Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспресс - методы оценки иммунного статуса крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Экспресс - методы оценки иммунного статуса крупного рогатого скота"

На правах рукописи

БОГОМОЛОВА ОЛЕСЯ АНАТОЛЬЕВНА

ЭКСПРЕСС - МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ИММУННОГО СТАТУСА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 СЕН 2010

Щелково- 2010

004609091

Работа выполнена в Государственном научном учреждений Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Клюкина Валентина Ивановна

доктор биологических наук Гринь Светлана Анатольевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор,

Заслуженный ветеринарный врач РФ, Албулов Алексей Иванович

доктор ветеринарных наук, профессор Мищенко Владимир Александрович

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина».

Защита состоится «24» сентября 2010 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности РАСХН по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, п/о Кашинцево, пос. Биокомбината, ВНИТИБП; e-mail: vnitibp@mail.ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности (ВНИТИБП) РАСХН.

Автореферат разослан "23" августа 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного советг кандидат биологических наук

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы. Одной из аюуальных проблем промышленного ведения животноводства является обеспечение населения страны высококачественными продуктами питания. Молодняк первых месяцев жизни наиболее подвержен риску инфекционных заболеваний из-за нарушения пассивной передачи материнских антител, что является одной из наиболее распространенных форм приобретенного иммунодефицита у молодняка сельскохозяйственных животных (Ю.Н. Федоров,2001).

Интенсификация производства молока оказывает влияние на иммунную систему животных, что выражается в угнетении функций неспецифических и специфических факторов иммунной системы, изменении количественного содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови и других биологических жидкостях организма животных, развитию иммунодефицитов (В.А.Мшценко, 2005; М.А.Сидоров и др., 2006; И.М. Донник, 2006).

Иммунодефицитное состояние способствует развитию маститов, эндометритов, болезней конечностей (В.П. Литвин и соавт., 2002; С.И.Джупина, 2007) и других патологий бактериального и вирусного характера у высокопродуктивных коров (М.И. Гулюкин, 2006; П.Н. Сисягин, 2007; Х.В. Баймишев, 2009).

Нарушение метаболических процессов в организме высокопродуктивных коров часто является причиной дефицита иммуноглобулинов в молозиве, снижения уровня их биосинтеза (D. Levieux, et al., 1999).

Для своевременного контроля состояния иммунитета у коров - матерей, новорожденных телят и иммунологической полноценности молозива необходимо с помощью высокочувствительных тест-систем быстро оценить иммунологический статус и принять адекватные решения.

В настоящее время эксперты ВОЗ рекомендуют применять современные, наиболее информативные методы оценки иммунного статуса животных, которые включают количественное определение иммуноглобулинов в сыворотке крови (В.М Чекишев, 1977; Н.Е. Indyk, 2003).

Благодаря совершенствованию методов иммунологического анализ появилась возможность диагностировать у животных генетически обусловленный и приобретенный иммунодефицита, что позволяет правильно выбрать стратегию иммуннокорригирующей терапии и профилактики (P.M. Хаитов и др., 1998).

Классический метод радиальной иммунодиффузии (РИД) по Манчини (1965) используется в ветеринарной практике для количественного определения иммуноглобулинов основных классов, однако у него есть недостатки: большой расход реагентов, длительность постановки реакции и невозможность определения низких концентраций иммуноглобулинов (J.D. Arthington et al., 2000).

Исследования ряда авторов показали, что перспективным является использование экспресс - методов, таких как иммуноферментный анализ (ИФА) и латекс - агглютинация (РЛА) для количественного определения иммуноглобулинов в сыворотке крови и других биологических жидкостях организма животных и человека (Б.Б. Дзантиев с соавт., 1982; Е.С. Adams, 1985; D.G.White, 1986; M.Oikawa et al., 1986; В.И. Клюкина, 2002; B.M. Murphy et al., 2005; E.B. Борзенко, 2005).

С учетом этого, разработка экспресс - методов для оценки иммунного статуса животных является актуальной задачей для практической ветеринарии.

Цель и задачи исследования. Цель исследований - разработка экспресс -методов для оценки иммунного статуса крупного рогатого скота.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1.Разработать тест-систему на основе «сэндвич» - варианта ИФА для количественного определения иммуноглобулинов класса G в сыворотке крови и молозиве крупного рогатого скота.

2.Разработать тест-систему латекс - агглютинации (РЛА) для количественного определения иммуноглобулина класса G в сыворотке и молозиве крупного рогатого скота.

3.Провести оценку иммунного статуса крупного рогатого скота и иммунологической полноценности молозива с помощью «сэндвич» - варианта ИФАиРЛА.

4.Изучить уровень естественной резистентности коров в зависимости от возраста и продуктивности.

5.Изучить физиологический и иммунный статус телят от высокопродуктивных оров.

Научная новизна исследований. Разработана тест-система на основе гэндаич» - варианта ИФА для количественного определения иммуноглобулина пасса О в сыворотке крови и молозиве крупного рогатого скота.

Впервые получен латекс - препарат на основе аффинноочшценных анти-^О ггател для количественного определения иммуноглобулина класса й в сыворотке эови и молозиве крупного рогатого скота.

Показана высокая чувствительность разработанных тест-систем для экспресс анализа уровня иммуноглобулинов в сравнении с методом РИД.

С помощью разработанных тест-систем изучен иммунный статус крупного эгатого скота и дана характеристика иммунобиологической полноценности олозива коров разного возраста и продуктивности.

Установлена взаимосвязь развития вторичного иммунодефицита у лсокопродукхивных коров от количества лактации.

Определена взаимосвязь физиологического и иммунного статуса телят от ¿сокоудойных коров - матерей, что позволяет прогнозировать использование к для воспроизводства молочного стада.

Практическая значимость работы. Результаты исследований вошли в: Методические рекомендации по оптимизации формирования колострального ммунитета у новорожденных животных», рассмотренные и одобренные 5.10.2009 г. на секции «Патология, фармакология и терапия» Отделения ¡теринарной медицины Россельхозакадемии, протокол № 3; Технологические ¡гламенты на производство: «Набор для количественного определения в .георотке крови и молозиве крупного рогатого скота в «сэндвич» - ИФА»,

«Набор для количественного определения 1§0 в сыворотке крови и молозиве крупного рогатого скота в реакции латекс - агглютинации», утвержденные 12.07.2010 г. директором ВНИТИБП.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Иммуноферментная тест - система на основе «сэндвич» - варианта для количественного определения в сыворотке крови и молозиве крупного рогатого скота.

2. Тест - система на основе латекс - агглютинации для оценки иммунного статуса крупного рогатого скота и иммунологической полноценности молозива.

3. Сравнительная оценка разработанных экспресс - методов и РИД для количественного определения 1§0 в сыворотке крови и молозиве крупного рогатого скота.

4. Результаты изучения естественной резистентности организма коров разного возраста и продуктивности.

5. Результаты изучения физиологического и иммунного статуса телят, полученных от высокопродуктивных коров.

Апробация результатов. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета и Методической комиссии ВНИТИБП 2008-2010 гг., в виде ежегодных отчетов по теме задания Российской НТП 08.06.01.«Разработать новые диагностические системы и комплексные лечебно-профилактические препараты экономически значимых инфекционных болезней животных».

Материалы диссертации доложены на:

-Международной научно-практической конференции Кубанского Аграрного Университета, Краснодар, 4-8 июня 2009 г.;

-Международной научной конференции, посвященной 80-летию Самарской НИВС, Самара, 2009 г.;

- Международной научно - практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щелково, 9-10 декабря 2009 г.

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 1 в рецензируемых изданиях, входящих в Перечень ВАК Министерства образования и науки РФ для публикации материалов кандидатских диссертаций.

Объем и структура диссертации. Диссертация объемом 101 страницы машинописного текста состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка использованных источников и приложения. Список литературы включает 172 источника, в том числе 69 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 13 таблицами, 20 рисунками.

Личный вклад соискателя. Экспериментальные исследования и обобщение результатов по теме диссертации выполнены автором самостоятельно.

Благодарности. Автор выражает благодарность за участие в выполнении отдельных фрагментов диссертации: кандидату ветеринарных наук В.И. Кис (ООО «Ветбиохим»), кандидату ветеринарных наук Т.П. Лобовой (ФГУ ЦНМВЛ, Косино), доктору биологических наук, профессору Е.В. Крапивиной (Брянская ГСХА), кандидату сельскохозяйственных наук, доценту К.Н. Калининой (РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева).

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в 2008-2010 гг. в отделе иммунологии ГНУ ВНИТИБП в соответствии с научно - технической программой фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития ЛК РФ на 2006-2010 гг. по заданию 08.06. «Разработать новые и совершенствовать существующие методы, средства, технику и технологии кспресс-диагностики и профилактики болезней животных, прогнозирования их озникновения и распространения, обеспечивающие сохранение ветеринарного

благополучия, получение продуктов и сырья животного происхождения высокого санитарного качества и охрану окружающей среды».

2.1. Материалы и методы

Экспериментальные исследования проводили в молочно-товарных сельскохозяйственных предприятиях ЗАО «Озеры-Молоко», СГЖ «Зубцовский» Московской области. Хозяйства подбирали с учетом однотипности технологии содержания животных, кормления и продуктивности. Для проведения экспериментов было сформировано две группы животных: I группа -низкоудойные коровы (n=45), II группа - высокопродуктивные коровы (п=45), телята от высокопродуктивных коров (п=10), телята от низкоудойных коров (п=10). Животных отбирали по принципу аналогов, с учетом возраста, продуктивности, однотипности кормления и содержания.

Исследуемый материал. В исследованиях использовали сыворотки крови (п=96) и молозиво коров (п=22), телочек (п=20) из хозяйства СПК «Зубцовский», ЗАО «Озеры-Молоко», ЗАО «МосМедыньагропром» (предоставленные ФГУ ЦНМВЛ) Московской области. Кровь исследовали от низкоудойных и высокоудойных коров - первотелок и коров третьей лактации, пробы молозива первого удоя. Сыворотку крови получали общепринятым методом, сыворотку молозива - створаживанием обезжиренного молозива сычужным ферментом, с последующим отделением казеина центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин.

Компоненты для экспресс-методов.

Выделение IgG из сыворотки крупного рогатого скота.

IgG выделяли ионообменной хроматографией на ДЭАЭ - сефадексе А-50 по методу J.I. Baumstark et al. (1964) в нашей модификации, которая заключалась в выборе ионной силы и pH элюирующего буферного раствора, соотношения сыворотка/ионообменник. IgG выделяли из глобулиновой фракции, которую получали осаждением раствором сульфата аммония 40% насыщения. Чистоту выделенного IgG анализировали методами электрофореза в ПААГ и иммуноэлектрофореза.

Приготовление антисыворотки к IgG крупного рогатого скота. Антисыворотку получали иммунизацией кроликов препаратом IgG по схеме, разработанной в отделе иммунологии ВНИТИБП. Преципитируюшую активность антител определяли методом диффузионной преципитации (РДП) по О. Ouchterlony (1967), специфичность методом иммуноэлектрофореза.

Очистка анти-IgG антител. Антитела к IgG крупного рогатого скота выделяли из кроличьей антисыворотки методом аффинной хроматографии на BrCN-сефарозе 4В («Sigma», USA) с иммобилизованными белками IgG, согласно рекомендациям фирмы изготовителя. С аффинного сорбента анти-IgG антитела элюировали 0,2М HCl-глициновым буфером pH 2,2-2,8, концентрировали до содержания белка 9-10 мг/мл и использовали для синтеза антивидового онъюгата, постановки «сэндвич»-ИФА и приготовления латекс-препарата.

Синтез анти-IgG крупного рогатого скота пероксидазного конъюгата. Ънъюгат готовили меткой аффинноочшценных анти-IgG антител с ферментом ероксидазы хрена (ПХ марка A, RZ=2,8-3,0, «Sigma», USA) перйодатным методом о P. Nakane (1974). Иммунологическую и энзиматическую активность конъюгата пределяли титрованием его в ИФА согласно ТУ 46-21-78-85 «Иммуноглобулины ятивидовые (анти-IgG КРС, анти-IgG свиньи, анти-IgG кролика), меченные ерментом пероксидазой.

1\шуноферментная тест-система на основе «сэндвич» - варианта ИФА.

оличественное определение IgG проводили «сэндвич» - вариантом ИФА по етоду F.Kristensen, D.F.Antczak (1983). Предварительно устанавливали птимальную концентрацию анти - IgG антител для сорбции на микроплаты.

Методика постановки «сэндвич» - варианта ИФА включала: внесение в у'нки микроплаты для ИФА («Costar», Голландия) по 100 мкл ^финноочищенных анти - IgG антител, инкубация 2 ч при 37°С или 18 ч при 'С, удаление избытка антител 3-х кратной промывкой фосфатным буфером с шн-20 и блокировка свободных участков лунок раствором альбумина крупного эгатого скота. После промывки, в лунки вносили исследуемые сыворотки, робы молозива в разведении 1:400 в трех повторностях, инкубировали 2 ч при

37°С, отмывали и вносили анти-IgG крупного рогатого скота пероксидазный конъюгат в рабочем разведении. Результаты «сэндвич» - ИФА учитывали по величине оптической плотности образца при 492 нм (ОП492) на спектрофотометре - ридере «Sigma» (USA). Содержание IgG в исследуемых пробах определяли на калибровочном графике зависимости ОП492 пробы от концентрации IgG в стандартной сыворотке или препарате IgG.

Чувствительность «сэндвич»- ИФА определяли титрованием стандартной сыворотки (препарата IgG) в диапозоне концентраций 0,01 - 20 мг/мл.

Тест-система латекс - агглютинации (PJIA). Постановку реакции латекс-агглютинации проводили по методу I.M. Leach et.al. (1971), Ю.П. Резников (1974). Для приготовления латекс - препарата подбирали концентрацию 3-8% полиакролеинового латекса (диаметр частиц 0,8 микрон, «ДИА-М») и аффинноочищенных анти-IgG антител, времени и условий сенсибилизации. Активность латекс - препарата определяли в PJIA титрованием его со стандартной сывороткой крови крупного рогатого скота. Результаты PJIA учитывали по титру исследуемой пробы, в которой наблюдали четкую агглютинацию в сравнении с разведением стандартной сыворотки, препарата IgG.

Количественное определение иммуноглобулинов классов G, М и А. Количественное определение иммуноглобулинов классов G, М и А в сыворотке крови и молозиве коров проводили методом радиальной иммунодиффузии (РИД) по Манчини (1965). Содержание IgG в сыворотке крови и молозиве коров определяли с помощью «сэндвич» - варианта ИФА и латекс - агглютинации. В реакциях использовали моноспецифические антисыворотки, аффинноочищенные антитела, стандартную сыворотку крови крупного рогатого скота с содержанием IgG - 21,8 мг/мл, IgM - 2,75 мг/мл, IgA - 2,0 мг/мл (Ю.Н. Федоров, 2009), препарат IgG - 20 мг/мл.

Гематологические исследования. Изучение физиологического состояния проводили исследованием крови от коров разного возраста и продуктивности совместно с профессором Е.В. Крапивиной.

Количество лейкоцитов и эритроцитов в крови подсчитывали в камере Горяева, лейкограмму - в мазках, окрашенных по Романовскому - Гимза.

Фагоцитарный показатель (ФП) рассчитывали как процент нейтрофилов, способных к поглощению частиц латекса, фагоцитарный индекс (ФИ) - среднее число частиц латекса, поглощенных одним активным нейтрофилом, абсолютный фагоцитоз крови (АФ, 109/л) - общее количество частиц латекса, поглощаемое нейтрофилами, фагоцитарное число (ФЧ) - среднее количество частиц латекса, приходящееся на один нейтрофил (как активный, так и инертный).

Функционально-метаболическую активность нейтрофилов оценивали по результатам реакции восстановления нитросинего тетразолия. Индекс активации нейтрофилов (ИАН) вычисляли согласно инструкции "Риакомплекс" по использованию НСТ - тест набора.

Поглотительную способность нейтрофилов (ФП, %, ФИ, у.е., АФ, 109/л, ФЧ, у.е.) и активность их оксидазных систем (+НСТ, %, ИАН) оценивали в двух состояниях: базальном - в свежевзятой крови стабилизированной гепарином, и стимулированном - после внесения в пробы крови зимозана, позволяющие оценить адаптационные резервы поглотительной и микробицидной способности нейтрофильных гранулоцитов.

Показатель резерва оксидазной способности нейтрофилов периферической рови (ПР) и коэффициент их метаболической активации (К) рассчитывали по [.А.Пахмутову, М.С.Ульяновой (1984).

Кислородонезависимую микробицидность нейтрофилов периферической рови оценивали по содержанию в них катионных белков по методу .И.Жибинова (1983), рассчитывая средний цитохимический коэффициент ГЦК) по формуле, предложенной Н.А.Макаревичем (1988).

Содержание популяции Т-лимфоцитов (Е-РОЛ %) определяли с помощью закции розеткообразования лимфоцитов с эритроцитами барана, В-лимфоцитов Л-РОЛ,%) - с эритроцитами мыши. Субпопуляции иммунорегуляторных Т-шфоцитов, обладающих преимущественно хелперной (Е-РОЛ^/о) и шрессорной (Е-РОЛх, %) активностью, - в тесте с теофиллином.

Лейко -Т-лимфоцитарный индекс (ЛТИ), позволяющий судить о наличии и степени вторичного иммунодефицита, рассчитывали как отношение абсолютного количества лейкоцитов к абсолютному количеству Т-лимфоцитов.

Физиологический и иммунный статус телят. Физиологический статус изучали у телят от рождения до 18-месячного возраста совместно с кандидатом сельскохозяйственных наук К.Н. Калининой (РГАУ - МСХА им. К.А. Тимирязева). Экстерьер коров изучали методом снятия промеров и вычисления индексов телосложения по рекомендациям Е.Я. Борисенко (1967).

Иммунный статус изучали по содержанию IgG в сыворотки крови телят до и после приема молозива на вторые сутки методом «сэндвич» - ИФА. Воспроизводительную способность телят от высокопродуктивных коров оценивали по возрасту прихода в охоту и плодотворного осеменения.

Степень чистоты иммуноглобулинов и аффинноочищенных антител определяли методом электрофореза в 7,5 % полиакриламидном геле, иммунноэлектрофорезом в 1 % агаровом геле по S. Takase, М. Yoshida (1969).

Определение белка. Общий белок определяли по Лоури и др. (1951) и спектрофотометрически на СФ-46 при длине волны 280 нм.

Статистическая обработка результатов. Математическую обработку результатов проводили с использованием PC Pentium программы Microsoft Excel-2007. Достоверность результатов оценивали с использованием критерия Стьюдента-Фишера по Н.А. Плохинскому (1961).

2.2 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Получение компонентов и разработка тест - систем на основе «сэндвич» - ИФА и латекс - агглютинации.

С целью разработки альтернативных высокочувствительных и экспрессных методов оценки иммунного статуса крупного рогатого скота были получены основные компоненты тест - систем, схема получения которых представлена на рисунке 1.

* Препарат IgG 20 мг/мл

Рис.1. Схема получения компонентов для тест - систем на основе «сэндвич» - варианта ИФА и PJIA.

Выделение IgG из сыворотки крови крупного рогатого скота. Выбор метода очистки IgG является ключевым звеном по получению специфических компонентов экспресс - методов. Преимуществом использования метода хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе А-50, для решения нашей задачи, является способность белков сыворотки крупного рогатого скота, кроме IgG, при низкой ионной силе и соответствующем рН буферного раствора, связываться с сефадексом.

Для выделения IgG мы применили двухэтапный способ, состоящий из получения глобулиновой фракции, трех кратным осаждением раствором сульфата аммония 40 % насыщения, и ионообменной хроматографии, который обеспечивает больший выход IgG. Сравнительный анализ результатов применения

Выделение IgG КРС методом хроматографии на сефадексе ДЭАЭ А-50 з 0,01 М буфере рН 6,8

Приготовление анти-IgG сыворопси иммунизацией кроликов препаратом IgG

элюирующего фосфатного буферного раствора рН 6,7-7,0 показал, что иммунохимически чистый был выделен с 10 г ионообменника, однократной элюцией 0,01М фосфатным буферным раствором рН 6,8.

Анализ чистоты выделенного в ПААГ и иммуноэлектрофорезе показал наличие окрашенной зоны на электрофореграмме и единственной дуги преципитации на иммуноэлектрофореграмме, характерной для После

концентрирования до содержания белка 20 мг/мл иммунохимически чистый крупного рогатого скота был использован для приготовления антисыворотки и в качестве стандартного препарата

Приготовление антисыворотки к Т^С? крупного рогатого скота. Последующие исследования были направлены на получение высокоактивной антисыворотки, пригодной для выделения специфичных анти-^С антител. По схеме, путем 4-кратного введения кроликам препарата с адъювантом, была получена антисыворотка на 50-й день от начала иммунизации с титром преципитирующих антител 1:64-1:128.

Анализ специфичности анти - антисыворотки методом

иммуноэлектрофореза показал наличие единственной дугу преципитации, соответствующей Антисыворотка была использована для очистки анти-^О антител методом аффинной хроматографии.

Очистка анти-^О антител. На следующем этапе решалась задача очистки анти-^О антител методом аффинной хроматографии на иммунносорбенте, приготовленном иммобилизацией ^О крупного рогатого скота на ВгСЫ-сефарозу 4В.

Результаты получения аффинного сорбента показали, сорбция на ВгС№ сефарозу составила 58% от наносимого белка, время инкубации составило 4 ч при 4°С.

Очистку анти-^О антител осуществляли инкубацией 20 мл анти-^О сыворотки с титром преципитирующих антител 1:64-1:128 в течение 2 ч при 20°С. Выход аффинноочшценных анти-^О антител составил 71,5%. После концентрирования до содержания белка 9,3 мг/мл препарат анти-^О антител

¡пользовали для синтеза пероксидазного конъюгата, постановки «сэндвич» - ИФА приготовления латекс - препарата.

Синтез антивидового конъюгата. Иммуноферментный конъюгат был )лучен связыванием аффинноочшценных анти-IgG антител в концентрации Змг/мл с 5 мг окисленной перйодатом пероксидазы хрена RZ=3,0 в течение 2 ч ш 4°С и очисткой комплекса гель - хроматографией на сефадексе G-200 в 0,01 М БР pH 7,4.

Синтезированный пероксидазный конъюгат обладал высокой грментативной активностью и имел соотношение ОП403/ОП280 0,5, что ютветствовало рабочему разведению 1:4000 и величине ОП492 1,350±0,012 o.e. антителами сыворотки крови крупного рогатого скота и низким фоновым ачением ОП492 - 0,07±0,01 o.e. с антителами сыворотки крови кролика, ключение бычьего сывороточного альбумина в 1% концентрации позволило абилизировать и сохранить активность конъюгата в лиофилизированном виде в чение двух лет (срок наблюдения).

Разработка тест - системы на основе «сэндвич» - варианта ИФА для шичественного определения IgG. Разработка тест - системы «сэндвич» -:рианта ИФА включала: определение оптимальной дозы аффинноочшценных [ти-IgG антител, времени и температуры для сорбции компонентов, учет и перпретация результатов ИФА.

Анализ полученных результатов показал, что наиболее эффективно зфинноочищенные антитела иммобилизуются в оптимальной дозе -1,8 мкг/мл ;лка, что соответствовало максимальной интенсивности ИФА (ОП492>1,2 o.e.) да времени экспозиции 2ч при 37°С или 18 ч при 4°С в 0,01 М карбонатном 'фере pH 9,5. Время инкубации стандартной и исследуемых сывороток >ставило 1,5 ч, анти-IgG конъюгата 1 ч при 37°С, учет реакции ИФА - через 30 янут после внесения 50 мкл 4N серной кислоты.

Содержание IgG в сыворотках крови и молозиве крупного рогатого скота феделяли на калибровочном графике зависимости величины ОП492 от шцентрации IgG в стандартной сыворотке или препарате IgG крупного рогатого

скота (рис.2). Для определения в сыворотке крови телят калибровочш график строили по результатам титрования стандартной сыворотки или прелара с содержанием белка 0,01-10 мг/мл.

Рис.2. Калибровочный график стандартной сыворотки крови и препарата крупного рогатого скота.

По оси абсцисс - концентрация мг/мл; по оси ординат - значения ОП492.

Как видно из рисунка 2, кривые титрования стандартных препаратов имели линейный характер в диапазоне концентраций 1-20 мг/мл.

Разработка тест-системы на основе латекс - агглютинации. Простота и возможность получения результатов за 1-2 часа позволяют применять РИА в качестве экспресс-метода для выявления различных антигенов и антител при массовых обследованиях. РЛА основана на специфической агглютинации окрашенного полиакролеинового латекса, сенсибилизированного антителами к крупного рогатого скота, при взаимодействии его с в исследуемых пробах.

Активность латекс-препарата напрямую зависит от степени очистки [тител, для сорбции на латекс и концентрации суспензии латекса, равнительный анализ 3-8 % взвеси полиакролеинового латекса с диаметром ютиц 0,8 микрон показал, что сенсибилизация 5%-ой взвеси латекса зфинноочищенными антикв антителами крупного рогатого скота в тшальной концентрации 4 мг/мл в течение 4 ч при 20°С в 0,1М ФБР рН 7,4, вводило получить латекс-препарат с наибольшей активностью, равной 1:512 и ■вствительностью - 75 мкг/мл.

Исследования латекс - препарата в реакции агглютинации со стандартной короткой крови крупного рогатого скота (положительный контроль) и с латекс препаратом и буфером (отрицательный контроль) показали, что препарат не вал неспецифических результатов и сохранял активность в виде 0,2 % спензии в 0,1 М ФБР рН 7,4, с 0,05 % азидом натрия 6 месяцев (срок .б.иодения).

Для количественного определения в сыворотках крови и молозиве :ров были отработаны условия постановки РЛА: в и - образные лунки пластин :осили испытуемые и стандартную сыворотку в двукратных разведениях на 1М фосфатно-солевом буфере рН 7,4 начиная с 1:16, молозиво - с 1:512 в ъеме 25 мкл, добавляли латекс-препарат в рабочем разведении, инкубировали 5 ч при 37°С и учитывали результаты по наличию аглютинации.

Содержание в исследуемых сыворотках крови и молозиве коров [ределяли по титру в сравнении с разведением стандартного препарата: при титре >1:512 (содержание 1§0>18 мг/мл) - нормальное содержание; при титре<1:128 (содержание <15 мг/мл) - пониженное содержание; при титре < 1:32 (содержание 1§0 < 5 мг/мл) - выраженный дефицит шуноглобулинов.

Молозиво считалось иммунологически полноценным при титре в РЛА не оке 1:2048 (содержание >30 мг/мл).

2.2.2. Сравнительная оценка экспресс - методов и РИД для количественного определения /§(7 крупного рогатого скота.

Одной из проблем сохранности молодняка является обеспечение новорожденных качественным молозивом, которое необходимо для скорейшего становления колострального иммунитета. Количественное определение иммуноглобулинов основных классов (^й, ^М, 1§А) в сыворотке крови и молозиве животных служит информативным тестом для диагностики врожденных и приобретенных иммунодефицитов.

С целью анализа эффективности и практического использования разработанных экспресс - методов и традиционно применяемого для определения иммуноглобулинов метода РИД, в нашу задачу входила их апробация при исследовании 96 сывороток крови и 22 проб молозива коров разного возраста и продуктивности (таблица 1).

Исследование сывороток крови методами «сэндвич» - ИФА, РЛА и РИД показало, что в сыворотке крови низкоудойных коров содержание 1§0 на 14,3% превышало содержание в сыворотках крови высокопродуктивных коров и с увеличением числа лактаций отмечено снижение в среднем на 4,8 % у коров обеих групп.

Установлено снижение на 16,3% содержания в молозиве

высокоудойных коров первотелок в сравнении с коровами третьего отела. Эта тенденция (снижение на 23,1 %) наблюдалась при определении в молозиве низкоудойных коров первого и третьего отелов. Отмечено низкое (на 36,7%) содержание 1§0 в молозиве высокопродуктивных коров - первотелок и на 29,2% коров третьего отела в сравнении с содержанием в молозиве

низкопродуктивных коров - первого и третьего отелов.

Об иммунологической полноценности молозива и пригодности его для выпойки новорожденным телятам свидетельствует содержание (выше

ЗОмг/мл) установленное как у низкоудойных, так и у высокоудойных коров разного отела.

Таблица 1. Содержание в сыворотке крови и молозиве коров

Исследуемый материал Содержание мг/мл (титр)

РИД ИФА РЛА

Сыворотка крови низкоудойных коров-первотелок 22,04±1,20 23,01±1,34 >18(1:2048)

Сыворотка ьфови высокоудойных коров-первотелок 19,22±1,96 18,35±1,37 >18(1:1024)

Сыворотка крови низкоудойных коров третьего отела 21,0411,20 21,95±1,46 >18(1:1024)

Сыворотка крови высокоудойных коров третьего отела 18,36+1,86 17,25+1,21 <15(1:512)

Молозиво первого удоя низкоудойных коров-первотелок 89,40±1,79 94,7511,86 >30(1:8192)

Молозиво первого удоя высокоудойных коров-первотелок 65,40±1,68 66,65+1,71 >30(1:4096)

Молозиво первого удоя низкоудойных коров третьего отела 72,60±1,57 76,45+1,31 >30(1:8192)

Молозиво первого удоя высокоудойных коров третьего отела 56,20±1,54 53,20+1,27 >30(1:2048)

Установлена более высокая чувствительность «сэндвич» - ИФА (2,1 мкг/мл) сравнении с РЛА- (75 мкг/мл). Коррелятивная зависимость (г=0,82 при ¡0,05) между содержанием определенным в «сэндвич»- ИФА и РИД, ;идетельствует о достоверности полученных результатов.

Преимуществом «сэндвич» - ИФА и РЛА является сокращение времени юведения анализа до 2-4 ч против 24 ч - РИД.

Таким образом, результаты анализа сывороток крови и молозива коров «мя методами подтвердили, что «сэндвич» - ИФА и РЛА могут быть яюльзованы в качестве экспресс - методов.

2.2.3, Изучение естественной резистентности организма юокопродуктивных коров. Показатели гемограммы, клеточного и морального звеньев иммунитета являются основньми критериями оценки тественной резистентности и адаптационной способности организма коров в юцессе эксплуатации.

В результате изучения морфологического состава крови, показателе клеточного и гуморального иммунитета коров не было выявлено существеннь различий, за исключением более высокого уровня базофилов в крови первотеле обеих групп.

Повышенная поглотительная способность нейтрофилов, при снижение функциональной активности оксидазных механизмов микробицидности эта клеток, установлена в крови коров обеих групп.

Анализ показателей клеточного звена иммунной системы (таблица 2 показал на пониженный уровень Т-лимфоцитов в крови у животных обеих груп относительно нормативных значений.

Анализ функционирования иммунной системы выявил тенденцию к боле высокому (на 40,53 %) содержанию теофиллинрезистентных Т-лимфоцитов крови у коров третьего отела, по сравнению с первотелками.

Количество теофиллинчувствительных Т-лимфоцитов в крови у первотеле было выше, чем у коров третьего отела, а малодифференцированны теофиллинрезистентных Т-лимфоцитов - на 77,92 % ниже.

Таблица 2. Характеристика клеточного и гуморального звеньев иммунной системы коров

Показатели I группа II группа

Е-РОЛ, % (Т-лимфоциты) 29,63+3,77 26,40±2,82

Е-РОЛ, 10у/л 1,15±0,23 1,00±0,11

Е-РОЛ тр., % 24,60+3,03 34,57±4,42

Е-РОЛ „.,% 6,90+3,04 0,30±0,20

Е-РОЛ гр. малодифференцированные, % 1,87±1,28 8,47±4,83

М-РОЛ, % (В-лимфоциты) 16,00+5,26 9,90±1,68

0-Л, % 52,50±7,46 55,2314,57

ЛГИ 6,71±1,27 6,70±0,72

мг/мл 22,04±1,2 20,22+1,96

мг/мл 1,37+0,08 1,61±0,27

1§А, мг/мл 0,41±0,035 0,44±0,04

Отмечено более высокое содержание В-лимфоцитов в крови первотелок на ,62%, в сравнении с этим показателем у коров третьего отела; лейко-Т-мфоцитарный индекс у первотелок составил 7,88 против 11,10 у коров третьего ;ла.

Анализируя содержание иммуноглобулинов, следует отметить пониженное держание в сыворотках крови коров II группы, при высоком уровне 1§М и актически одинаковом содержании 1§А, в сравнении с содержанием муноглобулинов этих классов в сыворотках коров I группы.

Таким образом, количественные изменения гематологических показателей и снижении показателей клеточного иммунитета, свидетельствуют о наличии 10% высокопродуктивных коров признаков вторичного иммунодефицита.

2.2.4. Результаты изучения физиологического и иммунного статуса тят от высокопродуктивных коров. В настоящее время выбраковка сокопродуктивных коров в молочно-товарных хозяйствах составляет 30-40% и спроизводство численности молочного стада в основном осуществляется за зт рожденных телочек.

В связи с тем, что наличие иммунодефицита у высокопродуктивных коров-терей может отрицательно сказываться на жизнеспособности потомства и цополучении от него, в дальнейшем, генетически обусловленного уровня одуктивности, нами изучен физиологический и иммунный статус телят, жденных от высокоудойных коров, с момента рождения до 18-и месячного зраста, в сравнении с потомством от низкоудойных коров.

По результатам этологических наблюдений, телочки от низкоудойных ров с первого дня жизни отличались большей активностью в сравнении с точками от высокоудойных коров, но к 4-месячному возрасту эти различия велировались.

Изучение физиологического статуса показало, что 98 % телочек I группы евосходили по живой массе при рождении на 4,8% , в возрасте трех месяцев на 4,7% и к шести месяцам показатели живой массы выравнивалась. Телочки группы до 3-х месяцев имели на 4,7% меньший абсолютный и на 4,5%

среднесуточный прирост живой массы, но к 6-и месяцам превосходили телоче) группы.

Анализ экстерьерных промеров показал, что телочки от высокоудойнь коров в три месяца отставали в развитии по высоте в холке на 2,9 %, обхва-пясти на 2,0% и к 6-месячному возрасту, превосходили телочек от низкоудойш коров на 3,2°/о по ширине, на 3,1 % по глубине груди и на 1,2% косой дли туловища.

К 18-месячному возрасту телочки обеих групп имели средню упитанность, характерную для здоровых животных, что позволяло проводить ъ осеменение. Отмечено, что оплодотворяемось телочек от высокопродукгивнь: коров была несколько выше и составила 65,8%, против 64,1% с низкопродуктивных коров.

Формирование пассивного иммунитета изучали по содержанию IgG сыворотках крови телят от высокопродуктивных коров до и после прие\ молозива методом «сэндвич» - ИФА.

В результате проведенных исследований установлено, что до приек молозива уровень IgG в сыворотке крови телят составил 0,043±0,0029 мг/мл, * вторые сутки после приема молозива - 18,9 ±1,4 мг/мл. На успешнс формирование пассивного иммунитета оказало влияние применение телятам первые двое суток молозива с содержанием IgG 50-90 мг/мл.

Таким образом, в результате проведенных исследований были разработаны экспресс - методы количественного определения IgG в «сэндвич» - ИФА и PJIA.

Применение разработанных методов в мониторинговых исследованиях иммунного статуса позволили установить наличие вторичного иммунодефицита у 80% обследованных высокопродуктивных коров, определить взаимосвязь иммунодефицита с возрастом и продуктивностью, определить критерии оценки полноценности молозива и прогнозировать эффективность использования телочек для воспроизводства молочного стада.

4. ВЫВОДЫ

Разработана тест - система «сэндвич» - варианта ИФА на основе {>финноочищенных анти-^О антител для количественного определения в лворотке крови и молозиве крупного рогатого скота. Достоверные результаты ФА были получены при оптимальной концентрации аффинноочищенных анти-ф антител для сенсибилизации планшета 1,8 мкг/мл в 0,01 М карбонатном /фере рН 9,5, времени инкубации - 2 часа при 37°С или 18 часов при 4° С, введении пероксидазного анти-1§0 крупного рогатого скота конъюгата 1:4000, хледуемой сыворотки 1:400. Время инкубации исследуемой сыворотки, олозива составило 2 часа, конъюгата 1 час и учета реакции ИФА через 30 минут эсле внесения стоп - реагента.

Разработана тест - система на основе латекс - агглютинации и тгимизированы условия определения в сыворотке крови крупного рогатого сота, оценки иммунобиологической полноценности молозива. Латекс-препарат, }лученный сенсибилизацией 5% полиакролеинового латекса с диаметром 1стиц 0,8 микрон аффинноочищенными анти- антителами в оптимальной шцентрации 4 мг/мл, сохранял активность в виде 0,2 % суспензии в течение 6 есяцев. Активность латекс-препарата со стандартной сывороткой крови эупного рогатого скота составила 1:512.

Разработанные тест - системы «сэндвич» - ИФА и РЛА были апробированы эи определении 1§0 в сыворотке крови и иммунобиологической полноценности олозива коров, в сравнении с методом РИД. Показано, что чувствительность сэндвич» - ИФА составила 2,1 мкг/мл, РЛА- 75 мкг/мл. Установлена эложительная корреляция (г=0,82; Р<0,05) результатов количественного зределения с помощью «сэндвич» - варианта ИФА и РИД. «Сэндвич» -ФА и РЛА позволяют определять в сыворотке крови в течение 2-4 часа ротив 24 часов методом РИД, что позволяет рекомендовать их в качестве сспресс - методов.

4. С использованием разработанных тест - систем проведена оцен иммунного статуса коров разного возраста и продуктивности. Показано, ч' содержание в сыворотке крови низкоудойных коров различного возраста 1,2-1,4 раза превышало таковые значения у высокопродуктивных коров находилось в зависимости от числа лактаций.

5. Разработанные тест - системы использованы для оцеш иммунобиологической полноценности молозива коров разного возраста продуктивности. Молозиво низкоудойных и высокопродуктивных коров разно] возраста было полноценным для выпойки новорожденным животны] Содержание в молозиве низкоудойных коров первого отела составит 54,75±1,86 мг/мл, третьего отела - 76,45+1,31мг/мл, против содержания сыворотках высокоудойных первотелок - 45,65 ± 1,71 мг/мл и коров третье1 отела - 53,20 ± 1,27 мг/мл.

6. Анализ морфологического состава крови, показателей клеточного гуморального звеньев иммунитета показал наличие у 80 % высокоудойных коре признаков вторичного иммунодефицита. Содержание В-лимфоцитов в кроь первотелок на 61,62 % было выше чем у коров третьего отела; лейко-' лимфоцитарный индекс у первотелок составил 7,88 против 11,10 у коров третье1 отела; содержание ^М, ^А соответственно: 22,04+1,2 мг/мл, 1,37+0,08мг/м. 0,4110,035 мг/мл, против 20,22±1,96 мг/мл, 1,6110,27 мг/мл, 0,4410,04мг/мл.

7. Изучено формирование иммунного статуса телят от высокопродуктивны коров. Установлено, что до приема молозива в сыворотке крови телят урове* 1ёО в ИФА составил 0,043±0,0029 мг/мл, в 2-х суточном возрасте после прием молозива-18,9 ±1,4 мг/мл.

8. Определена взаимосвязь физиологического и иммунного статуса телят продуктивностью коров-матерей. Телята, рожденные от высокопродуктивны коров, до 6 месяцев уступали в среднем на 4% по живой массе, основны промерам тела и индексам телосложения, в сравнении с телятами, полученным от низкоудойных коров. Полученные данные позволяют прогнозироват

фективность использования телочек от высокопродуктивных коров для ^производства молочного стада.

5. Практические предложения

. основании проведенных исследований предлагаются для практики:

«Методические рекомендации по оптимизации формирования пострального иммунитета у новорожденных животных».

Разработаны технологические регламенты на производство:

- «Набор для количественного определения IgG в сыворотке крови и лозиве крупного рогатого скота в «сэндвич» - ИФА»;

- «Набор для количественного определения IgG в сыворотке крови и лозиве крупного рогатого скота в реакции латекс - агглютинации».

Для увеличения срока эксплуатации необходимо проводить мониторинг мунного статуса высокопродуктивных коров.

Для получения ценного ремонтного молодняка необходимо проводить пойку телятам в первые два часа жизни молозива с содержанием IgG не менее мг/мл.

В хозяйствах рекомендуется создать банк иммунологически полноценного лозива с содержанием IgG 50-80 мг/мл.

б.Список работ, опубликованных по теме диссертации

Скрабневская O.A. Влияние продуктивности коров - матерей на рост и развитие их дочерей // Сборник студенческих научных работ. Выпуск 14. -2008. - С. 228-232.

Клкжина В.И. Влияние продуктивности и возраста коров - матерей на иммунный статус и хозяйственно - полезные признаки телят / Клюкина В.И., Скрабневская O.A., Еремец Н.К. // Труды Кубанского государственного

аграрного университета, Серия: Ветеринарные науки. - № 1 (ч,2).- 2009. - С. 185-187.

3. Скрабневская О.А. Иммунный статус коров в зависимости от возраста и продуктивности // Материалы Международной научной конференции, посвященной 80-летию Самарской НИВС РАСХН. - Самара, 2009. - С. 428433.

4. Скрабневская О.А. Возрастная динамика иммунитета телочек от коров с разной продуктивностью / Клюкина В.И. // Материалы Международной научно-практической конференции: «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», посвященной 40-летию ВНИТИБП. - Щелково, 2009.-С.126-128.

5. Федоров Ю.Н. Алгоритмы в диагностике иммунодефицитов животных / Федоров Ю.Н., Клюкина В.И., Скрабневская О.А. (Богомолова О.А.) II Современные проблемы диагностики, лечения и профилактики болезней животных и птиц. Сб. научных трудов ведущих ученых России и Зарубежья, выпуск 3. - Екатеринбург, 2010. - С. 481-483.

Заказ № 259. Объем 1п.л. Тираж 100 экз. Отпечатано в ООО «Петроруш». г.Москва, ул.Палиха 2а.тел.250-92-06 www.postator.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Богомолова, Олеся Анатольевна

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Цель и задачи исследования.

Научная новизна работы.

Практическая значимость.

Положения, выносимые на защиту.

1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Состояние и перспективы развития молочного животноводства в Российской Федерации.

1.2. Факторы, вызывающие изменения иммунной системы крупного.рогатого скота.

1.3. Иммунологический мониторинг иммунодефицитов крупного рогатого' скота.

1.4. Методы количественного определения'иммуноглобулинов крупного рогатого скота.

1.5. Методы и средства коррекции иммунодефицитов' крупного рогатого'скота.

1.6.3аключение по обзору литературы.

2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материалы и методы.

Исследуемый материал.

Компоненты для экспресс - методов.

Иммуноферментная тест-система на основе «сэндвич» - вариантаИФА.

Тест-система латекс-агглютинации (РЛА).

Количественное определение иммуноглобулинов классов G, М и А.

Гематологические исследования.

Физиологический и иммунный статус телят.

Степень чистоты иммуноглобулинов и аффинноочищенных антител.

Определение белка.

Статистическая обработка результатов.

3.РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1.Получение компонентов и разработка тест-системы на основе сэндвич» - варианта ИФА.

3.1.1 .Синтез антивидового конъюгата.

3.1.2.0тработка условий постановки «сэндвич» - варианта

ИФА для количественного определения IgG.

3.1.3 .Результаты количественного определения IgG в сыворотке крови и молозиве крупного рогатого скота методом «сэндвич» - варианта ИФА.

3.2.Разработка тест-системы на основе латекс - агглютинации.

3.3. Количественное определение иммуноглобулинов методом РИД.

3.4.Сравнительная оценка экспресс-методов и РИД для количественного определения IgG.

3.5. Результаты изучения естественной резистентности организма высокопродуктивных коров.

3.6. Изучение клеточного и гуморального иммунитета коров.

3.7.Результаты изучения физиологического и иммунного статуса телят от высокопродуктивных коров.

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

5. ВЫВОДЫ.

6.ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспресс - методы оценки иммунного статуса крупного рогатого скота"

Актуальность темы. Одной из актуальных проблем промышленного ведения животноводства является обеспечение населения страны высококачественными продуктами питания. Молодняк первых месяцев жизни наиболее подвержен риску инфекционных заболеваний из-за нарушения пассивной передачи материнских антител, что является одной из наиболее распространенных форм приобретенного иммунодефицита у молодняка сельскохозяйственных животных (Ю.Н. Федоров,2001).

Интенсификация производства молока оказывает влияние на иммунную систему животных, что выражается в угнетении функций неспецифических и специфических факторов иммунной системы, изменении количественного содержания иммуноглобулиновч в сыворотке крови и других биологических жидкостях организма животных, развитиЬ иммунодефицитов (В.А.Мищенко, 2005; М.А.Сидоров и др., 2006; И.М. Донник, 2006).

Иммунодефицитное состояние способствует развитию маститов, эндометритов, болезней конечностей (В.П. Литвин и соавт., 2002; С.И.Джупина, 2007) и других патологий бактериального и вирусного характера у высокопродуктивных коров (М.И. Гулюкин, 2006; П.Н. Сисягин, 2007; Х.В. Баймишев, 2009).

Нарушение метаболических процессов в организме высокопродуктивных коров часто является причиной дефицита иммуноглобулинов в молозиве, снижения уровня их биосинтеза (D. Levieux, et al., 1999).

Для своевременного контроля состояния иммунитета у коров - матерей, новорожденных телят и иммунологической полноценности молозива необходимо с помощью высокочувствительных тест-систем быстро оценить иммунологический статус и принять адекватные решения.

В настоящее время эксперты ВОЗ рекомендуют применять современные, наиболее информативные методы оценки иммунного статуса животных, которые включают количественное определение иммуноглобулинов в сыворотке крови (В:М Чекишев, 1977; Н.Е. Indyk, 2003).

Благодаря совершенствованию методов иммунологического анализа появилась* возможность диагностировать у животных генетически обусловленный и приобретенный иммунодефициты, что* позволяет правильно выбрать стратегию иммунокорригирующей терапии? и профилактики' (P.M. Хаитов и др., 1998).

Классический метод радиальной иммунодиффузии (РИД) по Манчини (1965) используется в ветеринарной практике для количественного «определения* иммуноглобулинов основных классов, однако у него есть недостатки: большой расход реагентов, длительность постановки реакции и невозможность определения низких концентраций иммуноглобулинов (J.D. Arthington et al., 2000). >■

Исследования ряда, авторов показали, что- перспективным является использование экспресс - методов, таких как иммуноферментный анализ (ИФА) и латекс - агглютинация (PJIA) для количественного1 определения иммуноглобулинов в сыворотке крови и других биологических жидкостях организма животных и человека (Б.Б. Дзантиев с соавт., 1982; Е.С. Adams, 1985; D.G.White, 1986; M.Oikawa et al., 1986; В.И. Клюкина, 2002; B.M. Murphy et al., 2005; E.B. Борзенко, 2005).

С учетом этого, разработка экспресс - методов для оценки иммунного статуса животных является актуальной задачей для практической ветеринарии.

Цель и задачи исследования

Цель исследований - разработка экспресс — методов для оценки иммунного статуса крупного рогатого скота.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1 .Разработать тест-систему на основе «сэндвич» — варианта ИФА для количественного определения* иммуноглобулинов класса G в сыворотке крови и молозиве крупного рогатого скота.

2.Разработать тест-систему латекс - агглютинации (PJIA) для количественного определения иммуноглобулина класса G в сыворотке и молозиве крупного рогатого скота.

3 .Провести- оценку иммунного статуса крупного рогатого скота и иммунологической полноценности молозива с помощью «сэндвич» — варианта ИФА и РЛА.

4.Изучить уровень естественной резистентности коров в зависимости от возраста и продуктивности.

5.Изучить физиологический и иммунный статус телят от высокопродуктивных коров.

Научная новизна исследований

Разработана тест-система на основе «сэндвич» — варианта^ ИФА для количественного определения иммуноглобулина класса G в сыворотке крови и молозиве крупного рогатого скота.

Впервые получен латекс - препарат на основе аффинноочищенных анти-IgG антител для количественного определения иммуноглобулина класса G в сыворотке крови и молозиве крупного рогатого скота.

Показана высокая чувствительность разработанных тест-систем для экспресс - анализа уровня иммуноглобулинов в сравнении с методом РИД.

С помощью разработанных тест-систем изучен иммунный статус крупного рогатого скота и дана характеристика иммунобиологической полноценности молозива коров разного возраста и продуктивности.

Установлена взаимосвязь развития вторичного иммунодефицита у высокопродуктивных коров от количества лактаций.

Определена взаимосвязь физиологического и иммунного статуса телят от высокоудойных коров - матерей, что позволяет прогнозировать использование их для воспроизводства молочного стада.

Практическая значимость

Результаты исследований вошли в: «Методические1 рекомендации по оптимизации формирования колострального иммунитета1 у новорожденных животных», рассмотренные и одобренные 16.10.2009 г. на секции «Патология, фармакология и терапия» Отделения^ ветеринарной- медицины Россельхозакадемии, протокол № 3; Технологический регламент на производство «Набор для количественного определения IgG в сыворотке крови и молозиве крупного рогатого» скота в «сэндвич» - ИФА»; Технологический регламент на производство «Набор для- количественного определения IgG в сыворотке крови и молозиве крупного рогатого скота в реакции латекс -агглютинации», утвержденные 12.07.2010 г директором ВНИТИБП.

Положения, выносимые на защиту

1.Иммуноферментная тест - система на основе «сэндвич» - варианта для количественного определения IgG в сыворотке крови и молозиве крупного рогатого скота.

2.Тест — система на основе латекс - агглютинации для оценки иммунного статуса крупного рогатого скота и иммунологической полноценности молозива.

3.Сравнительная оценка разработанных экспресс - методов и РИД для количественного определения IgG в сыворотке крови и молозиве крупного рогатого скота.

4.Результаты изучения естественной резистентности организма коров разного возраста и продуктивности.

5.Результаты изучения физиологического и иммунного статуса телят, полученных от высокопродуктивных коров.

1.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Состояние ^перспективы развития молочного животноводства в

Российской,Федерации

Выполнение стратегической задачи повышения эффективности агропромышленного производства возможно при устойчивом ветеринарном благополучии и получении экологически безопасной, высококачественной продукции животноводства. Главной целью развития молочной отрасли является повышение производства молока высокого качества, за- счет эффективного ведения хозяйства, включая племенную работу [80,81].

На современном этапе скотоводство является превалирующей отраслью животноводства. Это обусловлено социальными факторами, крупный рогатый скот дает более 90 % молока и около 50% мяса - главных продуктов питания человека, а также поставляет сырье для кожевенной, легкой, парфюмерной и фармацевтическойпромышленности.

Основная ценность .молочного скотоводства заключается в том, что коровы способны давать продукты для питания человека в течение длительного периода - пяти - десяти лет. Коровы, поедая в больших объемах грубые корма, способны синтезировать животный белок из небелковых соединений, снабжают человека значительным количеством питательных веществ, при этом организм коровы является хорошим фильтром (коэффициент снижения токсинов составляет примерно 100%), препятствующим проникновению различных токсинов в молоко [100].

Основными причинами снижения поголовья молочного стада и выбытие животных до достижения репродуктивного возраста являются интенсификация их эксплуатации, а также болезни вирусной, бактериальной и другой этиологии. Перечисленные факторы ослабляют генофонд вида и наносят большой экономический ущерб молочному животноводству. В связи с этим улучшение условий содержания животных и своевременная профилактика инфекционных заболеваний является одной из задач-практической ветеринарии [12,61].

В Российской Федерации, начиная с 1990 года; численность крупного рогатого скота сократилась в 2,1 раза, в том числе коров; — в 1,6 раза, что явилось основной причиной падения на 60 % (в 1,67 раза) производства <молока с 55,7 млн. т. до 33,4 млн. тонн.

В настоящее время потребность населения России в молоке и молочных продуктах удовлетворяется на 86% за счет собственного производства, на долю импорта молока приходится-16;5%, масла - 32%, сыров — 46%, что показывает зависимость России от импорта [100].

Оценивая состояние отечественного животноводства (табл. 1) за 2005-2009 г.г., следует констатировать- о значительных негативных количественных и качественных изменениях, охвативших основные процессы воспроизводства и племенного дела [58].

Таблица 1. Динамика развития животноводства в РФ

Показатели 2005 г 2006 г 2007 г 2008 г 2009 г

Численность КРС, тыс. голов 21625 21561,6 21546 21043,7 20724,3

В том числе коров, тыс. голов 9522,2 9359,7 9320,2 9128,5 9022,3

Валовое производство молока, тыс.т 31069,9 31339,1 31988,4 32362,6 32592,1

Удой молока на одну корову, кг 3280 3564 3758 3892 4422

Получено телят на 100 коров, голов 76 78 78 77 77

Производство молока на душу населения, кг 217 220 225 228 230

Потребление молока на душу населения, кг 235 239 242 243 245 Официальный интернет - портал Минестерства сельского хозяйства Российской Федерации: сайт.- http://www.mcx.ru/navigation/docfeeder/show/145.htm

Согласно представленным в таблице данным, численность коров снизилась, но возросло валовое производство молока за счет увеличения среднегодового удоя на одну корову. За 2009 г. хозяйства недобрали 10-15% телят (на 100 коров получено 77 телят), а это 400-600 тыс. голов продуктивных, коров в будущем [82,112].

Одной из острых проблем отечественного животноводства является выращивание ремонтных телочек, так как средний возраст при первом осеменении составляет 22-23месяца при средней живой массе при случке 340350 кг, что меньше оптимальных зоотехнических норм на 4-5 месяца и 30-50 кг. В этом случае хозяйства недополучают минимум 700 кг молока на одну корову-первотелку [142].

Наблюдаемые поздние сроки первого отела (31 месяц против 27 месяцев) приводят к недополучению телят, что нарушает структуру молочного стада [32,100]. Анализ производства молока в мире (рис. 1) показывает, что за 2005 -2009 годы прирост составил 18,5 % [45].

Рис. 1. Динамика производства молока в мире (млн. тонн)

Для ликвидации неблагополучного положения, сложившегося в отечественной отрасли молочного животноводства, в РФ принята Программа развития сельского хозяйства на 2008 - 2012 годы, основной целью которой является ускоренное развитие молочной отрасли, за счет увеличения среднегодового роста сельскохозяйственной продукции на 4 %.

В 2009 году в России производство молока составило 32 млн. т. и к 2012-м планируется его увеличение до 37 млн. т., с годовым надоем от одной коровы не менее 4,5 тыс. кг [58].

В мировой практике молочного скотоводства выделяют четыре основные группы: черно-пестрый скот (разводят во всех странах Европы, Северной и Центральной Америки, Австралии, Японии и России); скот красной масти (страны Прибалтики, Белоруссия, Россия, Украина, Молдова); черно-пестрая и голштинская породы [5]. В современной России наиболее распространены породы молочного скота со среднем удоем 3500-5000 кг (рис.2).

Рис.2. А- Холмогорская (ср. годовой удой 3500-5000 кг, жирность молока 3,7-3,8%); В - Черно-пестрая (ср. годовой удой 4000-4500 кг, жирность молока 3,6-3,7 %); С - Ярославская (ср. годовой удой 3500-4000 кг, жирность молока 4,0-4,2%); D - Красно-пестрая (сргодовой удой 4400 - 5500 кг, жирность молока 3,61%); Е - Голштинская (ср. годовой удой 8000 - 10 000 кг, жирность молока 3,6-4,0%)

Для совершенствования пород и племенной «реконструкции» молочного стада с 2007 года в РФ завозят чистопородный голштинский скот, так в Самарскую область завезено 126 тыс. молочных голштинов из Голландии, Германии и Канады. Компания «Росагролизинг» с 2009 по 2012 гг. должна ежегодно поставлять по 30 тыс. голов [19,57,88,89,123,143,145]. Выбор Российских аграриев в пользу голштинской породы объясняется ее высокой продуктивностью: при правильных условиях содержания и кормления средний надой на корову составляет 8 тыс. кг в год. [1,29,46,48,53].

В рамках сотрудничества Департамента продресурсов Москвы и Министерства сельского и лесного хозяйства Земли Бавария (Германия) создан агрохолдинг «МосМедыньагропром», на животноводческие фермы которого были завезены племенные коровы голштино-фризской и симментальской пород, с конкретной целью - наладить выпуск молочных продуктов для москвичей. В январе 2009 года в Московских школах, а в феврале — в школах города Медыни Калужской области, где расположено предприятие, появилось фирменное, обогащенное витаминами и минералами питьевое молоко под маркой «Большая перемена» [144].

Анализируя состояние молочного скотоводства в РФ на современном этапе, важно отметить, что усилия ветеринарных специалистов должны быть направлены на сохранение отечественных пород высокопродуктивного молочного скота за счет применения сбалансированных кормов, своевременной диагностики и профилактики инфекционных заболеваний и проведения мероприятий по изучению иммунного статуса поголовья.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Богомолова, Олеся Анатольевна

5. ВЫВОДЫ

1. Разработана тест - система «сэндвич» - варианта ИФА' на основе аффинноочищенных анти-IgG антител для количественного определения IgG в сыворотке крови и молозиве крупного рогатого скота. Достоверные результаты ИФА были получены при оптимальной концентрации аффинноочищенных анти-IgG антител для сенсибилизации планшета 1,8 мкг/мл в 0,01 М карбонатном буфере рН 9,5, времени инкубации - 2 часа при 37°С или 18 часов при 4° С, разведении пероксидазного анти-IgG крупного рогатого скота конъюгата 1:4000, исследуемой сыворотки 1:400. Время инкубации исследуемой сыворотки, молозива составило 2 часа, конъюгата 1 час и учета реакции ИФА через 30 минут после внесения стоп - реагента.

2. Разработана тест - система на основе латекс - агглютинации и оптимизированы условия определения IgG в сыворотке крови крупного рогатого скота, оценки иммунобиологической полноценности молозива. Латекс-препарат, полученный сенсибилизацией 5% полиакролеинового латекса с диаметром частиц 0,8 микрон аффинноочищенными анти- IgG антителами в оптимальной концентрации 4 мг/мл, сохранял активность в виде 0,2 % суспензии в течение 6 месяцев. Активность латекс-препарата со стандартной сывороткой крови крупного рогатого скота составила 1:512.

3. Разработанные тест - системы «сэндвич» - ИФА и РЛА были апробированы при определении IgG в сыворотке крови и иммунобиологической полноценности молозива коров, в сравнении с методом

РИД. Показано, что чувствительность «сэндвич» - ИФА составила 2,1 мкг/мл, PJIA- 75 мкг/мл. Установлена положительная корреляция (г=0,82; Р<0,05) результатов количественного определения IgG с помощью «сэндвич» - варианта ИФА и РИД. «Сэндвич» - ИФА и PJIA позволяют определять IgG в сыворотке крови в течение 2'-4 часа против 24 часов методом* РИД,, что позволяет рекомендовать их в качестве экспресс - методов.

4. С использованием разработанных тест - систем проведена оценка иммунного статуса коров разного возраста и продуктивности. Показано, что содержание IgG в сыворотке крови низкоудойных коров различного возраста в 1,2-1,4 раза превышало таковые значения у высокопродуктивных коров и находилось в зависимости от числа лактаций.

5. Разработанные тест — системы использованы для оценки иммунобиологической полноценности молозива коров разного возраста и продуктивности. Молозиво низкоудойных и высокопродуктивных коров разного возраста было полноценным для выпойки новорожденным животным: Содержание IgG в молозиве низкоудойных коров первого отела составило 54,75±1,86 мг/мл, третьего отела - 76,45± 1,31 мг/мл, против содержания IgG в сыворотках высокоудойных первотелок - 45,65 ±1,71 мг/мл и коров третьего отела - 53,20 ± 1,27 мг/мл.

6. Анализ морфологического состава крови, показателей клеточного и гуморального звеньев иммунитета показал наличие у 80 % высокоудойных коров признаков вторичного иммунодефицита. Содержание В-лимфоцитов в крови первотелок на 61,62 % было выше чем у коров третьего отела; лейко-Т-лимфоцитарный индекс у первотелок составил 7,88 против 11,10 у коров третьего отела; содержание IgG, IgM, IgA соответственно: 22,04±1,2 мг/мл, 1,37±0,08мг/мл, 0,41±0,035 мг/мл, против 20,22±1,96 мг/мл, 1,61+0,27 мг/мл, 0,44+0,04мг/мл.

7. Изучено формирование иммунного статуса телят от высокопродуктивных коров. Установлено, что до приема молозива в сыворотке крови телят уровень 1 i 1 1

IgG в ИФА составил 0,043±0,0029 мг/мл, в 2-х суточном возрасте после приема молозива - 18,9 ±1,4 мг/мл.

8. Определена взаимосвязь физиологического и иммунного статуса телят с продуктивностью коров-матерей. Телята, рожденные от высокопродуктивных коров, до 6 месяцев уступали в среднем на 4% по живой массе, основным промерам тела и индексам телосложения, в сравнении с телятами, полученными от низкоудойных коров. Полученные данные позволяют прогнозировать эффективность использования телочек от высокопродуктивных коров для воспроизводства молочного стада.

6. Практические предложения

На основании проведенных исследований предлагаются для практики:

1. «Методические рекомендации по оптимизации формирования колострального иммунитета у новорожденных животных».

2. Разработаны технологические регламенты на производство:

- «Набор для количественного определения IgG в сыворотке крови и молозиве крупного рогатого скота в «сэндвич» - ИФА»;

- «Набор для количественного определения IgG в сыворотке крови и молозиве крупного рогатого скота в реакции латекс - агглютинации».

3. Для увеличения срока эксплуатации необходимо проводить мониторинг иммунного,статуса высокопродуктивных коров.

4. Для получения ценного ремонтного молодняка необходимо проводить выпойку телятам в первые два часа жизни молозива с содержанием IgG не менее 30 мг/мл.

5. В хозяйствах рекомендуется создать банк иммунологически полноценного S молозива с содержанием IgG 50-80 мг/мл. I

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Богомолова, Олеся Анатольевна, Щёлково

1. Агенство АгроФакт. Росагролизинг осуществил новые поставки элитного КРС // РацВетИнформ.- №8 (96).- 2009.- С. 5.

2. Албулов А.И., Самуйленко А.Я. и др. Хитозан как средство лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний молодняка с.-х. животных // Сб. ст. Межд. научно-практ. конф. «Современные вопросы патологии с.-х. животных», Минск, 2003. С.310-311.

3. Андреева А.В., Николаева M.JL, Мюристая M.JI. Иммунодефициты при недостатке меди и цинка и методы их коррекции. Уфа. 2009.

4. Баймишев Х.Б. Незаразная патология у крупного рогатого скота в зависимости от инфицированности вирусом лейкоза // Сб. ст. Международной конф., Самара, 2009. С.26-30.

5. Барабаш А.Ф., Хлевная Г.А. Практические советы по содержанию крупного рогатого скота // М.: ООО Издательство ACT, 2002. 142 с.

6. Бодрова О.С. Оценка и коррекция иммунного статуса коров с высоким уровнем молочной продуктивности // Сб. научных трудов ведущих ученых России и Зарубежья, Екатеринбург, 2010. С. 439-442.

7. Бобиев Г.М. Иммуностимулирующие препараты при бронхопневмонии телят // Ветеринария. 2000. - №10. - С.41 - 43.

8. Борзенко Е. В. Количественная характеристика иммуноглобулинов в биологических жидкостях крупного рогатого скота методами иммунохимического анализа // Дисс. канд. вет. наук. Москва, 2005. 109 с.

9. Борисенко Е.Я. Разведение сельскохозяйственных животных // М.: Колос, 1967. 264 с.

10. Боровик Р.В. Специфические свойства и функции иммуноглобулинов при некоторых вирусных и хламидийных инфекциях // Автореф. дисс.докт. вет.наук.-М., 1978,-30 с.

11. Бояринцев JI.E. Иммуномодулирующая активность лигавирина при гипотрофии телят // Ветеринария. 2002. - №9. - С.41 - 44.

12. Бузлама B.C. Адаптационная стратегия защиты здоровья высокопродуктивных молочных коров // Современная ветеринарная защита коров высокопродуктивных пород: Сб. ст. Первой научно-практической конф., Воронеж, 2005. С. 57-59.

13. Верещак Н.А., Шкуратова И.А. Воздействие экотоксикантов на иммунную систему животных // Сб. ст. Международной конф., Самара, 2009. С. 47-50.

14. Воронин Е.С., Денисенко В.Н., Печникова Г.Н., Смоленская-Суворова О.О. и др. Влияние Т-активина на иммунологический статус телят // Ветеринария.- 1989.- №5.- С. 51-53.

15. Галактионов В.Г. Иммунология // Учебник. М.: РИЦ МДК. 2000. -487с.

16. Герберт У. Дж. Ветеринарная иммунология // М.: «Колос», 1974. 311 с.

17. Голиков А.Н., Фомина В.Д. Физиология иммунной системы // Лекция. М.: Моск. гос. акад. вет. мед. и биотехнолог, им. К.И. Скрябина. 1995. -25 с.

18. Грачев Н.И., Попов С.М., Скопичев В.Г. Цитофизиология секреции молока. Л.: Наука, 1976

19. Гулюкин М.Й., Барабанов И.И., Иванова Л.А., Грек К.П. Профилактика и меры борьбы с лейкозом в высокопродуктивных и племенных хозяйствах // Сб. ст. Первой научно-практической конф., Воронеж, 2005. С. 19-20.

20. Гулюкин М.И: Лейкоз крупного рогатого скота: профилактика и меры борьбы // Ветинформ. 2002. - №3. - С. 6-7.

21. Деева А.В., Мехдиханов Г.Г., Соколов В.Д., Белоусова Р.В. Применение иммуномодуляторов продуктивным животным // Ветеринария. 2008. - №6. - С. 8- 13.

22. Джупина С.И. Кризис ветеринарии // Москва, 2007. 103 с.

23. Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М., Позняк М.В., Егоров Е.А., Мокеева Р.А., Журавлев B.C. Иммуноферментный анализ. Колличественное определение иммуноглобулина G в сыворотке крови человека // Проблемы гематологии и переливания крови. 1982. - №1. - С. 50-53.

24. Донник И.М., Бодрова О.С., Зависимость иммуногематологических показателей коров с разной продуктивностью от сезонов года // Ветеринария Кубани. 2009.-№1.-С. 10-13.

25. Донник И.М., Шкуратова И.А., Верещак Н.А., Шушарин А.Д. Применение сорбентов крупному рогатому скоту -при техногенном загрязнении // Ветеринария.- 2007. №9.- С. 5-9.

26. Дунин И.М., Никулин Н.С., Высоцкая В.М. и др. Племенная работа с холмогорской породой // п. Лесные поляны: ФГНУ ВНИИплем, 2007. 68 с.

27. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа // М.: Высшая школа. 1991. - 288 с.

28. Жибинов В.И. Применение лизосомально-катионного теста // Ветеринария. 1983. - № 8.- С. 30-31.

29. Злобин С. Качество молозива и сохранность телят // Животноводство России. 2008. - Март. - С. 57-58.

30. Иммуноглобулины антивидовые (анти-IgG КРС, анти-IgG свиньи, анти-IgG кролика), меченные ферментом пероксидазой. ТУ 46-21-78-85.

31. Каврук Л.С. Сохранность новорожденных телят: проблему можно успешно решать // Веткорм.-2006.-№4.-С. 18-20.

32. Калашников А.П. и др. Нормы и рационы кормления с.-х. животных//Справочное пособие. Москва. -2003.- 456 с.

33. Карпуть И.М. Гематологический атлас сельскохозяйственных животных.-Мн.: Ураджай, 1986.- 183 с.

34. Клос Ю.С. О происхождении белков молока у крупного рогатого скота // Всесоюз. сем. по физиологии и биохимии лактации: Тез. докл. — М.: 1990

35. Клюкина В.И. Промышленные технологии производства тест-систем для диагностики инфекционных болезней свиней: Автореф. дисс. доктора биол. наук. Щелково, 2002. - 50 с.

36. Кондрахин И.П. Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочное издание // М.: КолосС, 2004. 520 с.

37. Конопаткин А. А. Эпизоотология и инфекционные болезни сельскохозяйственных животных М.: Колос, 1984.

38. Крыжановская Е.В. Биологически активные вещества в ветеринарии // Автореф. дисс. доктора биол. наук. Щелково, 2008. - 44 с.

39. Кузнецов П.А., Албулов А.И., Клюкина В.И., Гринь С.А. Изучение иммуномодулирующих свойств сукцината хитозана // Веткорм. 2007. - С. 1213.

40. Купер Э. Сравнительная иммунология М.: Мир, 1980. - 422 с.

41. Лабинов В. Электронный ресурс. // Текущая ситуация в молочной отрасли мира и Российской Федерации: сайт. http://www.dairvnews.ru/news/detail.php7IBLOCK ID=l&SECTION ID=2&ELEM ENT ID=29916

42. Лебедько Е.Я., Никифорова Л.Н., Мазепкин А.А., Новикова Т.Г. и др. Совершенствование красно-пестрой породы крупного рогатого скота на Брянщине //Зоотехния. 2005. - № 9. - С. 2-3.

43. Лютинский С.И., Патологическая физиология сельскохозяйственных животных М.: Колос, 2001.

44. Мадисон В. Селекция отечественного скота: мифы и реальность // Животноводство России. 2009. - Октябрь. - С. 4-5.

45. Макаревич Н.А. Лизосомально-катионный тест для оценки уровня резистентности организма крупного рогатого скота // Ветеринария.- 1988.- № 5.-С.26-28.

46. Манько В.М., Петров Р.В., Хаитов P.M. Иммуномодуляция: история, тенденция развития, современное состояние и перспективы // Иммунология. -2002. Т. 23. - № 23. - С. 132-138.

47. Мищенко В.А., Кононов А.В., Мищенко А.В., Думова В.В., Никешина Т.Б., Павлов Д.К. Влияние физиологического и иммунобиологического статуса крупного рогатого скота на уровень поствакцинального иммунитета // Ветеринария Кубани, 2008. - №2

48. Мищенко В.А., Яременко Н.А., Мищенко А.В., Кононов А.В., Думова В.В. Особенности иммунодефицитов у крупного рогатого скота // Ветеринария,- 2006 -№11 С. 17-20.

49. Мищенко В.А., Павлов Д.К. Анализ причин выбытия высокопродуктивных коров // Современная ветеринарная защита коров высокопродуктивных пород: Сб. ст. Первой научно-практической конф., Воронеж, 2005. С. 4-6.

50. Моркунас А. Б. Количественная характеристика иммуноглобулинов классов G (G1h G2), М и А сыворотки крови здорового и больного лимфолейкозом крупного рогатого скота // Дисс. канд. биол. наук. Москва, 1988.- 146 с.

51. Мотова Е.Н. Оценка биохимического и иммунного статуса телят в ранний постнатальный период при выпаивании замороженного молозива с высоким содержанием иммуноглобулинов // Сельскохозяйственная биология, 2008. -№2. - С. 84-87.

52. Никулин Б.А. Пособие по клинической биохимии / Под ред. JI.B. Акуленко. М.: ГЭОТАР-Медиа, - 2007. - С.- 256.

53. Орсик JI.C. Лизинговые каникулы // Известия агропромышленный комплекс России, 2009. - Октябрь. - С. 4.

54. Официальный интернет — портал Минеетерства сельского хозяйства РФ: сайт. http://www.mcx.ru/navigation/docfeeder/show/r45.htm, (дата обращения: 15.04.2010)

55. Панько И.С., Лукьяновский В .А., Мироненко А.К., Кокуркин А.Н; Деформация копытец у высокопродуктивных коров // Ветеринарный консультант. 2003. - №5. - С.29-30.

56. Пахмутов И.А., Ульянова M.G. Оценка функциональной активности нейтрофилов крови» животных // Ветеринария.- 1984.- № 3.- С. 68-69.

57. Плейфер Дж., Чейн Б.М. Наглядная иммунология. // М.: Гэотар Медицина, 2002, -95 с.

58. Петров Р.В., Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммунодиагностика иммунодефицитов // Иммунология. 1997.-№4.-С. 4-7.

59. Петров Р.В., Хаитов P.M., Манько В;М. и др. Оценка иммунного статуса, иммунологический мониторинг современные проблемы клинической иммунологии и аллергологии // Иммунология. -1994. - №6.-С. 4-9.

60. Петров Р.В. Иммунология // М.: Медицина. 1982. -368 с.

61. Петров Р.В., Хаитов P.M., Пинегин Б.В. и др. Оценка иммунного статуса человека при массовых обследованиях (Методология и методические рекомендации).- М.: Медицина. 1989. - 153 с.

62. Петрянкин Ф.П., Петрова О.Ю. Использование иммуностимуляторов для повышения физиологического статуса молодняка // Ветеринарный консультант. -2007.-№20.-С 18-20.

63. Пешкус Ю.К. Иммунохимическая и функциональная характеристика иммуноглобулинов крупного рогатого скота при лейкозе // Дисс. доктора биол. наук в виде научного доклада, Москва, 1991. 47 с.

64. Племяшов К.К. Производственное долголетие коров в Ленинградской области // Ветеринария.- 2008. №2. С. 9- 11.

65. Плохинский Н.А. Биометрия. Изд-во Сибирского отделения АН СССР.-Новосибирск, 1961. 362 с.

66. Понякина И.Д., Лебедев К.А., Васенович М.И. и др. Способ определениялиммунологического состояния организма. А. с. 1090409 (РФ) МКИ А 61 К 39/00, №3429. 198/28-13; заявл. 23.04.82; опубл. 07.05.84, Бюл. №17.

67. Попович Д.П. Иммунохимический анализ перехода некоторых белков из крови в молоко и молозиво // Физиология и биохимия лактации. Л.: 1972

68. Порфирьев И.А., Мироненко А.К. Профилактика неспецифической бронхопневмонии у телят // Ветеринария.- 2007. №1. - С. 42- 46.

69. Резников Ю.П., Серна Ф.Р. Латексный тест в диагностике внутриутробной инфекции // Лаб. Дело. 1974. - №11. - С. 682-684.

70. Рецкий М.И., Шахов А.Г., Чусов Д.В., Золотарев А.И., Лебедев М.И., Ермолова Т.Г., Близнецова Г.Н. Коррекция антиоксидантного статуса новорожденных телят для формирования более высокого колострального иммунитета // Доклады РАСХН. 20Ю.-№2. - С. 42-44

71. Решетов В.Б., Черепанов Г.Г. Мониторинг физиологических функций и признаков продуктивности у молочных коров // Сельскохозяйственная биология. -2005.-№4.-С. 3-9.

72. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология // М.: «Мир».- 2000.- 592с.

73. Романенко Л.В., Волгин В.И. Совершенствование системы кормления высокопродуктивных коров // Веткорм. 2008. - №1. - С. 12-14

74. Романюха А.А. Иммуная система: норма и адаптация // Иммунология. -2009. -№1.-С. 7-12.

75. Серебряков Ю.М. Роды коров в боксах как метод профилактики патологии родов и бесплодия // Ветеринария.- 2008. №4. - С. 35- 37.

76. Сидоров М.А., Федоров Ю.Н., Савич О.М. Иммунный статус и инфекционные болезни новорожденных телят и поросят // Ветеринария.- 2006. -№11.-С. 3-5

77. Сисягин П.И., Реджепова Г.Р., Сисягина Е.П. Способы профилактики массовых респираторных болезней телят // Ветеринарный консультант. — 2007. -№ 19.-С. 16-17.

78. Слободяник В.И. Иммуномодуляция защитных факторов организма коров // Ветеринария.- 2002. №2. - С. 29- 34.

79. Смердова М.Д. Иммунобиологический/ статус черно-пестрого; скота Восточной Сибири и влияние на него различных аутоэкологических факторов. // Дисс. докт. биол. наук: Омск.- 2000;-590 с.

80. Сутыгина А.Н. Программа «Фелуцен»: как создать прочную защиту, от иммунодефицита//Веткорм. -2008; №1.

81. Терехов В.И., Крамарь П.В. Сохранность импортного молочного скота в хозяйствах Краснодарского края и причины его выбытия // Сб. научных трудов ведущих ученых России и Зарубежья, Екатеринбург, 2010. С. 629-631.

82. Уханов С.В.; Столповский Ю.А.; Банникова JI.B. и др. Генетические ресурсы крупного рогатого скота: редкие и исчезающие отечественные породы -М.; Наука, 1993.- 171 с.

83. Федоров Ю:Н! Первичные иммунодефициты у животных: характеристика, диагностика, коррекция // Тезисы докл. Международной конф. — Самара, 2009. -С. 497-505.

84. Федоров Ю.Н. Иммунодефициты крупного рогатого скота // Ветеринария. -2006.-№1.-С. 3-6.

85. Федоров Ю.Н. Иммунокоррекция: применение и механизм действия иммуномодулирующих препаратов // Ветеринария. 2005.- №2. - С. 3-6.

86. Федоров Ю.Н. Иммунобиологические основы и принципы профилактики болезней новорожденных телят // Ветинформ, 2002. - № 1. - С. 16-17.

87. Федоров Ю.Н. Оценка иммунного статуса и диагностика иммунодефицитов у животных // Ветеринария. 2002. - № 2. — С. 8-9.

88. Федоров Ю.Н., Верховский О.А. Иммунодефициты домашних животных. Москва. 1996. 96 С.

89. Федоров Ю.Н., Верховский О.А., Слугин И.В. Основы иммунологии и иммунопатологии собак. // Москва. 2000. - 248 с.

90. Федоров Ю.Н., Частов А.А. Этиологическая структура и иммунопрофилактика желудочно-кишечных болезней телят в ранний постнатальный период // Тезисы докл. Международной конф. — Самара, 2009. -С. 506-512.

91. Федоров Ю.Н., Кадыров С.О., Ездакова И.Ю. и др. Технология получения моноспецифических антисывороток к иммуноглобулинам' животных // Труды ВИЭВД988. Т.66. - С. 41-46.

92. Филиппова Г.И. Выделение отдельных классов иммуноглобулинов сыворотки крови крупного рогатого скота и использование их в иммунохимических исследованиях// Автореф. дисс. канд. биол. наук. М., 1983,-16 с.

93. Фисинин В.И. Успехи и проблемы российского животноводства // Животноводство России. Спецвыпуск 2008. С. 2-4

94. Фисинин- В.И., Дунин И.М., Амерханов Х.А. и др. Рекомендации по стабилизации поголовья крупного рогатого скота и реализации его генетического потенциала в хозяйствах Российской Федерации // М.: ФГНУ Росинформагротех. 2006. - 60 с.

95. Фримель X. Иммунологические методы // М.: Мир. 1979. - 518 с.

96. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммунная система желудочно-кишечного тракта: особенности строения и функционирования в норме и при патологии // Иммунология. 1997. - №5. - С. 4-7.

97. Хаитов Р.Б., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология. М.: ВНИРО, 1995.-219 с.

98. Храмцов В.В., Двоеглазов Н.Г., Агаркова Т.А., Осипва Н.А. Рациональная схема применения диагностических тест-систем при оздоровлении хозяйств от инфекции вируса лейкоза крупного рогатого скота //

99. Сб. научных трудов ведущих ученых России и Зарубежья, Екатеринбург, 2010. С. 261-264.

100. Чайка Н.А. Реакция агглютинации латекса // В кн.: Серологическая диагностика паразитарных болезней. М.: ВНИИМИ. 1982.- С. 14-25.

101. Чекишев В.М., Васильев B.C., Кабанцев А.И., Бондарь Т.В. Диагностика болезней животных и профилактика их на фермах и комплексах // Сборник научных трудов ИЭВС и ДВ Новосибирск 1984.

102. Чекишев В.М. Иммунологические аспекты резистентности телят // Дисс. доктора вет. наук, Новосибирск, 1983, -383 с.

103. Чекишев В.М. Колличественное определение иммуноглобулинов в сыворотке крови животных // Методические рекомендации. 1977. — Новосибирск. - 23 с.

104. Чередеев А.Н., Ковальчук JI.B. Иммунокоррекция // Иммунокоррекция и иммунореабилитация. Сб.научных.трудов. Саратов. 1991.-С. 3-16.

105. Чернохвостова Е.В. Структура и функции антител // М.: Мир. 1983. — 200с.

106. Чомаев А. От каждой коровы по теленку в год // Животноводство России. - 2008. Спец. выпуск молочное скотоводство. - С. 29-30.

107. Чумаченко В.Е., Высоцкий A.M., Сердюк Н.А., Чумаченко В.В. Определение естественной резистентности и обмена веществ у сельскохозяйственных животных//Киев: Урожай. 1990.- 136 с.

108. Шахов А.Г., Федоров Ю.Н., Аргунов М.Н., Панин А.Н. и др. Методические рекомендации по оценке и коррекции неспецифической резистентности животных. Воронеж.- 2005.-62 с.

109. Шахов А.Г., Федоров Ю.Н., Донник И.М., Панин А.Н. и др. Методические рекомендации .по оценке и коррекции иммунного статуса животных. Воронеж, 2005.

110. Шкуратова И.А., Белоусов А.И., Невинный В.К. Применение гермивита и витадаптина высокопродуктивным коровам // Ветеринария.- 2009. №1 С. 9-10.

111. Шкуратова И.А., Верещак Н.А., Ряпосова М.В., Бодрова О.С., Вершинина И.Ю., Невинный В.К. // Коррекция иммунного статуса у высокопродуктивных коров. Ветеринария.- 2008.- №2 С. 11-12.

112. Шкуратова И.А., Ряпосова М.В., Стуков А.Н., Невинный В.К. Коррекция нарушения обмена веществ и воспроизводительной функции коров // Ветеринария.- 2007. №9 - С. 9-11.

113. Шоршнев В.И., Муравьев В.К.,Онуфриев В.П. Выделение иммуноглобулинов и получение моноспецифических сывороток // Ветеринария. -1978.- № 1.-С. 44-47.

114. Шубич М.Г., Медникова В.Г. NBT-тест у детей в норме и при гнойно-бактериальных инфекциях // Лаб. дело.- 1978.- № 1. С. 663-666

115. Шубич М.Г., Нестерова И.В., Старченко В.М. Тест с нитросиним тетразолием в оценке иммунологического статуса детей с гнойно-септическими заболеваниями // Лаб. дело.- 1980.- № 7.- С. 342-344.

116. Шульга Н.Н. Динамика иммуноглобулинов в сыворотках крови и молозива коров // Ветеринария,- 2006. №1 - С. 45-47.

117. Эленшлегер А.А., Требухов А.В., Андрейцев М.З., Танкова О.В. Инновационные технологии и адаптации импортного скота в животноводческих комплексах Алтайского края // Сб. научных трудов ведущих ученых России и Зарубежья, Екатеринбург, 2010. С. 261-264.

118. Adams E.C. Latex agglutination. Determination of IgG in Neonatals and in colostrums // Патент США № 4.542.103. 17 сентября 1985

119. Aitken R., Hosseini R., MacDuff R. Structure and diversification of the bovine immunoglobulin repertoire // Vet. Immunol. Immunopathol. 1999. - N 72. - P. 2129.

120. Arthington J. D., Cattell M. B. and Quigley J. D. Effect of dietary IgG source (colostrum, serum, or milk-derived supplement) on the efficiency of IgG absorption in newborn Holstein calves // J. Dairy Sci. 2000.- N 83. - P. 1463-1467.

121. Baumstark J.I. et. al. A preparative method for the separation of 7S gamma globulin from human serum // Arch, biochem. Biophysics. 1964. - N 108.- P 514522

122. Bourne K. Immunoglobulins // Annual Review of Medicine. 1971. - 270 p.

123. Brambell F. W. R. The passive immunity of the young mammal // Biol. Rev. -1958.- N33.-P. 488.

124. Butler J. E. Biochemistry and biology of ruminant immunoglobulins // Prog. Vet. Microbiol. Immun. 1986 - N 2. - P. 1-53.

125. Butler J. E. Immunoglobulin gene organization and the mechanism of repertoire development // Scand. J. Immunol. 1997. - N 45. - P. 455-462.

126. Butler J.E. Immunologic aspects of breast feeding, antiinfectious activity of breast milk // Sem. Perinatol. 1979. - P. 255-270.

127. Chigerwe M., Dawes M., Tyler J., Middleton J. Moore M., Nagy D. Evaluation of a cow-side immunoassay kit for assessing IgG concentration in colostrum // J. Am. Vet. Med. Assoc. 2005. -N 227. - P. 129-131.

128. Collin R., Prosser C., McLaren R., Thomson M., Malcolm D. Development and validation of a nephelometric immunoassay for IgGi in milk // J. Dairy Res. 2002. -N69. P.- 27-35

129. Gaily J:A., Edelman G.M. Corroboration of recent models of the yG immunoglobulin molecule // J. Exp. Med. 1965.- N 121.- 373 p.

130. Goldman A. S., Garza C., Nichols B. L., Goldblum R. M. Immunologic factors of human milk during the first year of lactation // J. Pediatr. 1982. - N 100. - P. 563567.

131. Haasnoot W., Olieman K., Cazemier G., Verheijen R. Direct biosensor immunoassays for the detection of nonmilk proteins in milk powder. // Journal of agricultural and food chemistry. 2001. - N 49(11). - P. 5201-5206.

132. Hagemoster W.A., Roth J.A., Lofstedt J et al. Granulocytopathy in a Holstein heifer//J. Am. Vet. Med. Assoc. 1983. -N 183. -P. 1093- 1094.

133. Homola J, Yee SS, Gauglitz G. Surface plasmon resonance sensors: Review // Sensors Actuators B:Chem. 1999. - N 54. - P. 3-15.

134. Hood L., Gray W. R., Sanders G., Dreyer W. J. Light chain evolution // Cold Spring Harbor Symp., Quant. Biol. 1967.- N 32. - P.133-145.

135. Indyk H.I., Filonzi E.L. Determination of Immunoglobulin G in Bovine Colostrum and Milk by Direct Biosensor SPR-Immunoassay // J. of AOAC International. 2003. - N 2. - P. 386 - 393.

136. Korhonen, H.; Marnila, P. and Gill, H. S. Bovine milk antibodies for health // Brit. J. Nutr. 2000. - N 48- Suppl. 1. - P. 135 - 146.

137. Kristensen F., Antczak D. F. Advances in veterinary immunology 1982 // Developments in Animal and Veterinary Sciences, 12, Elsevier Scientific Publishing Company. Amsterdam Oxford - New York. - 1983. - P. 43-133.

138. Leach I.M., Ruck B.J. Detection of HAA by the Latex Agglutination test // Brid. Med. J. 1971. - N4. - P. 597-598.

139. Levieux D., Oilier A. Bovine immunoglobulin G,beta-lactoglobulin, alpha-lactalbumin and serum albumin in colostrums and milk during the early post partum period // J.Dairy Res. 1999. - N 66. - P. 421-430.

140. Li-Chan E. C. Y., Kummer A. Influence of standards and antibodies in immunochemical assays for quantitation of immunoglobulin G in bovine milk // J. Dairy Sci. N 80. - P. 1038-1046.

141. Lona V.D., Romero C.R. 2001- J. Dairy Sci. N 84. - P. 389-391.

142. Luckins A.G. Studies on bovine trypanosomiasis. Serum immunoglobulin levels in Zebu cattle exposed to natural infection in East Africa // British Vet.J. 1972. - N 128.-P. 523-528.

143. Lunn D.P., McClure J.T. Clinico-pathological diagnosis of immunodeficiency // Equine Vet. Edu. 1993.- N 5. - P. 30-32.

144. Maeda S., Morikawa A., Tokuyama K., Kuroume T. The concentration of bovine IgG in human breast milk measured using different methods // Acta Pediatr. -1993. -N82.-P. 1012-1016.

145. Malmqvist M. Biospecific interaction analysis using biosensor technology // Nature.- 1993.-N 361(6408).-P. 186-187.

146. Manchini G et. al. A single-radial-diffusion method fo the immunological quantitation of proteins // Immunochemistry/ 1965/ -V.2.-P/ 235-254.158'. Marchalonis J.J., Cone R.E. The phylogenetic emergence of vertebrate immunity // AJEBAK 1973'. - 461 P.

147. Naessens J. Surfase immunoglobulin on В lymphocytes from cattle and sheep // Int.Immunol. 1997. - N 9. - P. 349-354.

148. Naessens J.,Williams D.J.L.,Characterization and measurement of CD5+ В cells, in normal and Trypanosoma congolense-infected cattle // Eur. J. Immunol. -1992. N-22.-P. 1713-1718.

149. Naessens J., Newson J., Williams D. J. L., Lutje V. Identification of isotypes and allotypes of bovine immunoglobulin M with monoclonal antibodies // Immunology. 1988. -N 63. - P. 569-574.

150. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labelled antibody: a new method of conjugation //J.Histochem.Cytochem. 1974. -N 22. - P. 1084-1091.

151. Newby T.J., Bourne F.J. The nature of the local immune system of the bovine intestine // Immunology. 1976. - N 118. - P. 461-465.

152. Nielsen K.,Sheppard J., Holmes W., Tizard I. Experimental bovine trypanosomiasis. Changes in serum immunoglobulins, complement and complement components in infected animals // Immunology. 197. -N 35. - P. 817-826.

153. OIE Terrestrial Manual. 2008. - Chapter 2.4.11.- P. 729-738.

154. Oikawa M., Yoshihara Т. Wada R. et al. Latex agglutination test for handy, rapid measurement of foal serum and colostral IgG // Bull. Equine Res. Inst. 1986. -N23.-P. 62-66.

155. Pedersen R.E., Paulrud C.O., Tucker W.B. Influence of bovine antiserum (Bo-Bac 2X) injection on colostral immunoglobulin G absorption in neonatal dairy calves // J. Dairy Sci. 2000. - N 83(12). - P. 2829-2833

156. Symons D. B. A., Clarcson C. A., Beal D. Structure of bovine immunoglobulin constant region heavy chain gamma 1 and gamma 2 genes // Mol. Immunol. 1989. -N26.-P. 841-850.

157. White D.G. Evaluation of a rapid specific test for detecting colostral IgGj in the neonatal calf// J. The Veterinary Record. 1986. - January N 18. - P.68-70.

158. Williams D. J. L., Newson J., Naessens J. Quantitation of bovine immunoglobulin isotypes and allotypes using monoclonal antibodies // Vet. Immunol. Immunopathol. 1990. -N 24. - P. 267-283