Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспресс-диагностика неклостридиальных анаэробных инфекций иммунофлюоресцентным методом

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хлопунова, Ольга Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКЛОСТРИДИАЛЬНЫХ АНАЭРОБОВ И ЭКСПРЕССНЫХ МЕТОДОВ ИХ ОБНАРУЖЕНИЯ (обзор литературы).

1.1 Классификация семейства Ва^его1с1асеае.

1.2 Морфологические, культуральные и ферментативные свойства.

1.3 Неклостридиальные анаэробы - представители нормальной флоры человека

1.4 Роль неклостридиальных анаэробов как этиологического фактора гнойно-септических заболеваний

1.5 Факторы патогенности

1.6 Антигенная структура бактероидов

1.7 Получение гипериммунных сывороток.

1.7.1 Выбор животных-продуцентов иммуноглобулинов.

1.7.2 Получение антигенов и выбор схемы иммуни з а ции.

1.8 Экспресс-методы обнаружения бактероидов

1.8.1 Реакция агглютинации.

1.8.2 Реакция непрямой гемагглютинации

1.8.3 Иммунофлюоресцентный метод.

1.8.4 Иммуноферментный метод

1.8.5 Реакция ко-агглютинации.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1 Материалы.

2.1.1 Микроорганизмы.

2.1.2 Питательные среды.

2.1.3 Технические средства для культивирования неклостридиальных анаэробов.

2.1.4 Животные.

2.1.5 Характеристика обследованных больных

2.2 Методы исследований.

2.2.1 Методы получения гипериммунных сывороток к антигенам ВЛгадШз и Р.ше1ап1подеп±са

2.2.2 Методика получения флюоресцирующих антител к В.!гадШз.

2.2.3 Взятие, доставка и исследование клинических материалов.

2.2.4 Статистическая обработка полученных результатов.

ГЛАВА 3. ОБОСНОВАНИЕ ОПТИМАЛЬНОЙ СХЕМЫ ИММУНИЗАЦИИ ЖИВОТНЫХ-ПРОДУЦЕНТОВ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ НЕКЛОСТРИДИАЛЬНЫХ АНАЭРОБОВ.

3.1 Получение биомассы В.£гадШз и Р.ше1ап1подеп1са и приготовление из неё антигенов

3.2. Обоснование оптимальной схемы иммунизации животных.

3.2.1 Иммунизация кроликов

3.2.2 Иммунизация мышей.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспресс-диагностика неклостридиальных анаэробных инфекций иммунофлюоресцентным методом"

Актуальность исследования

Интенсивное изучение неклостридиальной анаэробной инфекции началось в 50-е годы XX столетия, чему способствовало оснащение лабораторий микробиологического профиля анаэробной техникой [89,112,115]. В результате за рубежом уже в 70-е годы были решены некоторые важные задачи прикладного и фундаментального характера, касающиеся этиологии и лабораторной диагностики таких заболеваний [80,113,138].

Отсутствие в нашей стране необходимого оборудования для создания бескислородной среды и специальных питательных сред, предназначенных для культивирования анаэробных неспорообразующих микроорганизмов, до недавнего времени сдерживало проведение подобных исследований, несмотря на всю важность данной проблемы для науки и практики, а этиологическая роль бактероидов при многих , инфекционных заболеваниях была незаслуженно принижена. Лишь в 80-е годы отечественные исследователи начали изучать и внедрять в практику микробиологические методы диагностики бактероидов, а также разрабатывать необходимые питательные среды [8,11,29-32,37-47].

Однако следует отметить, что микробиологические методы выделения и культивирования неклостридиальных анаэробов сложны и требуют больших материальных затрат: стоимость одного анализа в США составляет около 1000 долларов [133]. В результате такие исследования по-прежнему недоступны большинству отечественных практических лабораторий, многие из которых вынуждены ограничивать анализ микроскопией мазка, окрашенного по Граму, что, по понятным причинам, нередко приводит к ложным результатам.

Приведенные доводы, как нам представляется, указывают на актуальность исследований, предусматривающих совершенствование лабораторной диагностики неспорообра-зующих анаэробов, и указывают на важность разработки для этих целей более простых, информативных и в то же время доступных для практических лабораторий методов.

Наше внимание привлекли иммунологические методы, основанные на реакции антиген-антитело, которые лишены многих перечисленных недостатков и характеризуются высокой специфичностью [42,65,74-79].

В частности, было решено применить для этой цели такой перспективный метод как иммунофлюоресцентный, который интенсивно изучают за рубежом [150] и многие результаты уже широко внедрены в практику лабораторной диагностики бактероидов. В нашей стране иммунофлюоресцентный анализ также с успехом стали применять для обнаружения возбудителей многих инфекций [28, 33].

Нами [24,60] и другими авторами [3-6,9,23,39-41,61] показано, что в этиологии ряда инфекций, в особенности раневых, важную роль играют бактероиды группы B.fragilis и Р.melaninogenica. Из неклостридиальных анаэробов они являются наиболее частой причиной различных гнойно-септических процессов. Поэтому наши исследования были сосредоточены на разработке диагностических препаратов для обнаружения в пробах именно этих бактероидов.

Цель и задачи работы

Целью работы являлась разработка диагностических препаратов для обнаружения бактероидов методом флюоресцирующих антител в прямом (ПМФА) и непрямом (НМФА) вариантах и оценка их эффективности при исследовании клинических материалов от больных.

Для реализации цели исследования были поставлены следующие задачи:

1. Отобрать наиболее иммуногенные антигены В^гадШэ и Р.те1ап1подеп1са;

2. Выбрать животных-продуцентов антител и экспериментально обосновать оптимальную схему их иммунизации с целью получения гипериммунных сывороток против В.^гадШв и Р.те1ап1подеп±са, пригодных для выявления бактероидов в НМФА и ПМФА;

3. Оценить специфичность иммунных сывороток и полученных из них иммуноглобулинов, а также чувствительность НМФА и ПМФА на их основе;

4. Изучить эффективность обнаружения В^гадз-Иэ и Р.ше1ап1подеп1са иммунофлюоресцентным методом в сравнении с бактериологическим при исследовании клинических материалов от больных гнойно-септическими и другими заболеваниями инфекционной природы.

5. Обосновать целесообразность применения реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) как метода тестирования активности в инфекционном процессе (этиологической роли) выявленных в исследуемых материалах бактероидов по уровню и динамике специфических к ним антител.

Научная новизна

1.Впервые обосновано, что критерием иммуногенности В.йадШз и Р.те1аплподеп1са может служить наличие в популяции не менее 50% капсулированных форм клеток.

2. Изучена иммуногенность различных структур В.£га-дШв и Р .те1ап1подеплса и показано, что наиболее имму-ногенными являются целые клетки капсулированных форм бактероидов (капсульный антиген), убитые замораживанием (К3-антиген) или кислородом воздуха при хранении микробной массы в аэробных условиях (Кк-антиген).

3.Впервые обоснована оптимальная схема иммунизации кроликов, включающая грундиммунизацию и три ревакцинации, которая позволяет получать иммунные сыворотки с высокими титрами антител против В^гадИхБ и Р.ше-1ап1подеп1са.

4.Впервые показана принципиальная возможность использования мышей в качестве продуцентов специфических иммунных асцитных жидкостей, которые могут быть применены для выявления бактероидов иммунофлюоресцентным методом.

5.Установлено, что иммунные сыворотки и полученные из них иммуноглобулины высоко специфичны, а НМФА и ПМФА на их основе характеризуются выраженной чувствительностью.

6. В модельных опытах и при исследовании клинических материалов показано, что иммунофлюоресцентный анализ по эффективности выявления неклостридиальных анаэробов не уступают бактериологическому методу. В том случае, когда происходит отмирание бактероидов в исследуемой пробе (длительное хранение материала, доступ кислорода воздуха, поглощение микробных клеток фагоцитами, конкурентные взаимоотношения с ассоциантами) диагностическая эффективность НМФА и ПМФА даже выше, так как эти методы, в отличие от бактериологического, могут выявлять не только живые, но и убитые клетки (антигенный материал).

7. Впервые на модели ВЛгад1Нз обоснована целесообразность исследования уровня и динамики титров антител против неклостридиальных анаэробов, выявленных в клинических материалах, с целью установления их активности (этиологической роли) в инфекционном процессе.

Практическая значимость работы

1.Отобраны и предложены питательные среды для хранения маточных культур и получения биомассы B.fragilis и P.melaninogenica - коммерческая среда для культивирования неспорообразующих анаэробов, среда собственного изготовления на основе отвара куриных эмбрионов и Wilkens Chalgen Anaerobe Agar (Difco), на которых неклостридиальные анаэробы при еженедельных пересевах сохраняют капсулу в течение длительного времени (до 80% клеток до 6 мес).

2.Рекомендована оптимальная схема иммунизации кроликов, которая позволяет получать высокоспецифичные иммунные сыворотки с высокими титрами антител против B.fragilis и P.melaninogenica.

3. Предложены препараты для постановки НМФА и ПМФА -эффективных методов выявления B.fragilis и P.melaninogenica в клинических материалах от больных с различными заболеваниями инфекционной природы.

4.Рекомендовано для повышения эффективности диагностики отрицательные при бактериологическом анализе пробы повторно исследовать с помощью НМФА или ПМФА.

5.Получен эритроцитарный антигенный диагностикум для выявления в сыворотках крови больных специфических антител против B.fragilis с целью установления по их уровню и динамике этиологической роли этого микроорганизма в инфекционном процессе.

Основные положения, выносимые на защиту

1.Технология получения диагностических препаратов для выявления неклостридиальных анаэробов методом флюоресцирующих антител в прямой и непрямой модификации.

2. Результаты сравнительного исследования, подтверждающие одинаковую эффективность бактериологического и иммунофлюоресцентного методов выявления В^гадШБ и Р .те1аплподеп1са в клинических материалах от больных с разнообразной патологией инфекционной природы.

3.Обоснование целесообразности определения специфических антител в сыворотке крови больных против обнаруженных в исследованных клинических материалах неклостридиальных анаэробов с целью подтверждения их этиологической роли в инфекционном процессе.

Апробация результатов работы

Основные результаты работы доложены и обсуждены на: научно-практической конференции "Проблемы клинической микробиологии в неинфекционной клинике" (Винница, 1983),У111 научной конференции молодых ученых Воен.-мед.акад.- (Л.,1984), УШ межинститутской научной конференции (Челябинск,1986),I Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы нозокомиальных инфекций и лекарственной устойчивости" (Минск, 1986) , Ш1 всесоюзном съезде стоматологов(Волгоград,1987), конференции "Гнойно-воспалительные заболевания и осложнения в акушерско-гинекологической практике"(Л.,1985), юбилейных конференциях, посвященных НИИ военной медицин (СПб. 1994, 1999), конференции "Актуальные вопросы военно-морской и клинической медицины" (СПб. 1995), научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ (Киров, 1998).По теме диссертации опубликовано 23 научных работы, внедрено 3 рационализаторских предложения.

Реализация работы

По результатам исследования разработаны и утверждены Начальником ГВМУ МО РФ "Методические рекомендации по выявлению и идентификации возбудителей анаэробной хирургической инфекции неклостридиальной природы с помощью непрямого варианта иммунофлюоресцентного анализа" (1998), "Методические рекомендации по микробиологической диагностике раневых инфекций в лечебно-диагностических учреждениях армии и флота" (1999). "Методические рекомендации по ускоренному выявлению и идентификации неклостридиальных анаэробов прямым методом иммунофлюоресцентного анализа" находятся в стадии утверждения.

Разработанные и апробированные нами в практике препараты для постановки прямого и непрямого вариантов иммунофлюоресцентного анализа с целью выявления неклостридиальных анаэробов применяют в клиниках Военно-медицинской академии МО РФ при осуществлении научно-исследовательской и лечебно-диагностической работы.

Работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ГВМУ МО РФ и НИИ ВМ МО РФ.

Структура диссертации

Диссертация изложена на 196 страницах, состоит иэк введения, 5 глав, заключения и выводов. Список литературы включает 71 источник отечественных авторов и 162 источника зарубежных авторов. В диссертации приведены 38 таблиц и 5 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Хлопунова, Ольга Владимировна

ВЫВОДЫ

1.Разработаны и с положительным эффектом апробированы препараты для непрямого (НМФА) и прямого (ПМФА) вариантов иммунофлюоресцентного анализа клинических материалов от больных с различной патологией инфекционной природы с целью выявления этиологически наиболее значимых неклостридиальных анаэробов - B.fragilis и Р.melaninogenica, в результате чего подтверждены принципиальная возможность и перспективность внедрения в практику диагностических лабораторий страны этих доступных и информативных тестов для выявления условно-патогенных бактероидов.

2.Обосновано, что критерием пригодности штаммов B.fragilis и P.melaninogenica как патогенных культур для иммуногенной биомассы может служить наличие в популяции не менее 50% капсулированных форм клеток.

3.Для сохранения культур и накопления биомассы с необходимым количеством капсульных форм B.fragilis и P.melaninogenica целесообразно применять отечественную плотную питательную среду для культивирования не-спорообразующих анаэробов, предложенную нами среду на основе отвара из отработанных куриных эмбрионов или Wilkns-Chelenger agar (США), на которых бактероиды при еженедельных пересевах сохраняют капсулу в течение длительного времени (80% клеток до б месяцев).

4.Наиболее иммуногенными являются капсульные антигены B.fragilis и Р.melaninogenica, получаемые путём замораживания микробной массы бактероидов при -18°С или экспозиции её в течение суток в аэробных условиях при +4°С.

5. В качестве продуцентов специфических гипериммунных сывороток могут быть использованы кролики, иммунизация которых по предложенной нами многоэтапной схеме, состоящей из грундиммунизации и трёх ревакцинаций обеспечивает получение антител против B.fragilis и P.melaninogenica в высоких тирах (до 1:81420 в РИГА, 1:1280 в НМФА) при преобладающем количестве иммуноглобулинов класса G (IgG - 1:40960, IgM - 1:1280 в РИГА) .

6.Иммунные сыворотки кроликов и полученные из них иммуноглобулины обладают высокой специфичностью: в 100% случаев дают положительную реакцию с B.fragilis и P.melaninogenica и небольшое количество перекрёстных реакций с некоторыми гетерологичными микроорганизмами при низком разведении сывороток - 1:2 - 1:4.

7.НМФА и ПМФА на основе полученных нами антител против B.fragilis и P.melaninogenica характеризуются высокой чувствительностью. При исследовании проб, искусственно инфицированных бактероидами в лабораторных условиях, разрешающая способность тестов достигает 1x1О5 КОЕ/мл при просмотре единичных полей зрения. С уменьшением концентрации неклостридиальных анаэробов (10 -104) процент положительных результатов резко уменьшается, а для выярления светящихся клеток необходимо просматривать десятки полей зрения.

8. В результате исследования проб, искусственно приготовленных в лабораторных условиях, и клинических материалов от больных с гнойно-септическими процессами и другими инфекциями установлено, что иммунофлюорес-центный анализ по эффективности обнаружения неклост-ридиальных анаэробов не уступает бактериологическому методу. При этом диагностическая эффективность непрямого и прямого вариантов анализа одинакова.

9. В случае уменьшения количества жизнеспособных клеток бактероидов от изначального уровня вследствие длительного хранения проб, доступа в них кислорода воздуха, переваривания микробных клеток фагоцитами, конкурентных взаимоотношений с ассоциантами, диагностическая эффективность НМФА и ПМФА была выше бактериологического анализа, так как, в отличие от последнего эти тесты выявляли не только живые, но и погибшие (ослабленные) микроорганизмы (антигены), утратившие способность расти на питательных средах. На этом основании сформулирована рекомендация о необходимости повторного иммунофлюоресцентного анализа проб, из которых неклостридиальные анаэробы не выделены бактериологическим методом.

10. На модели B.fragilis обусловлена целесообразность оценки активности как этиологического фактора инфекционного процесса выявленных в исследуемых материалах от больных неклостридиальных анаэробов по уровню и динамике специфических к ним антител. При этом титрование сывороток целесообразно осуществлять в РНГА, апробированной на репрезентативной группе больных (475 человек) с различными нозологическими формами заболеваний инфекционной природы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Неклостридиальные анаэробы нередко являются причиной многих заболеваний инфекционной природы, в особенности гнойно-септических процессов различной локализации [3-11] . Поэтому научной разработке и усовершенствованию лабораторных методов обнаружения бактероидов в клинических материалах от больных придают весьма важное значение, поскольку только они позволяют более достоверно установить этиологию заболевания и определить правильную тактику этиотропного лечения [14, 21-24].

За рубежом такие исследования проводят в течение многих лет. При этом изучены диагностические возможности микробиологического и иммунологических методов, разработаны специальные питательные среды и тест-системы, сконструированы специальные технические средства для обеспечения оптимальной среды культивирования анаэробов, а также исследованы многие другие аспекты этой сложной проблемы[89-92]. В последние годы для выявления неклостридиальных анаэробов с успехом стали применять ПЦР [111]. Следствием этих разработок стало повышение уровня дальнейших исследований, касающихся проблемы неклостридиальных анаэробов, и результативности диагностической работы практических лабораторий.

Лабораторная диагностика неклостридиальных анаэробов в нашей стране до сих пор затруднена: микробиологический анализ недоступен большинству лабораторий в связи с отсутствием дорогостоящего оборудования и специальных питательных сред, а более простые в исполнении иммунологические исследования не могут быть выполнены, так как отсутствуют соответствующие диагностикумы. В связи с этим представляется целесообразным и экономически оправданным проведение исследований по разработке и оценке отечественных тест-систем для выявления некло-стридиальных анаэробов иммунологическими методами. Весьма привлекателен с этих позиций иммунофлюоресцент-ный анализ, который широко изучен в ряде зарубежных стран и внедрён в практику ускоренной диагностики не-спорообразующих анаэробов.

Если учесть, что большинство диагностических лабораторий военно-медицинской службы и гражданского здравоохранения России не оснащены всем необходимым для проведения микробиологического анализа, то актуальность налаживания в нашей стране более доступной иммунофлюо-ресцентной диагностики бактероидов становится ещё более очевидной. Особенно возрастёт значение этих методов в военное время, когда "эпидемия" раневых инфекций и дефицит времени в специфических условиях деятельности медицинской службы потребуют простых экспрессных методов обнаружения неклостридиальных анаэробов, этиологическая роль которых при данной патологии, безусловно, будет велика [109, 112,113].

Целью настоящего исследования являлась разработка препаратов, предназначенных для обнаружения этиологически наиболее значимых бактероидов (B.fragilis и P.melaninogenica) в клинических материалах от больных методом флюоресцирующих антител в прямом (ПМФА) и непрямом (НМФА) вариантах, а также оценка их эффективности.

Для достижения этой цели мы считали необходимым:

1. Выбрать наиболее иммуногенные видоспецифические антигены B.fragilis и P.melaninogenica и обосновать оптимальную схему иммунизации ими животных-продуцентов гипериммунных сывороток.

2. Оценить специфичность иммунных сывороток и полученных из них иммуноглобулинов, а также чувствительность НМФА и ПМФА на их основе.

3. Изучить эффективность обнаружения B.fragilis и P.melaninogenica в клинических материалах от больных иммунофлюоресцентным методом в сравнении с бактериологическим.

4. Обосновать целесообразность применения реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) как метода тестирования активности в инфекционном процессе выявленных в исследуемых материалах бактероидов по уровню и динамике специфических к ним антител.

Приступая к исследованию иммуногенности антигенов B.fragilis и P.melaninogenica, мы исходили из известного положения о том, что наиболее иммунологически активными являются капсульные формы бактероидов [113, 116] . Однако это общее положение не давало ответа на вопрос, какая часть клеток биомассы этих микроорганизмов должна иметь капсулу, чтобы получаемый из неё антигенный материал индуцировал образование антител в высоких титрах. В связи с этим мы считали целесообразным изучить зависимость иммунного ответа от количества (процента) кап-сулированных форм в популяции бактероидов.

В ходе иммунизации кроликов целыми клетками B.fragilis и P.melaninogenica в концентрации 2х106

КОЕ/мл, различные штаммы которых содержали от 10 до 100% капсулированных форм, было установлено, что для получения иммунных сывороток с высокими титрами (РНГА не менее 1:20480) половина клеток биомассы должна иметь капсулу. Уменьшение числа таких клеток до 10-25% приводило к существенному снижению иммуногенности прививочного материала, а если "вакцина" полностью состояла из капсульных форм, то медиана титров достигала в НМФА весьма высокого значения - 1:81920.

Исходя из представленных данных, в качестве критерия скрининга маточных штаммов B.fragilis и P.melaninogenica мы приняли наличие в популяции не менее 50% капсулированных форм клеток.

Для получения биомассы B.fragilis и P.melaninogenica с высоким содержанием капсулированных форм пригодны не все известные питательные среды, так как при культивировании на многих из них неклостридиальные анаэробы утрачивают капсулу [170, 171].

В результате оценки 8 сред отечественного и зарубежного производства наиболее приемлемыми оказались питательная среда для культивирования неспорообразующих анаэробов на белковой основе из непищевого сырья (НПО "Питательные среды", г. Махачкала) и Wilkens-Chelgern agar (Difco) , на которых около 80% клеток B.fragilis и P.melaninogenica сохраняли капсулу в течение б месяцев. Кроме того, обе среды давали большой выход биомассы, а полученные из неё антигены не содержали неспецифические белковые компоненты и не требовали трудоёмкой и затруднительной очистки.

Аналогичной по качеству была и предложенная нами плотная питательная среда на основе отвара из куриных эмбрионов. Она не только удовлетворяла указанным специальным требованиям, но была дешевле других сред. Из биомассы В^гадШв и Р.те1ап1подепзса, которую накапливали на указанных трёх средах, было получено по 10 различных антигенов: О-антигены (4 вида), К-антигены (3 вида) и липополисахариды (3 вида).

В последующем была проведена оптимизация схемы иммунизации кроликов с целью получения иммунных сывороток с максимально возможными титрами антител. При этом оценивали уровень иммунного ответа на все перечисленные антигены в зависимости от их дозы и кратности введения, интервала между инъекциями и вида вводимого препарата. Всего испытано 10 схем, часть из которых описаны в литературе [119, 140, 161 ,226], а некоторые предложены нами [24] .

В результате оказалось, что однократное введение антигенов (первичная иммунизация), даже с адъювантом Фрейнда, не позволяет получать сыворотки с высоким содержанием антител. Значительно более интенсивный ответ антигены индуцировали при многократном их введении по схемам, состоящим из грундирования и одной или нескольких ревакцинаций.

Из всех испытанных многократных схем предпочтительной является разработанная нами. Она включает первичную иммунизацию и 3 ревакцинации (последняя из них отдалённая - через 90 сут поле второй) . Иммунизация кроликов по этой схеме наиболее иммуногенными антигенами (К-антигенами, полученными в результате замораживания микробной массы при -18°С или хранения её в течение одних суток в аэробных условиях при +4°С) стимулировала интенсивный антителогенез. В этом случае медиана титров антител к B.fragilis и Р.melaninogenica равнялась в РНГА 1:81920. Антитела были представлены преимущественно иммуноглобулинами класса IgG: 1:40960 против B.fragilis и 1:81920 - против Р.melaninogenica титр IgM 1:1280.

Для постановки иммунофлюоресцентной реакции нередко используют антитела (иммуноглобулины) иммунных асцитных жидкостей (ИАЖ) привитых мышей [19]. Исходя из этого, мы попытались получить такие антитела против B.fragilis и Р.melaninogenica. Мышей прививали всеми наработанными нами антигенами по схемам различной напряженности. Как и в опытах на кроликах, наиболее иммуногенны-^-ми были капсульные антигены, но в данном случае они индуцировали менее выраженный антителогенез: титр антител ИАЖ был не выше 1:5120 в РНГА, при преобладающем количестве IgG (1:2560 в РНГА) по сравнению с IgM (1:160). Попытка усилить иммунный ответ путём варьирования дозами антигенов и адъюванта Фрейнда, а также интервалами между инъекциями успехом не увенчалась. Эти антитела мы использовали только в НМФА. Для наработки иммуноглобулинов требуются ИАЖ с более высокими титрами антител, для чего необходимы дальнейшие исследования по оптимизации схемы иммунизации мышей.

Обязательным при выполнении подобного рода работ является изучение специфичности иммунных сывороток и иммуноглобулинов, а также чувствительности иммунофлюоресцентного метода на их основе. Такие исследования были выполнены и нами.

Было установлено, что иммунные сыворотки и иммуноглобулины (до и после метки ФИТЦ) обладают достаточно высокой специфичностью. В 100% случаев они давали положительную реакцию с B.fragilis и P.melaninogenica, а перекрёстные (ложноположительные) реакции с некоторыми гетерологичными микроорганизмами наблюдали лишь при низком разведении иммунных препаратов.

Чувствительность НМФА и ПМФА оценивали при исследовании проб на основе физиологического раствора, мочи, гноя и крови, искусственно инфицированных неклостриди-альными анаэробами в лабораторных условиях в различных о л дозах - от 1x10 до 1x10 КОЕ/мл взвеси. В этих модельных опытах была установлена достаточно высокая чувствительность иммунофлюоресцентного анализа. Неклостриди-альные анаэробы выявляли в 100% случаев при их концентрации 1х105 КОЕ/мл и выше, для чего под микроскопом достаточно просмотреть одно поле зрения. При более низких концентрациях (1х104-1х103 КОЕ/мл) процент положительных проб снижался до 30-50%, и в этих случаях для выявления светящихся бактероидов необходимо просматривать 10 и более полей зрения.

Исследование центрифугатов тех же проб или лейкоцитарной плёнки крови повышает эффективность обнаружения B.fragilis и P.melaninogenica в НМФА и ПМФА. Например, при концентрации B.fragilis в физиологическом растворе 1х104 КОЕ/мл центрифугирование способствовало обнаружению этого бактероида в 95 пробах из 100 при просмотре всего лишь одного поля зрения мазка, в то время как без центрифугирования были положительными только 4 6 проб.

НМФА и ПМФА по эффективности выявления бактероидов в пробах, приготовленных в лабораторных условиях, не различались.

Важным также представлялось сравнить в модельных опытах диагностические возможности иммунофлюоресцент-ного и бактериологического методов. Как оказалось, им-мунофлюоресцентный анализ по эффективности выявления неклостридиальных анаэробов в инфицированных в лабораторных условиях пробах не отличался от бактериологического метода. Напротив, если в пробе с изначально высокой концентрацией микробных клеток происходило под воздействием каких-то факторов уменьшение числа жизнеспособных особей, эффективность иммунофлюоресцентного исследования по сравнению с бактериологическим становилась выше, так как в отличие от бактериологического анализа, выявляло не только живые, но и погибшие клетки (антигены).

Эту закономерность мы прослеживали, к примеру, при длительном хранении проб в анаэробных условиях. В течение первых трёх часов экспозиции оба метода выявляли В^гадШв во всех пробах, и их концентрация была на уровне исходной. Через 1 и 7 мес процент положительных результатов по данным микробиологического исследования уменьшался почти вдвое: через 1 мес - 63-67%, через 7 мес - 4 9-57%. Иммунофлюоресцентный анализ выявлял В.ГгадШэ в значительно большем проценте проб (соответственно в 87-90% и 71-73% случаев).

Если сопоставить количество обнаруживаемых микробных клеток, то бактериологический метод также уступал иммунофлюоресцентному. Так, на питательных средах через 1 месяц в среднем на чашках Петри вырастало 59-84% колоний от их исходного количества, а через 7 мес ещё меньше - 18-23%, что указывает на существенное уменьшение числа жизнеспособных микроорганизмов в пробах. В то же время по результатам НМФА концентрация B.fragilis снижалась не столь значительно: через 1 мес выявляли 80-100% клеток от исходного уровня, через 7 мес - 6089%.

Такие же преимущества иммунофлюоресцентного анализа установлены и при исследовании проб, в которых снижение жизнеспособности или гибель бактероидов происходили под воздействием кислорода воздуха или в результате переваривания их присутствующими в пробе фагоцитами.

Несомненный практический и теоретический интерес могут иметь результаты сравнительного изучения диагностической эффективности иммунофлюоресцентного и бактериологического методов при исследовании проб, инфицированных одновременно неклостридиальными анаэробами и другими аэробными и анаэробными микроорганизмами. Было показано, что если ассоцианты (например E.coli и B.clistasonis) не подавляют рост B.fragilis, то в этом случае эффективность обнаружения бактероида иммунофлюо-ресцентным и бактериологическим методами была одинакова. Если ассоцианты (например, Peptostreptococcus sp.) подавляют рост B.fragilis на питательных средах, то эффективность бактериологического метода снижается, а НМФА сохраняется на уровне контроля (как при исследовании проб, инфицированных монокультурой B.fragilis). Иными словами, складывается ситуация, при которой бактериологически из пробы может быть выделена только часть клеток B.fragilis , способная размножаться и расти на питательных средах, что, естественно, снижает результативность этого метода. В то же время иммуноф-люоресцентный анализ и в этих условиях выявляет фактическое количество микробных клеток в пробе, в том числе и погибшие.

Таким образом, представленные итоги модельных опытов, на наш взгляд, убедительно свидетельствуют о том, что иммунофлюоресцентный анализ по эффективности диагностики неклостридиальных анаэробов не уступает бактериологическому. Более того - получаемые с его помощью результаты в меньшей степени зависят от условий хранения исследуемых материалов, конкурентных взаимоотношений ассоциантов и других отрицательно воздействующих на бактероиды факторов, так как обнаруживает в пробе не только живые, но и погибшие микроорганизмы (антигены). Это можно считать весьма важным преимуществом НМФА и ПМФА.

На заключительном этапе работы диагностическую эффективность НМФА и ПМФА оценили на клинических материалах от больных в сравнении с бактериологическим методом. Были обследованы 2 группы больных: с гнойно^ септическими процессами (563 человека) и дизентерией (185 человек).

От больных первой группы исследовали гной, мочу, кровь, спинномозговую жидкость, околоплодные воды, содержимое коленного сустава и другие материалы, а также пунктаты лимфатических узлов умерших пациентов, проходивших лечение по поводу различных заболеваний неясной этиологии. Полученные данные свидетельствовали об одинаковой эффективности бактериологического и иммунофлюоресцентного методов.

Так, при исследовании 2 64 проб с помощью НМФА получено 58% положительных результатов (B.fragilis и P.melaninogenica выделены соответственно в 36% и 13% случаев, оба анаэроба одновременно - в 10% случаев; бактериологическим методом бактероиды обнаружены примерно в таком же количестве проб - в 4 9% случаев (B.fragilis - 28%, P.melaninogenica - 13%, оба вида одновременно - 8%) . При этом совпадение результатов было достаточно высоким и составило 80%.

Сходные результаты получены при анализе других 299 проб с помощью прямого варианта иммунофлюоресценции и бактериологическим методом.

Представляло интерес сравнить эффективность обнаружения неклостридиальных анаэробов НМФА и ПМФА. В результате исследования одних и тех же проб (всего 4 29) этими двумя методами одновременно была установлена их равнозначность: НМФА бактероиды выявлены в 131 пробе (31%) ПМФА - в 129 (30%). Совпадение результатов составило 98%.

В материалах от больных с гнойно-септическими процессами B.fragilis и P.melaninogenica чаще бывают в ассоциации с другими микроорганизмами. В частности, из 196 положительных результатов бактериологического исследования монокультура B.fragilis была выделена лишь в 11 случаях, что составило 2% от общего числа (548) исследованных проб или 2% от числа положительных результатов; в ассоциации с другой анаэробной и аэробной микрофлорой его высевали гораздо чаще - из 185 проб (34% от всех исследованных проб или 94% от числа положительных проб).

Аналогичные • данные получены и при выделении Р.melaninogenica.

Такая микробиологическая характеристика исследуемых клинических материалов указывает на пригодность разработанных нами диагностикумов для выявления неклостриди-альных анаэробов (В.fragilis и P.melaninogenica) даже при их ассоциации с другими микроорганизмами.

В модельных опытах была показана способность имму-нофлюоресцентного анализа выявлять В.fragilis в тех случаях, когда присутствовавший в пробе Peptostrepto-coccus sp. вследствие конкурентных взаимоотношений подавлял его рост на питательных средах, и бактериологическое исследование давало отрицательный результат.

Исходя из этих данных, мы отдельно проанализировали те результаты бактериологического исследования клинических материалов, которые указывали на наличие в пробе только Peptostreptococcus sp. (В.fragilis не был выделен). Таких материалов было 41 (8%) из 548 изученных. Оказалось, что в большинстве из них (81%) иммунофлюо-ресцентным методом (НМФА и ПМФА) в отличие от бактериологического удалось обнаружить В.fragilis (р<0,01).

Нам представляется, что эти результаты убедительно указывают на целесообразность повторного исследования иммунофлюоресцентным методом тех клинических материалов, из которых не удалось выделить неклостридиальные анаэробы бактериологически, особенно в тех случаях, когда на питательных средах наблюдается рост чистой культуры Рер-Ьоз1:гер1:ососсиз эр.

На клинических материалах от больных с гнойно-септическими процессами практически была подтверждена и другая закономерность, установленная в модельных опытах, а именно - присутствующие в пробах фагоциты снижают результативность бактериологического исследования, не влияя при этом на эффективность диагностики иммунофлюоресцентным методом.

С этой целью исследуемые материалы распределили на 2 группы - с большим количеством фагоцитов и незначительным. К первой группе мы отнесли мочу, спинномозговую жидкость, кровь, содержимое коленного сустава (152 пробы), ко второй (391 проба) - гной, секрет предстательной железы, околоплодные воды, соскобы из церви-кального канала, уретры и влагалища, пунктаты лимфоузлов трупов (гной отнесли к этой группе, так как большинство фагоцитов в нём были, как правило, разрушены). Оказалось, что при исследовании проб первой группы эффективность иммунофлюоресцентного анализа была достоверно выше (р<0,01) бактериологического: положительные результаты соответственно равнялись 53% и 32%. В то же время при малом количестве фагоцитов в пробах (группа 2) эффективность иммунофлюоресцентной и бактериологической диагностики была практически одинакова (положительных результатов было соответственно 43% и 38%, р>0,5).

Следует отметить, что в мазках из материалов, в которых наличие неклостридиальных анаэробов подтверждено бактериологически, капсула микробных клеток была мощная (превосходила диаметр клетки в 3-4 раза). Только около 30% светящихся микроорганизмов в результате фагоцитоза находились внутриклеточно. В отличие от этого, при им-мунофлюоресцентном исследовании проб, из которых B.fragilis и P.melaninogenica не были высеяны, значительная часть микробных клеток (до 80%) была фагоцитирована, а их капсула выглядела истонченной. Эта картина, по нашему мнению, в какой-то мере указывает на механизм снижения эффективности бактериологической диагностики бактероидов под воздействием присутствующих в клинических материалах фагоцитов, суть которого состоит в дезинтеграции микробной клетки и нарушении ее способности расти на питательных средах.

Мы понимаем условность деления клинических материалов на указанные 2 группы, однако представляется бесспорным факт более низкой эффективности бактериологического метода в сравнении с иммунофлюоресцентным при исследовании некоторых клинических материалов, что, безусловно, убеждает в необходимости повторного анализа проб с помощью НМФА или ПМФА, отрицательных по данным бактериологического исследования. Такую точку зрения разделяют и другие авторы [74].

Как мы уже упоминали, полученные нами диагностикумы были испытаны и при исследовании материалов от больных дизентерией - кала, мазков из сигмовидного и нисходящего отделов толстой кишки, а также биоптатов лимфоузлов толстой кишки пациентов, умерших от этой инфекции. В результате установлено, что НМФА и ПМФА по эффективности выявления B.fragilis из этих материалов не уступают бактериологическому исследованию: при помощи каждого из них анаэробы обнаружены в 81% проб, бактериологическим методом - в 78%. При этом процент совпадений результатов был достаточно высок (НМФА/бакисследование - 97%, ПМФА/бакисследование - 97%, НМФА/ПМФА - 100%) .

Обнаружение в исследуемом материале микроорганизмов не всегда является абсолютным доказательством их этиологической роли в патологии данного больного [162,169]. Поэтому при ряде инфекций прибегают к определению специфических антител в сыворотке кровь и по нарастанию их титра в динамике устанавливают роль конкретного возбудителя как причины развившегося заболевания.

Исходя из этого, одной из задач настоящего исследования являлась разработка эритроцитарного антигенного диагностикума для определения антител к B.fragilis в сыворотке крови и обоснование на этой модели ценности серологического анализа как метода диагностики инфекций, вызванных неклостридиальными анаэробами, и подтверждения этиологической роли выявляемых в исследуемых материалах бактероидов.

Под наблюдением находилось 475 человек с различными заболеваниями инфекционной природы, в клинических материалах которых с помощью НМФА и ПМФА были обнаружены B.fragilis.

Установлено, что у некоторых больных уже на 1-2 сутки заболевания уровень антител был существенно выше, чем у здоровых лиц (у больных 1:160 и выше, в контроле 1:10). К 15-25 сут заболевания титры продолжали нарастать и становились достоверно выше по сравнению с предыдущим сроком (1:640 и выше). Лишь в стадии рековалесценции (к 30-50 сут) они снижались и достигали нормальных значений (как у здоровых лиц - 1:10 - 1:40).

Представленные данные, по нашему мнению, являются убедительным доказательством активной роли В.йадШэ в этиологии заболевания обследованных пациентов.

У другой группы больных при первом исследовании определяли незначительное повышение титра антител (в среднем он был равен 1:80), что, видимо, обусловлено неспецифической активацией антителообразования на фоне инфекционного процесса, вызванного другими возбудителями. Особенно следует отметить, что в этих случаях не происходило нарастания антител в последующие сроки. Все это указывает на то, что у этой группы больных В.ГгадШэ не играют активной этиологической роли в патогенезе заболевания и их можно рассматривать как пассивных ассоциантов. Это подтверждало и последующее наблюдение лечащих врачей, которые, как правило, на основании дополнительных клинико-лабораторных данных устанавливали диагноз другой этиологии и исключали причастность к заболеванию неклостридиальных анаэробов.

Таким образом, при лабораторной диагностике неклостридиальных анаэробов наряду с выявлением их в клинических материалах больных, целесообразно определять динамику титров специфических антител к ним с целью установления их активности как этиологического фактора заболевания .

Подчеркнем, что высокие титры антител к В^гадШв (1:160 и выше) при поступлении больного в клинику давали лечащим врачам основание предполагать об участии в инфекционном процессе данного бактероида и являлись основанием для раннего целенаправленного применения соответствующих антибиотиков, что, как правило, ускоряло процесс выздоровления. Поэтому клиницисты, работавшие с нами в тесном контакте, весьма положительно оценивали этот метод исследования, равно как и иммунофлюоресцент-ный, позволяющий расшифровывать этиологию заболевания в более короткие сроки - до выделения культуры бактероида микробиологическим методом, для чего необходимо несколько суток.

В том случае, если в сыворотке крови пациентов наблюдалось нарастание титров антител, в мазках преобладали капсул ьные формы B.fragilis с интенсивно светящимися ободками (на 3-4 креста), капсула превышала диаметр клетки в 3-6 раз. Такая картина иммунофлюоресцент-ного анализа, как известно [166,168], указывает на наличие в исследуемом материале вирулентных штаммов бактероидов и косвенно также подтверждает их этиологическую роль в инфекционном процессе. Напротив, при отсутствии положительной динамики антителогенеза капсула у большинства микробных клеток была истончена или отсутствовала вовсе, что характерно для авирулентных или слабовирулентных штаммов, которые, по данным некоторых авторов (140) , редко являются причиной инфекций.

Таким образом, в результате настоящего исследования разработаны диагностикумы, предназначенные для выявления B.fragilis и Р.melaninogenica в НМФА и ПМФА, и обоснована их высокая эффективность при экспресс-диагностике инфекций, обусловленных этими этиологически наиболее значимыми неклостридиальными анаэробами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хлопунова, Ольга Владимировна, Санкт-Петербург

1. Арипов У.А., Нажмитдинов Л.М., Хаитов Р.М. К механизму действия адъювантов: влияние на миграцию стволовых клеток и В-лимфоцитов костного мозга // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1977. - № 9. - С.56-59.

2. Ашмарин И.Н., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях.- Л., 1962. 180с.

3. Баженов Л.Г. Выделение и идентификация бактероидов группы B.fragilis // Лаб. дело. 1990. - № 4. -С.9-13.

4. Баженов Л.Г. Исхакова Х.И. Микробиологическая диагностика гнойно-воспалительных процессов, вызванных строго анаэробными микроорганизмами // Лаб. дело. -1988. № 6.- С.37-42.

5. Баженов Л.Г. Выделение и идентификация строго анаэробных микроорганизмов при гнойно-воспалительных процессах: Автореф. Дис. . канд. мед. наук. М., 1987.- 19 с.

6. Баженов Л.Г. Метод и частота выделения анаэробных неспорообразующих грамотрицательных бактерий при различных гнойно-воспалительных процессах // Мед. журн. Узбекистана. 1984. - № 2.- С.36-4 0.

7. Бактериологическая диагностика раневой инфекции: Метод, рекомендации -М., 1984. -22 с.

8. Балтрашевич А.К., Воропаева С.Д., Анкирская A.C. и др. Выделение бактероидов из патологического материала // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1982. - № 12.- С.48-52.

9. Балтрашевич А.К., Кушнарёва М.В., Емельянова А.И., Комаровская Т.Р. Микробиологические исследования при послеродовом эндометрите // Лаб. дело. 1983. - № 1.- С.40-43.

10. Балябин A.A., Кочеровец В.И., Столбовой A.B. Некло-стридиальные анаэробные инфекции мягких тканей // Архив патологии. 1983. - № 3. - С.12-18.

11. Белая Ю.А., Бунин К.В., Белая О.Ф. Реакция специфических антигенов шигелл и сальмонелл с антительным стафилококковым диагностикумом // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1981. - N11. -С.112-113.

12. Бунин К.В., Белая О.Ф. Сравнительная диагностическая ценность при острой дизентерии иммунных реакций РИГА, ко-агглютинации, встречного иммуноэлектрофоре-за // Эпидемиология, патогенез и лечение дизентерии.- Саратов, 1982. С.23-25.

13. Волков А.П. Изучение анаэробных инфекций человека: Обзор основных направлений // Тр. Гос. мед. ин-та. -Иваново, 1990. С.24.

14. Воробьев A.A., Васильев H.H. Адъюванты.- М.: Медицина, 1969. - 206 с.

15. Гольдин Р.Б. Принципы и методы получения риккетси-озных и орнитозных сывороток для приготовления изних стандартных флюоресцирующих конъюгатов. Сообщ.

16. Критерии и методы оценки активности сывороток //Тр. ин-та эпидемиологии и микробиологи им. Л.Пастера.- Л., 1969.- Т.37.- С.155-163.

17. Гольдин Р.Б. Принципы и методы получения риккетси-озных и орнитозных сывороток для приготовления из них стандартных флюоресцирующих конъюгатов. Сообщ.

18. Схемы и методы получения высокоактивных риккетси-озных сывороток //Там же.- С.164-170.

19. Гольдин Р.В., Вельская Л.В., Крюкова И.Н., Шаханина К.Л. Иммунофлуоресценция в медицине.- М. : Медицина, 1977.- 47 с.

20. Гольдин Р.Б., Красник Ф.И., Прусакова 3.М., Рудин

21. Гублер Е.В., Генкин A.A. Применение непараметрщче-ских критериев статистики в медико-биологических исследованиях.- Л.: Медицина, 1973. 142 с.

22. Гук A.C. Особенности клиники, диагностики и лечения одонтогенных воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области с участием неспорообразующих анаэробов: Автореф. Дис. . канд. мед. наук. Л., 1990. - 24 с.

23. Джалашев Я.Х., Половой A.M. Этиологические особенности неклостридиальной анаэробной инфекции при холициститах // Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций: Тез. докл. Всесоюзной конф. -М., 1991. С.176-178.

24. Добрынин В.М., Раевский К.К., Кочеровец В.И. Совершенствование схем и методов микробиологической диагностики раневых инфекций и дизбактериозов //Материалы юбилейной научной конференции посвящ. 70 летию НИИ микробиологии МО РФ Киров,- 1998.- С. 8485.

25. Евдокимов В.В., Гукасян JI.A., Богоявленская И.Ю. Реакция ко-агглютинации в дифференциальной диагностике менингитов // Лаб. дело. 1983. - № 8.1. С.45-47.

26. Журавлева К.И. Статистика в здравоохранении.- М. : Медицина, 1981.-143с.

27. Иванов Ю.И., Погорелюк О.Н. Статистическая обработка результатов медико-биологических исследований на микрокалькуляторах по программам. М. : Медицина, 1990. - С.154.

28. Карпищенко А. И., Зеленин К.Н., Элькин Г. И. Экспресс-диагностика анаэробной инфекции. //Клин. лаб. диагностика.- 1997.- № 5.- с.37.

29. Колесов А.П., Столбовой A.B., Кочеровец В.И. Анаэробные инфекции в хирургии. Л.: Медицина, 1989.160 с.

30. Колесов А.П., Столбовой A.B., Кочетков A.B. Некло-стридиальная анаэробная инфекция JI.: Медицина, 1982. - С.5-10.

31. Комаровская Т.П. Видовой состав не образующих пигмента бактероидов, выделенных из клинического материала и из кишечника здоровых людей // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1983. - № 3. - С.39-44.

32. Коникова P.E., Носков Ф.С., Баяр Г.А. Разработка эритроцитарных препаратов для выявления антигенов и антител в РИГА // Реакции непрямой гемагглютинации.- Л., 1981. 87с.

33. Королюк A.M. Применение реакции коагглютинации для обнаружения и быстрой идентификации возбудителей иерсиниоза и псевдотуберкулеза // Лаб. дело. 1984.- № 4. С.250-252.

34. Королюк A.M., Милевский Е.И. Медицинская микробиология. М.: Медицин, 1983. - 253 с.

35. Королюк A.M., Ремезов П.И. Медицинская иммунология. Л.: Медицина, 1981. - 177 с.

36. Костючек Д.Ф. Особенности гнойно-септической инфекции после аборта: Автореф. дис. . доктора мед. наук. Л., 1988.- 39с.

37. Костюченок Б.М., Кулешов С.Е. Проблема анаэробной неклостридиальной инфекции мягких тканей // Анаэробная неклостридиальная инфекция в гнойной хирургии: Всесоюз. Симп. Тернополь, 1989. - С.31-33.

38. Кочеровец В.И. Неклостридиальная анаэробная инфекция ведущая этиологическая форма полимикробных инфекций в хирургии: Дис. . д-ра мед. наук / Воен.-мед. акад. - J1., 1990. - 554 с.

39. Кочеровец В.И. Результаты клинико-микробиологи-ческого обследования пострадавших в случаях развития гнойно-септических осложнений // Воен.- мед. журн. -1991. № 6. - С.26-29.

40. Кочеровец В.И., Столбовой A.B. Методические основы выделения неспорообразующих анаэробов при гнойно-септических заболеваниях // Лаб. дело. 1982. - № 11т - С.680-682.

41. Кубица Ю.Ф. Иммунофлуоресценция: Пер. с польского М.: Мир, 1967. -157с.

42. Кузин М.И., Костюченок Б.М. Раны и раневая инфекция: Руководство для врачей. М. : Медицина, - 1990. - С.149-166.

43. Кузин М.И., Костюченок Б.М., Кулешов С.Е. Анаэробная неклостридиальная инфекция в гнойной хирургии // Раны и раневая инфекция. М., 1986. - С.201.

44. Кулешов С.Е. Диагностика и хирургическое лечение анаэробной неклостридиальной инфекции мягких тканей: Дис. . д-ра мед. наук. М., 1989. - 487 с.

45. Кулешов С.Е., Ляпис М.А. Анаэробная неклостридиальная инфекция в гнойной хирургии // Вестн. хирургии. М., 1990.- № 5.- С.141-144.

46. Култаев M.C. Неспорообразующие анаэробы при гнойно-воспалительных заболеваниях челюстно-лицевой области: Автореф. дис. . канд. мед. наук. М.,1985. -23с.

47. Леннет Э., Шмидт Н. Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний.- М. : Медицина, 1971. 527с.

48. Махмудов Ю.А. г Кочеровский Ю.Э., Абдумаликова З.А. Люминисцентный микроскоп в экспресс-диагностике анаэробной инфекции // Мед. журн. Узбекистана. 1982. - № 3. - С.44-46.

49. Методические рекомендации по микробиологической диагностике заболеваний, вызванных неспорообразующими анаэробными бактериями // Кочеровец В.И., Петраков A.A., Пономарева Т.Р. и др. М., 1996. - 49 с.

50. Миронов А.Ю. Бактериологическое и газохроматографи-ческое исследование неспорообразующих анаэробов при гнойно-воспалительных заболеваниях челюстно-лицевой области и ЛОР-органов: Автореф. дис. . канд. мед. наук. М., 1987. - 17 с.

51. Михайлов И.Ф. Дьяков С.И. Люминесцентная микроскопия. Л.: Медгиз, 1961. - С.198.

52. Новокшенов B.C. Диагностика и химиотерапия местных форм хирургической анаэробной неклостридиальной инфекции: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Самара, 1992. - 21 с.

53. Носков Ф.С. Реакция ко-агглютинации // Иммунологическая диагностика вирусных инфекций / Под ред. Т.В.Перадц и П.А.Халинена. М., - 1985.-С.Д45-168.

54. Об унификации микробиологических (бактериологичегских) методов исследования, применяемых в клиникопрофилактических учреждений: Приказ МЗ СССР № 535 от 22.04. М.,1985. 126 с.

55. Окропиридзе Г.Г., Петраков A.A., Арутчева A.A. Анаэробные бактериемии при гнойно-септических осложнениях у травматологических и хирургических больных // Хирургия.- 1996.- №1.- С.70-72.

56. Организация бактериологического контроля за раневой инфекцией в экстремальных условиях // Блохина И.Н., Беляев Е.И. и др. Методические рекомендации Горький, 1989.- 54 с.

57. Покровский В.И. Медицинская микробиология.- М.: Медицина, 1998.- 670с.

58. Столбовой A.B., Кочеровец В.И. Диагностика неклост-ридиальных анаэробных инфекций // Хирургия. 1981.диагностическихлабораторияхлечебно- № 5. С.29-31.

59. Тайц В'.M., Зуева Л.П. Инфекционный контроль в лечебно-профилактических учреждениях. /СПбГМА им. И.И.Мечникова,-СПб., 1998.- 295с.

60. Титова Е.И., Савранская С.Я., Есипов С.Е. и др. Получение гипериммунных сывороток к микробным клеткам

61. B.fragilis и Citrobacter с использованием иммуностимулятора СТП // Актуальные вопросы медицинской биотехнологии: Материалы науч. конф., посвящ. 85-летию Томского НИИ вакцин и сывороток.: Тез. докл.- Томск, 1991.- Ч.2.- С.138-140.

62. Тышко А.Г. Роль неклостридиальных анаэробных микроорганизмов в этиологии и патогенезе осложненных форм острого холецистита // Клин, хирургия. 1986. - № 9. - С.20-22.

63. Хазенсон С.Л. Реакция ко-агглютинации и ее применение для идентификации и обнаружения бактерий, вирусов, растворимых антигенов // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1983. - № 2. - С.8-3.

64. Хазенсон С.Л. Использование реакции ко-агглютинации для идентификации шигелл //Там же. 1983.- № 7.1. C.89-92.

65. Царев В.Н., Ушаков Р.В., Ванеева Н.П., Ястребова Н.В., Разработка тест-систем для определения антител к В.melaninogenicus с помощью твердо-фазного иммуно-ферментного анализа // Клин. лаб. диагностика. 1993. № 5. - С.11-15.

66. Цвелев Ю.В., Кира Е.Ф., Кочеровец В.И., Баскаков В.П. Анаэробная инфекция в акушерско-гинеко-логической практике СПб.: Питер, 1995. - 313 с.

67. Шимчук Л.Ф., Игудин Л.И., Каунельсон Н.В. и др. О культивировании анаэробных неспорогенных микроорганизмов // Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии.: Тез.докл. Махачкала, 1990.- С.146-147.

68. Abshire R.LT, Dowell V.R., Lombard G.L. Serological study of trichloroacete acid extracts of B.fragilis // J. Clin. Microbiol. 197 9. - Vol.9, № 2. -P.274-279.

69. Abshire R.L., Lombard G.L., Dowell V.R. Fluorescent-antibody studies on selected strains of Bacteroides fragilis // J. Clin. Microbiol. 1977.- Vol.9, № 6. P.425-432.

70. Anhald J. P. Fluorescent antibody proceduses and counterimmunoelectrophoresis // Lab. Proc. Clin. Microbiol. New York. 1981. - P.249-277

71. Babb J.L., Cummins C.S. Relationships between serological groups and deoxyribonucleis acidhomology groups in Bacteroid.es fragilis and related species // J. Clin. Microbiol. 1981.- Vol.13, № 2. - P.369-379.

72. Badger S.J., Tanner A.G. R. Seroligical studies of Bacteroides fragilis, Compilobacter concisus, Wolinello recta and Eikenella corradens // Intern. J. System. Bacteriol.- 1982.- Vol. 31, № 4.- P. 446451.

73. Balows A., Hauslere W.J., Herrman K.L. Manual of clinical Microbiology.- Washington: D.C., 1991.- 5 ed.- 1364p

74. Beckmann I., Meisel-Mikolajzyk F. Serologische Reaktivit von Gesunden, Kranken und Tumor-Kranken Gegenber Antigenen Verschiedener Dacteroides Serotypen // Zbl. Bactriol. Pararitenk Infektions Krankh und Hyg. 1979. - Bd.168, № 5-6.- S.452-462.

75. Beckmann I., Van Eijk H.G., Meisel-Mikolaj zyk F., Wallenburg H.C.G. Detection of 2-keto-3deoxyoctonate in endotoxines isolated from six reference strains of the B.fragilis group // Intern. J. Biochem. 1989. Vol.21, №.6. - P.661-666.

76. Bennion R.S., Wilson S.E., Russell W.A. Early portal anaerobic bacteremia in mesenteric ischemia //Arch. Surg. 1984.- Vol. 119, N2. - P.151-155.

77. Bergey's manual of systematic bacteriology, / Eds S.T.Staley et al. Baltimore: Williams a. Wilkins, 1989.-Vol.3.-784p.

78. Bernard K.,Cooper C., Johnson W. Prevalence of anaerobes of reerred to the Canadian National Referece Centre from 1984 to 1996.: Pap. Meet.17 6

79. Anaerobe Soc. Amer., Chicago, 19-21 Juli, 1996 //Clin. Infec. Diseas.- 1997.-№ 25. -P.241-243.

80. Bixler-Forell E., Bertram M.A., Bruckner D.A. Clinical evaluation of three rapid methods of the detection of significant Bacteriuria // J. Clin. Microbiol. 1985. - Vol. 22, № 1. - P.62-67.

81. Bjornson A.B. Role of complement in host resistance against members of the Bacteroides // Rev. Infec. Diseas. 1984. - Vol.6, № 1. - P.34-39.

82. Bjornson A.B. Role of humoral factors in host resistance to the Bacteroides fragilis group // Ibid.- 1990.- № 12. P.161-168.

83. Bjornson A.B., Bjornson H.S. Participation of immunoglobulin and the alternative complement pathway in opsonization of B.fragilis and B.thetaiotaomicron // Rev. Inftc. Diseas. 1979. -Vol.1, № 2. - P.347-356.

84. Bobb J.L., Cummins C.S. Relationships between serological groups and deoxyribonucleic acid homology groups in Bacteroides fragilis and related species // J. Clin. Microbiol. 1981. - Vol.13, № 2. - P.369-374.

85. Bourgault A. Lamothe F. Update on pan-American activities in the field of anaerobes Canada.: Pap. Meet. Anaerobe Soc. Amer., Chicago, 19-21 Juli, 1996 //Clin. Infec. Diseases 1997.- № 25. P.237-240.

86. Brazier J.S., Goldstein E.J.C., Citron D.M., Ostovari M.I. Fastidious anaerobe-agar compared with Wilkins-Chalgren agar for susceptibility testing of Fusobacterium species // Antimicrob Agents and

87. Chemothel. 1990. - Vol.34, № 41. - P.2280-2282.

88. Brook I. Aerobic and anaerobic microbiology of infections after trauma // J. Accid. Emerd. Med.-1998.- Vol.15, № 3. P.162-167.

89. Brook I. Bacterial infection associated with malignancy in children. // J. Int. J. Pediatr. Hematol-Oncol. 1998.- Vol.5, № 6.- P.379-386.

90. Brook I. Recovery of anaerobic bacteria from a post-traumatic nasal septal abscess -A report of two cases. // J. Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 1998.-Vol.107, N11.- P.959-960.

91. Brook I., Frazier E. Aerobic and anaerobic infection associated with malignancy //J. Support. Care Cancer. 1998.- Vol. 6, № 2.- P.125-131

92. Brook I., Frazier E. Aerobic and anaerobic microbiology of chronic venous ulcers. // J. Int. J. Dermotal. 1998.- Vol.37, № 6.- P.426-428.

93. Brook I., Frazier E. Aerobic and anaerobic microbiology of dacryocystitis. //Amer. J. Ophthalmol.- 1998.- Vol.125, № 4. P.552-554.

94. Brook I., Frazier E. Aerobic and anaerobic microbiology of keratitis //J. Ann. Ophthalmol. Glaucoma. 1999.- Vol.31, № 1. - P.21-26.

95. Brook I., Frazier E. Aerobic and anaerobic microbiology of surgical-site infection following spinal fusion // J. Clin. Microbiol. 1999.-Vol.37, № 3. - P.841-843.

96. Brook I., Frazier E. Microbiology of liver and spleen abscesses // J. Med. Microbiol. -1998.-Vol.47, № 12.- P.1075-1080.

97. Brook I., Frazier E. Significant recovery of nonsporulating anaerobic rods from clinical specimens // Clin. Infec. Descases. 1993. Vol.16, № 4. - P.476-480.

98. Brook I. The role of encapsulated anaeribic bacteria in synergistic infection // FEMS Microbiol. Rev. 1994. - Vol.13, № 1. - P.65-74.

99. Brook I., Yocum P. Imiriun response to Fusobacterium nucleatum and Prevotella intermedia in patients with chronic maxillary sinusitis // J. Ann. Otol. Rhlnol. Laryngol. -1999.- Vol.108, № 3. P. 293-295.

100. Brook I., Yocum P., Shah K. Aerobic and anaerobic bacteriology of otorrhea associated with tympanostomy tubes in children //J. Acta. Oto-Laryngol. 1998.- Vol.118, № 2. - P.206-210.

101. Caselitz F.H., D. Krebs, Raabe W. Serologische studien Shaerophorus Infektionen. Zentrabe Bakteriol Parasitekd Infect // Hyg. Abt. 1968. - Vol.208, № 1. - P.338-343.

102. Casiciato D.A., Rosenblatt J.E., Bluestone R., Goldbery L.S. Susceptibility of isolates of Bacteroides to the Bactericidal activity of normal human seryum // J. Inf. Diseas. 1979. - Vol.140,1. P.109-113.

103. Chan E.C.S., J. De Vries, Harvey R.F., Tam Y.C. Use of fluorescens microscopy for monitoring periodontal desease state // Canadian J. Microbiol. 1981. -Vol.27, № 7. - P.675-678.

104. Chedid L. Adjuvants of immunity // Ann. Inst. Pasteur, Immunol. 1985. - Vol.136 D. - P.283-291.

105. Cherniak R., Lombard G.L., Dowell V.R. Immunochemical evidence for multiple serotypes of B.fragilis // J. Clin. Microbiol. 1979. - Vol.9, № 6. - P.699-704.

106. Claros M. Susceptibility of isolates of Bacteroides //Clin. Infec. Diseases 1997,- Vol.25, № 3.- P.-295-298.

107. Goldstein E.J.C., Agyare E.O., Silletti R. Comparative growth of Eikenella corrodens on 15 Media in three atmospheres of incubation // J. Clin. Microbiol. -. Vol.13, № 5.- P.951-953.

108. Collee J.G. Current classification of anaerobic bacteria // J. Infec. 1979. - Vol.1, supple.1. -P.3-12.

109. Collee J.G. The role of anaerobes and possible indications for anti-anaerobe chemotherapy ininfections of the head, neck and thorax // J. Antimicrob. Chemoth. 1982. - Vol.10, suppl. A, № 2.- P.145-151.

110. Costin J.D., Cappner M., Schmidt W. Anaerocult a new system for cultivation of microaerophilic and capneic // European Congress of Clinical microorganisms Microbiology.-Bologaa, 1983.- P. 7881.

111. Courant P.R., Gibbons R.S. Biochemical and immunological Keterogeneity of B.melaninogenicus // Arch. Oral Biol. 1977. - Vol.12. - P.1605-1613.

112. Cox M. Explosive potential of gas mixtures commonly used in anaerobic chambers.: Pap. Meet. Anaerobe Soc. Amer., Chicago, 19-21 Juli, 1996 //Clin. Infec. Diseas. 1997.-№ 25. - P.140.

113. Dalmau D., Cayouette M., Lamothe F., Vincelette J. Clindamycin resistance in the B.fragilis group: Association with hospital-acquired infections // Clin. Infec. Diseas.- 1997.- Vol.24, № 5. P.874-877.

114. Danielsson D., Lambe L.W. Immunology of anaerobic bacterial infections in Immunology of human infection / Eds Nahmius A.S. and O'Reilly R.S. New Iork, 1981. - P.317-343.

115. Deborah G., Sheila P. Emmorson M., Clarue G. Expression of Bacteroides fragilis fimbriol antigenin vitro and in vivo // Biochem. Soc. Transt. 1989. - Vol.17, № 4. - P.758-759.

116. Diedrich D.L., Martin A.E. Outer membrane proteins of the Bacteroides fragilis group // Current

117. Microbiol. 1981. - Vol.6, № 2. - P.85-88.

118. Dietlein E., Pulveres G. Differenril rung der humanmedirinisch relevanten Arten der B.melaninogenicus gruppa // Arrtl. Lab. 1989. -Vol.35, № 11. - P.255-260.

119. Domingues R. M.C., Fonseca M.E.F., Ferreira M.C.S. Hemagglutination activity of B.fragilis as a virulence marker // Rev. Microbiol. 1991. Vol.22, № 4. - P.272-281.

120. Doty S.L., Lopatin D.E., Syed S.A., Smith F.N. Humoral immune response to oral microorganisms in periodontitis // Infec. and Immun. 1982. Vol.37, № 2. - P.499-505.

121. Drugeon H.B., Chung S.S., Courtien A.L. Detection des anaerobies par immunofluorescence direct e sur les prelevements clinigues: evalution des Fluoretec F et M // Ann. Biol. Clin. 1981. - Vol.39. -P.181-184.

122. Ebersole J.L., Frey D.E., Taubman M.A. Serological identification of oral Bacteroides spp. by Enzyme-linked immunosorbent assay // J. Clin. Microbiol. -1984. Vol.19, № 5. - P.639-644.

123. Edelman R. Vaccine adjuvants // Rev. Infect. Deseas. 1980. Vol.2, № 3. - P.370-383.

124. Edvards R. Resistens to b-lactam antibiotics in B.fragilis. // J.Med. Microbiol. 1997.- Vol.4 6, № 12. - P.979-986.

125. Elhag K.M., Bettelheim K.A., Tabaqchali S. Serological studis of B.fragilis // J. Hyg. 1977 . - Vol.79. - P.233-241.

126. Elhag K.M., Tabaqchali S. A study of the surface and somatic antigens of B.fragilis // J. Hyg.-1978.- Vol.80. P.439-449.

127. Fales W.H., Feresa G.W. Fluorescent antibody technique for identifyiny isolates of Sphaerophorus necrophorum of bovine hepatic abscess origin // Am. J. Vet. Res. 1972. - Vol.33. - P.2323-2329.

128. Finegold S.M., Jousimies-Somer H. Pecently described clinically important anaerobic bacteria: Medical aspects: Pap. Meet. Anaerobe Soc. Amer., Chicago, 19-21 Juli, 1996 //Clin. Infec. Diseases.-1997,- № 25. P.88-93.

129. Finegold S.M. Anaerobes problems and controversies in bacteroiology infections and susceptibility tesiny // Rev. Inf.Diseas. 1990. - Vol.12, suppl.2. - P.223-230.

130. Gary C., Poxton I.R. Analysis of LPS of B.fragilis by sodium dodecyl sulphate-polyacytamide gel electrophoresis and electroblot tranfer // FEMS Microbiol. Lett. 1983. - Vol.20, № 3. - P.461-465.

131. Girolami P.L., Mepani C.P. Evaluation of a direct fluorescent antibody staining method for rapid identification of members of the Bacteroides fragilis group // Amer. J. Clin. Path. 1981. -Vol.76, № 1. - P.78-82.

132. Griffin M.H. Fluorescent antibody techniques in the identification of the gram-negative nonsporeforming anaerobes // Helth Lab. Sci. 1970.- Vol.7. P.78-83.

133. Hardic J.M. Application of chemotoxonomic techniques to the taxonomy of anaerobic bacteria // J.Inf.Desies. 1989. - № 62.- P.7-14.

134. Hofstad J. Cross-reactivity of Bacteroides fragilis o-antigens // Act. Path. Microbiol. Scand. 1977. - Vol.B.85. - P.9-13.

135. Hofstad J. Immunochemical studies of partially hydrolyzed lipopolysaccharide from Fusobacterium nucleatum ATCC 10953 // Act. Path. Microbiol. Scand.- 1982. Sect. B 90, № 4. - P.289-293.

136. Hofstad J. Serological properties of LPS from oral strain of B.melaninogenicus // J. Bact. 1969. -Vol.97. - P.1076-1082.

137. Hofstad J. Current taxonomy of medically important nonsporiny anaerobes // Rev.Infec.Diseas. 1990. -Vol.12. - Suppl.2. - P.122-126.

138. Hofstad J. Immunochemical studies of lipopolysaccharide and partially degraded lipopolysaccharide from Bacteroides fragilis IP2 E323 // Act. Path. Microbiol. Scand. 1982. - Sect. B 90, № 4. - P.281-287.

139. Hofstad J. Lipopolysaccharides from anaerobic GramNegative Rods // Infection. 1980. - Vol.8, Supp 2.- P.152.

140. Hofstad J. Precipitating carbohydrate antigens of

141. Bacteroides fragilis NCTC 9343 // Act. Path. Microbiol. Scand. 1981. - Sect. B 89, № 4. -P.215-219.

142. Hofstad J. Serological responses to Antigen of Bacteroid-aclal // Microbiol. Rev. 197 9. - Vol.43, № 1. - P.103-115.

143. Hofstad J., Skaug N., Bgornland J. O-antigenic cross-reactivity in Fusobacterium nucleatum // Act. Path. Microbiol. Scand. 1979. - Sect. B 87, № 6. -P.371-374.

144. Holland J.W., Cagnet S.M., Lewis S.A., Stauffer L.R. Clinical evaluation of a simple rapid procedure for the presumptive identification of anaerobic bacteria // J. Clin. Microbiol. 1977. - Vol.5, № 4. - P.416-426.

145. Holst E., Oscarson J., Mardh P.A. Evaluation of twofluorescent test Kits for detection of selected Bacteroides species in clinical specimens // Curr. Microbiol. 1979. - № 3. - P.133-136.

146. Hoppes W.L., Rissing J.P., Smith J.W., White A.C. Radioimmunoassay for B.fragilis infection // J. Clin. Microbiol. 1980. - Vol.12, № 2. - P.205-207.

147. Hsu P.C., Minshew B.H., Williams B.L., Lennard E.S. Use of immunoperoxidase method for identification of Bacteroides fragilis // J. Clin. Microbiol. 1979. - Vol.10, № 3. - P.285-289.

148. Jones G.R., Gemmell C.G. Impairment by Bacteroides spesies of opsonisation and Phagocytosis of enterobacteria // J. Med. Microbiol. 1981. Vol.15, № 3. - P.351-361.

149. Jonsson S.r Musher D.M., Chapman A., Gorec A., Clinton E.L. Phagocytosis and killing of common bacterial pathogens of the lang by human aeveolar macrofages // J. Inf. Dis. 1985. - Vol.152, № 1. -P.4-14.

150. Kasper D.L. Chemical and biological characterization, of the lipopolysaccharide of Bacteroides fragilis subspecies fragilis // J. Inf. Dis. 1976. - Vol.134, № 2. - P.59-66.

151. Kasper D.L. The polysaccharide capsule of B.fragilis subspecies fragilis immunochemical and morphological definition // J. Inf. Dis. 1976. -Vol.133, № 1. - P.79-87.

152. Kasper D.L., Fiddian P.A., Tabagchali S. Rapid diagnosis of Bacteroides infections by Indirect Immunofluorescent assay of clinical specimens //1.nceti. 1979. Vol.7. - P.239-242.

153. Kasper D.L., Finagold S.M. Virulence factor anaerobic // Rev. Inf. Die. 1986. - Vol.2.1. P.245-400.

154. Kasper D.L., Hayes M.E., Reinap B.G., Craft F.O., Onderdonk A.B., Polk B.F. Isolation and identification of encapsulated strains of Bacteroides fragilis // J. Inf. Dis. 1977. Vol.136.- P.75-81.

155. Kasper D.L., M.W. Seiler. Immunochemical characterization of the outer membrane complex of Bacteroides fragilis subspecies fragilis // J. Inf. Dis. 1975. - Vol.132. - P.440-450.

156. Kasper D.L., Onderdonk A.B., Grabb J.B.F., Bartlett J.G. Protective efficacy of immunization with capsular antigen against Experimental infection with Bacteroides fragilis // J. Inf. Dis. 197 9. Vol.5, № 5. - P.724-731.

157. Kasper D.L., Weintraub A., Lindberg A.A., Lonngren J. Capsular polysaccharides and lipopolysaccharides from two Bacteroides fragilis Reference strains: chemical and immunochemical characterization // J. Bacteriol. 1983. - Vol.153, № 2. - P.991-997.

158. Labbe M., Delamare N., Pepersack F., Crokaert F.,

159. Yourassowsky E. Detection of Sacteroides fragilis and Bacteroides melaninogenicus by direct immunofluorescence // J. Clin. Pathol. 1980. Vol.33, № 12. - P.1189-1192.

160. Lambe D.W. Characterization of a polyvalent conjugate of Bacteroides fragilis by fluorescent antibody staining // Amer. Soc. Clin. Pathol. 1979. Vol.71. № 1. - P.97-101.

161. Lambe D.W. Determination of Bacteroides melaninogemnicus serogroups by fluorescent antibody staining // Appl. Microbiol. 1974. - Vol.28. -P.561-567.

162. Lambe D.W., Moroz D.A. Serogrouping of Bacteroides fragilis subsp. Fragilis by the agglutination test //J. Clin. Microbiol. 1991.- Vol.3. - P.586-592.

163. Lindberg A.A., Berthold P., Nord C.E., Weintraub A. Encapsulated strains of Bacteroides fragilis in clinical specimens // Med. Microbiol. Immunol. 1979 Vol.167, № 15. P.29-36.

164. Linder S.G., Marcelis J.H., De Vas N.M., Hoogkamp-Korstanje. Intracellular Polysaccharide of B. fragilis // J. General Microbiol. 1979. Vol.111, № 1. - P.93-99.

165. Linnea L., Monoclonal antibody to the immunodominant lipopolysaccharide antygen of

166. B.fragilis cross-reacting with type II group B. streptococci diss // Turku. 1988. - 49 p.

167. Linnea L., Viljanen M.K. B.fragilis lipopolysaccharide and group B.streptokoccus II glycocalyx have a common major antigenic determination // APMIC. 1988. - Vol.96, № 9. -P.805-812.

168. Manscheim B.J., Kasper D.L. Detection of anticapsular antibodies to • Bacteroides asacchorolyticus in serum from rabbits and humans by use of an enzyme-linked Immunosorbent // Assay J. Inf. Dis. 1979. - Vol.140, № 6. - P.945-951.

169. Marsh P.D.; Ailsa S., McDermid A.S. Effect of haemin on enzyme activiti and cytotoxin production by B.gingival!s W50 // FEMS Microbiol. Leff. 1988.- Vol.55, № 1. P.87-91.

170. Meisel-Mikolajczyk F. Serological studies of Bacteroides vulgatus from normal gut flora // Act. Microbiol. Pol. 1989. - Vol.38, № 2. - P.171-176.

171. Meisel-Mikolajczyk F., Didoszak A. Immunochemical investigations on Bacteroides fragilis antigenic structure // Act. Microbiol. Polonic. 1980. Vol.29, № 2. - P.125-133.

172. Meisel-Mikolajczyk F., Grzelak-Puczynska J. Rapid Serotyping of Bacteria of the Bacteroides fragilis group by Direct Immunofluorescence, Serotype Specific Conjugates // J. Appl. Bacteriol. 1981. -Vol.51, № 1. - P.17-26.

173. Meisel-Mikolajczyk F., Rokosz A., Grzelak-Puczynska J. Serological Activity of Bacteroides fragilis Endotoxins-Strains Isolated In Poland // J. Appl. Bacteriol. 1981. - Vol.51, № 3.- P.399-404.

174. Meisel-Mikolajczyk F., Serological Prorerties of Bacteroidaceae // Europ. J. for the Clinical Study and Treatment of Infections. 1980. - Vol.8, supp.2. - P.140-141.

175. Meisel-Mikolajczyk F., Zawidzka E. A comparativ study of entorotoxin-producing B.fragilis strains isolated in Poland Pap. Meet. Anaerobe Soc. Amer., Chicago, III., 19-21 Juli, 1997 //Clin Infec. Diseases.- 1997.- Vol. 25, № 3.- P.-151-152.

176. Mouton C., Hammond P., Slats J., Genco R.J. Evaluation of Fluoretec-M for Detection of Bacteroides asaccharolyticus and Bacteroides melaninogenicus // J. Clin. Microbiol. 1980.1. Vol.11, № 6. P.682-686.

177. Mouton C., Hammond P.G., Read M.J., Genco R.J. Identification of B.gingivalis by fluorescent antibody staining // Ann. Microbiol. 1982. Vol.13, № 1. - P.69-83.

178. Munford R.S., Dietzchy J.M. Effects of specific antibodies hormoner and lipoproteins on bacterial lipopolysaccharides injected in to the rat // J. Infect. Dis. 1985.- Vol.152, № 1. - P.175-185.

179. Noboru 0., Migazaki K., Chida T., Niwagama K. Serogrouping of B.vulgatus by the agglutination test / / J. Clin. Microbiol. 1985. - Vol.22, № 1. -P.56-61.

180. Onderdonk A.B., Cisneros Ronald L., Finberg Robert, Crabb Joseph H., Kasper D.L. Animal model system for studying virulence of and host. responce to B.fragilis // J. Inf. Diseas. 1990. - № 12, suppl.2. - P.169-177.

181. Onderdonk A.B., Kasper D.L., Cisnros J.C. The capsular polysacharide of Bacteroides fragilis as avirulence factor-comporison of the pathogenic patential of encapsulated and unencapsulated strains // J. Inf. Dis. 1977. - Vol.136, № 1. - P.82-89.

182. Otto B.R., Verweing-van Vught A.M., van Doom J., Maclaren D.M. Outur membrane proteins of Bacteroides fragilis and Bacteroides vulgatus in relation to iron up take and virulence // Microbiol. Pathol. -1988.- Vol.4, № 4. P.279-283.

183. Papastathopoulou A., Bezirtzoglou E., Legafis N. B.fragilis production and sensitivity to bacteriocins // Anaerobe. 1997.- Vol.3, № 2-3.-P.203-206.

184. Poxton I.R., Braun R.r Sawyerr A., Ferguson A. The mucosal anaerobic gramnegative bacteria of the human colon: Pap. Meet. Anaerobe Soc. Amer., Chicago, III., 19-21 Juli, 1996 //Clin. Infec. Diseases.-1997.- Vol.25, № 3.- P.111-113.

185. Poxton I.R., Broun R., Collee J.C. Detection of species-specific and cross reactive cell-surface antigens of Bacteroides species by an indirect enzyme-linked Immunosorbent assay // J. Med. Microbiol. 1982. - Vol.15, № 12.- P.223-231.

186. Pruzzo C., Benedetto D., Ricchetti M. Piliated B.fragilis strains adhere to epithelial cells and ar. More sensitive to phagocytosis by human neutrophils than nonpilated strains // Inf. and Immun. 1984. - Vol.43, № 1. - P.189-194.

187. Pruzzo C., Gusman C., Benedetto D. Incidence of hemagglutination activity among pathogenic and nonpathogenic B.fragilis strains and role of capsuleand pili in HA and adherence // FEMS Microbiol. Lett. 1989. - Vol.59, № 1-2. - P.113-118.

188. Ramos J.M., Pilar G.C., Roblas F.R., Saniano F. Bacteriemia por anaerobios analisis de 131 episodios // Enferm. Inf. Microbiol. Clin. 1994. - Vol.12, № 1. - P.916.

189. Reed M.J., Slots J., Mouton C., Genco R.J. Antigenic studies of oral and nonoral black-pi gmented Bacteroides strains // Inf. and Immun. -1980. Vol.29, № 2. - P.564-574.

190. Roael P. Lauwers S. Evaluation of six different commercial blood culture media for the isolation of anaerobic bacteria.: Pap. Meet. Anaerobe Soc. Amer., Chicago, III., 19-21 Juli, 1996 // Clin. Infec. Diseases.- 1997.- Vol.9, № 25. P.141-142.

191. Rokosz A., Meisel-Mikolajczyk K. The toxicity of B.thetaiotaomicron cell surface antigens to chicken embryos // Act. Microbiol. Rol. 1990. - Vol.39, № 3-4. - P.211-214.

192. Romond C., Beerens H. Studies of the antigenic structure of the B.fragilis species // Infection. -1980. Vol.8, supp.2.- P.42.

193. Romond C., Romond M. Les neuvelles mithodes d'identification des bacteries anaerobies // Rev.

194. Fr. Lab. 1993. - Vol.22, № 255. - P.65-69.

195. Rosenblatt J. Can we afford to do anaerobic cultures and identification?: Pap. Meet. Anaerobe Soc. Amer., Chicago, III., 19-21 Juli, 1996 //Clin. Infec. Diseases.- 1997.- Vol.25, № 3. P.127-131.

196. Ross C.C., Gilmore R.F. Serological diagnosis of B.fragilis infections by complement fixation test // J. Clin.Pathol. 1978. - Vol.31, № 11. - P.1083-1084.

197. Rostad K., Bakken V. , Hofstad T. //Heat shock response of B.fragilis.: Pap. Meet. Anaerobe Soc. Amer., Chicago, III., 19-21 Juli, 1996 // Clin. Infec. Diseases.- 1997.- Vol.25, № 3. P.289-290.

198. Shah H., Collins M.D. Proposal to restrict the genus Bacteroides (Castellani and Chalmers) to Bacteroides fragilis and closely related species // Inf. J. Syst.Bacterid.- 1989.- Vol.39, № 1. P.85-87.

199. Slack M.P., Griffiths D., Johnston H.H. The fluoretec system for rapid diagnosis of bacteroides infections by immunofluorescence of clinical specimens // J. Clin. Pathol. 1981. - Vol.34, № 12. - P.1381-1384.

200. Sonnenwirth A. Antibody response to anaerobic bacteria // Rev. of Inf. Diseas. 1979. - Vol.1, № 2. - P.337-341.

201. Soriano F., Ponte C., Castilla S. M. Effect of B. fragilis on mortality induced by E.coli in an experimental infection treated with cefotoxime as treanam of gentamicin // J. Antimicrob. Chemoter. -1989. Vol.23, № 3. - P.383-388.

202. Stauffer L.R., Hill E.O. Indirect fluorescent antibody procedure for the rapid detection and identification of Bacteroides and Fusobacterium in clinical specimens // J. Clin. Microbiol.- 1975. -Vol.2, № 1. P.337-344.

203. Ste-Marie M.T., Lee E.M., Brown W.R. Radioimmunologic measurements of naturally occuring antibodies // Pediatr. Res. 1974. - № 8. - P.815-819.

204. Storz H. Stand and Entwicklung Stendenzen der

205. Anwendung Fluonrenzmikrosk oprscher // Zgenamte Hyg. und Gren. 1989. - Vol.35,'№ 10. - P.589-591.

206. Toshiharu S., Hiroko K. Fimbriae and hemagglutination in the B.fragilis group // Jap. J. Red. Sci. 1984. - Vol.46, № 3. - P.373-375.

207. Wade B.H., Kasper D.L., Mendel G.L. Interactions of B.fragilis and phagocytes: studies with whole organisms purified capsular polysaccharide and clindamycin-treated bacteria // J. Antimicrob. Chemother. 1983. - Vol.12. - P.51-62.

208. Waiff L.F., Anderson L.A., Sendbery G.P., Aeppli D.M., Shelborne C.E. Fluorescence immunoassay for detecting periodontal bacterial pathogens In plaquae // J.Clin. Microbiol. 1991. - Vol.29, № 8. -P.1645-1651.

209. Walker C., Bueno L. Anaerobic resistent in an oral Isolate of Prevotella Intermedia.: Pap. Meet. Anaerobe Soc. Amer., Chicago, III., 19-21 Juli, 1996 //Clin. Infec. Diseases.- 1997,- Vol.25, № 3. -P.281-283.

210. Weintraub A., Lindberg A., Nord C. Identification of B.fragilis by indirect immunofluorescence // Med. Microbiol. Immunol. 1979. Vol.167, № 4. - P.223-230.

211. Weissteld A.S., Sonnenwirth A.C. Rapid detection and identification of B.fragilis and B.melaninogenicus by immunofluorescence // J. of Clin. Microbiol.- 1981. Vol.13, № 4. - P.798-800.

212. Wexler H. Pore-forming molecules in gram-negative anaerobic bacteria.: Pap. Meet. Anaerobe Soc. Amer.,

213. Chicago, III., 19-21 Juli, 1996 //Clin. Infec. Diseases.- 1997.- №25. P.284-286.

214. Williams P. Role of the cell envelope in bacterial adaptation to growth in vivo on infections // Biochim. 1988. - Vol.70, № 8. - P.987-1011.

215. WInkelhoff A.J., Standergen M. Further characterization of Bacteroides endodontalis on assachorolytic black-pigmented Bacteroides species from the oral cavity // J. Clin. Microbiol.- 1985.-Vol.22, № 1. P.75-7 9.

216. Yasui H., Yasutake N., Ohwaki M. Immunogenicity of Bacteroides isolated from mice: relationship between immunogenicity and cell wall antigens //Inf.and Immun.- 1979.- Vol.24, № 1.- P.39-46.

217. Yousef i-Mashouf R., Ely A., Duerden B. Characterization of non-pigmented species of the genues Prevotella by polyceylamlde gel electroforesis // J. Med. Microbiol. 1992. Vol.37, № 2. - P.83-90.

218. Zhang G., Weintraub A. Identification of B. fragilis by Co-agglutination, using a specific monoclonal antibody.: Anaerobe.- 1997 Vol.3, № 5.-P. 295-306.