter CTR1 Regulates Cisplatin Uptake in Saccharomyces cerevisiae // Mol Pharmacol, 62(5): 1154-1159,2002.

55. Linder M.C. Copper and genomic stability in mammals // Mutat Res, 475(1-2): 141-152,2001.

56. Linder M.C., Hazegh-Azam M. Copper biochemistry and molecular biology // Am J Clin Nutr, 63(5): 797S-811S, 1996.

57. Linder M., Bryant R., Lim S., Scott L., Moor J. Ceruloplasmin elevation and synthesis in rats with transplantable tumors // Enzyme, 24(2): 85-95, 1979.

58. Liu, Jingxuan, Sitaram, Anand, Burd, Christopher G. Regulation of Copper-Dependent Endocytosis and Vacuolar Degradation of the Yeast Copper Transporter, Ctrlp, by the Rsp5 Ubiquitin Ligase // Traffic, 8(10): 1375-1384, 2007.

59. Llanos R.M., Michalczyk A.A., Freestone D.J., Currie S., Linder M.C., Ackland M.L., Mercer J.F. Copper transport during lactation in transgenic mice expressing the human ATP7A protein // Biochem Biophys Research Commun, 372(4): 613-617, 2008.

60. Llanos R.M., Mercer J.F.B. The Molecular Basis of Copper Homeostasis Copper-Related Disorders // DNA Cell Biol, 21(4): 259-270, 2002.

61. Lonnerdal B. Copper nutrition during infancy and childhood // Am J Clin Nutr, 67(5 SuppI): 1046S-1053S, 1998.

62. Lonnerdal B. Intestinal regulation of copper homeostasis: a developmental perspective I I Am J Clin Nutr, 88(3): 846S-50S, 2008.

63. Lonnerdal В., Bell J.G., Keen C.L. Copper absorption from human milk, cow's milk, and infant formulas using a suckling rat model // Am J Clin Nutr, 42(5): 836-844, 1985.

64. Lowe J., Vieyra A., Catty P., Guillain F., Mintz E., Cuillel M. A Mutational Study in the Transmembrane Domain of Ccc2p, the Yeast Cu(I)-ATPase, Shows Different Roles for Each Cys-Pro-Cys Cysteine // J Biol Chem, 279(25): 2598625994, 2004.

65. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Fair A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J Biol Chem, 193(1): 265-275, 1951.

66. Mackenzie N. Cloning, expression pattern and essentiality of the high-affinity copper transporter 1 (ctrl) gene in zebrafish // Gene, 328: 113-120, 2004.

67. Madsen E., Gitlin J.D. Copper deficiency // Curr Opin Gastroenterol, 23(2): 187-192, 2007.

68. Maltais D., Desroches D., Aouffen M., Mateescu M., Wang R., Paquin J. The blue copper ceruloplasmin induces aggregation of newly differentiated neurons: a potential modulator of nervous system organization // Neurosci, 121(1): 73-82,2003.

69. Mani K, Cheng F., Havsmark В., David S., Fransson L. Involvement of GPI-linked ceruloplasmin in the Cu/Zn-NO-dependent degradation of glypican-1 heparan sulfate in Rat C6 glioma cells // J Biol Chem, 279(13): 12918-12923,2004.

70. Manolis A, Cox D. W. Purification of rat ceruloplasmin. characterization and comparison with human ceruloplasmin. Prep Biochem, 10(2):121-132, 1980.

71. Marabese M, Mazzoletti M., Vikhanskaya F., Broggini M. HtrA2 enhances the apoptotic functions of p73 on bax // Cell Death Differ, 15(3): 849-858, 2008.

72. Marone M, Mozzetti S., De Ritis D., Pierelli L., Scambia G. Semiquantitative RT-PCR analysis to assess the expression levels of multiple transcripts from the same sample // Biol Proced Online, 3: 19-25, 2001.

73. Mason K. A conspectus of research on copper metabolism and requirements of man//JNutr, 109(11): 2066, 1979.

74. Matsumoto S., Tanaka Т., Kurokawa H., Matsuno K., Hayashida Y., Takahashi T. Effect of copper and role of the copper transporters ATP7A and CTR1 in intracellular accumulation of cisplatin // Anticancer Res, 27(4B): 2209-2216, 2007.

75. McArdle H.J. The transport of iron and copper across the cell membrane: different mechanisms for different metals? // Proc Nutr Soc, 51(2): 199-209, 1992.

76. Merchant S.S., Allen M.D., Kropat J., Moseley J.L., Long J.C., Tottey S., ТегансЫ A.M. Between a rock and a hard place: trace element nutrition in Chlamydomonas // Biochim Biophys Acta, 1763(7): 578-594, 2006.

77. Mitro A., Palkovits M. Morphology of the rat brain ventricles, ependyma, and periventricular structures // Bibliotheca anatomica, 21: llOpp, 1981.

78. Mufti A.R., Burstein E., Duckett C.S. XIAP: Cell death regulation meets copper homeostasis // Arch Biochem Biophys, 463: 168-74, 2007.

79. Murata K., Mitsuoka K., Hirai Т., Walz Т., Agre P., Heymann J.В., Engel A., Fujiyoshi Y. Structural determinants of water permeation through aquaporin-1 // Nature, 407(6804): 599-605, 2000.

80. Musci G., Fraterrigo T.Z., Calabrese L., McMillin D.R. On the lability and functional significance of the type 1 copper pool in ceruloplasmin // J Biol Inorg Chem, 4(4): 441^146, 1999.

81. Nadella, Sunita, Grosell, Martin, Wood, Chris Mechanisms of dietary Cu uptake in freshwater rainbow trout: evidence for Na-assisted Cu transport and a specific metal carrier in the intestine // J Comp Physiol B, 177(4): 433^146, 2007.

82. Nose Y., Kim B.E., Thiele D.J. Ctrl drives intestinal copper absorption and is essential for growth, iron metabolism, and neonatal cardiac function // Cell Metab, 4(3): 235-244, 2006a.

83. Nose V., Rees E.M., Thiele D.J. Structure of the Ctrl copper trans'PORE'ter reveals novel architecture // Trends Biochem Sci, 31(11): 604-607, 2006b.

84. Ohgami R.S., Campagna D.R., McDonald A., Fleming M.D. The Steap proteins are metalloreductases // Blood, 108(4): 1388-1394, 2006.

85. Olivares M., Lonnerdal В., Abrams S.A., Pizarro F., Uauy R. Age and copper intake do not affect copper absorption, measured with the use of 65Cu as a tracer, in young infants // Am J Clin Nutr, 76(3): 641-645, 2002.

86. Osman D., Cavet J. Chapter 8 Copper Homeostasis in Bacteria // Adv Appl Microbiol, 65: 217-247, 2008.

87. Pabla N., Murphy R.F.F., Liu K., Dong Z. The copper transporter Ctrl contributes to cisplatin uptake by renal tubular cells during cisplatin nephrotoxicity // Am J Physiol Renal physiology, 296(3): F505-F511, 2009.

88. Patel B.N., Dunn R.J., David S. Alternative RNA Splicing Generates a Glycosylphosphatidylinositol-anchored Form of Ceruloplasmin in Mammalian Brain // J Biol Chem, 275(6): 4305^1310, 2000.

89. Репа M.M.O., Lee J., Thiele D.J. A Delicate Balance: Homeostatic Control of Copper Uptake and Distribution // J Nutr, 129(6): 1251-1260, 1999.

90. Petris M.J., Smith К., Lee J., Thiele D.J. Copper-stimulated Endocytosis and Degradation of the Human Copper Transporter, hCtrl // J Biol Chem, 278(11): 9639-9646, 2003.

91. Platonova N., Guolikhandanova N., Tsymbalenko N., Zhiguleva E. Zhivulko T. Vasin A., Evsukova I. Puchkova L. Milk ceruloplasmin is a valuable source of nutrient copper ions for mammalian newborns // J Trace Elem Med Biol, 21(3): 184-193,2007.

92. Portnoy, Portnoy M., Schmidt, Schmidt P., Rogers, Rogers R., Culotta, Culotta V. Metal transporters that contribute copper to metallochaperones in Saccharomyces cerevisiae // Mol Genet Genomics , 265(5): 873-882, 2001.

93. Pribyl T, Schreiber, Jahodovd J Polyphenol oxidase activity in the rat hypothalamus: stimulation after oestrogens and inhibition after the administration of silver // Physiol Bohemoslov , 30(6): 525-530, 1981.

94. Prohaska J.R. Role of copper transporters in copper homeostasis // The Am J Clinical Nutr, 88(3): 826S-829S, 2008.

95. Prohaska JR., Brokate B. The timing of perinatal copper deficiency in mice influences offspring survival // J Nutr, 132(10): 3142-3145, 2002.

96. Puchkova L., Zhivulko Т., Mishenko В., Vasin A., Platonova N. Tsymbalenko N. Copper nutrition and copper metabolism in rat newborns // Metal ions in biology and medicine, 3(3): 441-451, 2002.

97. Puig S., Thiele D.J. Molecular mechanisms of copper uptake and distribution // Curr Opin Chem Biol, 6(2): 171-180, 2002.

98. Puig S., Lee J., Lau M., Thiele D.J. Biochemical and Genetic Analyses of Yeast and Human High Affinity Copper Transporters Suggest a Conserved Mechanism for Copper Uptake // J Biol Chem, 277(29): 26021-26030, 2002.

99. Quintanar L., Stoj C., Taylor A.B., Hart P.J., Kosman D.J., Solomon E.I. Shall we dance? How a multicopper oxidase chooses its electron transfer partner // Acc. Chem Res, 40(6): 445-452, 2007.

100. Rae T.D., Schmidt P., J, Pufahl R.A., Culotta V.C., V, O'Halloran T. Undetectable Intracellular Free Copper: The Requirement of a Copper Chaperone for Superoxide Dismutase // Science, 284(5415): 805-808, 1999.

101. Rees E.M., Thiele D.J. Identification of a vacuole-associated metalloreductase and its role in Ctr2-mediated intracellular copper mobilization // J Biol Chem, 282(30): 21629-21638, 2007.

102. Reyes A., Leiva A., Cambiazo V., Mendez M., Gonzalez M. Cop-like operon: structure and organization in species of the Lactobacillale order // Biol Res, 39(1): 87-93, 2006.

103. Roy C.N., Enns C.A. Iron homeostasis: new tales from the crypt // Blood, 96(13): 4020-4027, 2000.

104. Saeki K., Nakjimi M., Loaghlin Т., Calkins D.C., Baba N., Kiyota M., Tatsukawa R. Accumulation of silver in the liver of three species of pinnipeds // Environ Pollut, 112(1): 19-25, 2001.

105. Safaei R. Role of copper transporters in the uptake and efflux of platinum containing drugs // Cancer Lett, 234(1): 34-39, 2006.

106. Safaei R., Katano K., Samimi G., Naerdemann W., Stevenson J.L., Rochdi M., Howell S.B. Cross-resistance to cisplatin in cells with acquired resistance to copper // Cancer Chemother Pharmacol, 53(3): 239-246, 2004.

107. Samimi G., Howell S.B. Modulation of the cellular pharmacology of JM118, the major metabolite of satraplatin, by copper influx and efflux transporters // Cancer Chemother Pharmacol, 57(6): 781-788, 2006.

108. Sharp P. Ctrl and its role in body copper homeostasis // Int J Biochem Cell Biol, 35(3): 288-291,2003.

109. Sharp P. The molecular basis of copper and iron interactions // Proc Nutr Soc, 63, 563-569, 2004.

110. Shi X., Stoj C., Romeo A., Kosman D.J., Zhu Z. Frelp Cu2+ Reduction and Fet3p Cul+ Oxidation Modulate Copper Toxicity in Saccharomyces cerevisiae // J Biol Chem, 278(50): 50309-50315, 2003.

111. Sinani D., Adle D.J., Kim H., Lee J. Distinct Mechanisms for Ctrl-mediated Copper and Cisplatin Transport // J Biol Chem, 282(37): 26775-26785, 2007.

112. Solioz M., Stoyanov J. Copper homeostasis in Enterococcus hirae // FEMS Microbiol Rev, 27(2-3): 183-195, 2003.

113. Southon A., Burke R., Norgate M., Batterham P., Camakaris J. Copper homoeostasis in Drosophila melanogaster S2 cells // Biochem J, 383(Pt 2): 303309, 2004.

114. Southon A., Farlow A., Norgate M., Burke R., Camakaris J. Malvolio is a copper transporter in Drosophila melanogaster // J Exp Biol, 211(Pt 5): 709-716, 2008.

115. Sfo/ C., Kosman D. Cuprous oxidase activity of yeast Fet3p and human ceruloplasmin: implication for function // FEBS Lett, 554(3): 422^126, 2003.

116. Stoj C.S., Augustine A.J., Solomon E.L., Kosman D.J. Structure-Function Analysis of the Cuprous Oxidase Activity in Fet3p from Saccharomyces cerevisiae // J Biol Chem, 282(11): 7862-7868, 2007.

117. Sze C., Khairallah G., Xiao Z„ Donnelly P., О'hair R., Wedd A. Interaction of cisplatin and analogues with a Met-rich protein site // J Biol Inorg Chem, 14(2): 163-165,2009.

118. Tennant J., Stansfield M., Yamaji S., Srai S.K., Sharp P. Effects of copper on the expression of metal transporters in human intestinal Caco-2 cells // FEBS Lett, 527(1-3): 239-244, 2002.

119. Turnlund J.R., Keyes W.R., Anderson H.L., Acord L.L. Copper absorption and retention in young men at three levels of dietary copper by use of the stable isotope 65Cu // Am J Clin Nutr, 49(5): 870-878, 1989.

120. Turnlund J.R., Keyes W.R., Peiffer G.L., Scott K.C. Copper absorption, excretion, and retention by young men consuming low dietary copper determined by using the stable isotope 65Cu // Am J Clin Nutr, 67(6): 1219-1225, 1998.

121. Turski M.L., Thiele D.J. Drosophila CtrlA functions as a copper transporter essential for development // J Biol Chem, 282(33): 24017-24026, 2007.

122. Uauy R., Olivares M., Gonzalez M. Essentiality of copper in humans // Am J Clin Nutr, 67(5 Suppl): 952S-959S., 1998.

123. Wu X., Sinani D., Kim H., Lee J. Copper transport activity of yeast Ctrl is down regulated via its C-terminus in response to excess copper // J Biol Chem, 284(7): 4112-4122, 2008.

124. Vavilova T.P., Gusarova I.N., Koroleva O.V., Medvedev A.E. The role of ceruloplasmin in neoplastic processes. Biomed Khim, 51(3): 263-275, 2005.

125. Wyman S., Simpson R.J., McKie A.T., Sharp P.A. Dcytb (Cybrdl) functions as both a ferric and a cupric reductase in vitro // FEBS Lett, 582(13): 1901-1906, 2008.

126. Xue Y., Davis A., Balakrishnan G., Stasser J., Staehlin В., Focia P., Spiro Т., Penner-Hahn J., O'Halloran T. Cu(I) recognition via cation-pi and methionine interactions in CusF // Nat Chem Biol, 4(2): 107-109, 2008.

127. Yonkovich J., Mckenndry R., Shi X., Zhu Z. Copper Ion-sensing Transcription Factor Maclp Post-translationally Controls the Degradation of Its Target Gene Product Ctrlp // J Biol Chem, 277(27): 23981-23984, 2002.

128. Yoshimura S, Tamaoki N, Ueyama Y, Hata J. Plasma protein production by human tumors xenotransplanted in nude mice // Cancer Res, 38(10): 3474-3478, 1978

129. Zhou В., Gitschier J. hCTRl: a human gene for copper uptake identified by complementation in yeast// Proc Nat Acad Sci USA, 94(14): 7481-7486, 1997.

130. Zhou H., Cadigan K.M., Thiele DJ. A Copper-regulated Transporter Required for Copper Acquisition, Pigmentation, and Specific Stages of Development in Drosophila melanogaster // J Biol Chem, 278(48): 48210-48218, 2003.

131. Zimniclca A.M., Maryon E.B., Kaplan J.H. Human copper transporter hCTRl mediates basolateral uptake of copper into enterocytes: implications for copper homeostasis // J Biol Chem, 282(36): 26471-26480, 2007.

132. Zhu Z., Labbe S., Репа M., Thiele D.J. Copper Differentially Regulates the Activity and Degradation of Yeast Macl Transcription Factor // J Biol Chem, 273(3): 1277-1280, 1998.

133. Zisowsky J., Koegel S., Leyers S., Devarakonda K, Kassack M.U., Osmak M., Jaehde U. Relevance of drug uptake and efflux for cisplatin sensitivity of tumor cells // Biochem Pharmacol, 73(2): 298-307, 2007.

134. Бабич 77. Метаболизм меди в мозгу крыс при различных состояниях организма. Кан. Дис. // НИИЭМ РАМН, СПб, 2008.

135. Васин А., Платонова Н., Повалихин Р., Клотченко С., Самсонов С., Цымбаленко И., Пучкова Л. Митохондриальный церулоплазмин млекопитающих // Мол Биол, 39(1): 42-52, 2005.

136. Клотченко С. Анализ структуры и экспрессии псевдогена церулоплазмина человека. Диссертация на соискание учёной степеникандидата биологических наук // ГУ НИИЭМ РАМН, Санкт-Петербург, 139 е., 2008.

137. Коттон Ф., Уилкинсон Дж. Современная неорганическая химия. М.: Мир, 1969. т. 3.592 с.

138. Платонова И.А., Жигулева Э.А., Цымбсшенко Н.В., Мищенко Б.С., Васин А.В., Живулько Т. В., Пучкова Л.В. Возрастные особенности биосинтеза и распределения церулоплазмина в организме крыс // Онтогенез. 2004, 35, 3: 171-182. •

139. Пучкова Л., Алейникова Т., Цымбаленко Н., Захарова Е., Конописцева Л., Чеботарь И., Гайтцхоки В. Биосинтез и секреция церулоплазмина клетками молочной железы в период лактации // Биохимия, 59(2): 341-348, 1994.

140. Пучкова Л., Платонова Н. Механизм, обеспечивающий гомеостаз меди у эукариотов, и его связь с транспортом железа // Усп совр биол, 123(1): 41— 58, 2003.

141. Слесарев В.И. Химия: Основы химии живого. СПб: Химиздат, 2000. 768 с.

Информация о работе

Самсонов, Сергей Алексеевич
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2010
ВАК 03.01.04

Диссертация

Экспрессия гена CTR1 у млекопитающих при разных состояниях метаболизма меди и IN SILICO анализ его белкового продукта - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы