Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспресс-оценка вирулентности грибов Verticillium lecanii Zimm. u Beauveria bassiana (Bals.) Vuili по морфолого-культуральным и физиолого-биохимическим показателям

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Экспресс-оценка вирулентности грибов Verticillium lecanii Zimm. u Beauveria bassiana (Bals.) Vuili по морфолого-культуральным и физиолого-биохимическим показателям"

РТБ им

„ 3 ^

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ й ВИРУСОЛОГИИ

"3, руМШИСИ

СУЛЕИМЕНОВА ЖАНАРЛ БЕГЕЖАНОВНА

ЭКСПРЕСС-ОЦЕНКА ВИРУЛЕНТНОСТИ ГРИБОВ

VfRTfCUUUM LFCANII ZI ММ U BEAUVFRIA ß ASSI AN А (BALS) VUill ПО МОРФОЛОГО-КУЛЬТУРАЛЬНЫМ И ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИМ ПОКАЗАТЕЛЯМ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Алматы - 1995

Работа выполнена в Казахском научно -к ссле до ва те аъ с ком Институте защита растешй» Институте микробиологии и вирусологии HAH PK

Научные руководители: член-корресъондент HAH PK, доктор биологических наук - НД. Еигаева доктор биологических наук - Н.А» Айтхожина

Ведущая организация: Кафедра фитопатологии Казахского Государственного сельскохозяйственного института

Официальные оппоненты: доктор биологических наук - АаМ. Дубицкий Kai^ugxaT биологических наук - X.X« Макажанова

Защита диссертации состоится " "_1995 г.

в часов на заседании специализированного совета

Д. 53.. 24, 01 при институте микробиояогаи и вирусологам HAH PK

по адресу: 480100, Алматы, ул„ Богенбай батыре, 103.

G диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии и виру соло гаи HAH PK

Автореферат разослан " "_1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

H.A. Айтхожина

ОБ;.ЛЯ хдРАжгастикл РАБОТЫ

Актуальность nrcrizc-Wt Экологический подход к решению комл-лок^ньг: прошлом развития сельского хозяйства требует регламентации применения химических средств защиты растений от вредителей

И болезней. АлкТРПНоташч» -.««п .«•■iiunnuTHim™»«»

уьотнн •»»«ПИМ«»» - «¡СмОЯЬиОвалИИ безопас-

ных для окрутпкгдей среды биологических и других методов борьбы с вредными организмами. С накоплением экспериментальных данных о биологии, вкологии и паразитической активности грибов Vorcicil-liua locanilK Boauvoria Ьаоз1апа } a также ВОЗМОЖНОСТЬЮ массового получения препарати&кых форм на их основе, эта группа микроорганизмов стала представлять собой интерес для направленного применения в биологической борьбе с членистоногими вредитейтуя ( тли, кледк, белокрылкя ) в защищенном грунте« Однако эффективность ниэтинсектипидои а производственных услогиях зачастую недостаточна из-за варьирования признака вирулентности у штамков-продуиентоп.

,Цля повышения рентабельности производства и расширения его пб-ь^ксе требуется использование высоковирукентных штаммов, получаемых путем экспериментальной евгеники, 3 ото?! связи необходимо совершенствовать систем опенки и контроля признака вирулентности а проиесее селетоттонтгого отбора, накопления, хранения и применения биоматврипяя, Ис?ояь?ппс:п'о сзгггестьуклцих методов оценки вирулентности путем прямого подсчета тячвых и погибших ьа се комах послз ин-фипирозания патогенами крайне затруднительно для такого объекта как белокрылка в связи с ее мелкими размерами; высокой репродуктивной способность» и структурой популяции, представленной одновременно всеми стадиями развития от яйца до имаго®

Одним из новых направлен;'й, получивших развитие за рубехжм является разработка и использование экспесс-«отодоп биоопйкки вирулентности микроорганизмов«, В этой связи проводится изнекзшо ленетестируемых in vitro показателей, косвешго характеризующих целевой признак, что позволяет проводить предварительный отбор плюс-вариантов по выявленным маркера».! и лишь окончательна био-оиенку осуществлять традиционными методами»

Цель И|тзддвчи исследований о. Lpnba настоящей работы было выявление морфолого-культуральшх и физиояого-биохииичесгпсг свойств, взаимосвязанных с патогегаюстью грибов V.locanii к

В.Ъааа1ава на беяокрыкке для использования этих характеристик в качестве маркеров при отборе потенциально высоковирулентшх штаммов.

Исходя из поставленной цели определены следующие задачи:

- уточнить спсктр патогенного действия грибов и унифицировать с учетом эпизоотического потенциала и фазо-воэрастной .специфичности штаммов методику опенки вирулентности;

- оценить уровень .ирулэнтности исследуемых штаммов в отношении беяокрилки;

- изучить морфолого-культуральные особенности различающихся по вирулентноста штатов;

- провести качественно-количественную оценку ферментативной активности различающихся по вирулентности штаммов:

- провести биосистекнкй анализ взаимосвязи морфояого-кулъту-ралъвдх и физиолого-биохимических признаков с вирулентностью грибов в отношении оран/керейной белокрыяки.

Научная новизна проверенных исследований представлена совокупностью данных по фенотипнческому.разнообразия и вирулентности 18 штаммов 7.1всап11 и 8 штаммов В.Ьазз1аиа . Впервые показана . возможность использования ряда ыорфояого-кулътуральшх признаков И фИЗИОЯОГО-бИОХИКИЧОС!СИХ свойств ( текстура колоний, скорость прорастания спор, каталазная активность ) а качестве маркеров потенциально шеоновируяентаых штаммов,, В Казахстане исследования в отом плане ракеа не проводились»

Практическая значимость. Предложены доступные критерии, характеризующие потенциально внеоковируяентше штамма, что позволяет существенно сократить время и трудовые затрата в процессе селекционной работа с эктоиопатогенгамк грибами.

Основные положения „^шосимые на защиту;

- совокупность выявленных морфолого-куяътуральных и физиояого-биохшических показателей, характеризующих гетерогенность популяции У.1есап11 и В„Ъавз1апа 5

- признаки, коррелирующие с вирулентностью, в качестве критериев первичного отбора штаммов-продуцентов микоинсектицидов»

Апробация работы» Результаты исследований доложены на Всесоюзной научно-практической конференции "Проблемы овощеводства в защищенном грунте, Самарканд, 1990; I Международной науцно-лракти-

ческой конференции по чгрзргзл* проблемам, ЛЗВИ, Аяматы, 1993; Научной конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов Секция: Защита растений к экология» КазСХИ, Алмл-а, Т0?3; Научной конференции "Актуальна проблемы вирусологии*'» п„ Гря.рдвйскки г 1994«

Структура у объем работа» Диссертация иэложпиа «а

"Дсрг-,- ьишп. , сспора ли'Гсрлтурм, 5 глав, заккоченпя, выводов и сппмга цитированной литературы.

СОДЕВНАШЕ РАБОШ

Во введения раскрыта актуальность проблем, определена основный идеи гтсссртйййй» иекь и конкретны!? ^адачй йссгедояавкйв

кк1<о5;;ор литературу, состоящий чь двух раздело;..- содор-

анализ ¡к$ч;но-«РХшчепко1* чкфорг'гкик по проблеме о ошнкой достигнутого уровня а аср:-пекгнч рязвкткя иссяедовший ко рассыас--•зираймо!^- зопросу»

Т.. СБхЕШ Й 1.2Т0.141 КШЕ&ОШь&

тс^естге обтокто:; мселедо^аки;"! лспольпойч^ись гри-

7Ш11 зарегкетрированше в коллекции лаборатории биотохкоаопы

КяяНИИЯР.

■■ дсЧсузия грибо:; окзь^иЕ! оенг^л:;;

-¡¿.¿ьлс-сигап'юс вредителях тепличках культур; оранжзрвйной бвяокрня-ке ( "гг1а1оиго<1о8 •торагаг102-иа \<ео1гл,)> паутишюм клеще ( Те *гапусЬи» -агЬ1сае К») бахчевой ( АрМв зозоурИ Иот) И ' ъегаХсно ь, } тгях. ^ ¡шд'Остзэ осковьох^о тссг-обхагсга

¡п-; провор^пщ; иселсдовг;;::л1 ксвояьзоваяи 5е«окры/шус

Культивирорчкзге ьтапгезргакйвтв осу^зетвляди поверхности ;ет зяотшх средах (тдаюе суаао-йгар* рзхезрозкай агар Сз^рэ, картофолыю-гйэкозшй агар и др»), поворхиостно-глубинкда и гцу-бингам способами 5» 50 % пквтом сусло при опишальшх для развития грибов уСЕОВИЯХр

Изучаете кукмуры представляли собой моноспоровыз изоляты

соответствующих штаммов. Титры спор определяли в камере Г'оряева. Опенку продуктивности спорообразования осуществляли путем смыва ко1!идий с поверхности 12 сут культуры 10 мл воды со следовыми добавками Тритона Х-100. Продуктивность биомассы при глубинном культивировании определяли стандартным методом. Скорость роста грибов изучали та декс~розном агаре Сабуро. Процент прорастания спор рассчитывали для каждого шталаиа через 6; 10; 12; 18; 24; 2а и 36 часова

3 качестве инфекционного материала при оценке вирулентности штаммов использовали конидиильную суспензию со следовыми добавками Тритона Х-100» Дозирование инфекционной нагрузки на уровне 5 х Ю7 спор/мл осуществляли по методике, описанной В.М. Гораль /1970/. Вирулентность оценивали общепринятыми способами путем прямого подсчета количества живых и погибших особей, а также по модифицированной нами методике биооценки, описанной по ходу изложения результатов исследований в экспериментальной части диссертации,, При изучении эпизоотического потенциала грибов з качестве источника инфекции использовали погибших насекомых с типичными симптомами развития грибов на их наружных покровах, а также опрыскивание кони-диалъной суспензией с титром 1-2 х 10®спор/мл»

Морфо лого -куль тура льше особенности различных штаммов изучали по общепринятым в микробиологических исследованиях методам. При описании характера развития грибов vitro употреблялась терминология, используемая специалистами по энтомопатогенным грибам (Евлахова, 1974; Коваль, IS74),

Ферментативную активность грибов определяли с использованием качественных и количественных методик» разработанных для других микроорганизмов и частично модифицированным с учетом особенностей изучаемых патогенов»

Сравнительную активность каталазы, пероксидазы, супероксиддис-мутазы, полифенолоксидазы, глюкозо-6 фосфатдегидрогеназы, су кии-натдегидрогеназы, фосфатезы и осте разы на различных стадиях онтогенеза иэучаедах грибов осуществляли методом электрофореза в поли-акриламидном геле ( Cole at al„, 1968 J Proedoviah, 1971 ). Экстракцию белков проводили посла сбора микробного материала на нитроиеллювоэшх фильтрах,, Количество белков в пробах определяли по Лоури, используя в качество стандарта бычий сытюроточный альбумин. Условия эяектрофорааа; ковдекграпия бема при »«несении

материала - 10 Мг/мл; напряжение тока - 30 кА; температура 4°С; продолжительность ~ 3 часа» После электрофоретического разделения пластинки с гелем окрашивали в темноте, а идентчфиинровантэ полосы представляли в виде диаграмм.

Наличие нротеолитической, хитиналитичоской н амилолитической активности устанавливали по зонам гидролиза казенна. *и<г'«я» ч

vtüüitjr» акту.йжстъ сг.роделлли титрометрическ.м методом (Войкарская, 1965), каталазнуя - перманганатным методом (Мозель, Зимин, I95S), пероксидазную и полифенолоксидазную - колориметрическим методом (Яловипын, 1977; Карягина, 1986)0

В работе проводилась статистическая обработка эксперкменталь-шх данных методами вариационной статистики и дисперсионного анализа, а также расчет коэффициентов корреляции (Доспехов, 1985)8

2«, ВИРУЛЕНТНОСТЬ РАЗЛИЧН-:Х СГГА'Г.ЛОВ V.LECAHII И B.BASSIAHA в ОТГОШШ БЕЛОКРШЖИ

Вирулентность возбудиталя является ocfow-.'м показателем его патогенности, поэтому одним из существенных элементов исследовательской работы в области патологии и микробиологич насекомых является оценка вирулентности тою или иного микроорганизма, того или иного штамма (Еэлахова, IS74; li/лемисова,• Воронина»1990).

■Определение вирулентности V. leca ,ii и в. Ъаа л lana осу-ийотря».*«« Knttn с псггья шязйшмя штаммовозхз варьирования данного признака в анализируемых попугяштях» Гассма^гривасшй показатегл . ¿убран как основной маркер ( fingor print ) для характеристики и разграничения изучаемых штаммов на близкие и различающиеся группы« •

2-1 CiitiKíp патогенного действия грибов на членистоногих вредителей

Уточнен спектр патогенного действия исследуемых грибов на членистоногих вредителей тепдичшх культура Изучаемые штаммы способны обеспи'амь табель оранжерейной беяокрыяки при заражении конидиями (титр - 5,0 х Ю^спор/мл) на уровне 65-80 %а Смэр~чость паутинного клеща, бахчевой и персиковой тлей в аналогичных условиях эксперимента не превышает 25-30 %„ Белокрылка отобрана в качества основного тест-объекта для дальнейших исследований,,

2.2 Характер патогенного действия грибов на оранжерейную белокрыдшу

Вирулентность эктомопатогеннах грибов эволюционно связана с взаимоотношениями паразит-хозяин, а характер развития микозов на насекомых зависит в свою очередь от ряда факторов внешней среды и патогенности возбудителя ( f err od, ,1У76; Огарков, 1990; Khacha-touriana ,1994).

В этой связи представляло интерес уточнение ряда физиолого-екологических особенностей различающихся по вирулентности штаммов

Фазо-возрастная спепи^ичность штаммов в отношении белокрылки уточнена по степени восприимчивости к инфицированию разных стадий развития насекомого» Установлено, что v.iecanü - ттаммьЛГ j , V -С-3, наиболее активно поражают белокрылку на постэмбриональной стадии, штамма K-I6, v -12-5 более вирулентны на предимагинальной стадии, а штамм TVi -PI2 высоковирулентен га взрослых особях. В вариантах с B.baesiana действие на личинок не имело выраженных штаммошх различий» Особо следует отметить высокую вирулентность птаммог B^j и By в отношении нимф (личинок старшего возраста).

Анализ фазо-возрастной специфичности штаммов позволил уточнить наиболее восприимчивые к инфицированию патогенами стадии развития местной популяции оранжерейной белокрилки и выбрать критическую фазу в онтогенезе этого насекомого-личинки II-III возраста для дальнейшей оценки вирулентности природных изолятов.

Изучение особенностей развития микозов на разных этапах онтогенеза белокрылки показало, что при поражении грибами эмбрионов, личинок и взрослых особей внешние екмптоыы были идентичш и не носили штаммошх различий. Развитие микоза более выражено при повышенной относительной влажности воздуха (95-100 %), тогда как при слабо насыщенной влагой атмосфере (50-80 %) погибшие особи практически не обрастают мииевмем, а просто ссыхаются.

Оценка эпизоотического потенциала грибов in vivo показала, что внесение погибших от инфицирования грибами особей (имаго) в качестве инфекта на листья растения, заселенного белокрылкой, не обеспечивает в течение 1,5 месяцев перезаражения и гибели особей, несмотря на искусственно созданные благоприятные.условия микроклимата (температура 24-26°С, относительная влажность воздуха 95-100 %, фотоперуод - 16 ч ). Из этого следует, что грибы V. 1есч-

nii u в.basalana обладают низким эпизоотическим потенциалом и, по-видимому, недостаточно связаны с белогсрылкой как хозяином эволшионно. Заражение особей происходит только пря индуцированной инокуляции - контакте с инфекционными спорами, иго необходимо учитывать при оценке вирулентности штаммов»

2.3 Эффективность патогенного действия тиЛл-

ииникя «"«^."""ТТ"";; ¿ii.4<WuUaXO№t<t«ur грг'бчг С

трудностями тестирования целевого признака. Существующие методические указания по проведения учетов гибели насскошх и расчетам показателя вирулентности штаммов по только трудоемки, но зачастую не обеспечивают воспроизводства достоверных результатов в серии идентичных опытов (Борисов, 1993).

Оптимизация биооцонки вирулентности грибов in vivo , проведена с учетом спектра патогенное™, эпизоотического потенциала и фйэо-Еозрастшй спеШ'.фи'-пгости штаммов в отношении болоярылкио Для получения сопоставимых данных по вирулентности штаммов предка гается унифицированная методике, включающая разведенке белокрык-кн гл растениях огурца, выращиваемых в вазонах с почвой при контролируемых условиях температура и относительной аяажности воздуха,, Инфицирование особей следует осуществлять путам опрыскивания листьев, заселенных яичинэтши II —III возраста, водной суспензией ь-о!г,(дий грибов с титром 5 х Ю' слор/мл0 Учеты гибели вредителя -проводить на 7 сут под бккзхуяяроы,

ДисперсиониыЯ анализ результатов л ипопеккт? г;:ру-С'1П"пооти и о прелагаемой нага методике показал досторориое отсутствие рдзяя-vt;3 по соответствующим значошши азягах шхашша но «реи опытам при четырехкратной повторности вариантов.

Оценка .штаммов по, признаку вирулентности в отношении гест-объекта показала разяичнуч степей*, патогешости грибов» более вы-pa^eHHj-.s yv, locnnü (10,4-86,9 % табели)« Полученные результата поэволиви ocyqecmtsb ранжирование по HCPqc на близкие и ряэ.тачгв-апгося по соотлетствующим значениям (табя» I) группы,, У гриба тл»-

canii к низковирулентным (10,4-36,5 % табели) охкесекы

6 штаммов: 2574, Rg, Т jq, Н Xj; ерэднэвируленткч

(51,7-58,8 % гибели) - 7 штампов: Tj, 7-с-З, Х?, 2842, VJ4, Is - I; высоковирулэнтш (72,4-86,9 % гибели) - б штаммов: V-I2-5, I S - 6, I В- 5, Vjg, I S -4» У гриба В. bassiana к ннзковирулентным (15,7-24,1 % гибели) отпасены 2 шта?ма: Bjj и

среркенирукентны (42,6-55,4 % гибели) - 4 штамма: В^, В&, Вб, Ву; вдсоковирулентны - 2 штамма: Ъ^ и В^ - 82,3 и 61,4 % гибели, соответственно.

Следует отметить, что уровень вирулентности использован нами как показатель, характеризующий различия штаммов по рассматриваемому признаку в идентичных условиях окспериыснта, а не для количественной характеристики биологической ¡эффективности патогенов, которая зависит также от множества других факторов.

3„ ФЕГО2ИПИЧЕСК0Е РАЗНООБРАЗИЕ И ХАРАКТЕР РАЗВИТИЯ

Вцутривидовой полиморфизм, описанный в-литературе у ряда ентомопатогеншх грибов ( йиаяАааЗсоуа ей а1. , 1561; Кальвиш, 1967; В1с1осЫса , 1593) подтверждает мнение о существовании отих микроорганизмов в виде различающихся по фенотипу рос» Это послу-шло основанием длл изучения фенотипических признаков в качестве потенциальных маркеров вирулентности штаммов.

3„1 Морфолого-куяьтуральше признаки грибов

При культивировании грибов на агаризованшх средах отмечены штаммовые различия по характеру роста и текстуре колоний, У гриба УЛесгшИ можно выделить два основных различающихся между собой "типа колоний - с пушистым ватообразным мицелием и более плотным ватообразно-бархатистьш мицелием. Ряд штаммов образует дерновину, другие отличаются радиальной складчатостью и зональностью колонийе У гриба в.ЬазаХааа выявлено 4 основных типа морфологически различающихся по характеру раэвиткя колоний: с войлочно-бархатистой .поверхность»; пушсто-ватообразшм г-^здуЕШм мицелием; мучнисто-бархатистым, пылевидным типом поверхности и рыхлым ватообразно-паутинистым мицелием»

При микроскопическом изучении различных штаммов 7.1есап11 особое внимание обращалось на строение конидиального аппарата. Конидии - одноклеточные, удлиненной цилиндрической или яйцевидной формы с закругленными концами 3,1-6,5 мкм длиной и 0,8-2,1 мкм шриной; развиваются на конидиеносцах одиночно, однако часто собрата в шаровидные головки, достигающие 10-35 мкм в диаметре и распадающиеся на 5-7 конидий при суспендировании в воде. Конидие-носш недифференцированы, размещаются без определенного порядка, фиалиды тонкие, шиловидные, расположены под острым углом. Репро-

Таблица I

Вирулентность различных штаммов удегацИ и В.Ъазв1апа в откосонки оранжерейной болокрнлки

ламш !

I"

Количество особей, ст»

I Гибель особей.

ТЛосапИ

2574

У1 7-12-5

V гу

У -с-3

7 10 АО

Н2

I В - б

15-5 2

;,:2

7 13

I 3- л

•Г 14 I 5- I

В.ЪаевАапа

_0

3Ю Вт

15 %

В„

Контроль (вода)

50,2 18,3 36,514,1

58,2 13,3 22,9*5,4

73,2 40,6 55,б±4,9

67,1 48,5 72,4*6,3

72,0 17,5 24,4-5,1

75,4 47,8 63,5*6,2

65,6 6,8 10,4*3,3

61,0 31,5 51,7*4,8

66,2 11,8 17,9*3,2

75,7 2Л.4 29,6-4,3

79,0 67 §8 85,9*4,6

77,С 66,9 80,9*3,7

75,0 44,1 58,8*5,8

63,5 48,6 58,3*4,9

64.0 кт С 60 >7 ¿4,0

77,0 56,9 86,9*5,8

54,7 23,9 53,0*6,0

79,5 46,5 58,5*6,1

НСР05=9,б

72,5 оо ^ 49,9*4,4

53,2 27,7 52,1*5,9

5-4,2 23,0 42,6*4,7

65,0 15,8 24,1*3,9

70,0 42,9 61,4*3,7

68,4 56,3 82,3*5,5

65,3 36,1 55,4*4,-

73,2 > 11,5 15,7*3,3-

КСР05=0,9

79,7 5,2 6,5*3,1

к

дуктивные структуры в.Ъаэз1апа представлены двух- или трехзубчатыми вилкообразными фиалидамн, несущими от I до 4 конидиеносцев, отпочковываяп^их короткие стеригмы, вздутые у основания и суживающиеся к вершине» На концах стеригм образуются одноклеточные округлые или овальные конидии, размер которых варьирует в зависимости от ытамшвой принадлежности» Биометрические показатели микроструктур У»1осап11 и В.Ъазв1апа и иллюстративный материал представлены в диссертации.

При глубинном культивировании грибы образуют бластоспоры: латералъко или при фрашентапии мицелия. Существенных штаммовых различий не обнаружено.

За2 Продуктивность -бмомассы и интенсивность споруляиии Сценка продуктивности различгах штаммов по скорости роста колоний на деистрозном агаре Сабуро, выходу биомассы при глубинном, культивировании и титрам конидий и бяаетоспор в соответствующих условиях культивирования позволила выявить штамшвые различия по рассматриваемым показателям* У гриба У.ХесапИ ряд штаммов (Н2в ^х» ) имели более высокую начальнув скорость роста в поверхностной культуре. Штаммовые различия по уровгаз образования конидий и бластоспор не носили явно выракенного характера. Данные по продуктивности биомассы исследуемых втакмов также не имели существенных различий*,

У гриба в.Ъазв1аюа уровень спорообразования различался в большей степени. Штаммы В^ и В^ превосходили штаммы В2 и Взд по соответствующим значениям в 2-4 раза« Отмечены различия и по продуктивности биомассы: шадаг Взд превосходил остальные варианты в 1,5-2 раза.

3.3 Скорость и уровень прорастания конидий и бвастоспор Одним из факторов, связанных с реализацией вирулентности является способность спор патогена к прорастаю® и инфицирования потенциального хозяина«, Исследуемые штаммы различались по скорости и уровнв прорастания конидий и бластоспор. Некоторые штаммы У.1е-сгаи ( 18-4, 1Б - 6, V 13) иВ.Ъавв1ааа (В15 И В^ ) начинали прорастать через 10-12 ч , достигая 25-100 % уровня в течение 24. ч в Прорастание спор у ряда других штаммов ( ''2* ^6* начиналось после 18 ч инкубации и достигало. 95-100 % уровня лила, по истечении 36 ч .

Таким образом, выявненше морфологические особенности и харак-

тер развития различных штаммов in vitro позволяя? Составить представление о фототипическом рззкообрагчи онтомопатогенных грибов и охарактеризовать отдельные штаммы*

•■i, ФЕРМЕНТАТИВНАЯ ЛКМЗНОСТ-. i ВЕБОВ V. ьесашт

И 3. BASSIMA

иЯМмнм при«м««'( СС-ЬпЧНЬ К8ТОГСИП0СТИ мно-

гих кикроорганизмов, является способность к активному синтезу ферментове определяющих OTHOsrereie патогена-к хозяину,,

Изучение знзиматического ко-лчлокса энтомопатогеннкх грибов в связи с вирулентностью начаты сравнительно недавно. В расшфровггэ механизмов вирулентности некоторых видов грибов, инфицирующих насекомых путем прорастания через кутикулу, решающая рель отводится виекяеточнкм гидаяитичеекки фераенгам, прзг——гова-•

ни» возбудителя в '¡'ело хозяина (Павпжин, 1989; 'Cia-cge et г'J, ,1990).

процессе --каих исследований осуществлено выдояокиз ряда белкоя на рваных стадиях р-^звлтил культур T.leconii u B.basoiaaa и <1»оволено нх изучение кзтоялм ояоктрофорейа в поляакр:»га?п!ДНом геге. сияеяепя аггиикэсть; кггтолаэм, пвркеида.эд, сулерокс«*д?стсну-тапм, «олифеиолоксидаян, глюкозо-б-фосфатдегидрогенаэы, сукиина®-дегиррогенапв, фосфатам« и эетеразы, причем на Отдогьшх этапа:-; онтогенеза грибов обнаруживались до восьми язофермвнуних Лорм вемраэы«

R п«п,ш>вив« t? пзнск<мияо приемлемях биохимических

С:3'Т?аНН>;;. ПГТфАНШЮСОД* грибов особое В1ВШ8КПС било гзередохочеио ш» определении качественными и количественными методами гидролитических и окислительно-восстановительных ферментов у исследуемых штаммов»

4,1 ПротеслМ'МЦ'/слсая пктиькость

Для эшшопчуогенннх мккроороишонов практичеекг важным являемся 1,идролитическое белков кутикул» касемдаого протеолчтическими экзоферментами.

Протесяитическая активность характеризующаяся интенсивность» гидролиза (просветления субстрата вокруг инокулюма), продлялась на вторые сутки культивирования и варьировала в количественном выражении как в вариантах с v.lecanii , так и в вариантах с. B.bas-sisaa « Штакмсвые различия по рассматриваемому признаку аиаяизи-

ровали на 3 сут культивирования. В случае с V. lecanii у 9 из 13 исследуемых штаммов зоны лизиса составляли 18,0-21,0 мм в диаметре» Другая часть штаммов ( I S- 4; Is - 5; Is - 6; V ¡3 ) существенно превосходила первую группу по уровню гидролиза субстрата, достигая соответствующих значений - 26,2-26,7 мм в диаметре. В вариантах с B.bassia. л штаммы распределялись на три группы: Bjq; Bjj; Bj>; By - образовывали зоны лизиса субстрата 17,0-18,5 мм в диаметре; В^ и Bg - 20,3-20,7 мм; Bjg и Bgj - 23,2-26,2 мм, соответственно.

4.2 Хитинолитическая активность

Ферменты, гидролизующие хитин как один из основных компонентов кутикулы насекомых,, играют важную роль а механизме проникновения патогена в полость тела потенциального хозяина.

В вариантах с V.Xooaaii у анализируемых штаммов не выявлено явно выраженных различий: II из 13 штаммов вызывали на 3 сутки роста просветление субстрата на уровне 19,2-21,0 мы в диаметре. Выпадающие значения отмечены у штаммовR g - Í7,3±G,74 мм и Is - 4 - 26,5± 1,21 мм. В вариантах с B.feaasiana различия по хитинолитической активности штаммов такие не носили выраженного характера. Вариабельность признака составляла 19,0-21,0 мм.

4.3 Липолитическак активность

Ря начальном этапе патогенеза в момент перфорации интегумен-то насекомого возбудителем происходит гидролитическое расщепление иипидов кутикулы. Агрессивность штаммов о нтомопатогенных грибов, таим образом, зависит от активности акзовипаз.

Результаты наших исследований показали, что рассматриваемый признак существенно варьирует1 у исследуемых грибов от 25,7 до 52,2 мл 0,1 н K0H/I г биомассы, в первом случае и от 38,2 - до 49,6 мл/г - во втором. На основании дисперсионного анализа штаммы V. 1есадИ были разделены на две различающиеся между собой группы ( Нб; Xjj-Д 2) и ( V I4; I S - 4; I S- 5; I S - 6; У13), Остальные 5 штаммов (2574, 18- I, Mg» ^2 м ^В42 ) составляли пограничную группу между полярными значениями. В вариантах с B.baseiena также выделено две достоверно различающиеся группы (%0« ®Н, ^ и ^ ®15» % и В проявляли сред-

ний уровень активности,

4.4 Амилолитическая активность

При развитии in vivo,и культивировании in vitro энтомопатоген-

гае грибы способны расщеплять крахмал и утилизировать продукта гидролиза в качестве источника питанши

Результаты наших исследования по сравнительной опенке ачияо-литичесяой активности различных штаммов V.lecanii u в.Ьазо1апа показали, что данный критерий малопригоден для ранжирования вариантов в пределах выборки. Качэственшй метод оценки, ппименяв-

ú ÍMtuiÍA unOiivpfimoiuaÁ гкэ ЬпНЬНм {vaKnA^inuu шÍQKWÜoí*А иолшгчии»

4.5 Активность катадаз, пероксидаз и п о лифе ноло ксидо з

Реализация патогеном своей агрессивности при прохождении кутикулярного барьера мояет также определяться телексом окислительно-восстановительных ферментов, роль которых остается до последнего времени недостаточно изученной.

Что т касается сопоставимой оценки различных штаммов 7.1е-oaaii и В, basslana по активности катаяазы, пероксидазы, полиленолок^идчяы,то, по всей видимости, она проведена наш апер-Р.ЫОр

В вариантах с B.baasiana показатель активности ютталазу в зависимости от штамма варьировал в пределах от 3,3 до 5,18 ь:л 0,01 н IC.ÍnO^/O.OI г биомассы» Повышенной активностью обладали" штаммы Bjg и Bgj- ( 4,8 -5,2 мл/0,01 г ) достоверно превышает.™ остальные изолятц.

В вариантах с V. lecanii выявлены достоверно различающиеся ие:.:ду собой группы штаммов: Xj, 2574, Н g, с одной стороны, и 2842, Is - б, IS -5. IS _ 4, n npyrcfl сторон«- Ппчч»ш—

«не 5 гстаммов (н 2« ■•■■¿* т ц, I S - I и Xg) характеризовались средни?".! значениями показателя активности катах&зы.

Пероксидазная активность в вариантах с V. lecanii варьировала в зависимости от штамма от 0,33 до 0,67 мкг/0,1 г биотассУ, я в вариантах с В» baggisna _ 0,43-0,87 мкг/0,1 ги

Активность полифенолоксидазы составляла в вариантах с У.Юса:;. 0,27-0,87 мкг/0,1 г биомассы, а в вариантах с в. oasoiana 0,46-1,03 мкг/0,1 г, соответственно.

Таким образом, нами проведено ранжирование исслодуекых штаммов v. lecanii и в. basaiana по уровню активности гидролитических и окислительно-восстановительных ферментов in vitro , что позволило выделить группы по активности иэояятоа, достоверно различаю гдахся в пределах выборки.

5. БИОСИСТЕМШЙ АНАЛИЗ ВЗАЮЮСВЯЗИ МОГЩЮГО-КУЛЫУ-

РАЛЫЫХ И ШИОЛОГО-ШОХИМИЧЕШХ СВОЙСТВ V. ЬЕСАНИ и В.БАБЗКША С ВИРУЛЕНТНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ ОРАНЖЕРЕЙНОЙ БЕЛОКШЛКИ

Сложность объективной оценки вирулентности энтомопатогенных грибов ка оранжерейной белокрылке методами прямого подсчета насекомых обусловила необходимость изыскания доступных критериев» характеризующих в той или иной степени уровень патогенности штаммов. Совокупность полученных нами данных по морфолого-культураль-иым и физиолого-биохимическим свойствам различающихся по вирулентности штаммов и анализ литературы по этому вопросу дают основание вычленить значимые признаки культур, характеризующие потенциально высоковируяентше изоляты?. Отобранные показатели имеют различную степень сопряженности с целевым признаком - вирулентностью и могут быть использованы в качества основшх или вспомогательных критериев дня выявления потенциальных штаммов-продуцентов»

Предварительный отбор вирулентных штаммов из большого числа моноспорозых изолятсв мошю осуществлять по ыорфолого-культураль-ным признакам^ Для высоковируиентных штш.шов V» 1всап11 при развитии на дёкстрозном агаре Сабуро наиболее типичны округлые колонии белого цвета с плотным ватообразно-бархатистым мииелием и продуктивностью конидиального спороношения на 12 сут на уровне 1,0 х 10® спор/сгл2 поверхности культуры® Для высоковируиентных штаммов З.Ьаззхспа при развитии на дёкстрозном агаре Сабуро наиболее типичны округлые колонии белого с желтовато-кремовым от-т-еггком светя с распростертым типом мицелия и мучнисто-бархатистой поверхностью с меловым или пылевидным конидиальным слоем и продуктивностью конидиального спороношения та 12 сут на уровне 1,0x10 спор/см^ поверхности культурыв

Установлено, * 'о слабовирулентные штаммы V. 1есап11 икают более высокую скорость начального роста, чем высоковирулентные, чего ке отмечено у В. Ьааа1япав

Уровень вирулентности штаммов нэ определяется интенсивностью споруляции у V. 1зсап11 , тогда как у в* Ъав^апа высоковиру-лентше птаымы превосходят елабовирулентные по уровню образования конидий и бластоспор в 2,7-4,3 раза«,

Выявлена явно выраженная связь между скоростью прорастания

ti-;

uj

«

4 o

o

iX «

E 3 1"

ri i i

Hß

I r—t ----- — ra

i i Г "п M w

I I I I I' VAS\ i i I i i глЯ

Cfl

fifl

M O

o

B»

S*3

n

"i Ï

не

ев

П

к

вв

S

1 5

13«

на

Firc.I. Взаиг/оснязь ¿ ehoc tîî гидролитических '¡ераентов с

SÍ:w.!Í:Í>I;

¡тлсстьл ■-rer. ••.■?

LH

се м

v.teconU C3-S.êorr/ona 1В-НИЗКОВЯРУЛ0!ШШ0

СВ-средаевирулеятнне ЬБ-ЕНС0КСВ7.рул6ИТЯК0

-le-

se

Г) g

й о к о и о

ГС ф

' о и

1 I

Iй

5*

р.'

во

• V Secanii

РисВзаимосвязь активности окксллтелько-восстаисвительных ферментов с вирулентностью

ШТШ.Х.ОЗ '

Ii- „I- e.ios.siana НВ-низковирулентные СВ-средневнрулентше ЬВ-високовирулентные

спор и вирулентностью. Спорь; высокозирулентшх штампов начинаю? прорастать через 10-12 ч и достигают 95-100 % уровня прорастания в течение суток, тоге*, кап споры низко вирулентных штаммов начинают прорастать после 18 ч инкубации и достигают соответствующего уроскл прорастания лишь по истечении 35 ч 0

В процессе П.".fin™ 11 rvnuf.* я —„toiwiW""™ r.p.;.jiiUK. сни^инмый f zyizz^^.^iv, г*»ц~х¡у; рзз:явиру-

лентшх штаммов, Этот показатель оставлен нами кок know-how и будет использован в качестве одного из критериев при отборе высоковирулентных штаммов экспресс-методом в дальнейшем.

Взаимосвязь вирулентности различных штаммов .. lecanii 31 в. bonsiana в отношении оранжерейной белокрыяки и их протеовитя-ческоЯ активности показана на рис. I а. Сопряженность признаков, установленная методами вариационной статистики и регрессия;-?-го г.нализа, характеризуется высоким-уровнем корреляции ( г = 0,90) ~ у V. lecanii и (г = 0,В6) - у В. baseiana . Зто позволяет суДИГЬ о потенциально высокой вирулентности изолятов по соотас ству.^чим зо,!чм протеолига субстрата in vitro.

Анплиэ полученннх нами данных по хитанолитичзской активности штаммов в связи с их вирулентностью (рис. I б ) показывает, что, г; случае с v. lecanii сопрятепность признаков недостаточно внрлке-на (коэффициент корреляции - 0,56 ), В отношении в. ЪпяяШпа азаимосвязь имеет более выраженный характер (коэффициент корреляции - 0.76U Вмроккй уровень тг-гганоя^тической активности ряда атаммов v.ioc-mU и в. basslane не всегда соответствует шеокш г-ирулснтности отих. штаммов и не может быть использован при вкспреес-оценке как определяющий фактор.

Результаты наших экспериментов (рис. I в ) подтвердили связь рирулентности патогенов с активностью их липаз. Коэффициент корреляции для V. lecanii составил 0,86, а для В. baaaiana 0,82 » Еысоковирулеитные штаммы V.lecanii превышают по уровню липолити-ческой активности ниэковирулентные штаммы в 1,8-2,0 разав Уровень липолитической активности-могкет быть однозначно использован в качестве показателя для выявления потенциально высоковирулентных штадасэе Взаимосвязь активности полифенолоксидаз (рис, 2 а ) и перокси-даз (рис» 2 б ) с вирулентностью не позволяет сделать заключение о роли данных ферментов в реализации агрессивности штаммами» Коэффициент корреляции полифенолоксидаэной активности и вирулентности

Таблица 2

Степень выраженности наиболее характерных признаков у различающихся по вирулентности пггаммов

Шч-пшли | Продуктивность ! Скорость! Активность

шишиы спороношения ! прорас- ? ■■ ......... ..

1.............■ - ' ■> тания !протеазы! липазы !каталазы

! конидии! бвасто-! спор ! ! !

? споры ? ! !_{___

Ус1асад11

н 2 X т

+-

*13 18-4

18-6

В.Ьааз1апа

В10

15 %

+-

+

низковирудентныо штаммы

ваеоковкруяентные штаммы

+ +- + + + +

+- + + + + +

+ +- + . + + +

низковирунентнке штаммы

тсокоыгруявнттв штаммы + + +

+ + +

+ +

+ +

Примечание: + - высокий уровень значений б выборке +- - средний уровень значений в быворке - низкий уровень значений б выборке

- 24 для v.lecanii И 0,004 для В. bassiana ; по пероясидвэКоЯ активности - г = 0,33 и г = 0,37, соответственно,, Дпшзле по каталазкой активности как в озучае с 7. lccs^ii , га;; и с 3. Ъаав1апа (рис» 2 в ) довольно тесно сопркжзкы с вирулентностью штаммов. Коэффициент корреляпии - 0,89 и 0,74, соответствен-

un

характеризующих потенциально высоковируяенпаа штанга cssjjyoí использовать:

- скорость прорастания спор;

- уровень протеолитической активности;

- уровень активности экзолипазы;

- уровень активности каталазы.

В U В 0 Д и

I. Спэнку вирулентности грибов V. iecardi и В. bossiaen следует проводить isa предимагиианькой стадии развития С локрил¡га (личинки II-III возрастов) на веготирующкх растениях огурце, при контролируешх условиях микроклимата пучен опрыскивания листьев, заселенных вредителем, конидиаяьной суспензией с дозированным титром спор. Достоверность результатов боспегагл вирулентности различных штаммов по предлагаемой методике подтвержден* результатам! персионного анализа.

нов S.t-essisns в o"ííoi;sr:;;n бслокрылзга, Гетзрогазгесть грибов по признаку вирулентности позволяет ранжировать соответствующие культуры по группам та сяабовирулвнтше (10,4-36,5 % гкбеяк), средиевируяентные ( 51,7-61,4 % гибели ) и высоковируяентные (72,4-со,3 % гибели * птаммы.

3. Изучено феноткпичэскоа разнообразие и характер развития грибов 1л vitro. Морфолого-кулътураяънне признаки, характерные д?« различающихся по вирулентности штаммов (текстура колоний, продуктивность спороноаенил, скорость прорастания спор), могут быть использованы при первичном отборе потенциально высоковирулентных изолятов.

4. Проведена качественная и количественная опенка активности ряда гидролитических и окислительно-восстановительных ферментов 13 штаммов V. lucanit и 8 штаммов В. bassiaaa . Установлено, i'To соответствующие значения протеолитической, хитинолирической,

липолитической, полифенолоксидазной, пероксидазной и каталазной активностей имеют штакмовые различия и могут быть использованы при анализе взаимосвязи ферментативной активности с их вирулентностью,

5« С использованием био системно го анализа выявлена высокая степень сопряженности вирулентности и ферментативной активности. Наиболее значимые коэффициенты корреляции получены у V.lecanii по протеолиткпаской (г - 0,90 ), липолитической ( г. = 0,86 ) и каталазной активности (г = 0,89 ) ; В вариантах с B.bassiana по протеолитической ( г = 0,86 ) и липолитической ( г= 0,82 ) активности.

6„ Разработанные критерии отбора рекомендуются для экспресс-оценки потенциально Бысоковирулентных штаммов V.lecanii и В. bassiana « Выявленные морфолого-культуральные признаки и физиояого-биохимические свойства могут бать положены в основу экспресс-метода отбора плюс-вариантов при селекционном процессе»

РАБОЩ,ОПУБЛИКОВАНИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

I. Орынбаев С.О., Гештовт Н.Ю., Сулейменова.Ж.Б, Отбор высо-ковирулентшх штаммов Verfcicilliua lecanii Ziam» для борьбы с оранжерейной белокрылкой // Тезисы докладов Всесоюзной научно-практической конференции "Проблемы овощеводства в защищенном грун-тзи„ - Самарканд. - 1990« - С. 69-70.

2в Орынбаев Со0„, Гештовт Н„Ю., Сулейменова Ж.Б. ~ фулент-ность коллекционных штаммов Verticillium leoanii Zinrv u Beau--'oria basolana (Bals) Vuill. в отношеши оранжерейной белокрылая - Сб0 статей научной конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов. - Алматыв - 1993, - С. II5-TI6.

За Гештовт Н„Ю0, Сулеймэнова Ж.Б., Айбасова М.Е. Биологическая эффективность инсекто-акарипидов микробного происхождения а борьбе с вредителями ряда сельскохозяйственных культур // Тези-•J докладов I Международной научно-практической конференции по аграрным проблемам, - А яка ты „ - 1993 - С. 300.

4« Исе!кулов БаА., Айтхокина Н.А., Сулейыенова 10Б., Гештовт Н*Ю„ Ыорфояого-куиьтуралькые признаки токсикогенных стажов гриба Verticillium lecanii ZI ми // Тезисы докладов научной конференции "Актуальные проблемы вирусологии» - пе Гвардейский« - 1994.-С„ I25-Ï26®

5а ÇyK0ib:0iï0Bû ;1ЭБ0, Айтхокина Н,А0 йорыантативная активность

онтомопатогенного гриба Vortlciliiua leeaœil ZtmnB отнопгзшш орпнжерейной белокрндки // Депа в Коз Гос ИШМа - 1994» - a XII»-С. AZ,

6« СулеЯмйнова Н»Б., Айтхожина R.A», Шигавва ;/Д„ Хитииоян--тическля активность и вирулентность энгонопатогеиного гриба Vertlcilliun lacanii Ztc® . // Деп. в Квз Гос ИШ, - 1995в

7. Сулейменова Ж.Б., £игаева М.Х,, Айтхожина Н.А., Гегзтов?

Н.Ю. Электрофоретичоский анаяиз белков энтомопатогеншх грибов Vorticillium leeanii Zlmn u Beauverla bassiana (Bals) Vulll. // Деп. в Каз Гос ШЛИ, - 1995. - в. I. - С» 60.

Сулейменова К.В. " Verticilliua lecanii Zimm sane Beauveria bassiana (Bale) Vuill са«раЭТ$улацтар вирулент-ri-rine / уыттнлыгына / морфологи«-культураяыц взна фиеисяоги«-биохими-мыт? KopcQTKiKTepi арт^иы экспресс-бага беру "

Бул жуыкста энтоиопатогендх V. lecanii язне в« bassiana санрауцула»;тара фенотип турлер! *гэне вирулентт!гх кенЬще кур-йзхлген гылыми тэжрибе ыел1меттер1 калухрхлген»

lorapFH вирулентт! штамдары бхрпвп рет сурыптау белгЬю-pi анщталды яене гылми Heri эделд!« Алынган натнвелердщ дурыс-тыш дисперсиялж* жаядауыен далелденд!» Зэрттелген цаеиеттерд! сан ар^шхы багаяау яэнв вируленттхнтхн регрессявт! таддщуы мен озара баиланнсы агфцтавды.

Аяынган uaniuerrepfli экспресс зд1с1н1ц иег!зх рэ?1нде вк-рулеиттхко биолога"льп; бага беру» салекцкч «ушсын svpriay ке-ахпдз вене ендхрхске шкоинсектицидтер шгауудац цтъ? £?аснет-торгн бе^кязуга паидзлшлуга бояада»

J.B. Souloinenova " Morphological-cultural and physio-l^gical-biocheaical criteria as the base of the rapid nethod of biological evaluation of entoiaopathogenic fungi Verticilli-ua lecanii Zisa and Beauveria bassiana (Bale) Vuill level "

Experimental data on phonotypical diversitys esfcracel -lular ensyiasa and virulence level of entosogenous fungi V,lecaaii and B.bassiana are presented. Criteria for primari selection of the 3train with high virulence level are submitted.

The reliability of the results are proved using disperse analysis and the correlation botwoen qualitive evaluation of presented characteristics and virulence level are supported too.

The results obtained at present work have to be used as exprosa Method for biological evaluation of virulence level during selection studios. This nethed 1з reconaended also for • the control of main characteristics vfhen oycoinsecticidos are manufactured.