Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия альфа-I-антитрипсина в бактериальных клетках

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия альфа-I-антитрипсина в бактериальных клетках"

РГ6 од

Российская академия медицинских наук 1 п ПП »ппч .......

НАШОЧКСЛШКШШЖЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЗРМЖНТАЛШОИ ШИЦШЦ

На правах рукописи

СТРАХ' О В А ' Марина Игоревна

ЭКСПРЕСС т АЛШ-1-АНТ11ТР1ШСША. ... В БАКТЕРПАЛЫЖ КЛЕТКАХ.........

03.00.04 - БИОХйиМ

. ....... -А. в т о р е ф е р а т

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук- ■.---■

Санкт-Петербург 1993 ,

Работа выполнена в отделе молекулярной генетики Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН / директор - академик РШ Б.И.Ткачелко/.

Научный руководитель: 'Ойициальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

доктор медицинских наук, профессор В.С.Гайцшш

доктор биологических наук, профессор Н.В.Тсшшш

кандидат медицинских наук В.И.Голубков

Санкт-Петербургский Химико-Оармацеэтический институт.

Защита диссертации состоится "..."..................199 г.

в часов на заседании Специализированного Ученого совета / К 001.23.01/ по присуждению ученой-степени кандидата наук при Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РШ по адресу: 197376, Санкт-Петербург.ул.агод. Швлова,12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ШИШ РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург.ул.акад. Павлова,12.

Автореферат разослан ..............199 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

О.Г.Куликова

- 3 -

ОНДЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ . . •— •

Актуальность проблемы. Алв£а-1-антитркпсин (AT) - ото гли-копротеин плаз.мы крови, принадлежащим-к семейству белков-ингибиторов оераноБнх протеаз4(оершшов). Основная физиологическая . функция AT - это подавление активности эластази - фермента, • 1 разрушающего эластические мембраны а выделяемого ке£тро$алшшя лейкоцитами. ■••••"■."" .'

Наследственная недостаточность AT является одним аз,часто встречающихся аутосомно-р^цессивиых заболеваний (1/2000-1/^500 в различных популяциях Европы и Северной Америки). Основное клиническое проявление болезни --развитие первичной эмфиземы легких - связано о неконтролируемо!; деградацией эластических мембран альвеолярной ткани, обусловленной дефицитом AT и снижением антиэластазного барьера., . •

Наиболее эффективный путь„предупреждения леч'еиая* клянл-ческмх проявлении'недостаточности AT - это повышенно антнолас-тазного барьера легочных альвеол, которое мо.~ет быть достигнуто двумя путяга. Первый состоит в разработке методов генетической коррекции заболевания. В ряде работ, появившихся в последнее врё;ля, сообщается о разработке способов введения в легкие генно-инженерных конструкции обеспечивающих высокоэффективный синтез AT, однако создание подобных -конструкций сопряяено с рядом ' серьезных трудностей, в частности, с необходимостью, подбора безопасных ретровирусных-векторов'('СиШ^в.а.,-' .ISD9; J .. Roienieieltf.e^BÖI).'Второй;путь связан с заместитель!«^ введением препаратов AT. Одаако для стабильного подаерздння ЫЩектлЪг. -ной концентраций AT в .кровотоке требуется' введение I г AT в неделю для каждого больного ( ba&weU е.а., 1986). Таким образом, учитывая высокую частоту заболевания, елшгодная потребность в этом препарате меяег составить несколько'тонн AT в год, что ко может быть реально обеспечено путем выделения природного белка -из крови человека. ■ ,. ■ ••• •-.--.. '

Поэто'ду Наиболее реальной4 представляется заместительная терапия дефицита -AT, ориентированная„ на .-.применение препаратов ре-комбанантного АТ'(рАТ).

В ряде работ было показано, что рАТ, полученный при экспрессии в дрояхевых клетках и клетях Е- toi I обладает, той' яе антиэластаэной активностью, что'и АГ, -выделенный4 из плазмы. - '

3 опытах по' аэрозольному введении рекомбянантного AT было показано, что он 'достигает тканей легкого без существенной деградация ( Casolaro е.а.Д387; Hubbard е.а., 1989).

Одна из основных трудностей терапевтического использования очищенного приходного AT заключается в интенсивном спонтанном окислении Met° , находящегося в активном центре белка, что приводит к быстрой инактивации AT. В связи с этим возникает про-с:;чл не только создания бактерий - продуцентов рЛТ, но и сайт-адресованного одтагенеза ЛТ-кДНК, направленного на изменение аминокислотной последовательности реактивного центра AT и увеличения е^о функциональной стабильности при выделении и хранении ( [Jaiiat е.а., 1986; bischoff е. а., 1991).

Как задача получения генио-инженерного белка, так и разра- ■ ботка ыоделеЛ корреции наследственной недостаточности AT, требует в первую очередь создания рекоабш-щнтных ДКК, обеспечивающих элективный синтез AT в гетерологичшх клетках.

Цели и задачи исследования. Основной целью работы является изучение закономерное тел экспрессии рекомбиншшшх ДКК, содераа щах ген AT человека, в метках E.coit .

- На:ли были поставлены'следующие задачи:

1. Получить генно-инженерными методами полноразмерную АТ-

k.iiJiK.

2. Создать рекомбинантные конструкции на основе различных экоирессионких векторов, направляющих синтез AT в клетках В.coli

3. Исследовать зависимость экспрессии гена AT человека в клетках Е-coli от бактериальных регуляторных элементов и от структуры клонированной последовательности гена AT. :

4. Исследовать функциональную активность рекомбинантного А'1. ' .

5. Разработать методы выделения рекомбинантного AT из клеток Е.ссИ .

Основное- положения, зннооимые на защиту:

X. Получена полноразлюрная АТ-кДНК и на ее основе сконструированы экспрессионные векторы, направляющие синтез рекомбинантного алк£а-1-аититрапсина под контролем tac.- и fcrp -про.-.'.оторов E.coit . Получены итагмв бактерий, продуцпрулцях рА1

- о -

2. Рокомбкшнтный 'AT имеет молекулярную- шсоу 46 кДа; что соответствует молекулярной массе негликозилированкого AT. Гибридный белок OmpF-ЛТ имеет молекулярную массу 48 кДп. -

3. Показано, что уровень синтеза рекоглбпкактного ЛТ определяется структурой о'-концевой части клоннроьаиноЛ кДШ\. Содержа-: . шш рЛТ с 1-ой Ы -концевой аминокислотой зрелог-о AT (Giü- ) составляет 1.5$ тотального ¡щеточного' белка,, содержание рАТ с долсдавя этой ашютшелоты, а' также гибридного бежа Ompf -AT -

' 2.2%.

4. Синтезируемый в клетках £.c°Ü рекембинактшн альСа-1-интитрипсип представляет собой стабильный полипептид, не деградирующий в течение 2 часов культивирования клеток £.соiL

■ 5. Рекомбинантнып антитрипсин обладает ингибиторноп активностью по отношению к трипсину.

6. Разработана схема очистки рАТ из бактериальных-клеток;- • С помощьа комплекса хроыа^ограаач^ских кетодов получен выооко-очящешшй белок Отр f -AT, имеющий молекулярную-массу 48 ¿Да.

Научная новизна работы. Выполненная -работа посвяаеда разработке и оптимизации подходов к получению реко^бкиайтяого AT гж потенциального лечебного препарата.

■ Получена полдоразмерная АТ-кЯЯК, на основе' которой виервае разработаны оригинальные зкспресскопнке конструкции и получены штаммы клеток E-.coii , активно синтезирующие AT человекд... . -

Продемонстрирована 'существенная заёкси;,!Ость уровня экспрессии AT- от структуры 5 -конца клонированной последовательное!:'. ЛТ-кДИК. Разработака схема выделения рекембднантпого .альи-а-!-... . актитряпсика из клеток.,E.toli ♦............-

Научно-практическое значение полученных результатов:

■ I. Полученные реко^'бийантные ДНК могут быть использозаглл б качестве 'зондов при проведении диагностики наследственно;; недостаточное!:; -.ЛТ. ■ ■.",'''■

2. Создание штаммов E.coii лродевдру лвдх'£уиацяональзо активны;! AT, и разработка метода его ьнделения дают возмозюсть изучения тбраиеьт;:ческого- делСтв^-рекокбинаитног-о' AT в оксперя-"" ментах.'на лабораторных ;:сивотных.

3. Помимо этого, доступность ры.омбинантного AT делают его хорошим источником получения доликлоиадышх антител против AT, что моает шгеть принципиальное значение для создания тест-систем, используемых для диагностики недостаточности антитрипсина в клинической практике.

Апробация. Результаты работы бит долоаены па I Всесоюзном сед;ппаре по генной терапия, Киев, 1989; Всесоюзной школе-сешна-ре г.'олодых ученых "¡Молекулярная биология и медицина", Ленинград, 1090 г., II Всесоюзной планово-отчетной конференции по направлению "Генная н клеточная инженерия", ПОТ "Повейше метода био-ииленеряи'', Яущино, 1991 г., на научной конференции отдела молекулярной генетики РШ РАМН, 1993 г. •

Структура диссертации. Диссертация изложена на III страницах к состоит кз. введения, обзора литературы (главы 1,2 и 3), материалов м методов исследования (глава 4), собственных исследований (глаш 5,6,7), обсуждения результатов а выводов. Работа иллштркровака 23 рисунками. Список литературы содержит 121 работу на русском и английском языках. ■

.. СОДЕРЖАШШ РАБОТУ .'.Яатерыалы и методы исследований

'Выделение,, рестрикционный анализ плаз годной 'ДНК, фосфори-лкроЕанис и отжиг линкера,"достройку "тупых" концов ДНК фрагментом Кленова ДНК-полямеразы'1, лигировапие ДЖ, трансформацию клеток E,toLi , поиск и анализ рекомбянантных клонов проводил:! ■ согласно работе Лжштяс и др. (IS84).

Определение нуклеогидаой последовательности ДНК проводили с использованием дчдезокситерминаторов ( äanger е.а., 1977).

,;!№ исследования экспрессии рАТ использовали штаммы E.coii 0MIO9,2>H:ó ( Sambrc-oK е.а., ISO?) и Ш04й ( We.nslock <?.а., 1983). '

Получение бактериальных экстрактов проводила обработкой клеток ультразвуком с последующим центрифугированием.

' Электрофоретическое разделение белков проводили в полиак-р;;ла:.здном геле в денатурирующих условиях ( Laemlte , 1970).

Анализ экспрессия рАТ проводили с помощью явдуноблотищхз. . (■ Ge rshoifit s. a., 1985), о- поликлональной антисывороткои кро-. лкка против AT плазмы человека.

Ингибиторную активность рАТ в отношении трипсина исследовали с применением хромогенного субстрата Ы - оС-бензоил-DL-ap-гкшш-4-нитроанилида (Serva , Германия),по,методу Eriksson "(1965). '

,, , В качестве.контроля- использовали экстракт,,ата:.ка'£.coli ',' . пс содержащий рАТ, а также природный AT человека.' Для этого брали сыворотку с известным содерзханием AT, которое определяли ракетным иммуноэлектрофорезом ( beefce , и др., 1977).

Для исследования стабильности вновь синтезируемого, рЛТ использовали штамм E .colt ItA 109, трансформированный соответствую-, щиш плазмидныш ДНК под контролем ¿ас-промотора. Культуры вы- . ращмвали на среде L6 в присутствии ампициллина (100 .глсг/мл) до концентрации. клеточной, суспензия, .соответствупдей OD g¿Q=o; 35; после чего переносили на минимальную-среда ..19 я проводили импульсное мечение в течение 30 мин в присутствия 2 ?.üí андолкл-£-D -тяогалактозида ( IPTG, Serva , Германия). В качестве меченых предшественников белка использовали смесь пятнадцати аминокислот, равномерно меченных изотопом (250 шазра,5 мл,

Amersham , Англия). Далее клетки переносили на среду L6 и инкубировали .в течение 30-120 мин в отсутствие метки. Бактериальные экстракты получали, как описано выше. Для последующего по- ,. -■-<•- лучения' пмгдунопрецапйтатов'исйользайла ан'тясыворогсу кролика. против' AT человека, ¿- ослиную антисыворотку против иммуноглобулинов сыворотки кролика.

.. ...... • 0 скорости- синтеза рАТ судаий". ño''включению'^й-а?,'лгюккслот

в ижлуцопрехушитируйшй AT, синтезируемый клеткам ÜM 109 и ■ DH 5, которые были трансформированы, соответственно, шизмядами с £ас - и ¿rp -'.щюмоторами. В качестве индукторов использовали, соответственно, JPTG- (в концентрации 2 мМ) и ß -нндолнл- . - • акриловую кислоту (-^ЙАК, '80-мсг/кл, Serva /Германия)'.

Клетки выращивали на среде ¿8 до ОТ) gg0=0.3 , после чего . переносили .ш. средуоодераищую-аемвченннв" а/айнокасйъ'зд. Импульсное мечение приводили в течение 30,60,90,120,150,180 мин, после чего клетки обр батквали: ультразвуком и-получали ,иадлуно-преципитаты, как опис; но выше. "., .-■ •' :•"'. ■ :

Процентное содержание рАТ по отношению к тотальному клеточное белку определяли путем измерения включения меченых С аминокислот в тотальный бйлок бактериальных экстрактов и в имму-нопреци.иитируенкй рАТ.

Для первичного .разделения тотальных белков штамм E.coli продуцирующего рекомбинанткый белок Owp f -AT, использовали ионообменную высокоэффективную аидкостную хроматографию (БЭКК) на ко;.знке UitrapacK TSK Т>£ЛЕ5Я¥7.6x100 мм уравновешенную фосфат-во-солевкм буфером ( Р&& ., pH 6.5). Элквдю осуществляли, исполь- . вуя градиент 0-500 Ali-Mati ь буфере PbS pH 6.5. Дальнейшую очистку приводила методом ВЭЖ на той. же колонке, используя градиент 0-500 Mtf.JfaCi. в буфере. 50 м.<1 Трис- CI , I »J ДТТ, 10 мМ ЭДТА. Окончательную очистку проводили с помощью гельироникаявдеЯ хроматографии на колонке, заполненной се*>адаксом & -100. Элю-цшэ осуществляли .буфером, 30 лМ Трис- CL , I м»1 ЭДТА, I мг.1 ДТТ, pH Ь.О. В случае всех хроматографий детекцию белка проводили при 280 .ям, наличие рАТ .ео фикциях элюата контролировали иммунобло-тинго.-д.

РЕЗУЛЬТАТЫ -MJajiUOBAIMi'i ' I. Получение штаммов E.eoli , продациру'щих'рс-комбинантный AT

Необходимым этапом в разработке технологии получения рАТ является создание генно-инженерных конструкций; экспрессируадих !;,упк1\аональко активный AT в гетерологачных клетках, в частности, в Е.гоЦ ( Casüiaro е\а,( 1987; Ccurfc п^у е. а, ВД4}., Для peuici "я этоЬ задачи на первом этапе работы наш была получена гюлноразмерная АТ-кДЩ. ■

J »'той целью нами были использованы сконструированные payee плаз.-эды. рК ÄT и' ph ATI8. -Ллазшда ph А'!1 создана па основе вектора рТ£ IS и'содераит фрагмент хромосомного гена AT, вьделичнкй кади ранее из библиотеки генов человека на-векторе Харон 4А (Изарц-йн и др., 1990). Данный фрагмент имеет размер В.5 т.п.н. и включает экзоны Я - У и полностью Бесь 3-конец гена AT. Iüaswma ph ATI8 представляет собой вектор р UС- 8 с клони- ; роьанным в кем фрагментом АТ-кДНК, выделенным «as® ранее из библиотека кДвК печени человека на векторе ^¿t II; Давние секьс-ня-рэ';-алля показали, что в'данном фрагменте АТ-к^Щ недостает при-

~ 3 -

мерно 30 кодовое 5 -концевой части, при этом 3'-последопатс.иь--кость предотаышна.полностью (ВЬарцгои и др.. I9S0) и содер:;лт пбли(Л)-тракт из 17 остатков.

получения полнодлинной.кдак фрагмент хрогдасомиого гена, содсрадаз" кодотш ä -шщевой'части AT-mPIIK, бил объединен.с, АТ-кДИК в уникальном сайте для.рестриктазьг-С^¡г ГОЛ. Дяи этого плаз.зд'. ■ рй ЛТ18 гидролизоьали рестрккт;!зя•';!:•:, : Eooß J"'- к " ttг 10.1, выделял«.из 0.6;»агярозпого геля арлr;,.ciiT ДТ-кдгКшз-■ «шрот9-14 'н.п'. Пчаздшду" рЬАТ ги^фолизоьалл рестрнктазаш Cir 10.1 и ЕсоИ либо Cfr ЮЛ и Ват El и выделяли из 0.8? агарозного геля ¿рцгмевго- размером 2897 н.п. пли 337 и.а., соответственно. Полученные фрагменты объединяли с Фрагментом 944 н.п. из пляэмидо ph .ATIö. Полученная прк. этом ш.1нз;.зда у>/гАТЗ содержала все кодонн АТ-мРНК и Фрагмент интронной последователь- . 'ности гена AT. Плазмндя f>h АТ4 содержала вставку рекембянэнт- " 'ной'ЛНК размером 1281 н.п. ,. вклячаящу» все годокы АТ-мРНК, начиная с "позиции +2 ( Asp ') зрелого AT, и 5 -концевой Ват 1'1 сайт, совпадающий с позицией +2.

.Экспрессия AT в бактериальных метках в виде самостоятельного, негибридного белка требует наличия ингщилрулдего kl в- ~ кодона непосредственно перед первыми кодояаш для А/ -концевой части зрелого AT. Таким образом, для создания самостоятельных экспрессионных конструкций нами- била проведена соответствующая модификация б'-концевой области полученной.АТ-юЩК,' при' этом были применены ..следующие 2 подхода. • '"" • . В первом, случае шюзмияу ' 'ph ÄT4 гидролизовали рестргистаза® Uind И и Barry III и заменяли фрагмент Итс/З- бит A I полилинкера с;:нтетичес1шм-дуплекс0м;' " • ' ' .. ' . " 4 . ' ' Met aiu

5'- AGCTTG ААТ TCATGÜAG-J'

• З'-А CT ТА iGTA С. С TCCTAG-S"'

* ■ . .... ' . - ■ - * содержащим сайт для .реотриктазн' EcoRI •"' *, инчципру наций АТб- -кодон'и кодон ÖAG ( Giu ), ходируздй первую ажиюкцелоту - " зрелого AT. Полученная такай -образовг пла'йлада была использована далее -для. поучения экспрессйонных векторов. С этой целью реко.м- . бинантшя ЛКК била гицролизована рестриктазой EcoRl и виде-лопрыЙ фрагмент был.далее клонирован по Ecoßlсайту в векторную пдазкиду' рКК223-3, содертса^О'Ю 4ас. -промотор,; сайт „емзквания

рибосом и.тераднатор транскрипции и в плазмиду рбй 322/lrptf-i8-дериват j>bR 322 с клонированным в ней I т.п.н. - фрагментом хро.\здсомно£ ДЖ В.coli , содержащим промотор 1тр -оперона. Полученные таким образом ллазмяды ¡>h АТ37 и phATl4 содержали полноразмерпую АТ-кДНК, начиная с позиции +1, и инициирующий AU?-кодон под контролем промоторов ¿ас- и trp -, соответственно, U другой стороны, -ранее было показано, что 'деления одной или нескольких аминокислот Л -конца AT может вести к повышению уровня его синтеза в клетках E.coli ( Johansen 1987\ Suiipbcng

е,а., 198?). Для получения рекомбинаитной ДНК, кодирующей.бе-• лок AT с •■одифицироваышм Я -концом исполъзомли комплементарно сигшетричный олигону1Сдеотид 5CAГАСАДТТСТА ГС-¡' содержащий инициирующий'АТ£-кодон и Его AI -линкер. Для этого плазвду ' ph АТ4, гидролизовали рестриктазой Etoßl и после достройки фрагментом Кленова до "тупого" конца лигировали с го-моду плексом - ■«■ . Mfft

5'- CA тла А А Т Т СТА TG - з' i-öTAT'CTT'A АО'ЛТ'А C-J'

полученным*после обработки полинуклеотидкиназой фага Т4 исходного олигонуклеотида и его откига.

Полученная ДИК была Далее .гидролизовгша рестриктазой .и соответствующий фраидент, содерхшщий AT-KjiHK,-был клонирован в плазмада рХК 223-3 и p6R 322/ trpf -А 8 по Есо^Г оайту. Полученные векторы, ph АТ6 и ph ATII'содержали'под-контролем промоторов fcäc-и irp -, соответственно, полнодлинную АТ-К.ЩЖ, на- v ' чиная с г.одона +2 ( ), и инициирующий АТ<?-кодон при наличии восстановленного ftamHI -оайта (рис.1).

ü датой'стороны,. известно, что экспрессия эукариоткческих белков. в составе -слитых белковможет существенно повышать их . 'стабильность,' поскольку таким образом предотвращается распознавание и 1 i зрушение эукариотическах белков протеазами бактериальных клеток ( Lukacsovlcb е.а.,1990).

Для получения рАТ в виде такого слитого бежа был использо-'г>:н: вектор pPRF. I, содержащий 5-последовательность гена ompF , ввлячанщую промотор, сайт связывания рибосом, кодоны для 2.1 аминокислоты сигнального пептида и дая 12 аминокислот собственно белка Omp-F ( We<»»stock е.ö., 1ШЗ). Дня создания конструкции pOmpf /АТ, эксазюеояруацей габрадинй балок, плазнаду p h АТЗ

BamHI EcoBI Met Asp Pro -G A AT TCT ATGGATCCÇ-

EcoW BamHI Sail Pstl Hind III

..........BamHI

Hind III EcoBI Met Glu Asp Pro ;AAG C1T GAATTC ATG GAGCATCCC;

BamHI . EcoRI Met Asp Pro

EcoRI

BamHI

Hind HI EcoBI Met Glu Asp Pro -AAG CTT GAA TTC ÄTG GAG GÄT CCC-

EcoBI

РпсЛ. Хартн.цлазмидph "AT6, ' ' pbAÏ37. ph:Á'iI4, : ph ATII. 5 З-ген 5 SpPHK'£,coii , rrnЙТ>Гг ■ - тершшатор транскрип-

ции.

гидролизовали рестрзиктазой и соответствующий фрагмент,

содержащий АТ-кДНК, встраивали no 8am. HI -сайту в вектор ¡¡OHFJ под контроль промотора гена ompf (рис.2).

Sali BamHI Pro Ser Thr Asp Pro -CCG TCG ACGGATCCC-OnpF ---'—AT

BamHI

Püc.2. Охема длазмиды pOrrpF /ЛТ,

■Наличие инициирующего кодона, восстановление рамок считывания, а таете • последовательность кодонов 5'-концевой части гена Al' была проверены секвениррвакием'для всех полученных.экоп-рессионных конструкций. . •

2. Изучение экспрессии рекомбкнантного альс.а-1-автитрйгюмна

Экспрессия АТ-К.1ЩК под контролем ¿ас -промотора исследовалась ь штамме E.eoít' 9М 109, индукция tac. -промоторе* осуществлялась добавлением IPTG до концентрации I м.,1 при ОЪг^О.З. Экспрессы! АТ-кДНК под контролем trj> -промотора исследовалась в щтамме £,coli ФИ о, индукция trp -промотора осуществлялась добавлением к клеткам p-líak при Oí>55q=0.3. Для исследования пкс-• пресоиа рАТ б виде гибридного белка ¿V/>f-AT использовали мя&ч '¿ÍI046 с те.-.-иературочувствителы-юй цутацие;? oirtpBc,s I, порво-лчжр:; ::пдуцнроп'«'Ь синтез белка Omp f при ЗУ°С\

¡'^пользование метода ишдуноблотинга показало, что во всех иташах. £,соИ, транофоргларовашшх соответст^ющиш шюзмздама, происходит синтез рекокбинантного АТ. Молекулярная масса рАТ составляет 48 кДа для гибридного белка- Orr^pf -АТ, и 46 кДа -е для.самостоятельного полипептида АТ, т.е. соответствует молеку-лырпо? тоое неглакозилировашюго АТ (£ис.З).. ... ..«-••

— ввкОа

mm __4в kOa

i л*

12 3 4 5 в г 8 a to 11 12 •

Рао.З, Пмглуноблотишг лизатов штаммов E.coli , содержащих различные плаз.чиды. Дорожи I-4-AT плазм» в количестве 0.1, 0.5, 1.0 2 I.b ;лкг, соответственно, ú - контрольни!) отаач № IOS, G -f>0mf>F/A1\ 7 - ph ATO, 8 - />А A'i'37. 9-10 - штаммц, содержащие плазмиди ph A Til" и ph.A'L'U и выращенные без индуктора f> ПАК, Il-T¿ - те не штаммы, выращенные в присутствие индуктора. . В случае всех :<5акториалы«х лизатов"бралось по' 150 мкг бактериального белка на пробу. . .

Применение трех различных бактериальных* р'егуляторных после-• дбватсльнЬстей,.á также'использование .д-IIAK, являэде','ся индуктором irp -промотора, не оказывает существенного влияния на синтез АТ.

О другой стороны, содержание АТ-в клетках E.coli существенно зависит от структуры 5' -нокцевай части клонированной AT-igöüi. В случае экспрессии АТ-кДПК с делецией первого кодона содержание АТ существенно превь'Г'ает содержани е рскомбикантного белка-продукта экспрессии подиоразмернои кДНК, содержащей первый кодон AT &А&. Эти''результаты хорошо согласуются с данными ( Johansen «*;а.,Пй7;

ibütipbong е.*., 1й)7), показывающим, что отсутствие нескольких ¡•одонов для К -концевых аминокислот может вести к 'люгократио:.^ по¡-ыкекич.oTicnpoc-JHii AT в клетках í.coli , ... .

Дальнейшие опыты но исследование стабильности вновь синтезированного белка, проведенные с использованием смеси пятнадцати аминокислот, равномерно меченных изотопом . показали,, что содеркание обоих рекомбинантных белков (с модифицированной и • немодифитдированной Ж -концевыми частями) в течение 30.мин импульсного мечения достигает одинаковой величины - приблизительно 1.5>а тотального клеточного белка и поддерживается далее постоянным на протяжении 2 ч инкубации в богатой среде в отсутствие метки (рис.4). Таким образом, можно 'заключить, что отсутствие N -концевой аминокислоты природного АТ ) не оказывает

влияния на стабильность вновь синтезируемого белка.

Рис.4. Исследование стабильности вновь синтезированного рАТ. • - рИАТб, 4- рЬАТ37. По оси абсцисс - длительность чейза, мин. Но оси ординат - {имп.шн~"^/Ю^кл)х103• ' ■- • ' . .

О другой стороны, -опыты но изучению динамики синтеза рАТ показали, что накопление в клетках белка-с' модифицированной (+2), и ^модифицированной (+1) N '-концевой частью примерно одинаково в течение первых 30 мин синтеза. Далее оодераагу^е-немодийициро-' ванного АТ (+1) поддерживается постоянным на протяжении 3 ч роста клеток в присутствии метки, а содержание модифицированного белка (+2) продолжает возрастать за это же время и'увеличивается в 1.5 раза по сравнению с содержанием немодифицированного белка (рис.5). ' . ■

Рис.5. Исследование динамики синтеза рАТ в клетках ДН5, трансформированных плазмидами рЬ АТП (•-•). рЬ АТ14 По оси абсцисс - время инкубации клеток, час. По оси ординат -(имп.мин^/Ю^юОхЮ3. .

сопоставляя данные обоих опытов,- можно заключить, что немо-дифяцированный белок синтезируется в течение не более 30. мин,.а. далее его синтез по каким-то причинам ингибируется, синтез же белка -с делецией Н -концевой аминокислоты продолжается в течение всего периода роста клеток, так, что его содержание достигает 2.2^ тотального клеточного белка.'"" "'"'*;." ' ..

Известно, что делетирование первых 5,10 и 15 кодонов для аминокислот К -концевой части АТ ( ЗоИапйеп 1987) существенна повышает уровень синтеза рАТ. о другой стороны, введение в начальные кодоны АТ мутаций, уменьшавших стабильность вторичной структуры мРНК и оптимизирующих использование кодонов,' дает существенно манее выраженный эффект. При этом генно-инженерные модификации АТ-кДНК не ведут к'сколь-либо заметному уменьшении содержания и стабильности АТ-мРНК. Таким образом, лимитирующей стадией в синтезе АТ является, очевидно, трансляция.

-¡опоставлян полученные наш результаты о литературными данными,'мокно предположить, что, очевидно,- кодоны, соответствую-

■ щие начальным аминокислотам АТ, имеют принципиальное значение для эффективной инициации трансляции АТ-мРНК в бактериальных " клетках. Следует подчеркнуть особое значение 1-ого кодона, наличие которого в наших опытах практически полностью блокировало • синтез рАТ.

Данный эффект является, очевидно, геноспецифичшдм., Причина его не совсем ясна и, возможно, состоит в образовании ме.нее прочного комплекса инициации трансляции, что безусловно, требует своего дальнейшего изучения и лодтвервдения.

Дальнейшее изучение свойств рАТ, проведенное нами на бактериальных экстрактах, показало, что он обладает ингибиторной . активностью в отношении трипсина ( рис.6)

Рис.6. Исследование ингибиторной активности рАТ в отноше-•НШ1 трипсина. . '

• - лизат клеток. Е.col »штамма ТК 1046, трансформированных плаздадой. pOrt'/'F/AT.

к - лизат клеток E.coi< штамма 7Н109, трансформированных плаз.мидой рЬАТб. . ,

. ' Ш - лизат клеток. В.соИ контрольного, штамма ТК 1046. По оси абсцисс - содержание -белка в бактериальных лизатах, мкг. Ло оси ординат - активность, трипсина ( 0Т>^).

3. принципиальная схема ,.- - • •• . шделекия рекомбинантного АТ из клеток Е.соИ

Для дальнейшего изучения сврйств рекомбинантного белка нар ми бал разработан метод выделения р">Т из клеток Е.соП . Б ?вязи с тем, что индукция синтеза рАТ в штамме .ТК1046 не требует'применения: дорогостоящих импортных сред,и индукторов, р качестве......

наиболее удобного объекта для изучения'г:ащ'был .м'бран гибрид-' - ннй белок От^-КТ. ■._.'.'■ _ '.

После индукций культуры собранные кле-^;*: лизировали в присутствии детергента Тритон Х-100 и далее обрабатывали 'ультразвуком. Осаяденные. при помощи 4.1М сульфауа аммония белки растворяли в буфере Р63 , рН 6.5.

В результате последовательного проведения двух ионообменных ВЭЗНХ была отобрана фракция, обогащенная рАТ.

Окончательная очистка была проведена с применением гель-проникагацей 'хроматографии на сефадексе С-100, позволяющей эффективно разделять многокомпонентные препараты в соответствии о молекулярной массой (рис.71

Рис.7. Разделение белков Е.соИметодом гель-проникающей .хроматографии. "" ' '

Цифрами отмечены номера фракций злюата.

- Фракция I, содержащая высокоочищенный рАТ.

Ш

Проведение электрофореза в денатурирующих условиях позволило обнаружить в одной из фракций (й I) присутствие высоко-очищенного белка с молекулярной массой 48 кДа (рио.8).

Исследование иммуноблотингом данного препарата также подтвердило наличие в нем рАТ. ■

Таким образом,, с помощью комплекса хроматографических методов удалось выделить высокоочищенный рекомбинантный АТ (молекулярная масса.48 кДа).

4.2 3 И б 6 7 8.

Рио.8. Денатурирующий гель-электрофорез фракций злвдта, полученных после проведения гель-проникавдей хроматографии. Дорожки № 1-6 - фракции элюата 1-6, соответственно; 7 - АТ йлазми., 8 - маркеры молекулярного веса БЗА (68 кДа), овальбумин • (46 кДа).

0ЮУЩ2Н11Е РЕЗУЛЬТАТОВ '

Недостаточность AT относится к числу наиболее распространенных, наследственных заболеваний человека. Тяжелые формы пато-елогии, обусловленные недостаточностью AT, высокая частота ее распространения, а также существенные ограничения, возникающие-при - применении природного AT для заместительной терапии обусловили обращение, к, разработке альтернативных путей коррекции заболевания.

В последние года наметились два основных пути коррекции наследственной недостаточности AT. Один из них состоит в разработке методов генетической терапии дефицита AT путем использования ретровирусных векторов. Однако пока это направление ограничено созданием моделей генетической коррекции на лабораторных тавотных и культурах клеток. Однако, в настоящее время,., иаибо-, лее реальным представляется другой путь решения проблемы, связанный с получением препарата гбнно-инженерного AT.

Решение обеих этих задач требует прежде всего наличия клонированных последовательностей гена AT и полноразмерной АТ-кДНК.

Первым результатом нашей работы явилось получение полнодлинной АТ-кДНК, что позволило нам далее сконструировать серию экс-прессионных плазмид, направлящих синтез AT в клетках Е.сoli .

Кроме того, полученные.нами рекомбинантные ДБК могут быть использованы в качестве 'зондов для. диагностика недостаточности AT.- - -■■-•--<•--• .' " ....... \

Рекомбянантшй АТ-продукт их, экспрессии имеет молекулярную массу 46 кДа (что соответствует молекулярной массе, негликоэили-.рованного белка AT), а гибридный белок Qtvff '-AT - 48 кДа.

Уровень синтеза рАТ существенно завиоит от структуры N -конца клонированной АТ-кДНК. Яри отсутствий кодона .для первой ' аминокислоты { (Ни У синтез AT существенно превышает таковой при экспрессии полноразмерной кДНК, -содержащей этот кодон.

Эти данные и отсутствие зависимости экспрессии рекимбинант-ного AT от про моторных последовательностей вектора- заставляыт предположить,, что дамитируифю роль в экспрессии AT. в бактерпаль-ных клетках играет трансляция.

• Проведенные нами опыты по исследованию стабильности и скорости синтеза рАТ дают возмохшооть заключить, что немодифициро-

е.'шшц белок, содержащий 1-ую аминокислоту Gl и , синтезируется

' 1 -

лишь на начальной стадии индукции, а далее его синтез по каким-то причинам блокируется. Синтез же белка с делегированной 1-ой аминокислотой продолжается в течение всего периода роста клеток. При этом оба белка являются стабильными и не подвержены протео-лизу.

Содержание рАТ о ^модифицированной fí -концевой частью составляет 1.5$ тотального клеточного белка, а содержание рАТ с делетированной 1-ой N -концевой аминокислотой, а такие гибридного белка Omf f -АТ, достигает 2.2£.

Эти результаты, а также литературные данные позволят' заклю-чит'ь, что кодоны для начальных аминокислот АТ, имеют принципиальное значение для эффективной инициации трансляции АТ-кДПК.

Рекомбинаитный АТ-продукт экспрессии АТ-кДНК под-контролем различных бактериальных промоторов, обладает функциональной активностью АТ и подавляет протео;^тическую активность трипсина. При этом по удельной трипоин-ингибирувдей активности рАТ близок к природному АТ человека. •

Разработанный нами комплекс хроматографических методов дает возможность препаративного выделения рАТ'из экстрактов бактериальных клеток в виде белка, гомогенного, по данным денатурирующего гель-электрофореза. В перспективе .эта процедура может быть использована и для широкомасштабного выделения рАТ о целью экспериментального изучения его фармакокинетики и терапевтического действия. ' > .

' ВЫВОДЫ.

I; На основе полноразмернбй кДНК альфа-1-антитрилсина сконструированы экспрессионные векторы, направляицие синтез рекомби-наитного алв£а-1~антитрипоина под контролем tac. - и Ьгр - просторов и в виде гибридного белка,. включающего последовательности 'белка OmpF E.eoU . " fj ' "

21- Получены штаммы клеток £, со 11' , продуцирущих рекомби-шнтпШГальфа-1-антитрипсин. Рекомбинаитный белок имеет молеку-лкрнукГ'масбу 46 кДа, что соответствует молекулярной'массе негли-: кбзалярбванного алкса-1-антитрижзина. Гибридный белок Отр f -АТ имеет молекулярную массу 48 кДа.

3. Экспрессия к,!Щ алвйа-1-антитрипсина в клетках E.coli зависит от структуры 5'-концевой части клонированной последовательности. Содержание белка с M -концевой аминокислотой зрелого альфа-Х-антитрипсина Gl"-составляет 1.5% тотальных клеточных белков, содержание рекомбинаптного альфа-1-антитрипсина с деле-цией этой аминокислоты, а такяе гибридного белка - ОтрГ-дт, составляет 2.2%.~.....

, 4. Наличие первой аминокислоты зрелого белка' (Glu ) блокирует синтез рекомбинаптного альфа-1-антитрипсина в клетках E.coli . При наличии первой аминокислоты синтез рекомбинант-ного белка завершается в течение первых 30 мин, при делегированной первой аминокислоте синтез продолжается далее.

5. Независимо от наличия 1-ой К -концевой аминокислоты, рекомбинантный аль$а-1~антитрипсин представляет собой стабильный полипедтид, не подверженный протеолизу в гетерологичных бактериальных „клетках. - - ........................................."

6. Рекомбинантный альфа-1~пнтитрипсин, синтезируемый в клетках E.coli обладает ингибяторной активностью по отношению к трипсину.

7. Разработана схема очистки рекомбинантного альс>;а-1-анти-трипеина из клеток E.ûolt. Получен внсокоочищенный гибридный белок OmpP -AT с молекулярной массой 48 кДа.

Список работ, опубликованных по теме диссертации...

1. А.Л.Шварцман, М.И.Страхова,'-В.С.Гайцхоки, В.Бергер, Ч.Ку-тель> ДПК-диагностцка и подходи к генной терапии наследственного дефицита альфа-1-антитрипсина// Биополимеры и'клетка. - 1990.

- Ï.6. - I. - С.51-56. ....

2. 1Л.И. Страхова. Д[1К-диа гное тика и подходы к г.енной терапии наследственного дефицита альфа-1-антитрипсина// Тезисы семинара " Алеку лярнш биология и медицина". - М. - 1990. - С.85.

3. А.Л.Шварцман, А.Ковальская, М.И.Страхова, В.О'.Гайцхоки. Использование лолимеразной цепной реакция для диагностика наследственной недостаточности ал*4щ-1-антитрипсина// Биополимеры и клетка. - 1991. - Т.?. - 3 2. - U.20-24.

4. А.Л.Шварцман, М.И.Страхова. ДНК-диагностика наследственного дефицита альфа-1-антитрипсина// Тезисы Второго Всесоюзного съезда медицинских генетиков. - М. - 1991. - С.239.

5. М.И.Страхова, , Е.А.Орлова-, А.Л.Шварцман. Подходы к заместительной терапии наследственной недостаточности альфа-1-ан-

■ титрипсина. Синтез рекомбинантного алыра-1-антитрипсина человека

■ в клетках 1 //. Тезисы 2-ой Всесоюзной конференции "Геном человека - 91". - ¡Д. - 1991. - С.135-136. .

6. М. И. Страхова, Е.А.Орлова, А.Л.Шварцман, В.С.Гайцхоки. Создать методами генной инженерии клоны бактерий, продуцирующие с высокой эффективностью альфа-1-антитрипсин// Тезисы докладов 2-ой Всесоюзной планово-отчетной конференции по направлению "Генная и клеточная инженерия" ГНТП "Новейшие методы биоинжене-раи". - М. - 1991. - С.129. .

7. М.И.Страхова, А.Л.Швардан, М.Т.Тодорова, Е.А.Орлова, В.с.Гайцхоки. Экспрессия гена альфа-1-антитрипсина человека в клетках Е 5сЬвп'еЬ;а соЧ // Молекулярная биология. - 1-993.