Теоретические и экспериментальные подходы для изучения механизмов транспорта цисплатина в клетки с помощью белка CTR1

Затуловский, Евгений Аркадьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Теоретические и экспериментальные подходы для изучения механизмов транспорта цисплатина в клетки с помощью белка CTR1
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Теоретические и экспериментальные подходы для изучения механизмов транспорта цисплатина в клетки с помощью белка CTR1"

На правах рукописи 00461892У ^

ЗАТУЛОВСКИЙ Евгений Аркадьевич

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПОДХОДЫ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕХАНИЗМОВ ТРАНСПОРТА ЦИСПЛАТИНА В КЛЕТКИ С ПОМОЩЬЮ БЕЛКА СТШ

03.01.04 - биохимия 03.01.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 ДЕК 2010

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2010

004618929

Работа выполнена в ГОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный политехнический университет и в Учреждении Российской Академии медицинских наук Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины СЗО РАМН

Научные руководители:

д.б.н., проф. Людмила Валентиновна Пучкова

к.ф.-м.н. Алексей Николаевич Скворцов

Официальные оппоненты:

Ведущее научное учреждение: Институт цитологии РАН

Защита состоится «28» декабря 2010 г. в 11.00 часов на заседании Диссертационного совета ДОО 1.022.03 по защите докторских и кандидатских диссертаций при НИИЭМ СЗО РАМН, Санкт-Петербург, 197376, Каменноостровский пр. 69/71.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИЭМ СЗО РАМН (197376 Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12).

д.ф.-м.н., проф. Андрей Леонидович Тимковский

чл.-корр. РАН, д.м.н., проф. Михаил Владимирович Дубина

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук, проф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Роль меди как структурного и каталитического ко-фактора ряда жизненно важных ферментов известна более полувека и на протяжении этих лет интенсивно изучается (Karlin, 1993; Turnlund et al., 1998). В последние годы выявлены и другие биологические функции меди. Во-первых, установлено, что уровень меди в клетке контролирует клеточный цикл через Х-сцепленный ингибитор апоптоза {Mufti, et al., 2007) и, во-вторых, распределение меди в клетке оказывает влияние на соотношение гликолиза и дыхания в опухолях (эффект Варбурга; Zhivotovsky, Orrenius, 2009). В то же время, ионы меди могут быть высоко токсичными агентами, так как в свободном состоянии катализируют образование активных метаболитов кислорода. Для безопасного переноса меди у эукариотов существует система транспортеров, включающая не менее 10 мембранных и цитозольных белков, в которой медь передается при прямом контакте холо-переносчика с апо-транспортером в одном направлении по увеличению аффинности к иону меди (Kim et al., 2008). Даже незначительные изменения структуры этих белков ведут к дисбалансу меди, который провоцирует развитие таких тяжелых заболеваний, как рак, нейродегенеративные болезни, фибриллогенез, остеопороз и другие.

В реализации биологических функций меди ключевым событием является ее перенос в клетку. Он осуществляется белком CTR1 (copper transporter 1), относящимся к семейству высокоаффинных импортеров меди (Sharp, 2003). Нокаут гена CTR1 у мышей приводит к ранней гибели эмбрионов-гомозигот, а у гетерозигот - к развитию дефицита меди, при этом содержание меди изменяется тканеспецифично (Lee, 2000). На ранних этапах эмбрионального развития амфибий и млекопитающих белок CTR1 участвует также в морфогенезе и дифференцировке клеток (Haremaki et al., 2007; Haremaki et ai, 2009). К тому же белок CTR1 участвует в импорте цисплатина, широко используемого противоопухолевого платинового препарата (Ishida et al., 2002; Holzer et al., 2006). Однако до сих пор не рассматривался вопрос о том, может ли белок CTR1 транспортировать и медь, и платину, координационная химия которых столь различна; и, поэтому, связан ли транспорт платины с уровнем внеклеточной меди. Ответы на эти вопросы важны для понимания общего механизма транспорта меди в клетки и механизма поступления в клетки цисплатина. Представленная диссертация выполнена с учетом актуальности изложенной проблемы.

Цель представленной работы состоит в разработке модели для изучения связи между уровнем внеклеточной меди и транспортом цисплатина в клетки.

Для достижения заявленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить координационные свойства металлосвязывающих консервативных N-концевых мотивов белка CTR1 и создать теоретическую модель, объясняющую способность CTR1 переносить платину.

2. Разработать животную модель с изменяющимся уровнем внеклеточной меди.

3. Проверить полученную модель на возможность использования ее для изучения связи между метаболизмом меди и транспортом цисплатина.

Научная новизна полученных результатов. С помощью методов молекулярной эволюции показано, что медьсвязывающие мотивы N-концевого участка белка CTR1 являются внеклеточными нуклеофильными сайтами с селективной специфичностью по отношению к Cu(I), к Cu(II) и к Pt(II). Пространственная сближенность этих сайтов создает условия для внутримолекулярного восстановления меди (И) и транспорта цисплатина при ее участии. На модели мышей, получавших серебро с пищей, показано, что ионы Ag(I), изоэлектронные Cu(I), узнаются белками метаболической системы меди (МСМ) и переносятся ими по межклеточным и внутриклеточным маршрутам меди. Серебро метаболически включается в церулоплазмин (ЦП), основной внеклеточный медьтранспортный белок позвоночных, что приводит к снижению количества атомов меди на молекулу ЦП, к нарушению его третичной структуры и потере каталитических активностей. В печени Ag-животных синтез и активность генов медьтранспортных белков и купроэнзимов не изменяется. Таким образом, Ag-диета избирательно вызывает снижение содержания только той меди, которая ассоциирована с ЦП. Дефицит меди в этой форме снижает скорость роста опухолей человека у иммунодефицитных мышей. Наличие ионов серебра во внеклеточной среде влияет на цитотоксические свойства цисплатина. Скорость поступления цисплатина в клетки снижена у животных с низким уровнем внеклеточной меди.

Научно-практическое значение полученных результатов состоит в том, что они углубляют знания о механизмах, лежащих в основе нарушений метаболизма меди, ведущих к развитию медь-ассоциированных болезней; кроме того, они расширяют общие представления о метаболизме металлов в организме млекопитающих. В практическом плане, использование разработанной модели животных с изменяющимся уровнем меди в крови позволит изучить роль меди в индукции и скорости роста опухолей. Выявление связи между уровнем меди во внеклеточной среде и токсическим эффектом цисплатина открывает перспективу для оптимизации протоколов применения этого противоопухолевого препарата в клинике.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Белок CTR1 импортирует цисплатин при участии ионов меди Cu(II).

2. У лабораторных грызунов Ag-диета вызывает обратимое снижение содержания меди, ассоциированной с ЦП, и не влияет на метаболизм меди в печени.

3. Дефицит меди, индуцированный Ag-диетой, может быть компенсирован однократным введением сульфата меди.

4. Скорость роста опухолей человека в организме иммунодефицитных мышей снижается при дефиците меди, связанной с ЦП.

5. Ионы серебра влияют на цитотоксическое действие цисплатина.

6. Распределение цисплатина в организме мышей зависит от уровня меди в крови.

Апробация результатов работы. По теме диссертации опубликовано пять статей, четыре из которых - в журналах, включенных в список ВАК РФ. Результаты работы были представлены на 11-й, 12-й и 14-й Путинских школах-конференциях молодых учёных «Биология — наука XXI века» (Пущино-на-Оке, Московская область, 2007, 2008 и 2010 г.), устные сообщения; на Международной конференции по системной биологии, биоинформатике и синтетической биологии (Манчестер, Великобритания, 2007 г.), стендовое сообщение; на I Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2008» (Казань, 2008 г.), устное сообщение; на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008 г.), а также на 38-ой Международной конференции по координационной химии (Иерусалим, Израиль, 2008 г.); на VI Съезде Российского общества Медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, май 2010) и на 4-ом Международном симпозиуме по микроэлементам и минералам в медицине и биологии (СПб, июнь 2010), устное сообщение.

Личный вклад соискателя. Планирование работы, анализ докинг-взаимодействий, компьютерный анализ нуклеотидных и а.к. последовательностей, получение большей части экспериментальных результатов и написание статей выполнены соискателем.

Структура диссертации. Рукопись содержит «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и их обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список цитированной литературы». Диссертация изложена на 146 страницах, включающих библиографию (178 источников, из которых 167 на английском языке), 3 таблицы и 42 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы мыши линий С57В1 и CD-I; клеточные культуры линий НСТ116 и SKOV3; крысы линии Вистар; антитела к ЦП человека и крысы; антитела к пептидам, соответствующим участкам белков CTR1 и АТР7В; а также антитела фирмы «Abcam» (США) к СОД1, СОХ, VDAC, HTRA2, р53, цитохрому с и ß-актину. Реактивы для электрофореза -фирмы «Sigma».

Тотальную РНК изолировали с использованием реактива "TRIzol Reagent". Концентрацию РНК определяли сиектрофотометрически. Гель-электрофорез ПЦР-продуктов проводили в 1% агарозном геле. Гели окрашивали этидий бромидом (Sambrook el al., 1989). Синтез кДНК в реакции обратной транскрипции (ОТ) проводили на тотальной РНК со случайными праймерами, как описано ранее (Васин и др.. 2004). ПЦР на полученной кДНК проводили со специфическими праймерами для CTR1, ЦП, ГФИ-ЦП (ЦП, связанного с плазматической мембраной через гликозилфосфатидилинозитоловый якорь), СОХ, СОД1 и ß-актина, как описано ранее (Клотченко и др., 2008). Для полуколичественной характеристики экспрессии генов использовали соотношение между уровнем мРНК ß-актина и мРНК исследуемого гена (Marone el al., 2001). ЦП выделяли методом, описанным ранее (Manolis&Cox, 1980). Для сравнительного анализа очищенных препаратов ЦП и Ag-ЦП использовали измерение кругового дихроизма, UV/vis спектрофотометршо и дифференциальную сканирующую калориметрию. Выделение субклеточных фракций из гомогената клеток, приготовленного в буфере, содержащем 0,25 М сахарозу, 10 шМ Tris-HCl (pH 7,4), 100 мМ KCl, 8 шМ MgCl2, 0,04% ß-меркаптоэтанол, смесь ингибиторов протеаз фирмы "Sigma" (США) проводили методом дифференциального или равновесного центрифугирования (Васин и др., 2005). Электрофорез белков проводили в ПААГ в неденатурирующих условиях, или в присутствии 0.1%-ного ДСН по методу Laemmli (1970). Перенос белков из ПААГ на нитроцеллюлознуго

мембрану осуществляли полусухим методом или в буфере. Специфические иммунные комплексы выявляли после гибридизации со вторыми антителами, конъюгированньши с пероксидазой, с помощью хемилюменисцентных проявителей. Концентрацию меди, серебра и платины измеряли методом атомно-абсорбционной спектрометрии с электротермической атомизацией и зеемановской коррекцией неселективного поглощения на спектрометре «Perkin-Elmep>, Model 4100ZL, США. Оксидазную, ферроксидазную и супероксиддисмутазную активности определяли окрашиванием геля на соответствующие ферменты, используя специфические абиогенные субстраты.

Из открытой базы данных Entrez (www.ncbi.nlm.nih.gov) были извлечены следующие а.к. последовательности CTR1: NP 001850.1, NP 598284.1, NP 780299.1, AAL49494.1, CAD13301.1, ААН53785.1, AAL76092.1, ААМ75086.1, ЕАА01481.1, САЕ66920.1, САВ51175.1, САВ87806.1, САС83163.2, САВ38165.1, NP_015449.1. Для анализа o.k. и нуклеотидных последовательностей использовали программы ClustalX (www.clustal.org), UCSC Proteome Browser (genome.ucsc.edu), Multalin (http://npsa-pbil.ibcp.fr/), Cobalt (NCBI). Расчеты геометрии молекулярных структур и энергии взаимодействия выполнены методами молекулярной механики AMBER, полуэмпирического квантовохимического расчета в параметризации CNDO и ab initio в базисе 6-3 IG*, реализованными в программе HyperChem 7.01 (HyperCube). Визуализация рассчитанных структур проведена с использованием программ RasMol 2.7, HyperChem 7.01. Для характеристики белок-белковых взаимодействий между возможными донорами и акцепторами меди для CTR1 использовалась программа Hex 4.5. Результаты докинга, принадлежащие к структурным кластерам (пространственно близким результатам докинга), были упорядочены по энергиям и проанализированы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Филогенетический анализ белков CTR1 позвоночных

Учитывая данные о структуре ку профильной поры CTR1 и медьсвязывающего мотива в цитозольном домене CTR1, полученные нами ранее (Самсонов и др., 2006), в этом исследовании основное внимание уделено анализу структуры внеклеточного N-концевого домена и трансмембранного домена 1 (ТМД1) CTR1.

Филогенетический анализ N-концевого домена CTR1 показал, что он является наиболее вариабельным участком CTR1, однако в его строении могут быть выделены следующие закономерности:

1. Домен содержит необычно большое количество остатков метионина, часто собранных в кластеры ММ, МХМ и МХХМ, где X - чаще всего Gly или Ser.

2. Он обогащен остатками Glu и Asp и содержит мало остатков Lys и Arg, что должно благоприятствовать электростатическому притяжению катионов.

3. У многих видов N-конец содержит идеальные или несовершенные метионин-богатые повторы (длиной от 3 до 19 а.о.), количество повторов варьирует у близких видов.

4. У многоклеточных животных N-конец обогащен остатками His, которые также собраны в кластеры. У одноклеточных и грибов N-конец CTR1 часто вообще не содержит His и образован преимущественно Met, Ser/Thr и Asp.

5. Внеклеточный домен CTR1 содержит один или несколько потенциальных сайтов N-гликозилирования.

6. Остатки Cys в N-концевых доменах CTR1 отсутствуют.

7. Предсказание вторичной структуры не дает каких-либо предпочтительных элементов вторичной структуры у этого домена. Кроме того, он содержит остатки Pro, положение которых в эволюции неконсервативно.

Анализ а.к. последовательностей позволяет сделать вывод, что решающее значение в эволюции N-концевого домена CTR1 имеет не конкретная первичная или вторичная структура сайтов, а содержание в них а.о., способных координировать медь, и взаимное пространственное расположение этих сайтов.

У позвоночных структура N-конца значительно более упорядочена, чем в общем по эукариотам. В нем можно выделить His-Met богатый сайт (медьсвязывающий мотив 1), гистидиновый сайт (медьсвязывающий мотив 2), глициновый линкер и метиониновый кластер (медьсвязывающий мотив 3). Число остатков His и Met и их расположение в мотиве 1 варьирует, обычно в этом мотиве также присутствуют Asp/Glu. Мотив 1 и мотив 2 разделены одним или несколькими остатками Pro, у млекопитающих в этой же области находится сайт N-гликозилирования. Число остатков His в мотиве 2 и его а.к. состав вариабельны (у млекопитающих он содержит 4-5 остатков His), но расположение остатков His относительно консервативно. Глициновый линкер, разделяющий мотивы 2 и 3, является вариабельным участком, его длина не совпадает даже у близких видов. Мотив 3 у позвоночных имеет последовательность (М)МММХМ, где в качестве X обнаруживаются Gin, Pro, His, Ala и Lys; кодоны, соответствующие этим а.о. могут быть получены друг из друга путем одиночных нуклеотидных замен. Поскольку замены а.о. в этом положении в эволюции происходили неоднократно, следует предположить, что значение этого остатка непринципиально для функционирования мотива 3, в отличие от каждого из остатков метионина.

Накопившиеся данные по структуре и функции Си(1)-связывающих белков прокариот (CusA, РсоА, СорА, СорК, СорС, шаперон DR] 885, N-концевой домен прокариотических СОД), указывают на то, что сайт, образованный только остатками Met может рассматриваться как новый самостоятельный и широко представленный в эволюции класс Си(1)А^(1)-связывающих сайтов. Именно к этому классу принадлежат медьсвязывающие сайты CTR1, что подтверждается закономерностями связывания металлов с пептидами, соответствующими N-концу CTR1 позвоночных (Rubino et al., 2010). У метионина боковая группа, в силу наличия двух метиленовых групп, имеет большую конформационную свободу, чем боковые группы Cys и His. Кроме того, атом серы тиоэфирной группы имеет две неподеленные пары электронов и может образовывать координационные связи в двух близких направлениях, легко изомеризующиеся друг в друга за счет поворота на 60° вокруг C-S связи. Поэтому, по конформационной жесткости метиониновый комплекс является значительно более "рыхлым", чем цистеиновый или гистидиновый. Хелатный эффект для метионинового комплекса будет слабее, поэтому Met-сайт должен легко отдавать медь другим сайтам. Поскольку CTR1 функционирует в виде гомотримерного тригонального канала, устье которого образовано поворотами между ТМД2 и ТМДЗ, а три мотива 3 могут быть сближены друг с другом и с устьем канала за счет гидрофобного взаимодействия, то локальная концентрация

остатков метионина здесь очень велика. Это создает идеальные условия образования комплексов меди (I). Наличие отрицательно-заряженных а.о. способствует электростатическому притяжению катионов, а гидрофильность дистапьной части N-концов и их гликозилирование препятствуют слипанию с мембраной и друг с другом.

Канонический анализ топологии доменов в белке CTR1 предсказывает, что ТМД1 начинается с 68 а.о. и продолжается до 86 а.о., он расположен на расстоянии 22 а.о. от описанного выше метионинового сайта {Sharp, 2003). Предполагаемое начало ТМД1 определяется нечетко, так как CTR1 содержит достаточно протяженную область гидрофобных а.о., разделенных единичными заряженными а.о. (рис. 1, см. вкладку). Поэтому допустимо считать, что начало ТМД1 расположено значительно ближе к N-концу, чем следует из канонического анализа трансмембранных доменов, то есть длина ТМД1 может составлять 27-29 а.о., а метионин-богатый мотив 3 располагается у устья купрофильной поры вблизи критических для переноса меди остатков метионина 150 и 154, принадлежащих ТМД2. Длина консервативного линкера между удлиненным ТМД1 и мотивом 3 позволяет последнему сближаться с устьем канала. Так как Met-домены не обладают конформационной жесткостью, геометрия образуемых ими комплексов, скорее всего, не фиксирована, поэтому специфичность по отношению к Cu(I) невелика, а лабильность (характеризуется скоростью образования и распада комплекса в реакциях нуклеофильного замещения) значительна. Теоретически, эти мотивы должны связывать любые мягкие электрофилы - Cu(I), Ag(I), Hg(II), Pt(II), Au(III) и т.п., что отчасти подтверждается экспериментально (Rubino et al., 2010; Arnesano et al., 2008).

Таким образом, описанные свойства N-концевого домена CTR1 полностью соответствуют его биологической роли, которая состоит в первичном захвате иона меди и удержании его в восстановленном состоянии вблизи устья канала, образованного ТМД2 и ТМДЗ. Наличие большого количества мягких нуклеофильных групп и изоляция иона от молекул воды в гидрофобном метиониновом окружении мотивов 3 делают восстановленную форму Cu(I) энергетически более выгодной, чем Cu(II), и препятствуют окислению или диспропорционированию: ион(ы) меди (I) "растворен(ы)" в прочно связанной вблизи устья канала нанокапле тиоэфира. В отличие от медьтранспортных белков, в данном случае специфичность первичного связывания не очень важна, так как общая высокая аффинность транспорта по отношению к Cu(I)/Ag(I), скорее всего, определяется далее сайтами по ходу канала (например, Metl50 и Metl54 (Guo et al, 2004)). Эти сайты находятся в предорганизованной геометрии (De Feo et al., 2009), а поэтому энергетически более выгодны для соответствующих по свойствам ионов в силу увеличения хелатного эффекта.

2. Предполагаемое функциональное значение медьсвязывающих мотивов N-конца CTR1 позвоночных

Значительная консервативность N-концевого домена CTR1 у позвоночных, образование в нем трех мотивов и сохранение относительно постоянной длины указывает на возникновение новых консервативных функций. В самом деле,

CTR1 является основным и, по-видимому, универсальным транспортером меди в клетку. В рамках существующей концепции МСМ позвоночных это означает, что CTR1 может получать медь (II) от разных доноров (напрямую либо с помощью переносчиков): от комплекса с гистидином (клетки печени), от ЦП (клетки негепатоцитарных рядов), а также связывать "неупакованную" медь (в просвете кишечника). Последнее однозначно подтверждается комплементацией CTR1 человека утраченной медьтранспортной функции у дефектных по CTR1 дрожжей (Zhou et al., 1997). Особенности строения N-конца CTR1 позвоночных позволяют предположить, что N-конец способен быть прямым акцептором меди для всех перечисленных доноров ([His2Cu], ЦП и «неупакованная» медь). Возможно, что ионы Cu(II) первоначально связываются с а.о. His мотивов 1 и 2, при этом неупакованные ионы связываются с ними напрямую, a [HisjCu] распадается за счет эквивалентного замещения Hi.sHis. Хелатный эффект и рассеянные в N-конце остатки Asp и Glu способствуют этому связыванию. В то же время, в силу отсутствия жесткой структуры сайта, такое связывание не является слишком прочным. На этом этапе происходит селекция Cu(II) от более жестких электрофилов. Ион Cu(II), первоначально связанный а.о. His, попадает в близкое окружение остатков Met, стабилизирующих восстановленное состояние. При наличии источника электрона происходит восстановление, сопряженное с перемещением Cu(I) из His-сайта в Met-сайт (мотив 3), подобно тому, как это происходит в белках СорС. На этом этапе происходит селекция Cu(II) от сходных по жесткости электрофилов (Zn2+), неспособных к восстановлению. Маловероятно, чтобы N-конец CTR1 мог сам выполнять функцию оксидоредуктазы, однако он является идеальным вспомогательным белком для осуществления реакции восстановления. Возможно, ионы Cu(I), образующиеся при неспецифическом восстановлении Си2+, и ионы Ag+ связываются напрямую с мотивом 3.

3. Докинг N-концевых медьсвязывающих мотивов CTR1 млекопитающих с предполагаемыми донорами меди

Консервативность длины N-конца CTR1 и наличие смешанного Met/His мотива 1 у позвоночных, вероятно, обусловлены возможностью прямого переноса иона меди на него с молекулы ЦП, являющегося у позвоночных основным донором меди для клеток негепатоцитарных рядов. Мотив 1 является наилучшим кандидатом на роль акцептора меди от ЦП в силу его дистального положения относительно мембраны. Для описания возможных взаимодействий между N-концом CTR1 и его потенциальными донорами меди был использован метод докинга в модели связывания лиганда с жестким рецептором.

В качестве молекулы-"лиганда" (акцептора меди) использовали различные мотивы из N-концевой области белка, кодируемого геном CTR1 человека, а в качестве "рецептора" (донора меди) - молекулы ЦП (PDB ID: 1KCW) и сывороточного альбумина (PDB ID: 1А06). Для этого из а.к. последовательности N-концевого домена белкового продукта гена CTR1 были выбраны 3 предполагаемых медьсвязывающих мотива (координаты в а.к. последовательности: 1-13, 19-26, 39-46). Далее с помощью программы

HyperChem 7.01 проводилась геометрическая оптимизация этих мотивов методом молекулярной механики AMBER с точечными зарядами на атомах, рассчитанными полуэмпирическим методом CNDO. Для каждого мотива оптимизация проводилась при двух различных начальных приближениях - в конформации a-спирали и в конформации р-слоя. В использованной для расчетов модели С-концы мотивов были блокированы N-метильными группами для нейтрализации заряда С-конца пептида (что и происходит при присоединении последующих а.к. с N-конца), N-концы мотивов 2 и 3 были блокированы ацетильными группами, а имидазольные группы остатков гистидина депротонированы, как это имеет место при физиологических значениях рН. Далее все полученные структуры мотивов использовались в качестве лигандов при докинге. Результаты приведены на рис. 2 (см. вкладку). Они показывают, что мотив 1 ('MDHSHHMGMSYMD13) с начальной конформацией a-спирали, в результате докинга сближен (на расстояние не более 3.5 Á) с а.о. молекулы ЦП, непосредственно координирующими лабильный атом меди в составе ЦП - Glu935, His940, Aspl025, и с самим этим атомом меди (Си62, нумерация остатков по записи PDB 1KCW, используемая в расчётах структура ЦП содержит 2 лабильных атома меди). Мотив, оптимизированный в конформации Р-слоя, оказывается локализованным в близкой области и также сближен с Glu935.

Структура, полученная оптимизацией второго мотива (19QPSHHHPT26) в конформации a-спирали, так же как и структура его в приближении р-слоя, в результате докинга оказывается сближенной примерно с той же частью молекулы ЦП, что и первый рассмотренный мотив.

Структуры, соответствующие двум разным начальным геометриям третьего мотива (39SMMMMPMT46) в результате докинга оказываются сближенными с разными участками молекулы ЦП. Однако оба эти участка содержат лабильные атомы меди. Таким образом, прямой захват меди из лабильных сайтов ЦП N-концом CTR1 весьма вероятен. Для молекулы альбумина выгодного взаимодействия медьсвязывающих мотивов N-конца CTR1 с физиологическим сайтом связывания меди не обнаруживается.

4. Модель, объясняющая транспорт цисплатина через CTR1

Перенос платины через CTR1 по механизму, идентичному с медью (I), невозможен в силу следующих причин:

а) медь(1) транспортируется в виде иона, а цисплатин представляет собой жесткую конструкцию, в которой некоторые исходные нуклеофильные группы критичны для взаимодействия с ДНК и должны быть сохранены;

б) связь Pt(II)-S-Met намного устойчивее, чем Cu(I)-S-Met. При взаимодействии с пептидами, моделирующими метиониновые сайты CTR1 in vitro, цисплатин быстро теряет свои лиганды и образует прочный комплекс с четырьмя тиоэфирными группами (Sze et al, 2009). In vivo такая ситуация приводила бы к необратимому блокированию медного канала, а не к транспорту Pt(II) в клетку.

Известно, что в некоторых системах медь (II) способна катализировать расщепление связи Pt(II)-S (Cheng et al., 1998). С учетом этого факта

предлагается следующий механизм транспорта платинового препарата белком CTR1 (Рис. 3).

На первом этапе активированные платиновые препараты связываются с остатками метионина. Наиболее важным является их связывание в мотиве 3, за счет чего осуществляется их локальное концентрирование вблизи устья канала (в полном соответствии с данными по роли мотива 3 в транспорте цисплатина (Sinani et al, 2007). В нормальном состоянии МСМ, CTR1 осуществляет транспорт меди, поэтому с большой вероятностью мотив 2 содержит связанный ион Cu(II), ожидающий восстановления. При этом в силу пространственной близости мотивов 2 и 3 создаются условия для каталитического расщепления связи Pt-S и освобождения платинового комплекса в устье канала до того, как произойдет полидентатное хелатирование, инактивирующее и комплекс, и сайт.

В соответствии с рабочей гипотезой, медь необходима для "проталкивания" платины в канал. С другой стороны, она конкурентно занимает сайты связывания с платиной. В связи с этими соображениями, уровень меди во внеклеточной среде и терапевтическая эффективность цисплатина не могут не быть взаимосвязанными. Степень заполнения Cu(II) и Cu(I) сайтов CTR1 в клеточных культурах контролировать сложно, поэтому чрезвычайно актуальным является исследование животных моделей, в которых CTR1 функционирует в паре с физиологическими донорами меди (His?Cu и ЦП). В таких моделях возникает возможность контролировать функционирование CTR1 за счет влияния на состояние внеклеточного статуса меди, который описывается тремя параметрами: концентрацией тотальной меди, уровнем оксидазной активности (концентрацией холо-ЦП) и содержанием иммунореактивного ЦП (сумма холо-ЦП и апо-ЦП) в сыворотке крови (Olivares et al, 2008).

5. Модель животных с искусственно изменяемым статусом меди

В представленной работе разработан и охарактеризован метод снижения статуса меди в крови и его последующего восстановления. Основой метода является способ, предложенный Schreiber с соавт. (Schreiber et al., 1980), который состоит в том, что крысам в корм добавляется нитрат серебра из расчета 50 мг в сутки на 1 кг массы тела (Ag-диета). Через месяц Ag-диета приводит к падению фенолоксидазной активности в крови и в жидкости, омывающей желудочки мозга.

В представленной работе показано, что во время Ag-диеты в крови крыс и мышей падает уровень оксидазной и ферроксидазной активности и пропорционально снижается концентрация меди (Рис. 4, см. вкладку). В кровотоке Ag-животных циркулируют 2 формы иммунореактивного ЦП. Одна форма ЦП имеет ту же подвижность в геле, что и холо-ЦП, вторая движется медленнее и этим напоминает апо-ЦП. Обе формы не окрашиваются на оксидазную активность. Серебро сыворотки ко-иммунопреципитируется антителами к ЦП. При этом относительный уровень ЦП-мРНК и содержание полипептида ЦП как в аппарате Гольджи, так и в сыворотке, не меняется. Таким образом, Ag-диета в сыворотке крови животных снижает только оксидазную

активность (которая зависит от меди, ассоциированной с ЦП), не изменяя экспрессию гена ЦП.

Из сыворотки Ag-крыс с нулевым уровнем оксидазной активности методом ионообменной хроматографии был получен набор фракций, обогащенных ЦП (Ag-ЦП). Элюцию проводили ступенчатым градиентом NaCl (градиент начинался со 100 мМ NaCl, и ступенька соответствовала 50 мМ). Данные анализа Ag-ЦП представлены на рис. 5 (см. вкладку). Они показывают, что полученный препарат содержит два мажорных полипептида, которые взаимодействуют с антителами к ЦП. Обе формы имеют одинаковую молекулярную массу, соответствующую полноразмерной молекуле ЦП. Во фракциях выявляется оксидазная активность, которая сохраняет специфический каталитический характер и, в пересчете на единичную концентрацию белка, снижается с номером фракции. Оксидазная активность составляет примерно 1 -2% от оксидазной активности холо-ЦП, взятого в том же количестве. Вероятно, что во фракциях присутствует и некоторая ферроксидазная активность, так как на дорожках геля можно увидеть ее следы.

Спектрофотометрический анализ препарата Ag-ЦП показал, что в соответствии с низким содержанием меди в Ag-ЦП, выраженная полоса поглощения ЦП при 610 нм, обусловленная окисленной медью типа I, в спектрах Ag-ЦП - очень слабая и выявляется только во фракциях с наибольшей концентрацией белка. Уменьшение отношения D6io/D2îio в Ag-ЦП по сравнению с холо-ЦП приблизительно совпадает с уменьшением скорости катализа окисления о-дианизидина. Соотношения D^tJDzm для холо-ЦП и фракций Ag-ЦП значимо не отличаются, поэтому £>2so может служить достаточно надежным способом определения суммарной концентрации белков в препаратах Ag-ЦП. Спектральной особенностью Ag-ЦП, отсутствующей в спектрах холо-ЦП (и примесного оксигемоглобина), является небольшая полоса в области 320-330 нм с е~1500 М~1см~', которая может быть обусловлена поглощением координированного серебра или не полностью сформированными медьсвязывающими сайтами.

Спектр КД холо-ЦП крысы почти совпадает со спектром КД ЦП человека {Noyer, Putnam, 1981) и характеризуется отрицательным КД в ароматической области и выраженным экситонным дублетом (400-650 нм) оптического перехода меди типа I при 610 нм. Анализ КД холо-ЦП крысы в области 190-240 нм с помощью алгоритма CDNN дает предсказание вторичной структуры 12% а, 36% р, 17% поворотов и 35% неупорядоченной структуры, что хорошо согласуется с данными рентгеноструктурного анализа {Zaitseva et al., 1996) ЦП человека (8.4% а, 34% (5). Фракции Ag-ЦП обладают в области 190-240 нм одинаковыми спектрами КД, отличия которых от спектра холо-ЦП очевидны без количественного анализа. Оценка содержания вторичной структуры дает 20% а, 9% р, 20% поворотов и 51% неупорядоченной структуры. КД Ag-ЦП в видимой области не детектируется в соответствии с отсутствием полосы поглощения меди типа I. КД Ag-ЦП в области 240-330 нм напоминает по форме спектр ЦП вблизи точки щелочной денатурации рН 10.5 {Noyer, Putnam, 1981) и спектр апо-CN-ЦП, лишенного ионов меди {Sedlak, Witting-Stafshede, 2007). Однако рН-

Рис. 1. Средний профиль гидропатичности выровненных по С-концу последовательностей СТШ позвоночных. Указаны среднее ± среднеквадратичное отклонение. Номера остатков соответствуют последовательности СТЯI человека. Наверху -значения гидопатичности а.о. (Еп%е1тап е/ а!., 1986), внизу - сглаженный профиль гидропатичности (рамка 19 а.о.). Указаны положения мотива 3, ТМД и возможный ТМД-1 увеличенной длины. Заметны осцилляции гидропатичности с периодом а-спирали в ТМД-2 (амфипатическая спираль).

МРНЗННМСМЭУМРВ^ТМ ОРЗНННРТСАБНЗНСййРЗ ЗММММРМТРУРСРКЫУЕИРБС

Рис. 2. Идентифицированные методом молекулярного докинга три участка ЦП (РОВ Ш: 1КС\У), с наибольшей вероятностью участвующие во взаимодействиях с ^концом белка СТК1.

Рис. 3. Гипотетическая схема импорта цисплатина в клетки через CTR1 с участием ионов меди. Для наглядности показана только одна из субъединиц гомотримера. А -размещение нуклеофильных сайтов, голубые -His, желтые - Met. Б - платина кинетически предпочтительно связывается с мотивом 3, медь (П), поставляемая донором меди, связывается с доменами 1 и 2. В - медь (II) катализирует отщепление платинового комплекса от остатков метионина в мотиве 3. Г - Медь (I) занимает мотив 3 и "вытесняет" платиновый комплекс внутрь канала.

iLt

130 «Да

Рис. 4. А - оксидазная активность в сыворотке крови крыс. По оси абсцисс: время, сутки; по оси ординат: концентрация ЦП, мг/100 мл. п = 10. Б - интенсивность зон геля, окрашиваемых орто-дианизидином. 1 - контроль. 2-4 - 1, 2 и 3 недели, в течение которых животные получали Ag-кopм; по оси ординат: оксидазная активность, условные единицы, п = 7. В -концентрация Си в сыворотке крыс (1) и мышей (2), п = 7. Г нД - сыворотка крови крыс (Г) и мышей (Ц) подвергнута электрофорезу в 8% ПААГ в неденатурируюших условиях, гели окрашены орто-дианизидином. 1 и 2 - контроль, 3 и 4 - Аз-животные. Е и Ж - то же, иммуноблотинг с антителами к ЦП. 3 и Я - выявление Си и Ag в сыворотке (1), в супернатанте (2) и в образовавшемся преципитате (3). По оси ординат: концентрация металла, мкг/л. К - содержание иммуноеактивного ЦП у контрольных и Аз-мышей по данным иммуноблотинга. Л - иммуноблотинг белков аппарата Гольджи, выделенного из печени мышей, с антителами к ЦП человека. 1 - контроль, 2 - Аз-мышь. Черные столбики -контроль, светлые - Аз-животные.

Б В

оксидазныи ЦП

130 кДа

1 2 3 4 5

12 3 4 5

1 2 3 4 5

холо-ЦП

250 350 450 550 650 750

14.«

4(Д1 >00 600 71X1 X, ПШ

0 12 3 4 5

Время, МИ11

40 60

Температура. °С

|>0 кса| К 'шо|'

холо-ЦП

Рис. 5. А - Хроматографические фракции Ag-ЦП, элюированные соответственно 150, 200, 250 и 300 мМ ИаС1, анализированы методом неденатурирующего электрофореза в ПААГ, окрашено на общий белок. Б - Иммуноблотинг с антителами к ЦП тех же фракций. В - То же, электрофорез проведен в денатурирующих условиях. Г и Д - Оксидазная и ферроксидазная активности, соответственно, в геле после неденатурирующего электрофореза. Е - Кинетика окисления орто-дианизидина хроматографическими фракциями Ag-ЦП. По оси ординат -оптическая плотность при 450 нм (О450, см-1). На 1 мл реагента вносили 10 мкл пробы белка. 1 - ЦП контрольных крыс, 1 г/л; 2-5 - фракции Ag-ЦП, 6-10 мМ СиБОф Ж - Спектры поглощения холо-ЦП и Ag-ЦП, элюированного 200 мМ раствором 1ЧаС1. По оси ординат -поглощение образца в 0.05 см кювете, концентрация белка 22 мг/мл. Звездочкой отмечена полоса, присущая только Ag-ЦП. 3 - Спектры кругового дихроизма тех же препаратов холо-ЦП и Ag-ЦП. По оси ординат - удельная эллиптичность на 1 а.о. град-см2/дмоль, и молярная эллиптичность [0]м, град-см2/дмоль. И - Кривая удельной теплоемкости тех же препаратов холо-ЦП и Ag-ЦП. По оси ординат - избыточная удельная теплоемкость 1.5 мг/мл раствора белка в 50 мМ ацетатном буфере, рН5.5, скорость нагрева 1 К/мин.

О I

Рис. 7. Экспрессия генов медьтранспортиых белков и купроэнзимов в печени контрольных (А) и Ag-мышeй (Б). Обозначения: 0 - |3-актин (для нормировки), 1 - ЦП, 2 -СТЮ, 3 - АТР7В, 4 - 80131, 5 - Сох4П, М - маркер молекулярных весов. В - результат денситометрического анализа гелей А и Б. Обозначения: 1 - ЦП, 2 - СТО 1, 3 - АТР7В, 4 -ЭОО1, 5 - Сох4П: белые столбцы соответствуют контрольным мышам, чёрные - Ag-мышaм.

Рис. 8. Относительное содержание иммунореактивных полипептидов СТК1, АТР7Ь и Сох4П (А), а также в001 в цитоплазме (£) и в митохондриях (Г). В и Д -Ферментативная активность 801)1 в цитозоле (В) и в межмембранном пространстве митохондрий.

Обозначения: 1 и 2: контрольные мыши, 3 и 4: Ag-мыши.

Секретируемый ЦП (крыса)

Время, ч

Рис. 11. Уровень секреции [14С]-ЦП, оксидазного ЦП мышей и крыс. Ось абсцисс: время, час. Ось ординат: [ С]-ЦП (% от общей радиоактивности); оксидазная активность (выражена: % от оксидазной активности сыворотки контрольных животных, деленный на 50 для сохранения масштаба).

Рис. 12. Ag-диeтa снижает скорость роста опухолей из клеток линии НСТ116, перевитых подкожно иммунодефицитным мышам.

А - динамика роста опухолей у контрольных (п = 5) и Ag-мышeй (п = 6). По оси абсцисс: время, дни; по оси ординат: средний вес опухолей, мг. Б - размер опухолей человека, выросших у контрольных и А§-мышей. Приведены данные по отдельным особям. По оси ординат: вес опухоли, мг. В - оксидазная активность в сыворотке этих же мышей (1 — 5 — контроль, 6 - 11 - Ag-мыши). Г - иммуноблотинг этих же сьюороток с антителами к ЦП человека.

Концентрация цисплатина

НСТ116

->-А63% 6%

25% -"-Ад 50%

НСТ116

Время, ч

Рис. 13. Вверху: Зависимость скорости роста клеток НСТ116 в культуре от концентрации ионов серебра в среде роста (МТТ-аналнз).

Внизу: Влияние ионов серебра на эффективность цитостатического действия цисплатина на клетки НСТ116. Приведены относительные количества клеток по сравнению с контролем.

Рис. 14. Распределение платины в клеточных экстрактах печени и почек (вверху) и в препаратах ДНК (внизу) контрольных и А£-мышей. По оси абсцисс: время после введения цисплатина, часы. По оси ординат: концентрация платины, мкг Р1Л ткани, или мкг Р1/г ДНК. Белые столбцы - контроль, серые - А§-мыпш.

Рис. 15. Профиль экспрессии гена CTR1 в органах взрослых мышей (А) и распределение в них меди (£), серебра (В) и платины (Г). Уровень CTRl-мРНК отнесен к содержанию мРНК (5-актина. По оси ординат: относительные единицы, о.е. (А); концентрация серебра и меди, мкг/г ткани (Б и В, соответственно) и концентрация платины, нг/г ткани (Г). Steady-state уровень CTRl-мРНК и концентрация меди измерены у контрольных животных, концентрация серебра измерена у мышей, получавших Ag-диету в течение 3 недель, концентрация платины измерена у мышей через 30 мин после введения 2 мг цисплатина на 1 кг массы тела. Обозначения по оси абсцисс: L - печень, Lu - легкие, Н - сердце, К. - почки, S - селезенка, В - мозг, AG - надпочечники, SM - скелетные мышцы, Т - семенники. Концентрация платины в надпочечниках не измерялась.

денатурированный белок сохраняет оптическую активность в видимом диапазоне, а ano-CN-белок сохраняет вторичную структуру.

Изменение вторичной структуры Ag-ЦП подтверждается данными дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Нативный холо-ЦП обладает четким пиком теплоемкости при 74.3 °С, Ag-ЦП - двумя пиками с максимумами при 53.8 и 58.9 °С, которые характеризуются большой шириной и, наиболее вероятно, являются суперпозицией многих структурных переходов. Гетерогенность Ag-ЦП не позволяет считать эти пики двумя последовательными стадиями. Площадь под пиками теплоемкости Ag-ЦП в 2 раза меньше площади под основным пиком холо-ЦП, что указывает на меньшую энтальпию денатурации Ag-ЦП.

У мышей Ag-диета в течение недели приводит к исчезновению оксидазной активности в крови. Соответственно изменяется и концентрация меди в крови этих животных. Органы мышей накапливают серебро неравномерно. Наибольшей накопительной способностью обладают печень и надпочечники. В печени серебро аккумулируется во фракциях, плотность которых в градиенте сахарозы соответствует плотности митохондрий (рис. 6,А). К тому же, эти фракции окрашиваются Mitotracker-580 Red, специфическим флуоресцентным красителем, который применяется для выявления фиксированных митохондрий. По данным иммуноблотинга, эти фракции также содержат иммунореактивную субъединицу 4 (Cox4il) митохондриального белка СОХ.

300 -г-200 -

' JJ

0,3 0,2 0,1 0

0 5 10 15 20 25

О 5 10 15 20 25 30

Рис. 6. Распределение серебра (А) и меди (Б) в органеллах клеток печени крысы, фракционированных в ступенчатом градиенте сахарозы методом равновесного ультрацентрифугирования. Обозначения: кружки - контроль, ромбы - Ag-мыши, треугольники - отмена Ag-диeты. По оси абсцисс, номер фракции градиента; по оси ординат: концентрация, мкг/л.

У мышей после отмены А§-диеты оксидазная активность восстанавливается частично уже через три дня и полностью через 2 недели. Концентрация серебра постепенно снижается во всех органах. Уровень и распределение меди в клетках печени не меняются во время А§-диеты и после ее отмены (рис. 6,Б).

С целью установить, влияет ли дефицит церулоплазминовой меди на метаболизм меди в клетках печени, было изучено влияние Ag-диeты на

экспрессию генов медьтранспортных белков и внутриклеточных купроэнзимов на всех уровнях - транскрипции, трансляции и ферментативной активности.

Методом полуколичественной ОТ-ПЦР в тотальной фракции РНК, изолированной из печени контрольных и Ag-мышей, был определен steady-state уровень зрелых мРНК, кодируемых генами медьтранспортных внутриклеточных белков (CTR1, АТР7А и АТР7В), обеих изоформ ЦП-мРНК (секреторной и связанной с мембраной) и внутриклеточных купроэнзимов (СОД1 и СОХ). Полученные результаты показывают, что у Ag-мышей профиль экспрессии генов медьтранспортных белков не меняется (рис. 7, см. вкладку).

Относительное содержание белков CTR1, АТР7В, Cox4il, и СОД1 было определено в субклеточных фракциях печени методом иммуноблотинга (рис. 8, см. вкладку). Видно, что содержание взятых в рассмотрение пептидов не меняется. Не меняется также активность и распределение СОД1 между цитозолем и митохондриями (рис. 8). В качестве критерия оценки активности СОХ и ее относительного содержания был использован полярографический метод определения скорости поглощения кислорода митохондриями в присутствии электрон-продуцирующей системы (ТМРД+аскорбат). Скорость поглощения кислорода митохондриями печени контрольных и Ag-мышей оказалась одинаковой. Следовательно, можно утверждать, что ни активность, ни содержание зрелой СОХ в митохондриях Ag-мышей не меняется.

Представленные данные позволяют считать, что у Ag-млекопитающих в межклеточных пространствах и в клетках серебро присутствует в обменной форме и перемещается по маршрутам меди. Естественное восстановление оксидазной активности после отмены Ag-диеты на фоне не меняющейся концентрации меди в пище происходит, но требует больше трех суток. Это слишком длительное время для того, чтобы использовать данный эффект при разработке животной модели с переключающимся статусом меди. В следующих опытах было испытано действие сульфата меди на статус меди Ag-животных.

6. Однократное введение сульфата меди восстанавливает ферментативные активности церулоплазмнна у Ag-животных

Животные с нулевой оксидазной активностью (Ag-крысы и Ag-мыши) однократно, внутрибрюшинно или per о.ч, получали 10 мкг CuSO^SHiO на 1 г массы тела, и через различные интервалы времени (от 10 мин до 72 ч) в сыворотке крови был измерен уровень оксидазного ЦП. В течение всего эксперимента животные продолжали получать с пищей серебро.

Результаты однозначно демонстрируют, что введение ионов меди вызывает повышение уровня оксидазного ЦП. При этом заметной разницы в действии сульфата меди в зависимости от способа введения не обнаруживается. Повышение оксидазной активности наблюдается уже через 10 мин после введения сульфата меди, а через 4 ч уровень оксидазной активности практически восстанавливается и сохраняется не менее 72 ч на фоне Ag-диеты (рис. 9). Прямое добавление ионов меди (И) к сыворотке Ag-животных не вызывает повышения ее оксидазной активности.

III

ä IS , 15 - Ii

Lull l.llll l.iillll l llll

1 2 ¡ 4 5 i

Ii 4 S (i 7

1 2 1 4 S

Рис 9. Однократное введение сульфата меди восстанавливает статус меди. А. Изменение оксидазной активности в геле сыворотки крови Ag-крыс (I и II) и Ag-мышей (III и IV) после введения CuS04 внутрибрюшшшо (I и III) или per os (II и IV). I-III: 1-контроль, 2-Ag-животные, 3-6-Ag-живoтныe через 1 час, 4, 24, 72 часа после введения C11SO4. IV: 1 -контроль, 2-Ag^iiBOTHbie, 3-8-Ag-живoтIIыe через 20, 40 мин, 1 час, 4, 24, 72 часа после введения CuS04. Б. Количественная оценка оксидазной активности тех же образцов сыворотки крови, отн. ед. Приведены средние значения по измерениям у 5-ти животных в каждой группе. Данные выражены как среднее значение ± среднее квадратичное отклонение.

III

з 4 5

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Рис. 10. Изменение соотношения между холо-ЦП и апо-ЦП Ag-животных после введения CuSOj. Обозначения: см. рис. 9. Соотношения вычислены, исходя из денситометрических данных по соотношению двух форм ЦП на иммуноблотинге.

В экспериментах типа пульс-чейз показано, что повышение оксидазной активности происходит быстрее (через 20 мин), чем новосинтезированный ЦП появляется в кровотоке (через 40 мин) (рис. 11, см. вкладку). Это означает, что медь включается в полипептид ЦП, находящийся уже в аппарате Гольджи. При этом существенного увеличения содержания иммунореактивного ЦП не наблюдается (рис. 10). Очевидно, медь, введенная в ЖКТ или внутрибрюшинно, уже через несколько минут поступает в печень, и метаболически посттрансляционно в комплексе Гольджи включается в ЦП.

7. Использование Ag-мышей для изучения влияния дефицита меди, ассоциированной с церулоплазмином, на скорость роста опухолей различного происхождения

Чтобы экспериментально изучить влияние дефицита меди, ассоциированной с ЦП, на рост опухолей in vivo, нами были использованы иммунодефицитные мыши, которым подкожно были введены клетки

человеческой колокарциномы линии HCT 116. Эксперименты проводили на двух группах животных:

1) Контроль - мыши с подсаженными опухолями, получавшие стандартную диету.

2) Ag-мыши, переведенные на диету, содержащую серебро, одновременно с подсадкой опухолей и получавших ее в течение всего последующего эксперимента.

Динамика роста опухолей у этих животных приведена на рис, 12 (см. вкладку). Оказалось, что у Ag-мышей в пяти случаях из шести опухоли не развились, и только у одной мыши наблюдался рост опухоли. По этой причине дисперсия размеров опухолей в этой группе с учетов всех случаев оказалась довольно большой (390±560 мг, по сравнению с 760±450 мг в контрольной группе). У Ag-мышей с подсаженными опухолями, как и у интактных мышей, серебро накапливается в печени (до 240 мкг/г ткани). В опухолях концентрация серебра тоже возрастает, хотя и не так значительно (до 30 мкг/г ткани), в то же время концентрация меди в них снижается почти на 30%. Однако не похоже, что опухоли не растут из-за дефицита внутриклеточной меди. По-крайней мере, по данным ОТ-ПЦР и иммуноблотинга, в опухолях Ag-мышей не изменяется уровень экспрессии генов основных медьтранспортных белков и купроэнзимов. К тому же, клетки этой опухоли синтезируют и секретируют оксидазный ЦП человека.

Определение уровня проапоптотических факторов методом иммуноблотинга показало, что в цитозоле опухолевых клеток Ag-мышей содержание белка р53 не меняется, но обнаруживается несколько повышенный уровень митохондриальной протеазы HTRA2. При этом наблюдается перераспределение цитохрома с между митохондриями и цитозолем, то есть в клетках Ag-мышей происходит переход этого белка из митохондрий в цитоплазму, что может являться одним из свидетельств апоптоза. Возможно, это объясняет подавление развития опухолей у Ag-мышей, однако, данный вопрос требует дальнейшего изучения.

8. Ионы серебра, присутствующие в среде культивирования, влияют на рост клеток и токсическое действие цисплатина

Для изучения влияния ионов серебра на рост клеток колонокарциномы человека (линия HCT 116) и их восприимчивость к действию цисплатина, были проведены эксперименты по культивированию клеток в среде, обогащенной ионами серебра. Среду культивирования, равновесно насыщенную ионами серебра ([Ag] 52.7-10"6 М), разводили полной стандартной средой культивирования в два - Ag50%, в четыре - Ag25% и в так далее раз. Тотальная концентрация меди в среде составляла 6.3-10"8 М и оставалась постоянной во всех случаях.

Результаты МТТ-анализа количества жизнеспособных клеток, представленные на рис. 13,А (см. вкладку), демонстрируют четкую концентрационную зависимость роста клеток от концентрации серебра. Наличие ионов серебра во внеклеточной среде снижает действие цисплатина, и этот

эффект также носит дозозависимый характер (рис. 13,Б, см. вкладку). Эксперимент показывает, что чем больше серебра содержится в среде, тем менее восприимчивыми к цисплатину становятся культивируемые в ней клетки НСТ116.

9. Влияние статуса меди на распределение цисплатина в организме мышей in vivo

Оценка выдвинутой рабочей гипотезы была проведена также в опытах in vivo на Ag-мышах. Мы исходили из того, что, если цисплатин переносится через пору CTR1 с участием меди, то дефицит меди во внеклеточном пространстве должен замедлять поступление цисплатина в клетки. Распределение платины в организме контрольных и Ag-мышей было определено через 30 мин, 2 часа и через сутки после внутрибрюшинного введения цисплатина в концентрации 4 мг/кг массы тела. Концентрация платины была определена в сыворотке крови, желчи и моче прямо, без специальной подготовке проб (мкг Pt /JI). В печени, почках, мочевом пузыре и желчном пузыре содержание платины было определено в тотальном клеточном содержимом (мкг Pt /г сырой ткани), а в печени и почках - дополнительно и во фракции ДНК (мкг Pt/r ДНК). Оказалось, что у Ag-мышей цисплатин дольше циркулирует в кровотоке, чем у контрольных животных, его экскреция с мочой и желчью также отстает от таковой у контрольных мышей. Через сутки концентрация платины в жидкостях организма падает и выравнивается между контрольными и Ag-мышами

На ранних сроках после введения цисплатина скорость поступления платины в печень и почки (рис. 14, см. вкладку) у Ag-мышей ниже, чем у контрольных животных. Но через 24 часа удельное содержание платины выравнивается. В почках и печени картина распределения платиновых аддуктов в ДНК в течение опыта в целом совпадает с таковой для клеточных компонентов.

Таким образом, данные демонстрируют, что низкий уровень меди в крови замедляет поступление платины в органы, что полностью согласуется с выдвинутой гипотезой.

Если выдвинутая гипотеза верна, а это подтверждается in vitro и in vivo данными, представленными в работе, то органоспецифический уровень экспрессии гена CTR1 должен симбатно соответствовать концентрации меди в органах, а также их способности поглощать серебро и цисплатин. В этом разделе проведено сравнение перечисленных параметров.

Данные, представленные на рис. 15 (см. вкладку), показывают, что максимальный уровень экспрессии гена CTR1 обнаруживается в печени, надпочечниках и почках. Легкие, сердце и мозг относятся к органам со средним уровнем активности гена CTR1. В скелетных мышцах, селезенке и семенниках уровень активности гена CTR1 - низкий. Уровень CTRl-мРНК в основном отражает уровень купроэнзимов в этих органах.

Способность анализируемых органов аккумулировать серебро в целом коррелирует с концентрацией меди и с активностью гена CTR1 в них. Обращает на себя внимание способность печени накапливать серебро в больших

количествах, чем его накапливают другие внутренние органы. Разница, вероятно, объясняется тем, что серебро поступает в клетки печени из кровотока в большом избытке по сравнению с медью, а в клетки внутренних органов - от Ag-ЦП. Так как третичная структура Ag-ЦП нарушена, должно быть нарушено и его взаимодействие с N-доменом CTR1. Качественное несоответствие наблюдается в мозгу. Серебро почти не аккумулируется в этом органе, вероятно, что серебро не пересекает гематоэнцефалический барьер. К сожалению, о механизме поступления меди в мозг взрослых млекопитающих очень мало известно, и даже нет убедительных данных, свидетельствующих о том, что у взрослых млекопитающих медь пересекает гематоэнцефалический барьер.

Через 30 мин после введения цисплатина в распределении платины и в активности гена CTR1 в разных органах прослеживается симбатность. Исключение составляет мозг. Цисплатин на коротких сроках эксперимента практически не пересекает гематоэнцефалический барьер. Но гемато-тестикулярный барьер он пересекает, что полностью согласуется с высокой эффективностью подавления цисплатином роста опухолей в этом органе. В целом данные хорошо согласуются с представлениями, что CTR1 участвует в транспорте цисплатина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Теоретический анализ внеклеточного N-концевого домена CTR1 позволил обосновать свойства локализованных на его последовательности трех медьсвязывающих сайтов (МСС). Результаты этого анализа показывают, что N-конец CTR1 улавливает ионы меди (II) и обеспечивает их внутримолекулярное восстановление у устья купрофильного канала. Модель объясняет механизм переноса платины через купрофильный канал: цисплатин связывается с метиониновым МСС, a Cu(II), находящаяся в гистидиновом МСС, вытесняет платину из S-аддуктов. Выводы хорошо совпадают с данными, полученными in vitro с синтетическими пептидами, соответствующими МСС CTR1 по первичной структуре, а также с данными о свойствах (Р1-5)-комплексов (Rubino et al, 2010; Arnesano et al, 2008; Gito et al., 2004; De Feo et al, 2009; Sze et al, 2009; Sceng et al., 1998; Sinani et al, 2007). Модель предусматривает, что транспорт платины может быть связан с уровнем внеклеточной меди: при дефиците меди на МСС2 поступление платины в клетки может замедляться. Ожидаемый эффект воспроизводится in vitro на клетках линии НСТ116. Показано, что заполнение МСС ионами серебра приводит к снижению действия цисплатина. Продемонстрировано, что in vivo круговорот платины у животных с низким статусом меди замедляется. Эти данные поддерживают сформулированную рабочую гипотезу.

Полученные данные показывают, что предложенная нами модель Ag-животных может быть использована для изучения связи статуса меди с опухолевым ростом и действием цисплатина.

нулевую оксидазную активность в сыворотке крови у любой по численности группы животных.

2. Статус меди может быть восстановлен в течение 4 часов однократным введением сульфата меди.

3. Природа дефицита меди точно известна. Это дефицит меди, ассоциированной с ЦП.

4. У Ag-животных с нулевой оксидазной активностью в сыворотке крови, поддерживаемой в течение 3 недель, в печени не нарушается распределение и локализация меди, на уровне транскрипции и трансляции не изменяется экспрессия генов медьтранспортных белков и купроэнзимов, и активность внутриклеточных купроэнзимов сохраняется.

5. Ионы серебра остаются в обменной форме, и их полное выведение у взрослых грызунов через желчь происходит в течение нескольких дней.

ВЫВОДЫ

1. Высоко аффинный транспортер меди CTR1 обладает набором внеклеточных нуклеофильных сайтов, строение которых обуславливает их специфичность по отношению к Cu(I) и к Cu(II). Сближенность этих сайтов создает условия для внутримолекулярного восстановления меди (II) и транспорта цисплатина при ее участии.

2. Ионы Ag(I), изоэлектронные Cu(I), узнаются белками медьтранспортной системы и переносятся ими по межклеточным и внутриклеточным маршрутам меди. Серебро метаболически включается в ЦП, что приводит к снижению количества атомов меди на молекулу ЦП, к нарушению его третичной структуры и потере каталитических активностей. В печени Ag-животных синтез и активность генов медьтранспортных белков и купроэнзимов не изменяется, однако, происходит снижение статуса меди: падение в крови концентрации меди, ассоциированной с ЦП.

3. Ag-мыши являются удачной моделью для изучения роли статуса меди в канцерогенезе и платиновой терапии, так как у них дефицит меди носит полностью воспроизводимый специфический и управляемый характер.

4. Дефицит меди, связанной с ЦП, снижает скорость роста опухолей человека у иммунодефицитных мышей.

5. Наличие ионов серебра во внеклеточной среде влияет на цитотоксические свойства цисплатина in vitro. У мышей с низким уровнем внеклеточной меди снижается скорость поступления цисплатина в почки и печень.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Zatulovskiv Е. Samsonov S., Skvortsov A. Docking study on mammalian CTR1 coppcr importer motifs // BMC Systems Biology, 1 (SuppI 1): 54,2007.

2. Клотченко С. А., Цьшбалепко H. В., Соловьёв К. В., Скворцов А. Н., Затуловский Е. А.. Бабич П. С., Платонова Н. А., Шавловский М. А/., ПучковаЛ. В., Броджини М. Влияние

ионов серебра на метаболизм меди и экспрессию генов медьтранспортных белков в печени крыс //Доклады Академии Наук, 418 (4): 549—552,2008.

3. Бабич П.С., Цьшбаленко Н.В., Кпотченко С.А., Платонова Н.А., Масалова О.О., Затуловский Е.А.. ¡Павловский М.М., Сапронов Н.С., Пучкова JI.B. Влияние дефицита церулоплазмнновой меди в сыворотке крови на метаболизм меди в мозге // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, том 147, №10, стр. 393-398,2009.

4. Скворцов А.Н., Ильичева Е.Ю., Затуловский Е.А.. Савельев А.Н., Цьшбаленко Н.В., Шавловский М.М., Пучкова JI.B. Частичная характеристика церулоплазмнна крысы, выделенного из сыворотки крови животных, получавших с пищей соли серебра // Цитология, т. 52, № И, с. 70-76,2010.

5. Ilyechova E.Yu., Skvortsov A.N., Zatulovskv E.A., Tsymbalenko N.V., Shavtovsky M.M., Broggini M., Puchkova L. V. Experimental switching of copper status in laboratory rodents // J. Trace Elem.Med. Biol., V. 24, 4, 2010. doi:10.1016/j.jtemb.2010.08.002 (published online ahead of print)

6. Затуловский E.A.. Кпотченко C.A., Соловьев K.B., Скворцов А.Н. Влияние серебра на статус меди у крыс. 11 -ая Международная Пущинская школа-конференция. Пущино-на-Оке, 29 октября - 2 ноября, 2007, С. 42.

7. Цьшбаленко Н.В., Кпотченко С.А., Затуловский Е.А.. Скворцов А.Н., Бабич П.С., Шавловский М.М., Пучкова Л.В. Влияние ионов Ag на метаболизм Си и синтез купроэнзимов у крыс. Сборник материалов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. 11-15 мая 2008 г., Новосибирск. С. 510.

8. Затуловский Е.А.. Ильичева Е.Ю., Скворцов А.Н., Самсонов СА., Цьшбаленко Н.В., Пучкова Л.В. Распределение микроэлементов и экспрессия генов Cu-транспортиых белков и купроэнзимов в печени мышей, получавших ионы Ag. Сборник материалов TV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. 11-15 мая 2008 г., Новосибирск. С. 448.

9. Zatulovskiv Е.А.. Skvortsov A.N. Tsymbalenko N. V., Babich P.S., Ilyeichyova E.Yu., Shavlovsky M.M., Broggini M., Puchkova L.V. The model to study cffccts of blood scrum coppcr dcficicncy on (/-element metabolism in liver and brain of rodents. Abstract book of 38th International Conference on Coordination Chemistry, Jerusalem, Israel, July, 2008, P. 310.

10. Затуловский E.A., Ильичева Е.Ю., Скворцов A.H., Пучкова Л.В. Исследование влияния ионов серебра на метаболизм меди и поступление препаратов платины в клетки млекопитающих. Сборник научных трудов по материалам I Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов биологов "Симбиоз Россия 2008" 6-10 июля 2008 г., "Биология: традиции и инновации в 21 веке" Издательство Казанского университета, Казань, 2008, С. 90-91.

11. Затуловский Е.А., Ильичёва Е.Ю. Участие метаболической системы меди в поступлении ионов серебра в организм лабораторных мышей. 12-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых, 10-14 ноября 2008, Пущино-на-Оке. С. 87-88.

12. Самсонов С.А.. Скворцов А.Н., Затуловский Е.А.. Бабич П.С.. Ильичева Е.Ю., Цымбаченко И.В., Пучкова Л.В. Экспрессия гена Ctrl, кодирующего высокоаффинный импортер меди, в органах крыс при различных состояниях обмена меди. Материалы V съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГИС), Москва, июнь, 2009, стр. 88.

13. Затуловский Е.А., Скворцов А.Н, Ильичева Е.Ю., Цьшбаленко Н.В., Пучкова Л.В. Новая животная модель для изучения болезни Вильсона и ацерулоплазминемии. Материалы VI-го Съезда Российского общества Медицинских генетиков, 15-18 мая 2010 г., Ростов-на-Дону, 2010, С. 66.

14. Zatulovskiv Е„ Iliecheva Е„ Puchkova L„ Tsymbalenko N.. Babich P., Skwrtsov N„ Caiola E„ Mazzoletti M„ Broggini M. Influence of ceruloplasmin-associated copper deficiency on copper metabolism in mammals. Abstracts of 41'1 International FESTEM Symposium in Trace Elements and Minerals in Medicine and Biology, June 9-12,2010, St. Petersburg, Russia, 2010, P. 32.

16. Iliecheva E., Skvortsov A., Zattihvskiy E. Tsymbalenko N., Ruskoni P., Broggini M., *. Puchkova L. A single injection of copper sulfate restores oxidase activity in blood serum of mammals fed by fodder with silver ions. Abstracts of 4th International FESTEM Symposium in Trace Elements and Minerals in Medicine and Biology, June 9-12, 2010, St. Petersburg, Russia, 2010, P. 24.

Работа поддержана грантами РФФИ № 06-04-49786 и 09-04-01165

THEORETICAL AND EXPERIMENTAL APPROACHES FOR STUDYING THE MECHANISMS OF CISPLATIN TRANSPORT BY CTR1 PROTEIN

Evgeny Zatulovskiy

Supervisors: Ludmila V. Puchkova, Alexej N. Skvortsov

Research performed in St. Petersburg State Polytechnical University and Research Institute of Experimental Medicine, St. Petersburg, Russia

Dissertation defended in Research Institute of Experimental Medicine, St. Petersburg, Russia

Copper acts as a necessary cofactor for many vital enzymes. Furthermore, it participates in cell cycle control and reprogramming of energetic metabolism in tumour cells (Warburg effect). The process of copper transfer into the cells is a crucial moment for all these biological functions. This transport is performed by a protein of the CTR1 (copper transporter 1) high affinity copper transporters family. Moreover, the CTR1 protein also participates in the import of cisplatin - a platinum-containing antitumour drug. In spite of the intense studies of CTR1 performed in the last decade, it is not known how CTR1 protein can transport both copper and platinum into a cell despite the fact that their coordination chemistry is completely different. Important questions that also remained to be uninvestigated so far are: how platinum transport might be dependent on copper status and what extracellular carriers transport copper to the N-terminal domain of CTR1 in mammals.

In this study we aimed to create, describe and proof an animal model that would be suitable to study the link between copper status and cisplatin import into the cells. To reach these goals we have solved a number of problems. First, we have analysed the coordination properties of the conserved N-terminal metal-binding domains of CTR1 protein and created a theoretical model describing the ability of CTR1 to transport platinum. Second, we have established an animal model with a switching copper status. And third, we have tested this animal model to confirm its applicability for exploration of the correlation between copper metabolism and platinum transport.

All results described in this thesis are novel; they shed light on copper and platinum import mechanisms and their interdependence. Using the methods of molecular evolution and quantum chemistry we have shown that CTR1 protein has an array of extracellular nucleofilic sites whose structure provides their specificity to Cu(I) and Cu(II). Proximity of these sites leads to the emergence of the possibility for intramolecular reduction of Cu(II) and its participation in Pt transport. Thus CTR1 works as a symport for copper and platinum.

On mice fed with a silver-containing fodder it was shown that Ag(I) ions, whicl are isoelectronic to Cu(I), are recognised by proteins of copper metabolic system am transferred by them using the same extra- and intracellular pathways that are utilise« for copper. Silver is metabolically inserted into ceruloplasmin (Ag-Cp), which leads to the decrease of an average number of copper atoms per one Cp molecule, to distortioi of Cp ternary structure and loss of its catalytic activity. In the liver of Ag-animals there were no changes in the activity and synthesis of cuproenzymes and coppe transporting proteins observed. Thus Ag-diet causes a decrease of copper status in blood. Deficit of Cp-associated copper reduces the growth rate of human tumours transplanted into immunodeficient mice. Presence of silver ions in extracellular medium affects the cytotoxic properties of cisplatin drug in vitro. Manipulations with copper status in vivo leads to significant changes in cisplatin transport dynamics.

The obtained results improve an existing knowledge about mechanisms underlying copper metabolism disorders and broaden the general understanding of metals metabolism in mammalian organisms. From practical point of view, the utilization о introduced animal model with a switching copper status allows one to study the role о copper in tumours growth. The revelation of the correlation between copper status ii extracellular medium, cytotoxic effect of cisplatin in vitro, as well as dynamics о cisplatin influx into cells, provides possibilities for the optimization of this drug clinical usage protocols.

СОКРАЩЕНИЯ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В ТЕКСТЕ АВТОРЕФЕРАТА

• Ag-диета - увлажненный гомогенизированный стандартный корм, содержащий хлорид серебра из расчета 50 мг AgCl на 1 кг массы тела

• Ag-животные - животные, получающие с пищей соли серебра

• CDDP - цис-диаминдихлорплатина (II), цисплатин

• FAAS - беспламенная атомная абсорбционная спектроскопия

• PBS - фосфатно-солевой буферный раствор (0.15 М NaCI, 10 мМ K-Pi буфер, рН7.4)

• TMPD - jV.A',A'',/V'-tctranicthyl-/3-phcnylcncdiaminc

• АТР7А/АТР7В - соответственно АТФаза Менкеса и АТФаза Вильсона

• ГФИ-ЦП - церулоплазмин, связанный с мембраной через гикозилфосфатидилинозитоловый якорь

• ЖМКО - концепция жестких и мягких кислот и оснований Пирсона

• МСМ - метаболическая система меди

• МСС - медьсвязывающий сайт

• МТТ - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид, тетразолий желтый

• СОД1 - Си2+/2п2+-супероксиддисмутаза

• СОХ - цитохром-ооксидаза

• ТМД - трансмембранный домен

• ЦП - церулоплазмин

Подписано в печать 19.11.2010. Формат 60x84/1 б. Печать цифровая. Усл. печ.л. 1,0.Уч.-изд. л. 1,0. Тираж: 100 экз.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в цифровой типографии "Сан Принт". 197022, Санкт-Петербург, Каменноостровский пр., д. 54 Тел.: (812) 234-22-22 Тел./факс: (812) 347-52-80

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Затуловский, Евгений Аркадьевич

СОКРАЩЕНИЯ. ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В ТЕКСТЕ ДИССЕРТАЦИИ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биологическая роль меди в организме

1.1.1. Биологические функции меди

1.1.2. Метаболическая система меди (МСМ)

1.2. Физико-химические свойства ионов меди

1.2.1. Образование координационных связей и концепция Пирсона.

1.2.2. Ионы меди Си(1) и Си(И)

1.2.3. Роль состава и геометрии координационной сферы в определении степени окисления иона меди. 19 1.2,4 Сходства и различия координационных свойств меди и серебра

1.3. Трансмембранный медьтранспортный белок СТИ

1.3.1. Основные пути транспорта ионов меди через плазматическую мембрану клетки

1.3.2. Топология и функциональные характеристики семейства белков СТШ

1.3.3. Физиологическая роль СТЯ1 у позвоночных животных

1.3.4. Белок СТШ человека

1.3.5. Взаимодействие ионов меди с доменами СТЯ

1.3.6. Участие СТШ в транспорте платиновых противоопухолевых препаратов

1.4. Экспериментальные модели для изучения метаболической системы меди (МСМ)

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Оборудование

2.2. Материалы

2.2.1. Лабораторные животные и клеточные линии

2.2.2. Антитела

2.2.3. Реагенты

2.3. Компьютерные методы

2.4. Экспериментальные методы

2.4.1. Выделение тотальной РНК.

2.4.2. Обратная транскрипция, сопряжённая с полимеразной цепной реакцией.

2.4.3. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот.

2.4.4. Полуколичественный метод определения квазистационарного уровня мРНК.

2.4.5. Иммуноблотинг.

2.4.6. Выявление оксидазной активности в геле.

2.4.7. Выявление ферроксидазной активности в геле.

2.4.8. Выявление активности СОД в геле.

2.4.9. Анализ препарата растворимых белков цистернального пространства мембран аппарата Гольджи.

2.4.10. Выделение очищенного препарата церулоплазмина.

2.4.11. Измерение УФ-спектров поглощения.

2.4.12. Измерение спектров кругового дихроизма.

2.4.13. Измерение кривых плавления.

2.4.14. Измерение скорости ферментативного окисления орто-дианизидина очищенными препаратами ЦП.

2.4.15. Разделение внутриклеточных фракций методом равновесного ультрацентрифугирования.

2.4.16. Определение количества живых клеток в культуре методом МТТ-анализа.

2.4.17. Флуоресцентная микроскопия.

2.4.18. Полярографическое измерение активности цитохром-с-оксидазы.

2.4.19. Измерение концентраций меди, серебра и платины.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Идентификация и вычленение сайтов в белке CTR1 на основе данных, полученных методами молекулярной эволюции

3.1.1. Анализ N-концевого домена белка CTR1 позвоночных на основе данных молекулярной эволюции

3.1.2. Докинг N-медьсвязывающих мотивов CTR1 млекопитающих с предполагаемыми донорами меди

3.1.3. Модель, объясняющая транспорт платиновых комплексов через

3.2. Модель животных с искусственно изменяемым статусом меди

3.2.1. Приготовление Ag-kopma

3.2.2. Динамика действия Ag-диеты на статус меди у лабораторных грызунов

3.2.3. Выделение и анализ ЦП из крови Ag-крыс

3.2.4. Распределение серебра в организме грызунов

3.2.5. МСМ клеток печени Ag-мышей

3.2.6. Однократное введение сульфата меди Ag-животным стремительно восстанавливает статус меди

3.3. Влияние дефицита внеклеточной меди на транспорт и активность цисплатина

3.3.1. Использование Ag-мышей для изучения влияния дефицита меди, ассоциированного с ЦП, на скорость роста опухолей различного происхождения

3.3.2. Влияние статуса меди на рост клеток и цитостатический эффект цисплатина in vitro

3.3.3. Влияние статуса меди на распределение цисплатина в организме мышей in vivo

3.3.4. Экспрессия гена CTR1 в различных органах мышей и распределение меди, серебра и платины в этих органах •

5. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Теоретические и экспериментальные подходы для изучения механизмов транспорта цисплатина в клетки с помощью белка CTR1"

Актуальность исследования. Роль меди как структурного и каталитического ко-фактора ряда жизненно важных ферментов известна более полувека и на протяжении этих лет интенсивно изучается (Karlin, 1993; Turnlund et al, 1998). В последние годы выявлены и другие биологические функции меди. Во-первых, установлено, что уровень меди в клетке контролирует клеточный цикл через Х-сцепленный ингибитор апоптоза {Mufti et al., 2007) и, во-вторых, распределение меди в клетке оказывает влияние на соотношение гликолиза и дыхания в опухолях (эффект Варбурга, Zhivotovsky, Orrenius, 2009). В то же время, ионы меди могут быть высоко токсичными агентами, так как в свободном состоянии катализируют образование активных метаболитов кислорода. Для безопасного переноса меди у эукариотов существует система транспортеров, включающая не менее 10 мембранных и цитозольных белков, в которой медь передается при прямом контакте холо-переносчика с апо-транспортером в одном направлении по увеличению аффинности к иону меди {Kim et al., 2008). Даже незначительные изменения структуры этих белков ведут к дисбалансу меди, который провоцирует развитие таких тяжелых заболеваний, как рак, нейродегенеративные болезни, фибриллогенез, остеопороз и другие.

Нокаут гена CTR1 у мышей приводит к ранней гибели эмбрионов-гомозигот, а у гетерозигот - к развитию дефицита меди, при этом содержание меди изменяется тканеспецифично {Lee, 2000). На ранних этапах эмбрионального развития амфибий и млекопитающих белок CTR1 участвует также в морфогенезе и дифференцировке клеток {Haremaki et al., 2007; Haremaki et al., 2009). К тому же белок CTR1 участвует в импорте цисплатина, широко используемого противоопухолевого платинового препарата {Ishida et ai,

2002; Holzer et al., 2006; Song et al., 2004). Однако до сих пор не 5 рассматривался вопрос о том, может ли белок СТЮ транспортировать и медь, и платину, координационная химия которых столь различна; и, поэтому, связан ли транспорт платины с уровнем внеклеточной меди. Ответы на эти вопросы важны для понимания общего механизма транспорта меди в клетки и механизма поступления в клетки цисплатина. Представленная диссертация выполнена с учетом актуальности изложенной проблемы.

Цель данной работы состоит в разработке модели для изучения связи между уровнем внеклеточной меди и транспортом цисплатина в клетки.

Для достижения заявленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить координационные свойства металлосвязывающих консервативных 1Ч-концевых мотивов белка СТЮ и создать теоретическую модель, объясняющую способность СТЮ переносить платину.

2. Разработать животную модель с изменяющимся уровнем внеклеточной меди.

Научная новизна полученных результатов. С помощью методов молекулярной эволюции показано, что медьсвязывающие мотивы >1-коневого участка белка СТЮ являются внеклеточными нуклеофильными сайтами с селективной специфичностью по отношению к Си(1), к Си(И) и к Р1(П). Пространственная сближенность этих сайтов создает условия для внутримолекулярного восстановления меди (И) и транспорта цисплатина при ее участии. На модели мышей, получавших серебро с пищей, показано, что ионы А£(1), изоэлектронные Си(1), узнаются белками метаболической системы меди (МСМ) и переносятся ими по межклеточным и внутриклеточным маршрутам меди. Серебро метаболически включается в церулоплазмин (ЦП), основной внеклеточный медьтранспортный белок позвоночных, что приводит к снижению количества атомов меди на молекулу ЦП, к нарушению его третичной структуры и потере каталитических активностей. В печени Ag-живoтныx синтез и активность генов медьтранспортных белков и купроэнзимов не изменяется. Таким образом, А§-диета избирательно вызывает снижение содержания только той меди, которая ассоциирована с ЦП. Дефицит меди в этой форме снижает скорость роста опухолей человека у иммунодефицитньтх мышей. Наличие ионов серебра во внеклеточной среде влияет на цитотоксические свойства цисплатина. Скорость поступления цисплатина в клетки снижена у животных с низким уровнем внеклеточной меди.

1. Бекок СТК] импортирует цисплатин при участии ионов меди Си(П).

2. У лабораторных грызунов Ag-диeтa вызывает обратимое снижение содержания меди, ассоциированной с ЦП, и не влияет на метаболизм меди в печени.

3. Дефицит меди, индуцированный Ag-диeтoй, может быть компенсирован однократным введением сульфата меди.

5. Ионы серебра влияют на цитотоксическое действие цисплатина.

6. Распределение цисплатина в организме мышей зависит от уровня меди в крови.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Затуловский, Евгений Аркадьевич

5. ВЫВОДЫ

2. Ионы Ag(I), изоэлектронные Cu(I), узнаются белками медьтранспортной системы и переносятся ими" по межклеточным и внутриклеточным маршрутам меди. Серебро метаболически включается в ЦП, что приводит к снижению количества атомов меди на молекулу ЦП, к нарушению его третичной структуры и потере каталитических активностей. В печени Ag-животных синтез и активность генов медьтранспортных белков и купроэнзимов не изменяется, однако, происходит снижение статуса меди: падение в крови концентрации меди, ассоциированной с ЦП.

3. Ag-мыши являются удачной моделью для изучения роли статуса меди в канцерогенезе и платиновой терапии, так как у них дефицит меди носит полностью воспроизводимый, специфический и управляемый характер.

4. Дефицит меди, связанной с ЦП, снижает скорость роста опухолей человека у иммунодефицитных мышей.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Теоретический анализ внеклеточного N-концевого домена CTR1 позволил обосновать свойства локализованных на его последовательности f трех медьсвязывающих сайтов (МСС). Результаты этого анализа показывают, что N-конец CTR1 улавливает ионы меди (II) и обеспечивает их внутримолекулярное восстановление у устья купрофильного канала. Модель объясняет механизм переноса платины через купрофильный канал: цисплатин связывается с метиониновым МСС, a Cu(II), находящаяся в гистидиновом МСС, вытесняет платину из S-аддуктов. Выводы хорошо

-л совпадают с данными, полученными in vitro с синтетическими пептидами, соответствующими МСС CTR1 по первичной структуре, а также с данными о свойствах (Pt-S)-KOMiuieKcoB (Rubino et al., 2010; Arnesano et al., 2007; Guo et al, 2004; De Feo et al, 2009; Sze et al, 2009; Sceng et al, 1998; Sinani et al., 2007). Модель предусматривает, что транспорт платины может быть связан с уровнем внеклеточной меди: при дефиците меди на МСС2 поступление платины в клетки может замедляться. Ожидаемый эффект воспроизводится in vitro на клетках линии НСТ116. Показано, что заполнение МСС ионами серебра приводит к снижению действия цисплатина. Продемонстрировано, что in vivo круговорот платины у животных с низким статусом меди замедляется. Эти данные поддерживают сформулированную рабочую гипотезу.

К ценным свойствам модели относятся следующие: 1. Использование Ag-диеты гарантирует синхронное и одинаковое по значению (100% и 60% у крыс и мышей, соответственно) падение концентрации меди и нулевую оксидазную активность в сыворотке крови у любой по численности группы животных.

2. Статус меди может быть восстановлен в течение 4 часов однократным введением сульфата меди.

3. Природа дефицита меди точно известна. Это дефицит меди, ассоциированной с ЦП.

4. У Ag-живoтныx с нулевой оксидазной активностью в сыворотке крови, поддерживаемой в течение 3 недель, в печени не нарушается распределение и локализация меди, на уровне транскрипции и трансляции не изменяется экспрессия генов медьтранспортных белков и купроэнзимов, и активность внутриклеточных купроэнзимов сохраняется.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Затуловский, Евгений Аркадьевич, Санкт-Петербург

1. Arnesano F., Scintilla S., Natile G. Interaction between platinum complexes and a methionine motif found in copper transport proteins // Angew Chem Int Ed Engl, 46(47): 9062-9064, 2007.

2. Arredondo M., Muñoz P., Mura C.V., Nunez M.T. DMT1, a physiologically relevant apical Cu1+ transporter of intestinal cells // Am Journal Physiol. Cell physiology, 284(6): C1525-C1530, 2003.

3. Axel sen N., Kroll I., Weeke B. A manual of quantitative Immunoelectrophoresis. Methods and application // Oslo: Universitets Forlaget, 1973.

4. Bauerly K.A., Kelleher S.L., Lônnerdal B. Functional and molecular responses of suckling rat pups and human intestinal Caco-2 cells to copper treatment // Journal Nutr Biochem, 15(3): 155-162, 2004.

5. Bertinato J., Swist E., Ploujfe L.J., Brooks S.P., L'abbé M.R. Ctr2 is partially localized to the plasma membrane and stimulates copper uptake in COS-7 cells // Biochem J, 409(3): 731-740, 2008.

6. Bertinato J., Cheung L., Hoque R., Ploujfe L.J. Ctrl transports silver into mammalian cells // J Trace Elem Med Biol, 24(3): 178-184, 2010.

7. Binks S., Dobrota M. Kinetics and mechanism of uptake of platinum-based, pharmaceuticals by the rat small > intestine // Biochem Pharm, 40(6): 1329-1336, 1990.

8. Bissig K.D., Voegelin T.C., Solioz M. Tetrathiomolybdate inhibition of the Enterococcus hirae CopB copper ATPase // FEBS Lett, 507(3): 367370, 2001.

9. Bohm G., Muhr R., Jaenicke R. Quantitative analysis of protein far UV circular dichroism spectra by neural networks // Protein Eng, 5(3): 191-195, 1992.

10. Brewer G.J., Dick R.D., Yuzbasiyan-Gurkin V., Tankanow R., Young A.B., Kluin K.J. Initial therapy of patients with Wilson's disease with tetrathiomolybdate //Arch Neurol, 48(1): 42-47, 1991.

11. Burstein E., Ganesh L., Dick R.D., van De Sluis B., Wilkinson J.S. Klomp L. WJ. Wijmenga C., Brewer G.J., Nobel G.J., Duckett C.S. A novel role for XIAP in copper homeostasis through regulation of MURR1 // EMBO J, 23(1): 244-254, 2004.

12. Cabrera A., Alonzo E. Sauble E., Chu Y.L., Nguyen D., Linder M.C., Sato D.S., Mason A.Z. Copper binding components of blood plasma and organs, and their responses to influx of large doses of 65Cu, in the mouse // Biometals, 21(5): 525-543,2008.

13. Card G.L., Zaitsev V.N., Lindley P.F. X-ray crystal structure of human ceruloplasmin at 3.0 angstroms // PDB direct deposition: 1996/9/25.

14. Chen H., Attieh Z.K., Su T., Syed B.A., Gao H., Alaeddine R.M., Fox T.C., Usta J., Naylor C.E., Evans R.W., McKie A.T., Anderson G.J., Vulpe C.D.

15. Hephaestin is a ferroxidase that maintains partial activity in sex-linked anemia mice // Blood, 103(10): 3933-3939, 2004.

16. Cheng C.C., Pai C.H. Specific displacement of glutathione from the Pt(II)-glutathione adduct by Cu(II) in neutral phosphate buffer // J Inorg Biochem, 71(3-4): 109-113, 1998.

17. Collins J.F., Franck C.A., Kowdley K.V., Ghishan F.K. Identification of differentially expressed genes in response to dietary iron deprivation in rat duodenum // Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 288(5): G964-G971, 2005.

18. Dancis A., Haile D., Yuan D.S., Klausner R.D. The Saccharomyces cerevisiae copper transport protein (Ctrlp). Biochemical characterization, regulation by copper, and physiologic role in copper uptake // J Biol Chem, 269(41): 25660-25667, 1994.

19. Davis W., Chowrimootoo G.F., Seymour C.A. Defective biliary copper excretion in Wilson's disease: the role of caeruloplasmin // Eur J Clin Invest, 26(10): 893-901, 1996.

20. De Feo C., Aller S., Sulivae G., Blackburn N. Unger V. Three-dimensional structure of the human copper transporter hCTRl // Proc Nat Acad Sci USA, 106(11): 4237-4242, 2009.

21. Engelman D.M., Steitz T.A., Goldman A. Identifying nonpolar transbilayer helices in amino acid sequences of membrane proteins // Annu Rev Biophys Biophys Chem, 15: 321-353, 1986.

22. Ettinger M.J., Darwish H.M., Schmitt R.C. Mechanism of copper transport from plasma to hepatocytes // Fed Proc, 45(12): 2800-2804, 1986.

23. Fields M., Lewis C.G., Lure M.D. The role of the adrenals in copper deficiency//Metabolism, 40(5): 540-544, 1991.

24. Fleischer B, Fleischer S, Ozawa H. Isolation and characterization of Golgi membranes from bovine liver // J Cell Biol, 43: 59-79, 1969.

25. Fleming R.F., Gitlin J.D. Primary structure of rat ceruloplasmin and analysisof tissue specific gene expression during development // J. Biol. Chem. 265: 77017707, 1990.

26. Furukawa T., Komatsu M., Ikeda R., Tsujikawa K., Akiyama S. Copper transport systems are involved in multidrug resistance and- drug transport // Curr Med Chem, 15(30): 3268-3278, 2008.

27. Gaggelli E., Kozlowski H., Valensin D., Valensin G. Copper homeostasis and neurodegenerative disorders (Alzheimer's, Prion, and Parkinson's diseases and amyotrophic lateral sclerosis) // Chem Rev, 106: 1995-2044, 2006.

28. Gelasco A., Lippard S.J. NMR solution structure of a DNA dodecamer duplex containing a cis-diammineplatinum(II) d(GpG) intrastrand cross-link, the major adduct of the anticancer drugcisplatin // Biochemistry, 37(26): 9230-9239, 1998.

29. Goodman V.L., Brewer G.J., Merajver S.D. Copper deficiency as> an anticancer strategy // Endocr Relat Cancer, 11(2): 255-263, 2004.

30. Gregoriadis G., Morell A.G., Sternlieb I., Scheinberg I.H. Catabolism of desialylated ceruloplasmin in the liver // J Biol Chem, 245(21): 5833-5837, 1970.

31. Gunshin H., Mackenzie B., Berger U. V., Gunshin Y., Romero M.F., Boron W.F., Nussberger S., Gollan J.L., Hediger M.A. Cloning and characterization of a mammalian proton-coupled metal-ion transporter // Nature, 388(6641): 482-488, 1997.

32. Guo Y., Smith K., Lee J., Thiele D.J., Petris M.J. Identification of methionine-rich clusters that regulate copper-stimulated endocytosis of the human Ctrl "copper transporter // J Biol Chem, 279(17): 17428-17433, 2004a.

33. Guo Y., Smith K., Petris M.J. Cisplatin stabilizes a multimeric complex of the human Ctrl copper transporter: requirement for the extracellular methionine-rich clusters // J Biol Chem, 279(45): 46393^6399, 2004b.

34. Hamza I., Faisst A., Prohaska• J., Chen J., Gruss P., Gitlin J.D. The metallochaperone Atoxl plays a critical role in perinatal copper homeostasis //

35. Proc Natl Acad Sci USA, 98 (12): 6848 -6852, 2001.

36. Hanson S.R., Donley S.A., Linder M.C. Transport of silver of virgin and lactating rats and relation to copper // J Trace Elem Med Biol, 15(4): 243-253, 2001.

37. Haremaki T., Fraser S.T., Kuo Y.M., Baron M.H., Weinstein D.C. Vertebrate Ctrl coordinates morphogenesis and progenitor cell fate and regulates embryonic stem cell differentiation // Proc Nat Acad Sci USA, 104(29): 12029-12034, 2007.

38. Haremaki T., Weinstein D.C. Xmc mediates Xctrl-independent morphogenesis inXenopus laevis // Dev Dyn, 238(9): 2382-2387, 2009.

39. Harris Z.L., Takahashi Y., Miyajima H., Serizawa M., MacGillivary R.T.A., Gitlin J.D. Aceruloplasminemia: molecular characterization of this disorder of iron metabolism // Proc Natl Acad-Sci USA, 92(7): 2539-2543, 1995.

40. Harrison M.D., Dameron C.T. Molecular mechanisms of copper metabolism and the role of the Menkes disease protein // J Biochem Mol Toxicol, 13(2): 93106,1999.

41. Hassett R„ Dix D.R., Eide D.J., Kosman D.J. The Fe(II) permease Fet4p functions as a low affinity copper transporter and supports normal copper trafficking in Saccharomyces cerevisiae // Biochem J, 351(2): 477-484,2000.

42. Hellman N.E., Ko no S., Miyajima N. Gitlin J.D. Biochemical analysis of a missense mutation in aceruloplasminemia // J Biol Chem, 277(2): 1375-1380, 2002.

43. Jiang J., Nadas LA., Kim A.M., Franz K.J. A Mets motif peptide found in copper transport proteins selectively binds Cu(I) with methionine-only coordination // Inorg Chem, 44(26): 9787-9794, 2005.

44. Karlin K.D. Metalloenzymes, structural motifs, and inorganic models // Science, 261(5122): 701-708, 1993.

45. Ke B.X., Llanos R.M., Mercer J.F.B. ATP7A Transgenic and nontransgenic mice are resistant to high hopper exposure // J Nutr, 138(4): 693-697, 2008.

46. Kim B.E., Nevitt T., Thiele D.J. Mechanisms for copper acquisition, distribution and regulation //Nat Chem Biol, 4(3): 176-185, 2008.

47. Kirchman P.A., Botta G. Copper supplementation increases yeast life span under conditions requiring respiratory metabolism // Mech Ageing Dev, 128(2): 187-195,2007.

48. Klinman J.P. The copper-enzyme family of dopamine |3-monooxygenase and peptidylglycine a-hydroxylating monooxygenase: resolving the chemical pathway for substrate hydroxylation // J Biol Chem, 281(6): 3013-3016, 2006.

49. Klomp A.E., Tops B.B., Van Denberg L.E., Berger R., Klomp L.W. Biochemical characterization and subcellular localization of human copper transporter 1 (hCTRl) // Biochem J, 364(Pt 2): 497-505,2002.

50. Klomp A.E., Juijn J.A., van der Gun L.T., van den Berg I.E., Berger R., Klomp L.W. The N-terminus of the human copper transporter 1 (hCTRl) is localized extracellularly, and interacts with itself// Biochem J, 370(Pt 3): 881— 889,2003.

51. Knutson M.D. Steap proteins: implications for iron and copper metabolism // Nutr Rev, 65(7): 335-340,2007.

52. Komatsu Y., Sadakata /., Ogra Y., Suzuki K.T. Excretion of copper complexed with thiomolybdate into the bile and blood in LEC rats // Chem Biol Interact, 124(3): 217-231, 2000

53. Kuo Y., Zhou B., Cosco D., Gitschier J. The copper transporter CTR1 provides an essential function in mammalian embryonic development // Proc Nat Acad Sci USA, 98(12): 6836-6841, 2001.

54. Mackenzie N. Cloning, expression pattern and essentiality of the high-affinity copper transporter 1 (ctrl) gene in zebrafish // Gene, 328: 113-120, 2004.

55. Maltais D., Desroches D., Aouffen M., Mateescu M., Wang R., Paquin J. The blue copper ceruloplasmin induces aggregation of newly differentiated135neurons: a potential modulator of nervous system organization // Neurosci, 121(1): 73-82,2003.

56. Manolis A, Cox D: W. Purification of rat ceruloplasmin. characterization and comparison with human ceruloplasmin // Prep Biochem, 10(2):121-132, 1980.

57. Marabese M., Mazzoletti M", Vikhanskaya F., Broggini M. HtrA2 enhances the apoptotic functions of p73 on^bax // Cell Death Differ, 15(3): 849-858, 2008.

58. Marone M., Mozzetti S., De Ritis D., Pierelli L., Scambia G. Semiquantitative RT-PCR analysis to assess the expression levels of multiple transcripts from the same sample // Biol Proced Online, 3: 19-25,2001.

59. Mason K.E. A conspectus of research on copper metabolism and requirements of man// JNutr, 109(11): 1979-2066, 1979.

60. Matsumoto S., Tanaka T., Kurokawa II, Matsuno K., Hayashida Y., Takahashi T. Effect of copper and'role of the copper transporters ATP7A and CTR1 in intracellular accumulation of cisplatin // Anticancer Res, 27(4B): 22092216,2007.

61. McArdle H.J. The transport of iron and copper across the cell membrane: different mechanisms for different metals? // Proc Nutr Soc, 51(2): 199-209, 1992.

62. Menkes J.H., Richardson F„ Verplanck S. Program for the detection of metabolic diseases. Chromatographic screening to find metabolic diseases, especially those involving the nervous system. // Arch Neurol, 6: 462-470, 1962.

63. Mercer J.F., Ambrosini L., Norton S., Gazeas S., Grimes A. Animal models of Menkes disease // Adv Exp Med Biol, 448: 97-108, 1999.

64. Merchant S.S., Allen M.D., Kropat J., Moseley J.L., Long J.C., Tottey S., Terauchi A.M. Between a rock and, a hard place: trace element nutrition in Chlamydomonas // Biochim Biophys Acta, 1763(7): 578-594, 2006.

65. Minghetti M., Leaver M.J., Carpene E., George S.G. Copper transporter 1, metallothionein and glutathione reductase genes are differentially expressed in tissues of sea bream (Sparus aurata) after exposure to dietary or waterborne copper

66. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol, 147(4): 450-459, 2008.

67. Moshkov K.A., Lakatos S., Hajdu J., Zavodsliy P., Neifakh S.A. Proteolysis of human ceruloplasmin. Some peptide bonds are particularly susceptible to proteolytic attack//Eur J Biochem, 94(1): 127-134, 1979.

68. Mufti A.R., Burstein E., Duckett C.S. XIAP: Cell death regulation meets copper homeostasis // Arch Biochem Biophys, 463: 168-174, 2007.

69. Murdoch P.S., Ranford J.D., Sadler P.J., Berners-Price S.J. Cis-trans isomerisation of Pt(L-methionine)2.: metabolite of the anticancer drug cisplatin. // Inorg Chem, 32(11): 2249-2255, 1993

70. Musci G., Fraterrigo T.Z., Calabrese L., McMillin D.R. On the lability and functional significance of the type 1 copper pool' in ceruloplasmin // J Biol Inorg Chem, 4(4): 441-446, 1999.

71. Nadella S., Grosell M., Wood C. Mechanisms of dietary Cu uptake in freshwater rainbow trout: evidence for Na-assisted Cu transport and a specific metal carrier in the intestine // J Comp Physiol B, 177(4): 433-446,2007.

72. Nordlund A., Leinartaite L., Saraboji K., Aisenbrey C., Grobner G., Zetterstrom P., Danielsson J., Logan D.T., Oliveberg M. Functional features cause misfolding of the ALS-provoking enzyme SOD // Proc Natl Acad Sci USA, 106(24): 9667-9672, 2009.

73. Norman R.E., Ranford J.D., Sadler P.J. Studies of platinum (II) methionine complexes: metabolites of cisplatin. // Inorg Chem, 31(5): 877-888, 1992.

74. Nose Y., Kim B.E., Thiele D.J. Ctrl drives intestinal copper absorption and is essential for growth, iron metabolism, and neonatal cardiac function // Cell Metab,4(3): 235-244, 2006a.

75. Nose Y., Rees E.M., Thiele D.J. Structure of the Ctrl copper trans'PORE'ter reveals novel architecture // Trends Biochem Sci, 31(11): 604-607, 2006b.

76. Noyer M., Putnam F.W. A circular dichroism study of undegraded human ceruloplasmin // Biochemistry, 20(12): 3536-3542, 1981.

77. Ogra Y., Miyayama T., Anan Y. Effect of glutathione depletion on removal of copper from LEC rat livers by tetrathiomolybdate // J Inorg Biochem, 104(8): 858-862, 2010.

78. Ohgami R.S., Campagna D.R., McDonald A., Fleming M.D. The Steap proteins are metalloreductases // Blood, 108(4): 1388-1394,2006.

79. Olivares M., Lonnerdal B., Abrams S.A., Pizarro F., JJauy R. Age and copper intake do not affect copper absorption, measured with the use of 65Cu as a tracer, in young infants // Am J Clin Nutr, 76(3): 641-645, 2002.

80. Osman D., Cavet J. Chapter 8 Copper homeostasis in bacteria // Adv Appl Microbiol, 65: 217-247, 2008.

81. Owen C.A. Wilson's disease: The etiology, clinical aspects and treatment of inherited copper toxicosis //Noyes publishers, New Jersey, 1981.

82. Owen J.A., Smith H. Detection of ceruloplasmin after zone electrophoresis. // Clin Chim Acta, 6: 441-444, 1961.

83. Pabla N., Muiphy R.F.F., Liu K., Dong Z. The copper transporter Ctrl contributes to cisplatin uptake by renal tubular cells during cisplatin nephrotoxicity // Am J Physiol Renal physiol, 296(3): F505-F511,2009.

84. Pearson R. G. Hard and Soft Acids and Bases and Joseph Chatt. // Modern Coordination Chemistry. The Legacy of Joseph Chatt. Royal Society of Chemistry, UK: 305-312,2002.

85. Pena M.M.O., Lee J., Thiele D.J. A delicate balance: homeostatic control of copper uptake and distribution // J Nutr, 129(6): 1251-1260, 1999.

86. Perbandt M., Guthohrlein E.W., Rypniewski W., Idaldeva K., Stoeva S.,138

87. Voelter W., Genov N., Betzel C. The structure of a functional unit from the wall of a gastropod hemocyanin offers a possible mechanism for cooperativity // Biochemistry, 42(21): 6341-6346, 2003.

88. Petris M.J., Smith K., Lee J., Thiele D.J. Copper-stimulated endocytosis and degradation of the human copper transporter, hCtrl // J Biol Chem, 278(11): 96399646,2003.

89. Portnoy M., Schmidt P., Rogers R., Culotta V. Metal transporters that contribute copper to metallochaperones in Saccharomyces cerevisiae // Mol Genet Genomics, 265(5): 873-882, 2001.

90. Prihyl T. Serum polyphenol oxidase activity (ceruloplasmin) in conventional laboratory animals and man // Folia Biol (Praha), 24(2): 136-141, 1978.

91. Prohaska J.R. Role of copper transporters in copper homeostasis // The Am J Clinical Nutr, 88(3): 826S-829S, 2008.

92. Prohaska J.R., Brokate B. Copper deficiency alters rat dopamine (3-monooxygenase mRNA and activity // J. Nutr. 129: 2147-2153, 1999.

93. Prohaska JR., Brokate B. The timing of perinatal copper deficiency in mice influences offspring survival // J Nutr, 132(10): 3142-3145, 2002.

94. Puchkova L., Zhivulko T., Mishenko B., Vasin A., Platonova N., Tsymbalenko N. Copper nutrition and copper metabolism in rat newborns // Metal ions in biology and medicine, 3(3): 447-457, 2002.

95. Puig S., Thiele D.J. Molecular mechanisms of copper uptake and distribution // Curr Opin Chem Biol, 6(2): 171-180, 2002.

96. Puig S., Lee J., Lau M., Thiele D.J. Biochemical and genetic analyses ofyeast and human high affinity copper transporters suggest a conserved mechanism for copper uptake // J Biol Chem, 277(29): 26021-26030, 2002.

97. Quinn J.F., Harris C.J., Cobb K.E., Domes C., Ralle M., Brewer G., Wadsworth T.L. A copper-lowering strategy attenuates amyloid pathology in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease // J Alzheimers Dis, 21(3): 903914,2010.

98. Quintanar L., Stoj C., Taylor A.B., Hart P.J., Kosman D.J., Solomon E.I. Shall we dance? How a multicopper oxidase chooses its electron transfer partner // Acc Chem Res, 40(6): 445-452, 2007.

99. Reedijk J. Why does cisplatin reach G-N7 with competing S-donor ligands available in the cell // Chem Rev, 99(9): 2499-2510, 1999. "

100. Reyes A., LeivaA., Cambiazo V., Méndez M., González M. Cop-like operon: structure and organization in species of the Lactobacillale order // Biol Res, 39(1): 87-93, 2006.

101. Rees E.M., Thiele D.J. Identification of a vacuole-associated metalloreductase and its role in Ctr2-mediated intracellular copper mobilization // J Biol Chem, 282(30): 21629-21638, 2007.

102. Roy C.N., Enns C.A. Iron homeostasis: new tales from the crypt // Blood, 96(13): 4020-4027, 2000.

103. Rubino J.T., Riggs-Gelasco P, Franz K.J Methionine motifs of copper transport proteins provide general and flexible thioether-only binding sites for Cu(I) and Ag(I) // J Biol Inorg Chem, 15(7): 1033-1049, 2010.

104. Safaei R. Role of copper transporters in the uptake and efflux of platinum containing drugs // Cancer Lett, 234(1): 34-39, 2006.

105. Safaei R., Katano K., Samimi G., Naerdemann W., Stevenson J.L., Rochdi M., Howell S.B. Cross-resistance to cisplatin in cells with acquired resistance to copper // Cancer Chemother Pharmacol, 53(3): 239-246, 2004.

106. Samimi G., Howell S.B. Modulation of the cellular pharmacology of JM118,the major metabolite of satraplatin, by copper influx and efflux transporters // Cancer Chemother Pharmacol, 57(6): 781-788, 2006.

107. Sarret G., Favier A., Coves J., Hazemann J.L., Mergeay M., Bersch B. CopK from Cupriavidus metallidurans CH34 binds Cu(I) in a tetrathioether site: characterization by X-ray absorption and NMR spectroscopy // J Am Chem Soc, 128(17): 5834-5850, 2010.

108. Sedlak E., Wittung-Stafshede P. Discrete roles of copper ions in chemical unfolding of human ceruloplasmin // Biochemistry, 46(33): 9638-9644, 2007.

109. Sharp P. Ctrl and its role in-body copper homeostasis // Int J Biochem Cell Biol, 35(3): 288-291, 2003.

110. Sharp P. The molecular basis of copper and iron interactions // Proc Nutr Soc, 63: 563-569, 2004.

111. Shi X., Stoj C., Romeo A., Kosman D.J., Zhu Z. Frelp Cu2+ Reduction and Fet3p Cul+ Oxidation Modulate Copper Toxicity in Saccharomyces cerevisiae // J Biol Chem, 278(50): 50309-50315, 2003.

112. Sinani D., Adle D.J., Kim H., Lee J. Distinct Mechanisms for Ctrl-mediated Copper and Cisplatin Transport // J Biol Chem, 282(37): 26775-26785, 2007.

113. Smith C.A., Anderson B.F., Baker H.M., Baker E.N. Metal substitution in transferrins: the crystal structure of human copper-lactoferrin at 2.1-A resolution // Biochemistry, 31(18): 4527-4533, 1992

114. Solioz M., Stoyanov J. Copper homeostasis in Enterococcus hirae // FEMS Microbiol Rev, 27(2-3): 183-195, 2003.

115. Southon A., Burke R., Norgate M., Batterham P., Camakaris J. Copper homoeostasis in Drosophila melanogaster S2 cells // Biochem J, 383(Pt 2): 303141309, 2004.

116. Southon A., Farlow A., Norgate M, Burke R., Camakaris J. Malvolio is a copper transporter in Drosophila melanogaster // J Exp Biol, 211(Pt 5): 709-716, 2008.

117. Stoj C.S., Augustine A.J., Solomon E.I., Kosman D.J. Structure-Function Analysis of the Cuprous Oxidase Activity in Fet3p from Saccharomyces cerevisiae // J Biol Chem, 282(11): 7862-7868, 2007.

118. Stoj C., Kosman D. Cuprous oxidase activity of yeast Fet3p and human ceruloplasmin: implication for function // FEBS Lett, 554(3): 422-426, 2003.

119. Sze C., Khairallah G., Xiao Z., Donnelly P., O'hair R., Wedd A. Interaction of cisplatin and analogues with a Met-rich protein site // J Biol Inorg Chem, 14(2): 163-165,2009.

120. TennantJ., Stansjield M., Yamaji S., Srai S.K., Sharp P. Effects of copper on the expression of metal transporters in human intestinal Caco-2 cells // FEBS Lett, 527(1-3): 239-244, 2002.

121. Theophilos M.B., Cox D.W., Mercer J.F. The toxic milk mouse is a murinemodel of Wilson disease // Hum Mol Genet, 5(10): 1619-1624, 1996.

122. Turnlund J.R. Human whole-body copper metabolism // Am J Clin Nutr, 67(5 Suppl): 960S -964S, 1998

123. Vives-Bauza C., Starkov A., Garcia-Arumi E. Measurements of the antioxidant enzyme activities of superoxide dismutase, catalase, and glutathione peroxidase // Methods Cell Biol, 80: 379-393, 2007.

124. Webster L.K., Ellis A.G., Apicella C., Deacon G.B. Atypical pharmacokinetics and excretion of new platinum analogues in rodents // Cancer Chemother Pharmacol, 49(1): 87-92, 2002.

125. Wernimont A.K, Huffman D.L., Lamb A.L., O'Halloran T. V., Rosenzweig A.C. Structural basis for copper transfer by the metallochaperone for the Menkes/Wilson disease proteins I I Nat Struct Biol, 7(9):766-771, 2000.

126. Wilkinson G., Gillard R.D., McCleverty J.A. Comprehensive coordination chemistry: the synthesis, reactions, properties and applications of coordination compounds // Pergamon Press, Oxford, 1989.

127. Wong E., Giandomenico C.M. Current status of Pt-based antitumor drugs // ChemRev, 99(9): 2451-2466, 1999.

128. Wu J., Forbes J.R., Chen H.S., Cox D. W. The LEC rat has a deletion in the copper transporting ATPase gene homologous to the Wilson disease gene // Nat Genet, 7(4): 541-545, 1994.

129. Wu X., Sinani D., Kim H., Lee J. Copper transport activity of yeast Ctrl isdown regulated via its C-terminus in response to excess copper // J Biol Chem, 284(7): 4112-4122,2008.

130. Wyman S., Simpson R.J., McKie A.T., Sharp P.A. Dcytb (Cybrdl) functions as both a ferric and a cupric reductase in "-vitro // FEBS Lett, 582(13): 1901-1906, 2008.

131. Xue Y., Davis A., Balakrishnan G., StasserJ., Staehlin B., Focia P., Spiro T., Penner-Hahn J., O'Halloran T. Cu(I) recognition via cation-pi and methionine interactions in CusF// Nat Chem Biol, 4(2): 107-109, 2008.

132. Zaitseva I., Zaitsev V., Card G., Moshkov K., Bax B., Ralph A., Lindley P. The X-ray structure of human serum ceruloplasmin at 3.10 A: nature of the copper centres // J Biol Inorg Chem, 1(1): 15-23, 1996.

133. Zhang L., Koay M, Maher M.J., Xiao Z., Wedd A.G. Intermolecular transfer of copper ions from the CopC protein of Pseudomonas syringae. Crystal structures of fully loaded Cu(I)Cu(II) forms // J Am Chem Soc, 132(11): 3770-3777, 2006.

134. Zhivotovsky B., Orrenius S. The Warburg Effect returns to the cancer stage // Semin Cancer Biol, 19(1): 1-3, 2009.

135. Zhou B., Gitschier J. hCTRl: a human gene for copper uptake identified by complementation in yeast // Proc Nat Acad'Sci USA, 94(14): 7481-7486, 1997.

136. Zhou H., Cadigan K.M., Thiele D.J. A Copper-regulated Transporter Required for Copper Acquisition, Pigmentation, and Specific Stages of Development in Drosophila melanogaster // J Biol Chem, 278(48): 48210-48218, 2003.

137. Zimnicka A.M., Maryon E.B., Kaplan J.H. Human copper transporter hCTRlmediates basolateral uptake of copper into enterocytes: implications for copper homeostasis // J Biol Chem, 282(36): 26471-26480, 2007.

138. Zisowsky J., Koegel S., LeyersS., Devarakonda K., Kassack M.U., Osmak M, Jaehde U. Relevance of drug uptake and efflux for cisplatin sensitivity of tumor cells // Biochem Pharmacol, 73(2): 298-307, 2007.

139. Клотченко С. Анализ структуры и экспрессии псевдогена церулоплазмина человека. Диссертация на соискание, учёной степени кандидата биологических наук // ГУ НИИЭМ РАМН, Санкт-Петербург, 2008.

140. Коттон Ф., Уилкинсон Дж. Основы неорганической химии // Мир, Москва, 1979.

141. Кукушкин Ю.Н. Химия координационных соединений // Высшая школа, Москва, 1985.

142. Платонова Н.А., Жигулева Э.А., Цымбаленко Н.В., Мищенко Б. С., Васин А.В., Живулъко Т.В., Пучкова Л.В. Возрастные особенности биосинтеза и распределения церулоплазмина в организме крыс // Онтогенез, 35(3): 171182,2004.

143. Платонова Н.А., Барабанова СВ., Повалихин Р.Г., Цымбаленко Н.В., Даниловский М.А., Воронина О.В., Дорохова И.И., Пучкова Л.В. In vivo экспрессия медьтранспортных белков в отделах мозга крыс // Известия РАН. Сер. Биол., 2: 108 120, 2005.

144. Пучкова Л.В., Платонова H.A. Механизм, обеспечивающий гомеостаз меди у эукариотов, и его связь с транспортом железа // Усп совр биол, 123(1): 41-58,2003.

145. Самсонов С.А., Платонова H.A., Скворцов А.Н., Цымбаленко Н.В., Васин A.B., Пучкова Л.В. Активность гена CTR1 и статус меди в различных органах крысы // Мол Биол, 40(2): 239-251, 2006.

146. Слесарев В.И. Химия: Основы химии живого // Химиздат, Санкт-Петербург, 2000.

Информация о работе

Затуловский, Евгений Аркадьевич
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2010
ВАК 03.01.04

Диссертация

Теоретические и экспериментальные подходы для изучения механизмов транспорта цисплатина в клетки с помощью белка CTR1 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы