Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия бета-интерферона человека в молоке трансгенных животных

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия бета-интерферона человека в молоке трансгенных животных"

На ППЯНЯУ гл/1тгтмгч1

0034524Б0

Ходарович Юрий Михайлович

Экспрессия бета-интерферона человека в молоке трансгенных животных

Специальность: 03.00.03. - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 Г:

МОСКВА-2008

003452460

Работа выполнена в группе трансгеноза в Учрежден™ Российской Академии Наук Институте биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Научный руководитель кандидат биологических наук Ларионов Олег Алексеевич

Официальные оппоненты доктор биологических наук, акад Павел Георгиевич Георгиев доктор биологических наук, член-корр Сергей Михайлович Деев

Ведущая организация

Учреждение Российской Академии Наук Институт биологии развития им Н К Кольцова

Защита состоится 19 ноября 2008 г в 10 час 00 мин на заседании диссертационного совета Д00201901 при Учреждении Российской Академии Наук Институте биоорганической химии им академиков РАН по адресу 117997, Москва, ул Миклухо-Маклая, 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской Академии Наук Институте биоорганической химии им академиков ММ Шемякина и Ю.А Овчинникова РАН

Автореферат разослан « II октября_2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета

РАН

доктор физико-математических наук

В А Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Лекарственные препараты нового поколения, создаваемые на основе рекомбинантных белков, в частности, гормонов и цитокинов, находят все большее применение в медицинской практике Один из наиболее интересных белков семейства цитокинов - бета-интерферон (ИФН-бета), является центральным регулятором неспецифического иммунитета Он обладает сильным антивирусным и антипролнферативным действием и используется в комплексной терапии различных онкологически и аутоиммунных заболеваний, тяжелых вирусных и бактериальных инфекций, сопровождающихся иммунодефицитными состояниями ИФН-бета является наиболее эффективным из известных препаратов для лечения рассеянного склероза (Dubois et al, 2003 )

Одним из наиболее эффективных способов получения белков со сложными посттрансляционными модификациями, свойственными клеткам высших эукариот, является создание трансгенных животных, продуцирующих нужные белки в молоке К настоящему времени некоторые линии трансгенных животных уже используются для производства рекомбинантных белков Так, например, в 2006 г Европейской коммисией было дано разрешение фирме GTC Biotherapeutics на производство препарата АТгуп®, созданного на основе синтезирумого в молочной железе коз рекомбинантного антитромбина человека (www gtc-bio com/pressreleases/pr080206 html), завершается разработка препарата rhClINH (Pharming Group NV) на основе C1-ингибитора, получаемого из молока трансгенных кроликов (www pharming com/index php',act=prod&pg=l) К сожалению, очень мало в настоящее время известно о регуляции экспрессии рекомбинантных белков у трансгенных животных Создание животных - продуцентов рекомбинантных белков основано на полуэмпирическом подборе "удачного" гибридного гена, обеспечивающего требуемый уровень экспрессии белка. Изучение особенностей экспрессии рекомбинантных белков у трансгенных животных не только расширяет наши познания о молекулярных механизмах функционирования клеток животных, но и помогает создавать более эффективные системы производства рекомбинантных белков

Цель работы. Целью работы было создание трансгенных животных, продуцирующих бета-интерферон человека в молоке, и изучение закономерностей экспрессии введённых генов

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые получены трансгенные кролики и мыши, продуцирующие бета-интерферон человека в молоке. Полученные результаты позволили сделать выводы о принципиальной возможности экспрессии биологически активного бета-интерферона человека в молоке трансгенных животных, невозможности универсального использования метода "вставки в первый экзон" и возможной невидоспецифичности действия бета-интерферона человека Впервые была предпринята попытка повышения уровня экспрессии трансгена в молоке с помощью регуляторного элемента, содержащего комбинацию SAR-элемента и тканеспецифичного энхансера. Использование такого элемента не привело к повышению уровня

экспрессии бета-интерферона у трансгенниых мышей, при этом наблюдалось уменьшение тканеспецифичности экспрессии трансгена Кроме того, в работе использовался малоизученный подход коииьекции двух фрагментов ДНК в пронуклеус зиготы Была подтверждена высокая эффективность коинтеграции инъецирумых фрагментов и показана возможность встраивания фрагментов в ориентации, при которой соединяются два различных липких конца

Апробация работы и публикации. Результаты данной работы были доложены на XX зимней международной молодежной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии " и VIII Молодежной научной конференции "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии". По материалам исследования опубликовано 3 печатных работы в журналах, одобренных ВАК

Структура диссертации. Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, изложения и обсуждения полученных результатов, выводов, приложения и списка цитируемой литературы, включающего 180 ссылок

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Создание гибридного гена для экспрессии бета-интерферона человека в молоке трансгенных животных.

Для продукции ИФН-бета в молочной железе кроликов было решено использовать подход вставки кодирующих последовательностей бета-интерферона в первый экзон гена бета-лактоглобулина овцы Подобный подход ранее использовался с переменным успехом для экспрессии кодирующих последовательностей генов (Velander et al, 1992) Причины вариаций в уровнях экспрессии могли заключаться как в не до конца изученных взаимодействиях между вставляемой последовательностью и геном, в который производится вставка, так и в том, что вставка производилась в различные "удобные" места первого экзона, где есть сайт узнавания рестриктазы При этом могло происходить удаление ряда регуляторных элементов и нарушение работы гена Поэтому для вставки последовательностей бета-интерферона человека в гене бета-лактоглобулина мною был проведён олигонуклеотид - направленный мутагенез, в результате чего последовательность AGCCATG (жирным выделен сайт начала трансляции) изменена на последовательность AGCGCTG, содержащую сайт узнавания рестриктазы Есо47Ш (выделен курсивом) При последующей вставке по сайту Есо47Ш последовательности гена бета-интерферона, начинающейся с нуклеотидов CATG, (жирным выделен сайт начала трансляции бета-интерферона) получился гибридный ген BLG-hlFNb, в котором последовательности перед стартом трансляции бета-интерферона в точности соответствовали последовательностям перед стартом трансляции гена бета-лактоглобулина овцы Схема создания гибридного гена BLG-hlFNb представлена на рис 1 Кодирующая последовательность ИФН-бета была получена путем проведения ПЦР на геномной ДНК человека Последовательность гена ИФН-бета и прилегающая

2

к ней область в плазмиде pBLG-liIFNb были секвенированы методом Сэнгера. Результаты секвенирования подтвердили структуру полученной плазмиды и не выявили различий между последовательностью гена ИФН-бета, клонированной нами и полученной из базы данных Entrez Nucleotides (код доступа J00218).

Рисунок 1. Схема создания гибридного гена ВиЗ-ЫРМЬ. Пронумерованные прямоугольники -экзоны гена бета-лактоглобулина овцы (В 1X5)

Оптимизация условий получения трансгенных животных

Предварительным этапом создания животных-продуцентов ИФН-бета являлось оптимизация и адаптация метода получения трансгенных животных. Работа проводилась с использованием гена для экспрессии гамма-интерферона человека в молоке трансгенных животных. Было показано, что для получения трансгенных животных можно использовать либо октагибридных мышей ЫМШ (Пущино), либо гибридов первого поколения (Р1) СВАхС57ВЬ/6 (питомник "Столбовая"). Оба типа мышей обеспечивали хорошую видимость пронуклеусов и

4 ДНК-

ПЦР

^ ДНК-ni

достаточно высокую имплантацию пересаженных зигот. Оптимальная концентрация инъецируемой ДНК составляла около 1 нг/мкл.

Получение транегениых кроликов, содержащих гибридный ген BLG-liIFNb

Для получения трансгенных кроликов использовали фрагмент Sali - Xbal плазмиды pBLG-hlFNb. В фрагменте отсутствовали последовательности плазмиды бактериального происхождения, которые, по литературным данным, могут ингибировать экспрессию у трансгена, а наличие липких концов должно было обеспечить максимально возможную эффективность интеграции трансгена. Этот фрагмент с помощью микроинъекций вводили в пронуклеусы зигот, полученных от крольчих. Работы по получению трансгенных кроликов проводились совместно с ГНУ Научно-исследовательский институт пушного звероводства и кролиководства им. В.А. Афанасьева. В результате микроинъекций родилось 39 крольчат. Родившиеся кролики были проверены на наличие трансгена с помощью ПЦР с парой праймеров BF3 и BR3, которые комплементарны участкам последовательности гена ИФН-бета в плазмиде pBLG-hlFNb. В качестве матрицы для ПЦР использовали геномную ДНК кроликов, выделенную из ткани ушей. В настоящее время ПЦР-анализ широко используется для идентификации трансгенных животных и по достоверности полученных результатов не уступает использовавшемуся ранее методу гибридизации по Саузерну. Тем не менее, все трансгенные кролики и мыши проверялись на трансгенность не менее двух раз, а в некоторых случаях слепым методом проводилось повторное выделение ДНК из ушей нетрансгенных животных с последующим повторным анализом на трансгенность с помощью ПЦР. Результаты всех повторных анализов всегда совпадали с предыдущими результатами. Результаты ПЦР-анализа первых 22 образцов ДНК кроликов приведены на рис. 2.

Рисунок 2. Гель - электрофорез в 1.5% агарозном геле продуктов ПЦР-анализа образцов ДНК кроликов с праймерами BF3 и BR3. Дорожки 1-22 соответствуют образцам ДНК кроликов № 700 -708, 713, 714, 716-724, R322, R364. Дорожки К1 и К2 - контроль (в качестве матрицы использовали геномную ДНК нетрансгенной кроличихи с добавлением плазмиды pBLG-hlFNb в количестве, соответственно, 1 и 0.1 пг).

Таблица 1 Получение трансгенных кроликов и анализ передачи трансгена по наследству (поколения Р1 и ¥2)

Поколение Номер линии Всею родил ось/окро лов Число трансгенных/про цент трансгенных Трансгенных самцов/самок

F0 - 39/- 2 (№714, 716)/ 5% 2/0

F1 714 271/43 31/11% 13/5

716 254/35 9 / 3 5% 2/3

F2 714 63/11 26/41% 5/4

716 37/5 7 /19% 2/4

Примечание сумма самцов и самок может быть ниже общего количества трансгенных кроликов из-за того, что часть кроликов погибала до возраста, когда можно определить пол

По результатам анализа, из 39 родившихся кроликов трансгенными оказались двое (табл. 1), что составляет 5% Такая эффективность интеграции соответствует литературным данным о эффективности интеграции трансгенов у кроликов

Анализ наследования и тканеспецифичностн экспрессии гибридного гена BLG-hlFNb

Исходных трансгенных кроликов (фаундеров), обозначенных №714 и №716, скрещивали с нетрансгенными самками для получения потомства, которое затем использовали для определения активности ИФН-бета в молоке и для анализа передачи трансгена по наследству. Наличие трансгена в геноме кроликов во всех случаях определяли методом ПЦР-анализа Полученные результаты представлены в таблице 1 Частота передачи трансгена первому поколению составляла 11 и 3 5% для двух исходных линий №714 и №716, соответственно Низкая частота передачи трансгена по наследству может объясняться токсическим действием бета-интерферона на эмбрионы или гаметы, нестабильностью трансгена, а также мозаицизмом, те присутствием трансгена лишь в части половых клеток организма (Palmiter et al, 1984, Wilkie et al, 1987, Wilkie et al, 1991, Gillespie et al, 1981 ) Для проверки предположения о мозаицизме полученных трансгенных фаундеров был проведен анализ передачи трансгена второму поколению Частота передачи трансгена второму поколению оказалась существенно выше (41 и 19% для линий №714 и №716, таблица 1), однако и в этом случае частота передачи трансгена оказалась меньше 50% Таким образом, низкую эффективность наследования трансгена нельзя объяснить мозаицизмом полученных фаундеров

Наиболее сильно действие трансгена могло сказаться на выживаемости кроликов в том случае, если экспрессия трансгена происходит не только в молочной железе, но и в других

органах Был проведён ОТ-ПЦР-анализ образцов РНК из разных тканей лактируюшей трансгенной крольчихи - потомка кролика № 716. Для контроля качества кДНК проводили ПЦР с парой праймеров. комплементарной участкам гена бета-актина кролика. Результаты анализа представлены на рис. 3.

И mg lg spf sg mus lit sk kid liv K*

Рисунок 3. Тканеспецифичностъ экспрессии гибридного гена BLG-hlFNb у трансгенной крольчихи № 824 (линия 716). Гель-электрофорез продуктов ОТ-ПЦР, полученных на матрице мРНК из различных органов трансгенной крольчихи №824 (линия 716) в период лактации с парой праймеров BF4 и BR4, комплементарной последовательности гена ИФН-бета, ( (а)-38 и (б)-32 цикла амплификации), и с парой праймеров RactFl и RactRl, комплементарных последовательности гена бета-актина кролика (в).

M - маркёр длин фрагментов 100-1000 п.о.; К+ - контроль, в качестве матрицы использована геномная ДНК крольчихи .№ 824 (линия 716); mg - молочная железа, lg - легкое, spl - селезёнка, sg - слюнная железа, mus - мышца, ht - сердце, sk - кожа, kid - почка, liv - печень.

При 32 циклах амплификации видна полоса ДНК только в дорожке, соответствующей молочной железе. Слабые полосы ДНК начинают появляться в других дорожках только при 38 циклах амплификации, т.е. превышение количества мРНК в молочной железе над количеством мРНК в других органах можно оценить как более, чем 64 (26)-кратное. Стоит отметить, что слабые полосы ДНК, которые начинают появляться при 38 циклах амплификации, по-видимому, являются следствием контаминации, от которой трудно избавиться при большом числе циклов амплификации. Таким образом, экспрессия гибридного гена BLG-hlFNb относительно тканеспецифична, однако количественные выводы об уровне эктопической экспрессии BLG-hlFNb сделать нельзя. Кроме того, полученные данные относятся к уровню эктопической экспрессии у лактирующей самки, что не исключает возможность активации промотора гибридного гена в различных тканях в ходе эмбриогенеза.

Изучение изменений в белковом составе молока трансгенной крольчихи

Считается, что все интерфероны (и ИФН-бета, в частности) являются видоспецифичными белками, не оказывающими действия на организмы другого вида (Gillespie et. al., 1981). В то же время, в ряде работ (Gillespie et. al., 1981, Derynck et. al., 1980, McCullagh et. al., 1983) была

показана существенная активность ИФН-бета человека в клетках мыши, а трансгенные мыши, экспрессирующие в своих тканях ИФН-бета человека, обладали повышенной устойчивостью к заражению вирусом (Chen el. al.. 1988). Кроме того, известно, что экспрессия собственного, мышиного. ИФН-бета в яичниках мышей приводит к стерильности и неспособности передавать трансген по наследству (Hekman el. al.. 1988, lwakura et. al., 1988). Таким образом, существует возможность действия ИФН-бета человека на кроликов, в результате чего частота рождения трансгенных кроликов может быть существенно ниже 50%.

Неполная видоспецифичность ИФН-бета сильнее всего должна была отразиться на профиле экспрессии белков в лактирующей молочной железе трансгенных кроликов. Проведённый электрофорез молока двух линий трансгенных и трёх различных нетрансгенных крольчих с последующим окрашиванием кумасси (рис. 4) показал отс)тствие как минимум одной полосы белка в дорожках с препаратами молока трансгенных крольчих (показана на рис. стрелкой).

тр1 трг Ki К2 кз

щтттЛ*»

ШШШШЩ

Рисунок 4. Сравнение белкового состава молока трансгенных и нетрансгенных крольчих. Электрофорез в 12 % ПААГ обезжиренных препаратов молока трёх различных нетрансгенных крольчих (дорожки Kl, К2, КЗ) и трансгенных крольчих линий №716 и №714 (дорожки Tpl, Тр2). Стрелкой указана полоса белка, отсутствующего у трансгенных крольчих.

Этот белок был элюирован из геля и идентифицирован с помощью масс-спектроскопического анализа. Полученный масс-спектр соответствовал смеси альфа- и бета-казеинов кролика (Mowse Score = 158). В литературе не удалось обнаружить данных о действии ИФН-бета на уровень экспрессии генов белков молока, однако имеются данные, что интерферон гамма (обладающий во многом сходной с ИФН-бета активностью) подавляет экспрессию бета-казеина в культуре клеток молочной железы (Kim et.al., 2002). Изменение белкового состава

молока можно также объяснить вставкой трансгена внутри или рядом с геном, кодирующим белок молока, однако в нашем случае полученные результаты были одинаковы для обеих линий трансгенных кроликов с различными местами интеграции трансгена. Таким образом, наиболее вероятной причиной различий в белковом составе молока трансгенных и нетрансгенных крольчих представляется воздействие бета-интерферона человека на клетки кролика, однако является ли это причиной низкой эффекивности наследования трансгена на основании полученных данных сказать нельзя

Определение биологической активности НФН-бета в молоке трансгенных крольчих поколений Н и

Препараты молока трансгенных крольчих первого и второго поколений линий №714 и №716 были проанализированы на наличие интерфероновой активности Биологическую активность определяли по защитному действию препарата на культуре клеток человека при обработке клеток вирусом Сэндай (штамм Индиана) Анализ проводили в лаборатории НИИ Эпидемиологии и Микробиологии им Н Ф Гамалеи РАМН В табл 2 приведены результаты анализа молока трансгенных крольчих №724 и №824, взятых, соответственно, из первого и второго поколения линии №716

Таблица 2. Активность интерферона в молоке трансгенных кроликов линии №716. Плюсы обозначают наличие дегенерации клеток вследствие цитопатического действия вируса

Номер образца Номер крольчихи -донора молока Степень дегенерации клеток поразееденияч Активност ь ИФН. МЕ

50 100 200 400 800 1600 3200 6400

1 К1 ++ ++ ++ ++ ++ ■н- ++ ■н- 0

3 К2 ++ ++ ++ 0

2 724 (П линии 716) - - - - ++ 16000

5 724 (П линии 716) - - - - - - - + - 32000

4 824 (Р2 линии 716) - - - - - - - ++ 16000

6 824 (Р2 линии 716) + - 32000

Рефсрснс-ИФН-Р - - - - - ++ ++ 8000

Каждый образец молока анализировали не менее двух раз, и итоговую активность определяли как среднее арифметическое значение результатов этих анализов Из табл 2 видно, что точность определения активности в каждом опыте примерно соответствует шагу разведения образцов (в 2 раза). В пределах данной точности определения не обнаружено разницы между уровнем интерфероновой активности образцов молока крольчих первого и второго поколений

Аналогичные результаты были получены и для потомков трансгенного кролика №714 По результатам анализа интсрфероновая активность составляла 2 2x10 и 7 2x104 МЕ на миллилитр молока крольчих линий №714 и №716, соответственно Стоит отметить, что наибольшая интерфероновая активность наблюдалась в линии №716, у которой наследование трансгена происходило с более низкой частотой Для использования трансгенных кроликов в биотехнологическом производстве необходим более высокий уровень ИФН-бета в молоке

Создание гибридной конструкции SAR-Enh, содержащей генетические элементы, повышающие экспрессию генов

Среди возможных причин недостаточно высокого уровня бета-интерферона в молоке кроликов наиболее вероятным представляется недостаточный уровень экспрессии гибридного гена В настоящее время известен и охарактеризован ряд регуляторных элементов, способных повышать уровень экспрессии находящихся рядом генов. В литературе имеются данные о попытках использования некоторых из этих элементов для повышения уровня экспрессии рекомбинантных белков в молоке В частности, использовались SAR/MAR - элементы (участки прикрепления ДНК к ядерному матриксу), которые в экспериментах на культурах клеток повышают уровень экспрессии в десятки раз В некоторых работах было показано, что использование SAR/MAR - элементов позволяет добиться позиционно - независимой экспрессии трансгена у животных (Lee et al, 1998), в других работах влияния SAR/MAR - элементов не наблюдалось или даже наблюдалось негативное воздействие SAR/MAR элемента на экспрессию трансгена (Barash et al, 1996) Слабое воздействие SAR/MAR - элементов на экспрессию гибридных генов у трансгенных животных может быть объяснено тем фактом, что SAR/MAR -элемент способен повышать экспрессию близлежащих генов только при наличии энхансера (Poljak et al, 1994) Поэтому мы решили создать регуляторный элемент SAR-enh, состоящий из SAR элемента из локуса генов белков теплового шока Drosophila melanogaster hsp70 и тканеспецифического энхансера из LTR (длинного концевого повтора) вируса MMTV (Вирус опухоли молочной железы мыши)

PCR

¡'.SAR-Enl 4104 b.p

Рисунок 5 Схема создания гибридной конструкции SAR-Enh, содержащей SAR-элемент из локуса генов HSP 70 Drosophila melanogaster и энхансера из LTR MMTV

Схема создания гибридного гена SAR-enh представлена на рис. 5. Коротко, последовательности SAR элемента и энхансера были амплифицированы методом ПЦР с парами праймеров, содержащих на некомплементарных участках 5'-концов сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции. Используя эти сайты, было проведено клонирование амплифицированных фрагментов в вектор pBluescript II KS(-), и, таким образом, получена искомая плазмида. Так же методом ПЦР была установлена взаимная ориентация клонированных фрагментов.

Для проведения микроинъекций в пронуклеусы зигот мышей использовали фрагмент Sall-Xbal плазмиды pSAR-Enh.

Фрагменты ДНК, представляющие собой созданный ранее гибридный ген ВЬО-МЕМЬ и полученную конструкцию SAR-Enh, были инъецированы в пронуклеусы 460 зигот мышей. Коинъекция линейных фрагментов ДНК ВЬО-ЫРМЬ (5 мкг/мл) и элемента SAR-Enh проводилась в мужские пронуклеусы мышиных зигот в молярном соотношении 1:1. Эти зиготы трансплантировались в яйцеводы 26 ложнобеременным самкам. У шести из них родилось 20 мышат (4,35 % от теоретически возможного количества).

Для анализа геномной ДНК мышей и проверки их на трансгенность использовался метод полимеразной цепной реакции. Амплификация проводилась при помощи праймеров как

1

Получениетрансгеннных мышей, содержащих гены BLG-hlFNb и SAR-Enh

комплементарных гену ВЬОИ[РЫЬ. так и комплементарных части гибридной конструкции 5АК-Еп11. На рнс. 6 приведена фотография электрофореза продуктов амплификации участка гена бега-интерферона. В качестве матрицы использовалась ДНК, выделенная из хвостов родившихся мышей. Видно, что мышата с номерами 8. 17 и 18 являются трансгенными по гену бета-интерферона.

17 18 19 20 8 716

*"» «Й>

9 10 11 12 13 14 15 16

Рисунок 6. ПЦР - анализ на трансгенность родившихся мышей, с использованием праймеров ВЮ и ВЬР2, комплементарных участку последовательности гена бета-интерферона:

Номера на рисунке соответствуют номеру мышонка. №716- положительный контроль (ДНК крольчихи, трансгенной по гену ВЬО-ЫРЫЬ.)

Рисунок 7. ПЦР - анализ при помощи праймеров ЕпЬ Р1 и Еп1> М на присутствие последовательности БАЯ-ЕлЬ в геноме мышей:

А: 1,2.6,7,8,9,10 - соответствуют номерам мышей 1,4,16,17,18,19,20; 3,4 - положительные контроли (ДНК нетрансгенной мыши с добавлением 0,5* 10~2 и 0,5*10"4 нг плазмиды ЗАЛ-Ел!) соответственно); 5 - геномная ДНК кролика, трансгенного по ВЬО-ИШРР;

Б: 1,4,5,6,7,8,9,10 - соответствуют номерам мышей 8, 1,2, 3 ,4, 5, 6,7; 2 - отрицательный контроль (геномная ДНК нетрансгенной мыши);

3,11 - положительные контроли (ДНК нетрансгенной мыши с 0,5* 10"2 и 0,5* 10"4 нг/мкл плазмиды БАЯ-ЕлИ соответственно).

Для проверки присутствия в геномах родившихся мышей последовательностей конструкции ЗАЯ-ЕпЬ использовались праймеры, которые ранее применялись для амплификации энхансерного участка. На рис. 7 приведены результаты ПЦР - анализа с использованием таких праймеров. По этим данным можно сделать вывод, что три мыши из двадцати являются

трансгенными (8, 17 и 18) сразу по обеим инъецированным конструкциям Этот результат подтверждает имеющиеся литературные данные о высокой эффективности коинтеграции линейных фрагментов ДНК при коинъекции

Анализ наследования трансгенов в поколении Р1 мышей

Проводился анализ наследования трансгенов потомкам трансгенных мышей номер 8 (самец) и 18 (самка) Третий трансгенный мышонок №17 умер, не дав потомства Для получения потомства они скрещивались с нетрансгенными мышами той же линии СВАХС57/ВЕ6 Всего было проанализировано 36 потомков 17 - от мыши №8 (8-я линия) и 19 от мыши № 18 (18-я линия) Результаты анализа представлены в таблице 3

Таблица 3 Наследование трансгенов в первом поколении мышей

Номер Количество Количество процент

линии потомков р 1 трансгенных трансгенных

потомков Р1 потомков

8 17 7 41%

18 19 10 53%

Проверка на трансгенность осуществлялась методом ПЦР на ген ИФН-бета человека и на элемент ЗАЯ-ЕпЬ В качестве матрицы для проведения реакции амплификации использовалась геномная ДНК мышей, выделенная из хвостов и из крови Во всех случаях наблюдалось совместное наследование трансгенов ВЬО-ЫКРЬ и ЗАЯ-ЕпЬ, что дает основание предположить, что произошла их совместная интеграция Как видно из таблицы, наследование трансгенов у мышей происходило с эффективностью, близкой к 50%, что соответствует законам Менделевского наследования

Анализ взаимной ориентации трансгенов в интегрированном состоянии

Был проведен анализ взаимной ориентации рекомбинантного гена ВЬО-ИШрр и конструкции ЗАЯ-ЕпИ в геноме мышей двух полученных линий методом ПЦР Для проверки взаимной ориентации ВЕО-ЫЫрр и .ЧАК-ЕпЬ использовались новые праймеры, комплементарные концевым последовательностям ВЬО-ЬЮТр и БАЯ-ЕнИ Схема и результаты анализа представлены на рис 8 Используемые праймеры обозначены на рисунке для простоты как 1,2,3, 4 Так как предполагалось, что перед интеграцией микроинъецированных фрагментов 5АК-ЕпЬ и В1Х}-Ы№Р происходит их лигирование в пронуклеусе по комплементарным липким концам, то ожидалось, что будет два варианта взаимной ориентации инъецированных фрагментов Очевидно, что в случае интеграции нескольких копий может быть представлено оба варианта ориентации (рис 8) Проводилась полимеразная цепная реакция при помощи всех возможных парных

комбинаций праймеров, описанных выше. При анализе 18-й линии наблюдался, как и ожидалось, амплифицированный продукт, полученный при помощи нар 2-4 и 1-3 (рис.9. А) Инъецируемые фрагменты: Sail Xbal Sail Xbal

Реализованные варианты взаимной ориентации: 2 4

2 3

Xbal

1 3 2. 1

Sal I

Линия N18 Линия N8

Рисунок 8. Анализ взаимной ориентации трансгенов BLG-hIFNb и SAR-enlv Показаны реализованные варианты взаимной ориентации трансгенов для линий №18 и №8. Пронумерованные стрелки - праймеры, использованные для определения взаимной ориентации трансгенов. Большая чёрная стрелка - ген BLG-hIFNb. Большая серая стрелка - элемент SAR-enh.

12 3 4 5 6 7

ш

1 2 3

i— * fjffjf

А Б

Рисунок 9. Анализ взаимной ориентации конструкций SAR-Enh и BLG-hINFb в геноме мышей линии №18.

А - Полимеразная цепная реакция с использованием праймеров 1,2,3,4:

I - праймеры 1-3; 2 - праймеры 2-4; 3 - 3; 4 - 1; 5 - 2; 6 - 4, 7 - маркер по 100 п.н., от 100 до 1000 п.н.

Б - Рестрикционный анализ продукта, амплифицированного с использованием праймеров 1-3: 1- рестрикция по сайту эндонуклеазы Hind Ш; 2- продукт амплификации; 5 - маркер по 100 п.н., от 100 до 1000 п.н.

Результаты ПЦР с парами 1-4; 3-4; 1-3; 2-3 не приведены (полосы отсутствуют). Таким образом, размер фрагментов ДНК, получившихся в результате реакции приблизительно соответствует ожидаемым. Для подтверждения того, что продукт ПЦР с использованием праймеров Sal L1 и Sal RI является ожидаемой последовательностью места соединения конструкций SAR-Enh и BLG-hINFb, был проведен рестриктный анализ при помощи

эндонуклеазы рестрикции Hind III Результаты приведены на рис 9,Б Размеры фрагментов, получившихся в результате рестрикционного анализа соответствуют теоретически определенным Аналогичным образом был проведен анализ взаимной ориентации трансгенов в линии № 8 Неожиданно оказалось, что в этом случае не наблюдается ПЦР продуктов 1-3; 2-4, соответствующих случаю лигирования по липким концам Из всех возможных вариантов ПЦР с праймерами 1,2,3,4 наблюдался продукт амплификации только для пар 1-2 и 2-3 Следовательно, у мышей линии № 8 интеграция в геном инъецированных конструктов была также совместная, но, по-видимому, в процессе проведения микроинъекций произошло затупление концов инъецируемых фрагментов, с последующим лигированием по тупым концам и вставкой в геном получившегося продукта лигирования При этом изменение длины концов было незначительным, так как длины продуктов ПЦР с парами 1-2 и 2-3 не отличались (при анализе картины электрофореза) от предсказанных теоретически Стоит отметить, что при данных условиях проведения эксперемента отсутствие полос амплификации с некоторыми парами праймеров не позволяет сделать однозначный вывод о отсутствии данного типа взаимной ориентации, так как в эксперементе отсутствуют положительные контроли, подтверждающие эффективность проведения ПЦР с данной парой праймеров. Тем не менее, основной полученный результат -подтверждение факта коинтеграции трансгенов и встраивание у линии №8 трансгенов в ориентации, при которой соединяются два различных липких конца (в отличии от линии №18), является достоверным

Изучение тканеспецифичности экспрессии бета-интерферона у трансгенных мышей

Исследование тканеспецифичности экспрессии гена бета-интерферона у мышей проводилось при помощи метода ОТ ПЦР. Количество кДНК, полученное из тотальной РНК, выделенной из кусочков тканей одинаковой массы, было стандартизовано амплификацией с использованием праймеров на ß-актин На рис № 10, А,Б представлены результаты полимеразной цепной реакции с праймерами, комплементарными последовательностям бета-интерферона человека и с кДНК, полученной из тканей мыши линии № 8 и №18

•щк лег сер сел мы.и лоч мои печ

пег кож печ мол гк>ч сел «ыш сл ж

щтт '"тт

штш

*сж лег сер сел мьш го-: тп г*ч у. к а & к & к

лег тж печ мс:

поч се" мыш сл.ж.

к

к

к

к

к

А

Б

Рисунок 10.Результаты ОТ ПЦР-анализа РНК, выделенной из органов мышей; А-линии №8; Б - линии № 18.

Кож - кожа, лег - легкие, сер - сердце, сел - селезенка, мыш - мышцы, поч - почки, мол - молочная железа, печ - печень, сл.ж. - слюнная железа; кож к, лег к, сер к, сел к, мыш к, поч к, мол к, печ к, сл.ж. к - контрольный ОТ ПЦР-анализ РНК, выделенной из тех же органов без добавления обратной транскриптазы.

Как хорошо видно на рисунке, в линии № 8 достаточно большое количество РНК гибридного гена ВЬО-Ы№Ь присутствует в образцах молочной железы, однако слабые сигналы наблюдаются в тканях лёгких и почек. Тем не менее экспрессию бета-интерферона в линии №8 можно считать тканеспецифичной. С другой стороны, при тех же условиях амплификации у мышей линии № 18 наблюдалось появление продуктов амплификации в образцах кДНК, полученных из мышц и слюнных желез (рис.10 Б). Интенсивность полосок, соответствующих образцам из мышц и слюнных желез, была примерно равна интенсивности сигнала из молочной железы, при этом в остальных тканях уровень амплификации оставался незначительным и существенно не отличался от соответствующих интенсивностей сигналов в линии №8. Возможно два объяснения отсутствия тканеспецифичности экспрессии бета-интерферона у линии №18. Во-первых, так как подобное явление наблюдается только в одной линии, то представляется вполне вероятным встраивание трансгена рядом с регуляторными элементами генома мыши, которые и приводят к повышенной экспрессии трансгена в тканях мышц и слюнных желёз. Второе объяснение предполагает возможность нетканеспецифичной активации трансгена элементом ЭАЯ-еп11, в частности, возможна не строго тканеспецифичная работа энхансера, применявшегося для увеличения уровня экспрессии гена бета-интерферона. Дело в том, что при изучении тканеспецифичности работы энхансера из ЬТЯ ММТУ Мок с коллегами не проводили

исследования его функционирования в клетках этих органов (скелетных мышц и слюнной железы) (Мок et al, 1992)

Функциональный тест на активность бета-интерферона в молоке.

Молоко потомков полученных трансгенных мышей анализировалось на наличие активности бета-интерферона в функциональных тестах на устойчивость клеточной культуры к действию вирусов По результатам анализа, активность бета-интерферона составляла 12 ООО МЕ в мл молока мышей линии № 8 Молоко мышей линии № 18 активного белка не содержало Полученные значения биологической активности ИФН-бета в молоке мышей оказались даже несколько ниже, чем активность ИФН-бета в молоке кроликов

Таким образом, использование элемента SAR-enh в данном случае не привело к получению трансгенных животных с высоким уровнем экспрессии бета-интерферона в молоке Возможно, созданный элемент не обладает способностью активировать экспрессию близлежащих генов у трансгенных животных С другой стороны, существует ряд факторов, которые могли привести к получению наблюдаемых нами результатов даже в случае способности элемента SAR-enh активировать экспрессию трансгена Во-первых, так как количество полученных линий мышей невелико, то низкий уровень ИФН-бета в молоке мышей может быть следствием неудачного места интеграции трансгена Во-вторых, при оценке действия элемента SAR-enh производится сравнение экспрессии трансгенов у разных видов животных - кроликов и мышей И хотя имеющиеся литературные данные говорят о хорошей корреляции между уровнями экспрессии одного и того же гибридного гена у разных видов животных, нельзя исключать наличия некоторых различий в уровнях экспрессии гена BLG-hlFNb у кроликов и мышей Тем не менее, стоит отметить, что подобные отличия не должны быть очень большими, и, таким образом, скрыть существенную активность элемента SAR-enh (повышение уровня экспрессии в несколько десятков раз) они вряд ли могут В-третьих, существует вероятность, что количество бета-интерферона в молоке животных лимитируется не на уровне экспрессии, и поэтому добавление элемента SAR-enh не оказывает существенного влияния на интерфероновую активность в молоке Так же нельзя исключить, что активность элемента SAR-enh зависит от структуры гибридного гена и проявляется не во всех случаях Этим можно объяснить противоречивые данные, полученные разными авторами при исследовании влияния SAR/MAR элементов на экспрессию гибридных генов в молоке трансгенных животных (Lee et al, 1998, Barash et al, 1996) Таким образом, в дальнейшем, для более полной характеристики свойств элемента SAR-enh, представляется перспективным исследовать влияние элемента SAR-enh на экспрессию трансгена при коинъекциях с другим гибридным геном

Выводы

1 Созданы трансгенные кролики, содержащие гибридный ген ВШ-МИМЬ Установлено, что у полученных трансгенных кроликов наблюдается низкая эффективность передачи трансгена первому поколению, и существенно более высокая эффективность наследования трансгена во втором поколении Этот эффект не наблюдается у мышей, содержащих ген ВИЗ-ЫРЬИ).

2 Показано, что молоко трансгенных крольчих содержит биологически активный интерферон Уровень экспрессии бета-интерферона сохраняется у следующего поколения трансгенных кроликов Вставка кодирующих последовательностей гена ИФН-бета в первый экзон гена ВЬО приводит к низкому }ровню экспрессии гибридного гена Белковый состав молока трансгенных крольчих отличается от молока нетрансгенных крольчих, предположительно, из-за неабсолютной видоспецифичности бета-интерферона человека

3 Созданы трансгенные мыши, содержащие гибридный ген ВЦЗ-МРЫЬ и элемент 8АК-спЬ Показано, что коинтеграция инъецируемых фрагментов ДНК происходит с высокой эффективностью, при этом могут реалнзовываться два варианта объединения коинъецированных фрагментов

а) по комплементарным липким концам

б) по некомплементарным концам

Коинтеграция гена ВЬО-ЫШЬ и элемента ЗАЯ-епЬ не привела к повышению уровня экспрессии бета-интерферона.

4 Показано, что ген ВЬС-ЫРКЬ/ЗАЯ-епЬ экспрессируется у трансгенных мышей нетканеспецифично, предположительно, из-за влияния регуляторного элемента ЗАЯ-епЬ

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1 Lagutin OV, Dobrovolsky VN, Vmogradova TV, Kyndiakov BN, Khodarovich YM, Jenkins N, James D, Markham N, Larionov OA Efficient human IFN-gamma expression in the mammary gland of transgenic mice J Interferon Cytokine Res , 1999, v 19(2), pp 137-44

2 Ю M Ходарович, H E Воробьева, M H Мезина, M В Пинюгина, M И Прокофьев, О А Ларионов. Экспрессия бета-интерферона человека в молочной железе трансгенных кроликов Биоорганическая химия, 2008, том 34, № 2, стр 185-193

3 ЮМ. Ходарович, Н Е Воробьева, О А Ларионов Использование комбинации SAR-элемента и энхансера для повышения уровня экспрессии гибридных генов у трансгенных животных Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук, 2008, №56, стр 41-44

4 Ходарович Ю М. Экспрессия рекомбинантных белков в молоке трансгенных животных XX зимняя международная молодежная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" 11-15 февраля 2008 г. (тезисы докладов, стр 32)

5 Ходарович Ю М Экспрессия бета-интерферона человека в молоке трансгенных животных VIII Молодежная научная конференция "Биотехнология в растеневодстве, животноводстве и ветеринарии" 2 апреля 2008 г. (тезисы докладов, стр 41)

Подписано в печать 16 10 2008 г

Печать трафаретная

Заказ №968 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (499) 788-78-56 www autorcferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ходарович, Юрий Михайлович

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. КРАТКИЙ ОБЗОР СОВРЕМЕННЫХ СИСТЕМ ПРОИЗВОДСТВА РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ, ИХ ПРЕИМУЩЕСТВ И НЕДОСТАТКОВ

2. СРАВНЕНИЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ТКАНЕЙ ТРАНСГЕННОГО ЖИВОТНОГО ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ

3. ПРОЗВОДСТВО РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ ИЗ МОЛОКА ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

3.1 Структура типичного эукариотического гена

3.2 Районы прикрепления ДНК к ядерному матриксу (S/MAR элементы)

3.3 Энхансеры

3.4 Регуляторные элементы генов белков молока

3.4.1 Промоторные области генов, экспрессирующихся в молочной железе во время лактации

3.4.2 Сайты гиперчувствительности к нуклеазам

3.4.3 Последовательность milk box

3.4.4 Последовательность KRMTTCYTRGAAYYR 34 3.4.5. Связавание ядерных факторов с промоторными областями генов белков молока

3.5 Экспрессия экзогенов в молочной железе трансгенных животных

3.5.1 а]-антитрипсин человека

3.5.2 Фактор свертываемости крови IX человека

3.5.3 Урокиназа человека

3.5.4 Тканевой плазминогенный активатор человека

3.5.5 Сывороточный альбумин человека

3.5.6 Прохимозин крупного рогатого скота

3.5.7 Белок С человека

3.5.8 Фибриноген человека

3.6 Стабильность рекомбинантных белков в молоке трансгенных животных

3.7 Способы промышленной очистки рекомбинантных белков из молока

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1 ИСПОЛЬЗОВАННОЕ ОБОРУДОВАНИЕ

2 ПЛАЗМИДЫ И ШТАММЫ

3 ПРАЙМЕРЫ

4 СОЗДАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК

5 ПРИГОТОВЛЕНИЕ МИКРОИНСТРУМЕНТОВ ДЛЯ МИКРОМАНИПУЛЯЦИЙ С ЗИГОТАМИ

5.1 Приготовление микроинъекционных пипеток

5.2 Приготовление удерживающих пипеток

5.3 Приготовление пипеток для трансплантации и переноса зигот

6 ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

6.1 Получение трансгенных мышей

6.1.1 Анестезия мышей

6.1.2 Вазэктомия самцов мышей.

6.1.3 Подготовка реципиентных ложнобеременных самок для трансплантации зигот

6.1.4 Получение беременных самок

6.1.5 Проведение суперовуляции

6.1.6 Получение зигот от донорных мышей

6.1.7 Проведение микроинъекций

6.1.8 Трансплантация зигот

6.2 Получение трансгенных кроликов

6.2.1 Проведение гормональной подготовки кроликов - доноров зигот

6.2.2 Извлечение зигот у кроликов

6.2.3 Проведение микроинъекций

6.2.4 Трансплантация микроинъецированных эмбрионов

7 АНАЛИЗ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

7.1 Выделение высокомолекулярной геномной ДНК солевым методом

7.2 Проведение ПЦР

7.3 Доение животных

7.4 Обезжиривание молока

7.5 Электрофоретическое разделение белков молока

7.6 Подготовка образца для масс-спектроскопического анализа

7.7 Обессоливание на микроколонке и снятие масс-спектра

7.8 Определение интерфероновой активности 67 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1 ПОЛУЧЕНИЕ И АНАЛИЗ ТРАНСГЕННЫХ КРОЛИКОВ,

ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ В МОЛОКЕ БЕТА-ИНТЕРФЕРОН ЧЕЛОВЕКА

1.1 Создание гибридного гена ВЬС-ЫПЧЬ

1.2 Получение трансгенных кроликов, содержащих гибридный ген ВЬО-ЫРМ)

1.3 Анализ наследования и тканеспецифичности экспрессии гибридного гена ВЬО-ЫРКЬ

1.4 Определение биологической активности ИФН-бета в молоке трансгенных крольчих поколений Н и VI

1.5 Изучение изменений в белковом составе молока трансгенной крольчихи

2 ПОЛУЧЕНИЕ И АНАЛИЗ ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ, СОДЕРЖАЩИХ КОИНТЕГРИРОВАННЫЕ ГЕНЫ ВГО-ШРШ И БАЯ-ЕШ

2.1 Создание гибридной конструкции, содержащей генетические элементы, повышающие экспрессию генов

2.2 Получение мышей, трансгенных по бета-интерферону и конструкции ЗАПЕЛ

2.3 Анализ наследования трансгенов в поколении И

2.4 Анализ ориентации трансгенов в интегрированном состоянии

2.5 Анализ белкового состава молока мышей

2.6 Изучение тканеспецифичности экспрессии бета-интерферона у трансгенных мышей

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспрессия бета-интерферона человека в молоке трансгенных животных"

Лекарственные препараты нового поколения, создаваемые на основе рекомбинантных белков, в частности, гормонов и цитокинов, находят всё большее применение в медицинской практике. Один из наиболее интересных белков семейства цитокинов - бета-интерферон (ИФН-бета), является центральным регулятором неспецифического иммунитета. Он обладает сильным антивирусным и антипролиферативным действием и используется в комплексной терапии различных онкологических и аутоиммунных заболеваний, тяжелых вирусных и бактериальных инфекций, сопровождающихся иммунодефицитными состояниями. ИФН-бета является наиболее эффективным из известных препаратов для лечения рассеянного склероза [1].

В настоящее время производятся препараты как гликозилированного ИФН-бета (препараты Avonex, Rebif), так и негликозилированного ИФН-бета (препараты Betaseron, Betaferon). Гликозилированный ИФН-бета (ИФН-бета-1а) получают путём экспрессии в культуре клеток яичника китайского хомячка, а негликозилированный ИФН-бета (ИФН-бета-16) - путём экспрессии в культуре бактериальных клеток (.Escherichia coli). ИФН-бета-16 имеет примерно в 10 раз более низкую удельную активность, чем ИФН-бета-1а, возможно, вследствие олигомеризации белка [2], что вынуждает увеличивать дозировку препарата и частоту его введения [3].

Одним из наиболее эффективных способов получения белков со сложными посттрансляционными модификациями, свойственными клеткам высших эукариот, является создание трансгенных животных, продуцирующих нужные белки в молоке. К настоящему времени созданы трансгенные животные, содержащие в молоке такие рекомбинантные белки как aj -антитрипсин [15], тканевой активатор плазминогена [14], гамма-интерферон человека [4], химозин [19], гранул оцит/макрофаг колониестимулирующий фактор [164] и другие. Некоторые линии трансгенных животных используются для производства рекомбинантных белков, так, например, в 2006 г. Европейской коммисией было дано разрешение фирме GTC Biotherapeutics на производство препарата АТгуп®, созданного на основе синтезирумого в молочной железе коз рекомбинантного антитромбина человека (www.gtcbio.com/pressreleases/pr080206.html), завершается разработка препарата rhClINH (Pharming Group NV) на основе С1-ингибитора, получаемого из молока трансгенных кроликов (www.pharming.com/index.php?act=prod&pg=l). Однако далеко не все попытки экспрессии 6 белков в молоке трансгенных животных оказались успешными. В первую очередь неудачи связаны с недостатком знаний о механизмах регуляции экспрессии гибридных генов. В настоящий момент не существует универсального вектора или подхода для экспрессии рекомбинантных белков в молоке трансгенных животных, а оптимальная стратегия по-прежнему заключается в создании нескольких гибридных генов и тестировании эффективности работы этих генов на трансгенных мышах. Изучение особенностей экспрессии рекомбинантных белков у трансгенных животных не только расширяет наши познания о молекулярных механизмах функционирования клеток животных, но и помогает создавать более эффективные системы производства рекомбинантных белков.

Целью работы было создание трансгенных животных, продуцирующих бета-интерферон человека в молоке, и изучение закономерностей экспрессии введённых генов.

Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Ходарович, Юрий Михайлович

Выводы

1. Созданы трансгенные кролики, содержащие гибридный ген ВЬО-ЫЛЧЬ. Установлено, что у полученных трансгенных кроликов наблюдается низкая эффективность передачи трансгена первому поколению, и существенно более высокая эффективность наследования трансгена во втором поколении. Этот эффект не наблюдается у мышей, содержащих ген ВЬО-ЫРМЬ.

2. Показано, что молоко трансгенных крольчих содержит биологически активный интерферон. Уровень экспрессии бета-интерферона сохраняется у следующего поколения трансгенных кроликов. Вставка кодирующих последовательностей гена ИФН-бета в первый экзон гена ВЬО приводит к низкому уровню экспрессии гибридного гена. Белковый состав молока трансгенных крольчих отличается от молока нетрансгенных крольчих, предположительно, из-за неабсолютной видоспецифичности бета-интерферона человека.

3. Созданы трансгенные мыши, содержащие гибридный ген ВЬО-ЫРЫЬ и элемент 8А11-епЬ. Показано, что коинтеграция инъецируемых фрагментов ДНК происходит с высокой эффективностью, при этом могут реализовываться два варианта объединения коинъецированных фрагментов: а) по комплементарным липким концам б) по некомплементарным концам

Коинтеграция гена ВЬО-МРЫЬ и элемента БАК-епЬ не привела к повышению уровня экспрессии бета-интерферона.

4. Показано, что ген ВЬО-ЫР№)/8АК-еп11 экспрессируется у трансгенных мышей нетканеспецифично, предположительно, из-за влияния регуляторного элемента БАК-епЬ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ходарович, Юрий Михайлович, Москва

1. Petri Т., and Weber-Diehl F.// J. (1995) Interferon beta-lb for the treatment of multiple sclerosis. Biotechnol.,43, 74-75

2. Lagutin OV, Dobrovolsky VN, Vinogradova TV, Kyndiakov BN, Khodarovich YM, Jenkins N, James D, Markham N, Larionov OA. (1999) Efficient human IFN-gamma expression in the mammary gland of transgenic mice. J Interferon Cytokine Res., 19(2), 137-44

3. Massoud M, Bischoff R, Dalemans W, Pointu H, Attal J, Schultz H, et al., (1991) Expression of active recombinant human alpha 1-antitrypsin in transgenic rabbits. J Biotech., 18, 193-204.

4. Limonta J, Pedraza A, Rodriguez A, Freyre FM, Barral AM, CastroFO, et al., (1995) Production of active anti-CD6 mouse/humanchimeric antibodies in the milk of transgenic mice. Immunotech., 1, 107-113.

5. Kerr DE, Liang F, Bondioli KR, Zhao H, Kreibich G, Wall RJ and Sun T (1998) The bladder as a bioreactor: urothelium production and secretion of growth hormone into urine. Nature Biotech., 1675-79

6. Nagaraju J, Kanda T, Yukuhiro K, Chavancy G, Tamura T and Couble P (1996) Attempt at transgenesis of the silkwormCSom^yx mori L.) by egg-injection of foreign DNA. Appl Entomol Zool., 31, 458-596.

7. Yamao M, Katayama N, Nakazawa H, Yamakaws M, Hayashi Y, Hara S, et al., (1999) Gene targeting in the silkworm by use of a baculovirus. Genes Dev., 13, 511-516.

8. Tamura T, Thibert C, Royer C, Kanda T, Abraham E, Kamba M, et al., (1999) Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotech., 18, 81-84.

9. Archibald, A.L., McClenaghan, M., Hornsey, V., Simons, J.P. and Clark, A.J. (1990) High-level expression of biologically active human a i-antitrypsin in the milk of transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 5278-5182.

10. Sharma A, Martin MJ, Okabe JF, Truglio RA, Dhanjal NK, Logan JS and Kumar R (1994) An isologous porcine promoter permithigh level expression of human hemoglobin in transgenic swine Bio/Technol., 12, 55-59.

11. Meade, H., Gates, L., Lacy, E. and Lonberg, N. (1990) Bovine alphasi-casein gene sequences direct high level expression of active human urokinase in mouse milk. Bio/Technology, 8, 443-446.

12. Wright, G., Carver, A., Cottom, D., Reeves, D., Scott, A., Simons, P., Wilmut, I., Garner, I. and Colman, A. (1991) High-level expression of active human alpha-1-antitrypsin in the milk of transgenic sheep. Bio/Technology, 9, 830-834.

13. Shani, M., Barash, I., Nathen, M., Ricca, G., Searfoss, G.H., Dekel, I., Faerman, A., Givol, D. & Hurwitz, D.R. (1992) Expression human serum albumin in the milk of transgenic mice. Transgenic Res., 1, 195-208.

14. Reddy, V.B., Vitale, J.A., Wei, C., Monstoya-Zavala, M., Stice, S.L., Balise, J. and Robl, J.M. (1991) Expression of human growth hormone in the milk of transgenic mice, Anim. Biotechnol., 2,15-29.

15. Wei, Y., Yarns,S., Greenberg, N.M., Whitsett, J. and Rosen, J.M. (1995) Production of human surfactant protein С in milk of transgenic mice. Transgenic Res., 4, 232-240.

16. Эрнст, Л.К., Гольдман, М.Л., Зиновьева, H.A., Бакшеев, Е.Д., Гоголевский, П.А., Кадулин, С.Г., Брем, Г. (1985) Получение овец, трансгенных по конструкции asi- казеин/химозин, Докл.Акад.Наук, 345, 555-558.

17. Pruncard, D., Cottingham, I., Garner, I., Bruce, S., Dalrymple, M., Lasser, G., Bishop, P. and Forster, D. (1996) High-level expression of recombinant human fibrinogen in the milk of transgenic mice, Nature Biotechnology, 14, 867-871.

18. Gordon, J.W., Ruddle, R.H. (1982) Germ line transmission in transgenic mice, in Embrionic Development, Part B: Cellular Aspects, (Burger, M.B., Weber, R., Eds.), 112-124, New York: Liss.

19. Jaenisch, R. and Mintz, B. (1974) Simian virus 40 DNA sequences in DNA of healthy adult mice developed from preimplantation blastocists injected from viral DNA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71,1250-1254.

20. Jaenisch, R., Fan, H. and Croker, B. (1975) Infection of preimplantation mouse embrios with leukemia virus: tissue distribution of viral DNA and RNA and leukemogenesis in the adult animal, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72,4008-4012.

21. Jaenisch, R. (1976), Germ line integration and Mendelian transmission of the exogeneus Moloney leukemia virus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 1260.

22. Lin, T.P. (1966), Microinjection of mouse eggs, Science, 151, 333-337.

23. Gordon, J.W., Scangos, G.A., Plotkin, D,J., Barbosa, A. and Ruddle, F.H. (1980), Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7380-7384.

24. Brinster, R.L., Chen, H.Y., Trumbauer, M.E., Yagle, M.K. and Palmiter, R.D. (1985) Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microijecting eggs, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4438-4442.

25. Hogan, B., Costantini, F., Lacy, E. Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual., (1986) New York, Cold Spring Harbor Laboratory.

26. Risha, J and Lo, C.W. (1989) Introduction of human DNA into mouse eggs by injection of dissected chromosome fragments, Science, 245, 175-177.

27. Palmiter, R.D. and Brinster, R.L. (1986) Germ-line transformation of mice, Ann. Rev. Genet., 465-499.

28. McKnight, R.A., Shamay, A., Sankaran, L., Wall, R.J. and Hennighausen, L. (1992) Matrix-attachment region can impart position-independent regulation of a tissue-specific gene in transgenic mice, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 69436947.

29. Pieter, F.R., de-Wit, I.C.M., Pronk, A.C.J., Kooiman, P.M., Strijker, R. and Krimpenford, P. J. A. (1992) Efficient generation of functional transgen by homologous recombination in murine zygotes, Nucleic Asid Res., 20, 1259-1264.

30. Gu, H., Marth, J.D., Orban, P.C., Mossmann, H. and Rajewsky, K. (1994) Deletion of DNA polymerase (beta) gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting, Science, 265, 103-106.

31. Rothenberg, B.E. and Voland, J.R. (1996) Beta(2) Knockout mice develop parenchymal iron overload: A putative role for class I genes of the major histocompatibility complex in iron metabolism, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1529-1534.

32. Huang, L.S., Voyiaziakis, E., Chen, H.L., Rubin, E.M. and Gordon, J.W. (1996) A novel functional role for apolipoprotein B in male infertility in heterozygous apolipoprotein B knockout mice, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 10903-10907

33. Rottmann, O.J., Stratova, C., Hornstein, M. and Hughes, J. (1985) Tissue specific expression of hepatitis B surface antigen in mice followong liposome mediated gene transfer into blastocists, Zentralbl. Vet. Med., A32, 676-682.

34. Lavitrano, M., Camaioni, A., Fazio, V.M., Dolci, S., Farace, M.G. and Spadafora, C. (1989), Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into eggs: genetic transformation of mice, Cell, 57, 717-723.

35. Al-Shawi, R., Kinnaird, J., Burke, J. and Bishop, J.O. (1990) Expression of a foreign gene in a line of transgenic mice is modulated by a chromosomal position effect, Molecular and Cellular Biology, 10, 1192-1198.

36. Brem, G. (1993) Tansgenic animals. Volume 2 of Biotrchnology, VCH, Weinheim, Federal Republic of Germany, 746-832.

37. Clark, A.J., Harold, G. & Yull, F.E. (1997) Mammalian cDNA and prokaryotic reporter sequences silence adjacent transgenes in transgenic mice., Nucleic Acids Res., 25, 1009-1014.

38. Dynan, W.S. (1986) Promoters for housekeeping genes, Trends in Genet., 2, 196197.

39. Mirkovitch J., Mirault M.E., Laemmli U.K., 1984. Organization of the higherorder chromatin loop: specific DNA attachment sites on nuclear scaffold. Cell, 39, 223-232

40. Jenuwein Т., Forrester W.C., Fernandez-Herrero L.A., Laible G., Dull M., Grosschedl R., 1997. Extension of chromatin accessibility by nuclear matrix attachment regions. Nature, 385(6613), 269-72

41. Чернов И.П., Акопов С.Б., Николаев Л.Г., 2004. Структура и функции участков прикрепления ДНК к ядерному матриксу (S/MARs). Биоорганическая химия, 30(1), 3-14

42. Heng Н. Н. Q., Goetze S., Ye С. J., Liu G., Stevens J. В., Bremer S. W„ Wykes S. M., Bode J. and Krawetz S. A., 2004. Chromatin loops are selectively anchored using scaffold/matrix attachment regions. J. Cell Sci., 117, 999-1008

43. Singh G.B., Kramer J.A., Krawetz S.A., 1997. Mathematical model to predict regions of chromatin attachment to the nuclear matrix. Nucleic Acids Res., 25(7), 1419-25

44. Dietz A., Kay V., Schlake T., Landsmann J. and Bode J., 1994. A plant scaffold attached region detected close to a T-DNA integration site is active in mammalian cells. Nucleic Acids Res., 22(14), 2744-2751

45. Caldovic L., Agalliu D. & Hackett P. B., 1999. Position-independent expression of transgenes in zebrafish. Transgenic Research., 8, 321-334

46. Luderus M.E., de Graaf A., Mattia E., den Blaauwen J.L., Grande M.A., de Jong L., van Driel R., 1992. Binding of matrix attachment regions to lamin Bl. Cell, 70(6), 949-59

47. Luderus M.E., den Blaauwen J.L., de Smit O.J., Compton D.A., van Driel R., 1994. Binding of matrix attachment regions to lamin polymers involves single-stranded regions and the minor groove. Mol Cell Biol. 14(9), 6297-305

48. Sumer H., Saffery R., Wong N., Craig J.M., Choo K.H., 2004. Effects of scaffold/matrix alteration on centromeric function and gene expression. J Biol Chem. 279(36), 37631-9

49. Mielke C., KohwiY., Kohwi-Shigematsu T., Bode J., 1990. Hierarchical binding of DNA fragments derived from scaffold-attached regions: correlation of properties in vitro and function in vivo. Biochem 29, 7475-7485

50. Pemov A., Bavykin S., Hamlin J.L., 1998. Attachment to the nuclear matrix mediates specific alterations in chromatin structure. Proc Natl Acad Sci USA. 95(25), 14757-62

51. McKnight R.A., Shamay A., Sankaran L., Wall R.J., Hennighausen L., 1992. Matrix-attachment regions can impart position-independent regulation of a tissue-specific gene in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 6943-6947

52. Kalos M., Fournier R.E., 1995. Position-independent transgene expression mediated by boundary elements from the apolipoprotein B chromatin domain. Mol Cell Biol. 15(1), 198-207

53. Burgess-Beusse B., Farrell C., Gaszner M., Litt M., Mutskov V., Recillas-Targa F., Simpson M., West A., Felsenfeld G.,2002. The insulation of genes fromexternal enhancers and silencing chromatin. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (4), 16433-16437

54. Allen G.C., Hall G.E. Jr, Childs L.C., Weissinger A.K., Spiker S., Thompson W.F., 1993. Scaffold attachment regions increase reporter gene expression in stably transformed plant cells. Plant Cell, 5, 603-613

55. Allen G.C., Hall G. Jr., Michalowski S., Newman W., Spiker S., Weissinger A.K., Thompson WF., 1996. High-level transgene expression in plant cells: effects of a strong scaffold attachment region from tobacco. Plant Cell. 8(5), 899-913

56. Poljak L., Seum C., Mattioni T., Laemmli U.K., 1994. SARs stimulate but do not confer position independent gene expression. Nucleic Acids Res. 22(21), 4386-94

57. Dijkwel P.A., J.C.Hamlin, 1988. Matrix attachment regions are positioned near replication initiation sites, genes, and an interamplicon junction in the amplified dihydrofolate reductase domain of Chinese hamster ovary cells. Mol.Cel.Biol 8, 5398-5409

58. Takano M., Egawa H., Ikeda J.E., Wakasa K., 1997. The structures of integration sites in transgenic rice. Plant J. 11(3), 353-61

59. Forrester W. C., Fernandez L. A., and Grosschedl R., 1999. Nuclear matrix attachment regions antagonize methylation-dependent repression of long-range enhancer-promoter interactions. Gen Dev. 13, 3003-3014

60. Struhl K., 1998. Histone acetylation and transcriptional regulatory mechanisms. Gen Dev. 12(5), 599-606

61. Norton V.G., Imai B.S., Yau P., Bradbury E.M., 1989. Histone acetylation reduces nucleosome core particle linking number change. Cell. 57(3), 449-57

62. Kries J.P., Buhrmester H., Stratling W.H. 1991. A matrix/scaffold attachment region binding protein: identification, purification, and mode of binding. Cell 64, 123-135

63. Heitmann B., Maurer T., Weitzel J. M.,. Stratling W. H., Kalbitzer H. R. and Brunner E., 2003. Solution structure of the matrix attachment region-binding domain of chicken MeCP2. Eur. J. Biochem. 270, 3263-3270

64. Martens J.H.A., Verlaan M., Kalkhoven E„ Dorsman J.C., Zautema L,A., 2002. Scaffold/matrix attachment region elements interact with a p300-scaffold attachment factor A complex and are bound by acetylated nucleosomes. Mol Cell Biol. 22(8), 2598-2606

65. Liu J., Bramblett D., Zhu Q., Lozano M., Kobayoshi R., Ross S., Dudley J., 1997. The matrix attachment region-binding protein SATB1 participates in negative regulation of tissue-specific gene expression. Mol Cell Biol. 17(9), 5275-5287

66. Dobreva G., Dambacher J., and Grosschedl R., 2003. SUMO modification of a novel MAR-binding protein, SATB2, modulates immunoglobulin p gene expression. Gen Dev. 17, 3048-3061

67. Kas E., Izaurralde E., Laemmli U.K., 1989. Specific inhibition of DNA binding to nuclear scaffolds and histone HI by distamycin. The role of oligo(dA).oligo(dT) tracts. J Mol Biol. 210(3), 587-99

68. Gasser S.M., Laemmli U.K., 1986. Cohabitation of scaffold binding regions with upstream/enhancer elements of three developmentally regulated genes of D. melanogaster. Cell 46, 521-530

69. Blasquez V.C., Xu M., Moses S.C., Garrard W.T., 1989. Immunoglobulin kappa gene expression after stable integration. I. Role of the intronic MAR and enhancer in plasmacytoma cells. J Biol Chem. 264(35), 21183-9

70. Poljak L., Seum C., Mattioni T., Laemmli U.K., 1994. SARs stimulate but do not confer position independent gene expression. Nucleic Acids Res. 22(21), 4386-94

71. Stief A., Winter D.M., Stratling W.H., Sippel A.E., 1989. A nuclear DNA attachment element mediates elevated and position-independent gene activity. Nature. 341, 343-345

72. Kim J.M., Kim J.S., Park D.H., Kang H.S., Yoon J., Baek K., Yoon Y., 2004. Improved recombinant gene expression in CHO cells using matrix attachment regions. J Biotechnol. 107(2), 95-105

73. Gutierrez-Adan A., Pintado B., 2000. Effect of flanking matrix attachment regions on the expression of microinjected transgenes during preimplantation development of mouse embryos. Transgen Res. 9, 81-89

74. Heitmann B., Maurer T., Weitzel J. M.,. Stratling W. H., Kalbitzer H. R. and Brunner E., 2003. Solution structure of the matrix attachment region-binding domain of chicken MeCP2. Eur. J. Biochem. 270, 3263-3270

75. Kong S., Bohl D., Li C., Tuan D., 1997. Transcription of the HS2 enhancer toward a cis-linked gene is independent of the orientation, position, and distance of the enhancer relative to the gene. Mol Cell Biol. 17(7), 3955-65

76. Felsenfeld G., Boyes J., Chung j., Clark D., Studitsky V., 1996. Chromatin structure and gene expression. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 9384-9388

77. Ohtsuku S., Levine M., Cai H.N., 1998. Different core promoters possess distinct regulatory activities in the Drosophila embryo. Gen Dev 12, 547

78. Dunaway M., Hwang J. Y., Xiong M. and Yuen H.-L., 1997. The Activity of the scs and scs' insulator elements is not dependent on chromosomal context. Mol Cell Biol. 17(1), 182-189

79. Li Q., Peterson K.R., Fang X., Stamatoyannopoulos G., 2002. Locus control regions. Blood. 100(9), 3077-86

80. Blackwood E.M., Kadonaga J.T., 1998. Going the distance: a current view of enhancer action. Science. 281(5373), 60-3

81. Fiering S., Whitelaw E., Martin D., 2000. To be or not to be active: the stochastic nature of enhancer action. BioEssays. 22, 381-387

82. Walters M.C., Fiering S., Eldemiller J., Magis W., Groudine M., Martin D.I.K., 1995. Enhancers increase the probability but not the level of gene expression. Proc Natl Acad Sci USA. 92, 7125-7129

83. Francastel C., Walters M.C., Groudine M., Martin D.I.K., 1999. A functional enhancer suppresses silencing of a transgene and prevents its localization close to centrometric heterochromatin. Cell 99, 259-269

84. Newlands S., Levitt L.K., Robinson C.S., Karpf A.B., Modgson V.M., 1998. Transcription occurs in pulses in muscle fibers. Gen Dev 12, 2748-2758

85. Arnosti D.N., Kulkarni M.M., 2005. Transcriptional enhancers: Intelligent enhanceosomes or flexible billboards? J Cell Biochem. 94(5), 890-8

86. Kulkarni M.M., Arnosti D.N., 2003. Information display by transcriptional enhancers. Development. 130(26), 6569-75

87. Gunzburg W.H., Salmons B., 1992. Factors controlling the expression of mouse mammary tumour virus. Biochem J. 283 (Pt 3), 625-32

88. Reuss F.U., Coffin J.M., 1995. Stimulation of Mouse Mammary Tumor Virus superantigen expression by an intragenic enhancer. Proc Natl Acad Sci USA. 92(20), 9293-7

89. Henrard D., Ross S.R., 1988. Endogenous mouse mammary tumor virus is expressed in several organs in addition to the lactating mammary gland. J Virol. 62(8), 3046-9

90. Maeda Т., Maeda M., Stewart A.F., 2002. TEF-1 transcription factors regulate activity of the mouse mammary tumor virus LTR. Biochem Biophys Res Commun. 296(5), 1279-85

91. Stewart T.A., Hollingshead P.G., Pitts S.L., 1988. Multiple regulatory domains in the mouse mammary tumor virus long terminal repeat revealed by analysis of fusion genes in transgenic mice. Mol Cell Biol; 8,473-479

92. Мок E., Golovkina T.V., Ross S.R., 1992. A Mouse Mammary Tumor Virus mammary gland enhancer confers tissue-specific but not lactation-dependent expression in transgenic mice. J. Virol. 66, 7529-7532

93. Yanagawa S.I., Tanaka H., Ishimoto A., 1991. Identification of a novel mammary cell line-specific enhancer element in the long terminal repeat of Mouse Mammary Tumor Virus, which interacts with its hormone-responsive element. J.Virol: 65,526-531

94. Mellentin-Michelotti J., John S„ Pennie W.D., Williams Т., Hager G.L., 1994. The 5' enhancer of the mouse mammary tumor virus long terminal repeat contains a functional AP-2 element. J. Biol Chem 269, 31983-31990

95. Lefebvre P., Berard D.S., Cordingley M.G., Hager G.L., 1991. Two regions of the Mouse Mammary Tumor Virus long terminal repeat regulate the activity of its promoter in mammary cell lines. Mol Cell Biol., 11, 2529-2537

96. Grimm S. L. and Nordeen S. K., 1999. A composite enhancer element directing tissue-specific expression of Mouse Mammary Tumor Virus requires both ubiquitous and tissue-restricted factors. J Bio Chem. 274(18), 12790-12796

97. Городецкий, С.И., Сулимова, Т.Е., Иванов, В.Н., Баев, А.А. (1984) Гены казеинов: пример возможного примения в биотехнологии. Тезисы докладов

98. Всесоюзной конференции "Новые направления в билтехнологии", Пущино, 32-33.

99. Clark, A.J., Simons, P., Wilmut, I. and Lathe, R. (1987) Pharmaceutical from transgenic livestock, Tibtech, 5, 20-24.

100. Stewart, T.A., Pattengale, P.K. and Leder, P. (1984), Spontaneous adenocarcenomas in transgenic mice that carry and express MTV/myc fusion genes, Cell, 38, 627-637.

101. Leder, A., Pattengale, P.K., Kuo, A., Stewart, T.A. and Leder, P. (1986) Consequences of widespread deregulation of the c-myc gene in transgenic mice: multiple neoplasms and normal development, Cell, 45, 485-495.

102. Yom, H.C., Heideman, J.K., Bremel, R.D. and First, N.L. (1989) Production of transgenic mice for analysis of mammary specific gene expression. J. Cell. Biochem. Suppl., 13b, 176 (conference abstract).

103. Bleck, G.T., Heideman, J.K., Cullen, D., First, N.L. and Bremel, R.D. (1989) Generation of transgenic mice containing a ligninase gene under control of mouse mammary tumor virus promoter. J. Anim. Sci., 67, Suppl. 1,319 (conference abstract).

104. Yom, H.C., Kessler, M.A. and Bremel, R.D. (1989) Cloning of MMTV LTR-bovine alpha-Si casein gene for the study of mammary-specific gene expression in transgenic mice and cell culture. J. Anim. Sci., 67, Suppl. 1, 319 (conference abstract).

105. Yom, H.C., Bremel, R.D. and First, N.L. (1991) High-level expression of bovine alpha-SI -casein cDNA under the control of MMTV promoter/enhancer in the milk of transgenic mice. J. Cell. Biochem. Suppl., 15 A, 213 (conference abstract).

106. Campbell, S.M., Rosen, J.M., Hennighausen, L.G., Strech-Jurk, U. and Sippel, A.E. (1984) Comparison of the whey acidic protein genes of the rat and mouse. Nucleic Acids Res., 12, 8685-8697.

107. Hall, L„ Emery, D.C., Davies, M.S., Parker, D. and Craig, R.K. (1987) Organization and sequence of the human alfa-lactalbumin gene. Biochem. J., 242, 735-742.

108. Vilotte, J.L., Soulier, S., Mercier, J.-C., Gaye, P., Hue-Delahaie, D. and Furet, J.P. (1987) Complete nucleotide sequence of bovine alfa-lactalbumine gene -comparison with its rat counterpart. Biochimie, 69, 609-620.

109. Laird, J.E., Jack, L., Hall, L., Boulton, A.P., Parker, D. and Craig, R.G (1988) Structure and expression of the guinea-pig alfa-lactalbumin gene. Biochem. J., 254,85-94.

110. Vilotte, J.L., Soulier, S., Printz, C. and Mercier, J.C. (1991) Sequence of the goat alpha-lactalbumin-encoding gene comparisin with the bovine gene and evidance of related sequences in the goat genome. Gene, 98, 271-276.

111. Alexander, L.J., Stewart, A.F., Nackinlay, A.G., Kapelinskaya, T.V., Tkach, T.M. and Gorodetsky, S.I. (1988) Isolation and characterisation of the bovine kappa-casein gene. Eur. J. Biochem., 178, 395-401.

112. Ali, S. and Clark, A.J. (1988) Characterization of the gene encoding ovine beta-lactoglobulin. J. Mol. Biol., 199, 415-426.

113. Harris, S., Ali, S., Anderson, S., Archibald, A.L. and Clark, A.J. (1988) Complete nucleotide sequence of the genomic ovine beta-lactoglonulin gene. Nucleic Acids Res., 16, 10379-10380.

114. Jones, W.K., Yu-Lee, L.Y., Clift, S.M., Brown, T.L. and Rosen, J.M. (1985) The rat casein multigene family. J. Biol. Chem., 260, 7042-7050.

115. Bonsing, J., Ring, J.M., Stewart, A.F. and MacKinlay, A.G. (1988) Complete nucleotide sequence of bovine beta-casein gene. Aust. J. Biol. Sci., 41, 527-537.

116. Yoshimura, M. and Oka, T. (1989) Isolation and structural analysis of the mouse beta-casein gene. Gene, 78, 267-275.

117. Thepot, D., Devinoy, E., Fontaine, M.L. and Houdebine, L.M. (1991) Structure of the gene encoding rabbit beta-casein. Gene, 97, 301-306.

118. Roberts, B., Ditullio, P., Vitale, J., Hehir, K. and Gordon, K. (1992) Cloning of the goat beta-casein-encoding gene and expression in transgenic mice. Gene, 121, 255-262.

119. Rijnkels, M., Kooiman, P.M., Krimpenfort, P.J.A., de Boer, H.A., and Pieper F.R., (1995) Expression analysis of the individual bovine (3-, aS2- and K-casein genes in transgenic mice, Biochem. J., 311, 929-937.

120. Eldin, S.C.R. (1988) The formation and function of DNAse I Hypersensitive site in process of gene activation, J. Biol. Chem., 263,19259-19262.

121. Whitelaw, B.A., Harris, S., Mc Clenaghan, M„ Simons, J.P. and Clark A.J. (1992) Position -independent expression of the ovine p-lactoglobulin gene in transgenic mice, Biochem. J., 286, 31-39.

122. Vilotte, J.L. and Soulier, S. (1992) Isolation and characterization of the mouse alfa-lactalbumib-encoding gene: interspecies comparison, tissue- and stage specific expression. Gene, 119, 287-292.

123. Lubon, H. and Hennighausen, L. (1987) Nuclear proteins from lactating mammary glands bind to the promorer of a milk protein gene. Nucleic Asids Res., 15,2103-2119.

124. Lubon, H. and Hennighausen, L. (1988) Conserved region of the rat alfa-lactalbumin promoter is a target site for protein binding in vitro. Biochem. J., 256, 391-396.

125. Jones, K.A., Kadonaga, J.T., Rosenfeld, P.J., Kelly, T.J. and Tjian, R. (1987) A cellular DNA-binding protein that activates eucariotic transcription and DNA replication. Cell, 48, 79-89.

126. Sontoro, C., Mermod, N., Andrews, P.C. and Tjian, R. (1988) A family of human CCAAT-box-binding proteins active in transcription and DNA replication: cloning and expression of multiple cDNA. Nature, 334,218-224.

127. Cordingly, M.G., Riegel, A.T. and Hager, G.L. (1987) Steroid- dependent interaction of transcription factors with the inducible promoter of mouse mammary tumor virus in vivo. Cell, 48, 261-270.

128. Harris, S., McClenaghan, M., Simons, J.P. Ali, S. and Clark, A.J. (1991) Developmental regulation of sheep P-lactoglobulin gene in the mammary gland of transgenic mice. Dev. Gen., 12, 299-307.

129. Watson, C.J., Gordon, K.E., Robertson, M. and Clark, A.J. (1991) Interaction of DNA-binding proteins with a milk protein gene promoter in vitro: identification of a mammary gland-specific factor. Nucleic Acids Res., 19, 6603-6610.

130. Gouilleux, F., Wakao, H., Mundt, M. and Groner, B. (1994) Prolactin induces phosphorylation of Tyr694 of Stat5 (MGF), a prerequisite for DNA binding and induction of transcription. EMBO J., 13, 4361-4369.

131. Schmitt-Ney, M., Doppler, W., Ball, R.K. and Groner, B. (1991) Beta-casein gene promoter activity is regulated by hormone-mediated relief of transcriptional repression and mammary-gland-specific nuclear factor. Mol. Cell. Biol., 11, 3745-3755.

132. Streuli, C.H., Edwards, G.M., Delcommenne, M.,Whitelaw, C.B.A, Burdon, T.G., Schindler, C., and Watson, C.J. (1995) Stat5 as a target for regulation by extrasellular matrix. J. Biol. Chem., 270, 21639-21644.

133. Li, S. and Rosen, J.M. (1995) Nuclear Factor I and mammary gland factor (STAT5) play a critical role in regulation rat whey acidic protein gene expression in transgenic mice. Mol. Cell. Biology, 15, 2063-2070.

134. Simons, J.P., Wilmut, I., Clark, A.J., Archibald, A.L., Bishopp, J.O and Lathe, R.1988) Gene transfer into sheep. Bio/Technology, 6, 179-183.

135. Gordon, K., Lee, E., Vitale, J.A., Smith, A.E., Westphal, H. and Hennighausen, L. (1987) Production of human tissue plasminogen activator in transgenic mouse milk. Bio/Technology, 5, 1183-1187.

136. Pennica, D., Holmes, W.E., Kohr, W.E., Harkins, R.N., Vehar, G.A., Ward, C.A., et al. (1983) Cloning and expression of human tissue-type plasminogen activator cDNA in E. coli. Nature, 301, 214- 220.

137. Wittwer, A.J., Howard, S.C., Carr, L.S., Harakas, N.K., and Feder, J. (1989) Effects of N-glycosylation on in vitro activity of Bowes melanoma and human colon fibroblast derived tissue plasminogen activator. Biochemistry, 28, 76627669.

138. Peters, Jr.T. (1975) Serum albumin. In: The Plasma Proteins; Structure, Function and Genetic control, edited by Putman, F.W. 133-173. Academic Press, San Diego.

139. Barash, I., Faerman, A., Baruch, A., Nathan, M., Hurwitz, D.R. & Shani, M. (1993) Synthesis and secretion of human serum albumin by mammary gland explants of virgin and lactating transgenic mice. Transgenic Res., 2, 266-276.

140. Hurwitz, D.R., Nathan, M., Barash., Ilan, N. & Shani, M. (1994), Specific combination of human serum albumin introns direct high level expression of albumin in transfected COS cells and in the milk of transgenic mice. Transgenic Res., 3, 365-375.

141. Clark, A.J., Cowper, A., Wallace, R., Wright, G. & Simons,J.P. (1992) Rescuing transgene expression by co-integration. Bio/Technology, 10, 1450-1454.

142. Clark, A.J., Archibald, A.L., McClenaghan, M., Simons, J.P., Wallace, R. & Whitelaw, C.B.A. (1993) Enchancing the efficiency of transgene expression. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Seriies B Biological Sciences, 339, 1288.

143. Yull, F., Harold, G., Wallace, R. & Clark, A.J. (1997) Transgene rescue in the mammary gland is associated with transcription but does not require transcription of BLG transgenes. Transgenic Res., 6, 11-17.

144. Esmon, C.T. (1987) The regulation of natural anticoagulant pathway. Sciense, 235,1348-1352.

145. Suk, K„ Jung, D.Y., Kang, S.W., Seo, E.J., Kang, H.A., Yu, M.H. and Seo, J.S. (1995) Human erythropoietin-induced polycythemia in transgenic mice. Molecules and Cells, 5, 634-640.

146. Chang AWS, Homan EJ, Ballou LU, Burns JC, Bremel RD. Transgenic cattle produced by reverse-transcribed gene transfer in oocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 14028-14033.

147. Chang AWS, Chong KY, Martinovich C, Simerly C, Schatten G. Transgenic monkeys produced by retroviral gene transfer into mature oocytes. Science 2001, 291,309-312.

148. Schnieke AS et al. Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts. Science 1997, 278, 2130-2133

149. Cibelli JB et al. Cloned transgenic calves produced from nonquiescent fetal fibroblasts. Science 1998, 280, 1256-1258.

150. Brink MF, Bishop MD, Pieper FR. Developing efficient strategies for the generation of transgenic cattle which produce biopharmaceuticals in milk. Theriogenology 2000, 53, 139-148.

151. Palmiter R.D., Wilkie T.M., Chen H.Y., Brinster R.L. Transmission distortion and mosaicism in an unusual transgenic mouse pedigree. Cell 1984, 36, 869-877.

152. Wilkie T.M., Palmiter R.D. Analysis of the integrant in MyK-103 transgenic mice in which males fail to transmit the integrant. Mol. Cell. Biol. 1987, 7, 1646-1655.

153. Wilkie T.M., Braun R.E., Ehrman W.J., Palmiter R.D., Hammer R.E. Germ-line intrachromosomal recombination restores fertility in transgenic MyK-103 male mice. Genes Dev. 1991, 5, 38^18.

154. Gillespie G., Carter W.A. Tex. Rep. Biol. Med. 1981, 41, 37-42.

155. Derynck R., Remaut E., Saman E., Stanssens P., De Clercq E., Content J., Fiers W. Expression of human fibroblast interferon gene in Escherichia coli. Nature. 1980, 287, 193-197.

156. McCullagh K.G., Davies J.A., Sim I.S., Dawson K.M., O'Neill G.J., Doel S.M., Catlin G.H., Houghton M. Biological properties of human interferon beta 1 synthesized in recombinant bacteria. J. Interferon Res. 1983, 3, 97-111.

157. Chen X.Z., Yun J.S., Wagner T.E. Enhanced viral resistance in transgenic mice expressing the human beta 1 interferon. J. Virol. 1988, 62, 3883-3887.

158. Sandgren E.P., Palmiter R.D., Heckel J.L., Brinster R.L., Degen J.L. DNA rearrangement causes hepatocarcinogenesis in albumin-plasminogen activator transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1992, 89, 11523-11527.