Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ АНДРОГЕНЕЗ И КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ ПШЕНИЦЫ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К СТРЕССАМ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ АНДРОГЕНЕЗ И КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ ПШЕНИЦЫ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К СТРЕССАМ"

/\~20ЪЦ

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

БЕККУЖИНА Сара Сабденовна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ АНДРОГЕНЕЗ И КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ ПШЕНИЦЫ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К СТРЕССАМ

Специальность 03.00.23 — биотехнология

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1993

----/'и I

на в лаборатории генетической и клеточной дела и Кафедры сельскохозяйственной био-технг

ч I

Научный-руководитель —кандидат биологических наук

И Д Никифорова

Официальные оппоненты — доктор биологических наук,

профессор И. П Ермаков,

кандидат биологических наук А В. Мезенцев

Ведущее учреждение — Институт физиологии

растений РАН.

Защита состоится « / июня 1993 г. в 14 30

на заседании специализированного ученого совета Д 120 35.07 в Московской сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева.

Адрес: 127550 г. Москва И-550, ул. Тимирязевская 49, сектор защиты диссертаций.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке МСХА.

Автореферат разослан « » мая 1993 года.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук А. С. Лосева.

Подп. в пр" 93 г.

Объем 1 п л Зак 277

нгаографил МГУЛ

Тир. 100

Актуальность проблемы. Проблема создания новых сортов хозяйственно-ценных видов растений, сочетающих в себе комплексную устойчивость к экстремальным факторам среды с высокой продуктивностью,является важнейшей задачей селекционных программ. Изменения климатических условий на земном шаре требуют постоянного улучшения сортов сельскохозяйственных культур. Длительное нарушение технологии орошения приводит к засолению почв и, как следствие этого, к снижению урожайности сельскохозяйственных культур. Для создания новых сортов и гибридов сельскохозяйственных растений применяются, как традиционные методы селекции, так и методы-биотехнологии.

Мзтод-экспериментальной гаплоидии уже нашел применение в селекционной практике. С его помощью в России и за рубежом уже получены сорта таких важных зерновых культур, как рис, ячмень, пшеница. Получение гомозиготных линий «методом ■культуры пыльников или изолированных микроспор позволяет существенно сократить сроки селекции. Однако низкая э<М>ек-тивность выхода гаплоидных структур, недостаточная изученность физиологических и цитозмбриологических механизмов эмбриогенеза, ограниченные возможности регулирования этого процесса пока не позволяют широко применять эту технологию.

Наиболее эффективным, на каш взгляд, может оказаться привлечение комплекса методов биотехнологии для решения теоретических и практических задач селекции. Сочетание методов клеточной селекции и клонального размножения с последующим переведением новых устойчивих форм в гомозиготное состояние будет способствовать не только созданию большого генетического разнообразия и отбору перспективных форм, но и углублению представлений о генетических и физиологических механизмах устойчивости.растений .к стрессам.

Цель и задачи. Целью данной работ было оценить возможность проведения селекции на устойчивость к засолению на уровне гамет методом культуры пыльников. Кроме того,на базе метода клонального размножения разработать технологию, позволяющую сочетать вегетативное размножение пшеницы с.од-

ЦЕ ИТРАЛЬНАЯ НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА Моск. соль-кохоз академии им. К. А.л иммрл^е;

Инв. №

штт

новременным тестированием на устойчивость к засолению на уровне це.-ого растения.

Для достижения поставленных целей было необходимо выполнить следующие задачи:

- провести оптимизацию условия культивирования пыльников пшеницы;

- изучить влияние условий засоления на формирование андроклинных структур в культуре пыльников пшеницы;

I - получить дигаплоилные растения;

- изучить возможность клонального размножения пшеницы;

- изучить влияние засоления ча процесс клонального размножения различных генотипов пшеницы и выделить устойчивые формы.

Научная новизна Впервые показана возможность образования эмориоидов и каллусов в культуре пыльников пшеницы в условиях засоления. Подобраны концентрации селектирующего Фактора, позволяющие проводить селекцию по разным схемам. Сделан первый шаг в разработке технологии гаметной селекции на устойчивость к засолению. Показано, что среди расте-ний-регенерантов, полученных ранее методами клеточной селекции, существуют Форш, продемонстрировавшие толерантность к засухе или засолению. Впервые предложен способ микроклонального размножения пьеницы в стрессовых условиях, пизводяквдй наряду с тестированием на устойчивость к засолению размножать устойчивые форны.

Практическая значимость Разработка технологии гаметной .-олекции на базе культуры пыльников позволит получать константные устойчивые линии пшеницы, что существенно сократит сроки селекции. Предложенный способ тестирования и размножения пшеницы позволяет совершенствовать технологию клеточной селекции и повысить ее эффективность. Полученные дигаплолдные формы пшеницы переданы в КазПИИЗернового хозяйства для создания на их основе новых сорюв.

Апробация работы Результаты исследования представлены на И Российском симпозиум« "Новые методы биотехнологии

. - з - .

растений"1993 года,на конференции молодых ученых Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева в 1992 . и 19.93 годах, на Всесоюзной научной конференции по биотехнологии в Целинограде, на заседании Кафедры сельскохозяйственной биотехнологии ТСХА. Г- ■ ■

Публикации. По материалам диссертации опубликовано три работы. • '

' Объём и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов и обсуждения и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 120 страницах текста, содержат 14 таблиц, 9 рисунков и 15 фотографий.0 Библиография содержит 215 источников отечественной и зарубежной литературы.

■ ' ' ОБЪЕКТЫ :< МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В качестве, объектов исследования были использованы сорта яровой мягкой пшеницы (ТПЫсшп абэМуипО селекции Северо-Казахстанского селекционного центра - Целинная-21 (Ц -21) и Целинная-юбилейная (Ц-Ю), а также сорт Саратовс-кая-29 (С -29) и Московская-35 (М-35). Кроме того,объектами исследования служили второе семенное поколение линий, полученных ранее в Лаборатории генетической и клеточной инженерии МСХА (Джозеф 1991,) в результате клеточной селекции на устойчивость к засолению - АССК1, полученная из сорта Ц-21 и КС Кб, полученная из сорта Ц-Ю, а,также шестое семенное поколение линий 1-6 и 1-34, полученных ранее в ИФР РАН из сорта Ц-Ю методом клеточной селекции на устойчивость ' к водному стрессу. • »

Донорные растения для культуры пыльников выращивали в полевых условиях на Кафедре селекции ЮХА. . В. осенне-гимний период растения выращивали в теплицах кафедры селекции и семеноводства ТСХА.а также в теплицах НПО Подмосковье,где температура поддерживалась в интервалах 22-25*С и фотопери: од 16-18 часов.

Для вычленения пыльников использовали растения в фазе трубкования. Срезанные колосья подвергали холодовой предобработке (+4*С). Кроме того.проводили предобработки донорных растений посредством опрыскивания их на корню (аа 7 дней до среаки) растворами фитогормонов (ИУК и БАШ. а также феру-ловой или аканитовой кислотами. Обозначали их- ИУК1, БАП1, АК1 и <И. Кроме предобработки растений на корню использовали двойную обработку,когда физиологическиактивные вещества добавляли в воду при холодовой предобработке срезанных колосьев. обработанных теми же веществами на корню. Такие варианты обработки обозначали- ИУК2,БАП2,АК2 и

Для культивирования пыльников использовали традиционно применяемые для этой цели составы сред- N6, С-17, ьлайдза, картофельная среда Р2, VI4 жидкие или с добавлением агара. Кроме того, эти среды модифицировали добавлением картофельного экстракта. пшеничного крахмала,гидролиэата казеина, аминокислот и различных моносахаридов. В обпей сложности вами было испытано 15 вариантов сред. Культивирование проводили в темноте при температуре 26*С. Через 30 дней после инокуляции пыльников образовавшиеся андроклинные структуры переносили на среду Блайдза для регенерации растений. По мере роста регенерантов и образования у них хороших корней переносили их в сосуды со средой Кнопа и выращивали до фазы кущения, после чего подвергали диплоидизации колхицином (0,02 X колхицина) (Дьячук,1989). После диплоидизации растения переносили в сосуды с почвой и выращивали до созревания.

В экспериментах по клональному размножению пшеницы эа основу была взята работа Штвеева Н. А. и Сидорова В. А. 1989 Пяти-семи дневные стерильные проростки пшеницы срезали, оставляя 1-1,5 см. высотой и помести на среду ыс с добавлением 2 мг/л гибберелловой кислоты и 0.5 мг/л кинетина. Культивировали при 22- 25*С и 1Ь часовом Фотопериоде в течение 30 дней. После чего, образовавшиеся дополнительные побеги переносили на среду МС без гормонов для укоренения. При проведении этих экспериментов в стрессовых условиях в

- Б - ■/.

среды добавляли различные концентрации NaCl.

Все эксперименты проводили в трёхкратной повторности и число эксплантов в одной точке превышало 30. Все экспериментальные данные проанализированы и статистически обработаны по общепринятым методам (Доспехов»1977; Дьячук,1989 ).

■ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. . • ' .

Раздел 1. Экспериментальный андрогенез для селекции яровой пшеницы.

Проблема получения мутантов на гаплоидном уровне давно привлекает- внимание исследователей. Это объясняется прежде всего тем, что на гаплоидном уровне можно выявить рецессивные мутации, ■■ а при удвоении числа хромосом можно получить константные дигаплоидные формы, что чрезвычайно валю, как для фундаментальных генетических исследований, так и для' практической селекции. Существуют исследования, в которых при использовании мутагенеза в системе протопластов из мезофилла листа гаплоидных растений были получены ауксотроф-ные и биохимические мутанты (Carlson 1973, Gebhardt et al 1981). Применение подобной техники для зерновых в настоящее время невозможно из-за методических трудностей. Однако, сочетание гаплоидной техники с техникой клеточной селекции в применении к зерновым культурам может служить одним из подходов к достижению той же цели - способствовать получению измененных, константных форм. / ;

Данная работа является частью исследований проводимых в Лаборатории- генетической и клеточной, инженерии Кафедры биотехнологии MOXA, в задачи которой входит создание^методами in v'itro высокопродуктивных форм яровой лшеницы, устойчивых к экстремальным факторам окружающей среды. В наши задачи входило разработать систему для отбора устойчивых к засолению форм ка гаплоидном уровне при культивировании пыльников используя при этом кроме комерческих сортов фор-

ми, полученные методами клеточной селекции на устойчивость к засолению.

1.1. Влияние холодовой предобработки на культуру пыльников пшеницы.

Известно, что холодовая предобработка срезанных колосьев увеличивает выход андроклинных структур в культуре пыльников различных видов растений. Поэтому первым этапом наоей раСогы было выяснение оптимальных сроков холодовой обработки для изучаемых сортов. Были использованы три сорта пшеницы: Целинная-21, Ыосковская-35 и Саратовская-29; и три продолжительности периода обработки 0,6 и 10 дней, ¿слученные результаты свидетельствуют, что сорта различаются между собой по эффективности андрогенезв. Так в условиях нашего эксперимента, для сорта Саратовская-29 максимальный выход эмбриоподобных структур наблюдался при использовании необработанных холодом растения. Тогда как для сорта Московская -35 оптимальным периодомм обработки было 6 дней,а для Целин-ной-21 - 10 дней. Таким образом, нами установлено, что существует сортоспецифическая реакция культуры пыльников на холодовую обработку и установлены оптимальные сроки этой обработки.

Так как основная работа в дальнейшем проводилась с сортами Ц-21 и Ц-Ю,а также с линиями, полученными из атих сортов мы использовали 10 дневную холодовую обработку колосьев.

1.2. Влияние генотипа и условий культивирования на эффективность культуры пыльников.

Дня определения роли генотипа в ответе на условия культивирования пыльники четырех сортов пшеницы культивировали на трех вариантах сред, традиционно применяемых в культуре пыльников. N6, Р2 и С-17. Результаты эксперимента

. .- 7 - • приведены в таблице 1. * , '

Таблица 1. Влияние генотипа на эффективность ' ' культуры пыльников пшеницы.

* число эффект.

Сорт Среда вью ах. андраген. • ' г

пыльников * , .

Нв 190 3,8 11.3

Р2 ■ . 230 ° 8,6 11.3 .

С17_ '360 V - ' ":,Ч ' :

•*. N6 230 . ' • 2,6 Ц.1 -

Р2 ' ' БОО 1.0 10.4 '

С17 БОО - 1,0 Л4 V'

N6 200 - • 2,0. ±0.9

Р2 | 600 3,0 10. 6

С17 600 1,3 Ю.Ч .

• N6 ■ 500 .'.'/-. .

Р2. 300 5,6 . 11.3 у -;

... • • •

Из представленных данных видно./Что среди испытанных• сортов Целинные сорта оказались наиболее отаывчивьм на ус- ' ловия культивирования. Однако,' эффективность выхода гаплоидных структур существенным образом зависит от составами-' тательной среда Почти для всех сортов картофельная 'среда Р2 была оптимальной при культивировании' пыльников. Одна-, ко.опыт,дальнейшей работы покааал.что результаты очень сильно варьировали в зависимости от сорта и состояния кар-, тофеля,из которого Готовился экстракт. Ввиду нестабильности

С-29

М-35

- в -

получаемых результатов нам пришлось отказаться от сред с картофельным экстрактом и в основном использовать модифицированную среду N6.

1.3. Влияние предобработок донорного растения на эффективность андроклинии в культуре пыльников.

Известно, что в некоторых случаях предобработка донор-

I

ных растений биологически активными веществами способствует повышению эффективности культивирования пыльников (Куо, Harada 1988. .Кучко.Ыаруненко 1986).С целью повышения эффективности выхода гаплоидных структур мы использовали опрыскивание колосьев донорных растений до срезки (за 7 дней) и добавление в воду при холодовой обрабо!ке растворами индо-лилуксусной кислоты (ИУК2), 6-бензиламинопурина (6- ВАГЕ), феруловой (.C/Z) и аканитовой (АК2) кислот. Результаты данного эксперимента, проведенного на сорте Целинная-21, представлены в таблице 2.

Предобработка донорных растений веществами различной природы в нашем эксперименте в большинстве случаев привела к снижению частоты выхода андроклинных структур. Однако, обработка растений, в некоторых случаях, существенно увеличила выход регенератов из образовавшихся структур (см. рис.1).

Интересно, что обработка только аканитовой кислотой при невысоком выходе гаплоидных структуре 5,1 и СХ) приводит к повышению морфогенной способности образовавшихся структур.

Известно, что технология получения гаплоидных форм складывается из двух чрезвычайно сложных и труднорегулиру-емых этапов. Первый - это перепрограммирование микроспор с гаметофитного пути развития на спорофитный с предпочтительным развитием по пути прямого эмбриогенеза. Вгорой -регенерация растений из структур, образовавшихся на первом этапе. Гистологические и гистохимические исследования эмб-

Рис. 1 Влияние предобработки растений - доноров яа регенерацию растения ив гаплоидных структур.

г во п>

■ ев

• ш.

V*..4«

20

. о

^ - контрольные растения. / •• • •

[—I: - обработка растений на корню аконитовой кислотой. Ц 11 - обработка растений на корню и срееанныг колосьев аконитовой кислотой. :

- обработка растений на корню и среванных колосьев

б-бензкяаминопурином. /'

ТТР - обработка растений на корню, я среванных колосьев феруловой кислотой.

- обработка растений на корню и среаанных колосьев

индолилуксусной кислотой.

- в -

Таблица 2. Влияние предобработки растений физиологичес-киакхивными веществами на эффективность андрогенева.

Кол-во Кол-во X

Среда Обработка андроген. андроген.

пыльников структур стр.

N6 - 190 7 3,6 ±1.3

иг - 230 20 8,6 tl.8

N5 се 160 4 2,5 tl.2

Р2 се 160 5 3,1 ±1.3

Р2 АК1 86 5 6,1 ±2.0

N6 АК2 250 11 4,4 тх.2

Р2 АК2 150 6 4,0 ±1.6

NÖ ИУК2 160 4 2,5 ±1.2

Р2 ИУК2 170 18 9.4 ±2.3

N6 БАП2 100 6 6,0 ±2.3

Р2 БАГЕ 170 9 5,2 ±1.7

риоидов, образовавшихся в культуре пыльников Brassica juncea ( КIran S. et al 1989) показали аномальное развитие эмбриоидов(недоразвитая апикальная или корневая меристемы), препятствующее нормальному их прорастанию. Вероятно, в нашем случае,. предобработка донорных растений в некоторых случаях способствовала более гармоничному развитию эмбри-оидса в культуре пыльников.

Кроме того,для различных видов растений ( особенно для дчменя) существует проблема регенерации зеленых растений ввиду высокой частоты появления альбинных форм. В культуре пыльников пшеницы проблема альбинизма не стоит так остро. В наших экспериментах была получена только одна альбинная, форма у сорта Целинная-21. /

Таким образом, заключая подготовительный этап навей работы можно заключить,что использованные в работе сорта

• - 10 -

обладают не высокой эффективностью в культуре пыльников при том, что выявлена сортовая специфика ответа на условия культивирования. Следует отметить, что сорт Целинная-21 Продемонстрировал наибольшую отзывчивость в культуре пыльников. Сорт Целинная- юбилейная оказался менее эффективным. Несмотря на предпринятые - попытки модификаций сред (было ■ испытано 15 вариантов) и различных обработок донорных растений,, нам не удалось существенным образом повысить выход эмбриоидов и каллусов в культуре пыльников пшеницы. Однзко положительным результатом можно считать обнаруженную возможность повышения уровня регенерации растений из гаплоидных структур при обработке донорных растений аканитовой кислотой.-—_____ : .

1.4. Особенности андрогенеза у потомства растений-регене-рантов,полученных методами клеточной селекции..

В наши задачи входило переведение в гомозоготное состояние растений-регенерантов, полученных в результате клеточной селекции и показавших свою перспективность-в лабораторных или полевых испытаниях. Для этого использовали семена растений-регенерантов второго семенного поколения для АССК1 и ВССКб,которые были получены при селекции' на устойчивость, к засолению, или шестого семенного поколения для форм 1-6 и 1-34, полученных методом клеточной селекции из сорта Целинная-юбилейная на устойчивость к водному стрессу и в полевик испытаниях в Красноярском аграрном университете продемонстрировавших высокую продуктивность,в сочетании с . устойчивостью к корневой гнили. Пыльники культивировали на различных питательных средах. Результаты . данного "эксперимента приведены'в таблице а. . .. .С-: I '

Из представленных данных видно, что.лЬтомство растений -регенерантов различается между собой по ответу на условия культивирования. Так форма АССК1 не отличается от исходного сорта Д-21 по эффективности образования гаплоидных струк-

- 11 -

Таблица а Влияние генотипа на эффективность андрогенеэа.

генотип Среда ЧИСЛО пыльников Число андро! ен. структур X андроген. структур

У14 200 2 1.0 ±0.7

Ц-21 У14-2 200 4 2,0 ±0.9

1 N6-6 400 15 3.8 ±0.9

АССК1 У14 100 1 1.0 ±0.9

N6-6 160 6 3.8 ±1.5

У14 150 0 0

Ц-Ю N6-6 700 9 1.2 ±0.4

мал 100 7 7.0 ±2.0

ВССК6 \п4-г 100 1 1.0 ±0.9

N6-6 200 21 10 ±0.7

У14 300 2 0.6 +0.4

1-6 У14-2 300 0 0

N6-6 400 2.2 ±0.7

1Л4 300 0 0

1-34 «4-2 300 1 0,3 ±0.3

N6-6 400 22 5,5 ±1.1

тур. Однако среди регенерантов полученных из сорта Целинная-юбилейная наблюдается значительное разнообрсш-е по ответу на условия культивирования. Выделяется своей высокой эффективностью форма ВССК5, причем это свойство проявляется на двух вариантах сред (N6-6 и VI4). Ллния 1-34 также превзошла по способности к формированию ¿ндро^инных структур ис-

• ■ - 12 -ходный сорт(Ц-Ю). Оптимальной для всех форм в этом эксперименте была среда N6-6. .

Таким образом, на основании представленных данных можно заключить, что среди растений-регенерантов могут встречаться формы,обладающие более высокой способностью к образованию гаплоидных структур чем исходный сорт. Следовательно» в результате сомаклональной вариабельности могут быть затронуты гены, контролирующие процесс смены программы с гаметофитного на спорофйтный путь развития в культуре пыльников..

1.5. Влияние засоления на развитие1андроклинных структур _1_в культуре пыльников пшеницы.

Ввиду того, что среди растений-регенерантов использованных в наших экспериментах были формы, полученные из устойчивых к засолению клеточных линий, было интересно изучить влияние засоления на частоту образования андроклинных структур в культуре пыльников. В эксперименте были использованы линии АССК1 и ВССКб полученные из сортов Ц-21-. и Ц-Ю соответственно. Растения были высеяны-в поле в два срока (в мае, как обычно, и в июле 1892 года) для того,чтобы иметь две повторности в условиях одного года. Концентрация соли была выбрана из рассчета на порядок ниже, чем используется при селекции соматических клеток. Результаты эксперимента приведены в таблице 4. / /

Данные, представленные в таблице 4 свидетельствуют о том, что формирование эмбриоподобных''структур в стрессовых условиях у- различных генотипов происходит с разной интенсивностью. Причем, увеличение концентрации соли в среде-ве-дет к , снижению эффективности андрогенеза у.всех испытанных форм.-Концентрация 0,05% ЫаС1 приводит к снижению эффективности вдвое, . то есть является полулетальной концентрацией. Только у линии А<рсК1 концентрация соли 0,051 снижает эф-

- 13 -

Таблица 4. Влияние засоления на эффективность

андрогенеза в культуре пыльников пшеницы.

ишь сентябрь

Генотипы Среда ----------------------------------

кол-во 2 кол-во 2 N6-6 пыльн. структ. пыльн. структ.

1 1 - 500 0,8 ±0. 4 200 2,5 ±1.1

ц-ю +0.05ХМаС1 500 0 300 1.3 10.6

♦0,1 2ЛаС1 500 0 300 0,5 ±0.4

- 100 10,0 ±3.0 100 11,0

ЕССКб +0,052МаС1 100 4,0 +1.9 100 6.0 ±2.3

+0,1 5ДОаС1 100 2,0 11.4 100 2,0 +1.4

- 200 2,5 ±1.1 200 5.0 ±1.5

Ц-21 +0,052МаС1 500 1.8 ±0.5 300 2.0 +0.8

+0,1 £N301 500 1.2 +0. 4 300 1,0 +0.3

100 з|о +1.7 60 5,0 +2.8

АССК1 +0,05ЗД1аС1 40 2,5 +3.4 50 4,0 +2.7

+0,1 ЗУ1аС1 40 0 50 0

х Фективность андроген«за только на 202 от контороля. К сожалению, ограничения в количестве семян от растений-реге-нералтов не позволило нам увеличить масштаб вьйорки, что повысило бы достоверность результата. Однако, тот фага, что результаты июльского и сентябрьского вариантов, несмотря на различия в абсолютных значениях, имеют общую тенденцию, позволяет предположить, что линия АССК1 мелет обладать большей толерантностью к засолению, чем исходный сорт Це-линная-21.

Многочисленные исследователи анрогенеза на различных видах растений подчеркивают, что на эффективность культуры

- 14 -

пыльников существенное влияние оказывает физиологическое состояние донорных растений. Отмечается, что оптимальным материалом являются растения, выращенные в полевых услови-_ ях. Наш экспериментальный опыт полностью подтверждает литературные данные Мы наблюдали значительную вариабельность по частоте образования змбриоидов и каллусов в различных экспериментах в зависимости от физиологического состаяния донорных растений и убедились, что использование растений, выращенных в теплицах нежелательно, ввиду резкого снижения уровня ответа в культуре пыльников. Поэтому при провел*«!.« экспериментов по сравнению различных генотипов или различных условий культивирования мы старались использовать полевые растения, а оценку результатов проводили по каждому эксперименту.

Приведенные в таблице 4 два варианта данных, полученных в разные сроки одного года, демонстрируют,что даже в условиях полевого эксперимента на эффективность в культуре пыльников большое влияние оказывает Физиологическое состояние растений. Низкая эффективность культуры пыльников летних растений в данном эксперименте может быть обусловлена угнетенным состоянием донорных растений, так как лето 1992 года характеризовалось сильной засухой. Однако, эти условия не сказались на эффективности культуры пыльников линии ВССКб. что может служить поводом для предположения о том, что она обладает большей устойчивостью к засухе, чем исходный сорт (Ц -Ю).

К сожалению нам не удалось регенерировать растений из структур, образованных в условиях солевого стресса. Однако, результаты, полученные в ходе работы, позволяют надеяться на положительный исход работы в целом. Необходимы дополни! елыше цитозмбриологнческие исследования, в результате которых можно будет выявить аномалии (если они существуют) в развитии змбриоидов и добиться регенерации растений через систему каллуса.

Растения-регенеранты, полученные нами в процессе отра-

.'■•■..■■'-.•' . - 1Б -Сотки метода,переданы в КазНИИЗернового хозяйства для испытаний и получения на их основе новых сортов.

Раздел 2. Клональное размножение для селекции пшеницы.

. В последнее . время в исследованиях по культуре клеток злаков получают развитие методы вегетативного размножения. Необходимость в клональном размножении появляется при отдаленной гибридизации, р результате которой наблюдается . низкая аавязываемость семян или полная стерильность гибридных растений. Кроме того, • необходимость в вегетативном размножении возникает в работах по клеточной селекции, когда из отселектированных клеточных линий получают единичные, уникальные растения, а для дальнейшего изучения или полевых испытаний требуется большое количество материала Размноже ние семенами в данном случае растягивает этот процесс на годы, приводя к расщеплению в последующих поколениях.

Именно с недостаточным количеством материала мы столкнулись в нашей работе ,при проведении работ по культуре пыльников, на материале полученном из устойчивых клеточных линий. Таким образом, разработка методов клоналыюго размножения необходима •' для создания полной технологической цепи, включающей клеточную селекцию,, . клональное размножение и культуру ПЫЛЬНИКОВ. -.'■■' ;

Методы традиционного клонального размножения для злаков в настоящее время разработаны недостаточно. При размножении гибридов при отдаленной гибридизации часто используют размножение через каллус, получая его из молодых соцветий, с последующей регенерацией растений. Известно,что культивирование каллуса приводит к сомаклональной вариабельности и поэтому-не всегда бывает приемлемо.." . ,

■ Для клонального размножения пшеницы использовали ■ индукцию кущения у стерильных проростков добавлением гиббет релловой кислоты и кинетина. Через•месяц, образовавшиеся дополнительные, побеги,;. ..переносили на безгормональную среду

Мурасиге-Скуга для укоренения. Таким образом,один цикл размножения включал в себя два этапа- собственно размножение и укоренение, и занимал по времени 1,5-2 месяца. Укоренившиеся побеги в дальнейшем могли быть использованы в следующем цикле размножения, или (после адаптации) для высадки в почву. В качестве объектов мы использовали сорта Целинная-21 и Целинная -юбилейная, а также второе семенное поколение двух линий, полученных из этих сортов - АССК1 (из Ц-21), и ВССКб (из Ц -Ю).

/

2.1 Влияние вида экспланта на формирование-дополнительных побегов у яровой пшеницы.

Известно, что для успешного развития клеточных технологий или клонального размножения различных видов растений большую роль играет выбор экспланта Долгие годы из культивируемых клеток злаков не могли регенерировать целое растение. И только тогда, когда в качестве экспланта стали использовать незрелые зародыши,появилась возможность регенерировать растения и применять клеточные технологии для селекции зерновых В нашей работе для клонального разм-ножени мы использовали в качестве зксплантов незрелые зародыш (14-16 дней после цветения), зрелые зародыши и семена Результаты этого эксперимента представлены в таблице б.

Анализируя полученные данные можно отметить, что в условиях данного экспег/мента у всех генотипов мы наблюдаем достаточно низкий коэффициент размножения Однако, возможность увеличения количества материала в 2-3 раза за месяц обнадеживала.

Как видно из представленных данных, незрелые зародыши не являются оптимальным объектом для клонального размножения, во всяком случае в условиях этого эксперимента Более высокие коэффициенты размножения получены для всех генотипов при использовании в качестве экспланта зрелых зароды-

■..'■'■••■ . • -.17 -

Таблица 6. Роль экспланта в формировании дополнительных

побегов у яровой пшеницы. . .............

! незр. зар. ; I зрел. зар. I семена

Зкспланты!,_

1 ....

Генотипы I 1 __ I

_1.

3 1 1 1

_I_

I

3 1.1

__1 _

Ц-21

37 4211,0 2Ь1 120 291 ±1,6 3,4 60 70*1.7 2,1

АССК1-2 20 30*0.8 2.5 10 42+0,7 5,2 9 18+0.9 3,0

Ц-Ю

45 30*2.3 1.6 16 26+1.6 2,6 46 20*1,7 1,4

ВССИ6-2 .7 18*0,7 3,5 10 37*0.8 4,7 12 30+0,6 3,5

Обозначения в таблице:. .

1 - число высаженных побегов

2 - число полученных дополнительных побегов

3 - коэффициент размножения .

•лей. Поэтому в нашей дальнейшей работе мы использовали толь-. ко зрелые зародыши. Такой эксплакт.. устраивал нас еще и. потому, ч?о незрелые зародыши не всегда доступны, а при использовании целых семян бывало трудно избавиться от внутренней инфекции. . . • 1 : .'..•

Кроме того,' из представленных данных видно.что из всех испытанных генотипов при' использовании различных эксплан-тов линии,, прошедшие через культур/ клеток,обладали более высокой способностью к образованию дополнительных побегов, чем исходные сорта. Причем исходные генотипы практически не различались между собой по интенсивности кущения. Эти результаты хорошо согласуются с данными полученными при полевых ипытаниях растений-регенератов,где отмечалась высокая продуктивная кустистость форм, полученных методами биотех-. нологии. • " ' ' N

Интересно,, что к концу пассажа у основного.'побега мы наблюдали прорастание и укоренение пазушных почек. . Такие проростки тоже в дальнейшем включались в размножение.

/ \. Г.-

Рис. 2 Особенности побегообразования в условиях ín vitro у различных генотипов яровой мягкой пшеницы.

| - X растений ве образующих дополнительных побегов О- X растений образующих 1-3 дополнительных побега 1X растения образующих 4-5 дополнительных побегов ЭД- X растений образующих 6-7 дополнительных побегов {3" 2 растений образующих 8-10 дополнительных побегов

' ■ ■ - 1В - ■ Для выявления различий 9 характере размножения мы проанализировали полученный материал с точки зрения частоты встречаемости проростков о различной эффективностью кущения. Результаты такого анализа представлены на рисунке 2. • . Исходные сорта и линия ВССКб практически не различаются между собой по характеру размножения. Модальные классы составляют проростки,образующие по 2-3 или 3-5 дополнитель-' ных побегов (до 90Х).Однако, у линии АССК1 появились побеги способные образовывать ■ „от б до 10 дополнительных побегов. Таким образом,; выявляются генотипические различия в харак-. те ре .размножения. ■ .. '>

При размножении во втором цикле мы обнаружили, что коэффициент размножения у большинства генотипов возрастает. Результаты этого эксперимента представлены в таблице 7.

Таблица 7. Образование дополнительных побегов во втором цикле размножения яровой пшеницы.

Генотипы

число эксплантов

.число доп. побегов

КОЭф.'

размнож.

Ц-21

v АССК1-2

ц-ю V

ВССКб-2

53

Ю

34 16

253+3.5 ... 70+1.8 244±2,9 , ,80*1.3

4.7

7.0

7.1

5,0

Возрастание.коэффициента размножения ' во втором цикле можно на наш взгляд объяснить с одной стороны адаптацией' к " условиям культивирования и отбраковкой форм не дающих дополнительных побегов, а с другой стороны отбором форм, обладающих высокой кустистостью. Для выяснения этих механизмов необходимы дополнительные' исследования..

■ 2.2. Укоренение дополнительных побегов.

Укоренение полученных после размножения , побегов . для многих видов•растений является сложной проблемой, требующей

специальной разработки. Ввиду того, что для укоренения растений-регенерантов пшеницы, полученных в культуре соматических клеток, нет необходимости в добавлении гормонов спо; собствующих укоренению. мы для укоренения использовали среду НС без гормонов. В таблице 8 приведены данные-по укоренению дополнительных побегов пшеницы в двух циклах размножения.

Таблица 8. Способность к укоренению дополнительных побегов в двух циклах размножения пшеницы.

1 I цикл 1 II цикл

Генотипы I 1

1 1 1 2 3 1 1 1 2 3

Ц-21 . 60 1 53*0,7 88 200 110*1,4 55

АССК1-2 52 10*0,4 19 50 25*1,6 50

Ц-Ю 42 34*1.2 80 200 92*0,9 46

ВССК6-2 47 16*0,5 34 80 35+1,3 44

1 - число побегов

2 - число укоренившихся побегов 3-Х укоренения.

• Из представленных данных видно, что в первом цикле размножения укоренение у побегов исходных сортов значительно выше, чем у семенного поколения растений-регенерантов. Однако. во втором цикле размножения процент укоренения у зтлх линий возрастает, в то время как способность к укоренению у дополнительных побегов сортов Целинная-21 и Целинная-юбилейная снижается. Представленные данные свидетельствуют, что процесс укоренения дополнительных побегов при размножении пшеницы также, как и укоренение других видов растений.требует дополнительных исследований. Тем не менее, полученные таким образом растения были перенесены в торфоперегнойные горшочки с песком для адаптации и в "последующем выращивали в почве до созревания. Следует отметить.

" 20 ~ ' '•■ . ' .' что при развитии в почве растения сохраняли сортовые признаки. Отличительньм признаком этих растения являлась . повышенная продуктивная.кустистость. У линии АССК1-2 количество' продуктивных побегов в почве составляло 6 побегов, а у исходного сорта ц-21 всего 3. """.''

Основываясь на полученных данных, можно провести расс-чет по эффективности применения метода клонального размно-; ження пвеницы. фи коэффициенте размножения равном 5 за один год (б циклов) ш „можем получить более трех тысячь растений. Такая технология значительно сократит затраты времени на размножение материала,*полученного методами биотехнологии. г'-,' ■''.."■■■'

2.3. Влияние засоления на процесс-вегетативного . размножения различных генотипов пвеницы.

^ Ранее в работах по клеточной селекции пшеницы на устойчивость к засорению (Джозеф 1991) было показано,, что устойчивость на клеточном уровне не всегда приводит к устой-, чивости целого растения. Существует проблемы ' тестирования" растений-регенерантов на устойчивость к засолению. Поэтому ^мырешили использовать систему размножения для тестирования, растений, проводя размножение в стрессовых условиях. Для этого использовали теже генотипы, которые размножали в присутствии различных концентраций .НаС1 ( О; 0,2; 0,4; 0,6 и 0,8 X NaCl). Результаты данного'эксперимента представлены в таблице 9.* "*_'• ;..*

Из представленных данных видно,. что с повышением концентрации соли у всех генотипов увеличивается число погибших проростков, хотя у сортов, это увеличение происходит быстрее, достигая более 50Х при 0,8Z NaCl. Увеличение концентрации* соли в среде приводит и к снижению коэффициентов размножения. Однако, обе линии, полученные ив клеточных линий устойчивых к засолению продемонстрировали.большую толерантность к соли'по способности образовывать дополнительные

- 21 -

Тайлица 9. Особенности вегетативного размножения пшеницы в условиях засоления.

кол-во кол-во КОЛ-ВО козффиц.

Генотипы эксплант. непро- дополн. разшож.

росших пророст.

Ц-21 О 120 0 411*1.4 3,4

0,2 ХНаС1 120 40*0,3 134*1,8 • 1.1

0.4 - 120 60*0.3 160+1.6 1.3

0.6 - 120 53+0,2 107*0,8 0,8

0.8 - 120 70*1,0 60+0,6 0.5

АССК1-2 0 10 0 62*1,3 6.2

0.2 ЗДаС1 . 70 . 0 230*1,8 3.2

0.4 - 70 7+0.2 216+0.7 3.0

0.6 - 70 14*0,3 156+0.5 2.2

0.8 - 70 , 20*0,5 140*0.8 2,0

Ц-Ю 0 120 0 380*1,9 3,1

0.2 £N301 •120 2012,6 251*2,0 2,0

0.4 - 120 47*1.4 197*0.9 1,5

0.6 - 120 58*0.8 115*1,7 0,9

0.8 - 120 73*1.1 64*0,9 0,7

ВССК6-2 0 10 0 47*2.3 4.7

0.2 ХЫаС1 100 8*0,6 312*2,0 3,1

0.4 - 100 14*0.5 249*1,7 2,4

0.6 - 100 24*0,8 216*1,8 2,1

0.8 -. 100 40+0.7 1 142*0,9 1.4

I

побеги в стрессовых условиях. Сравнение распределения характера кущения в стрессовых условиях показало,что увеличение концентрации соли в среде приводит у исходных сортов к пре-

■ V • "■ Л-" ' - 22 -обладанию доли некустящихся побегов. В то время, как у подученных линий характер размножения в' солевых условиях различался. Так для .пинии ACORI при- всех испытанных концентрациях соли характерно преобладание (до 702) побегов, образующих 2-3 дополнительных побега Линия ВССК6 при повышении концентрации до 0,62 NaCl сохранает достаточно большую долю эксплантов (20Z), способных образовывать до семи дополнительных побегов. Можно предположить, что такие различия в ответе на солевой стресс обусловлены гетерогенностью линии ВССКб-2, вызванной расщеплением при семенном размножении материала. • ;

На основании полученных данных можно заключить. что растения-регенеранты, полученные из устойчивых клеточных линий более толерантны к соли по способности образовывать дополнительные побеги в стрессовых условиях. Следовательно, признак приобретенный в результате сомаклоналыюй вариабельности, отобранный на клеточном уровне, сохраняется при переходе от клеточного уровня на уровень, целого растения,, передается в . поколениях и проявляется при размножении в стрессовых условиях.

выводы: • ';■■■'

■1. Впервые предпринята попытка проведения гаметной селекции яровой пшеницы (Triticum aestivum) на устойчивость к засолению, используя культуру пыльников.- Полученцые результаты позволяют рассчитывать на успешную разработку ; комплексной технологии создания новых устойчивых форм пшеницы.

2. Установлены концентрации селектирующего Фаотора при селекции на гаплоидном уровне. Обнаружено, что концентрация 0,052 NaCl является полулеталыюй для сортов пшеницы использованных в эксперименте. •

3. Выявлена у>оль фиг.дологического состояния' доиорного растения на процесс формирования гаплоидных' структур в

. культуре пыльников и предложены' способы повышения , уровня

регенерации растений из этих структур путем предобработки донорных растений.

4. Предложен способ сочетающий возможности одновремен ного тестирования на солеустойчивость на уровне целого растения с возможностью размножения устойчивых генотипов.

5. Показано, что расаения-регенеранты, полученные из устойчивых клеточных линий проявляют большую толерантность к стрессам, чем исходные сорта, что указывает на перспективность развития работ по клеточным технологиям для селекции яровой пшеницы.

6. г^-„'сз>1готные формы, полученные в культуре пыльников переданы в Каз. НИИЗернового хозяйства для испытаний и получения на их основе новых сортов.

Работы, опубликованные по теме диссертации

1. Беккужина С.С., Никифорова И.Д. Оптимизация условий выхода андро1енны" гаплоидов в культуре пыльников яровой мягкой пшеницы./ Тезисы докладов Всесоюзной научной конференции по сельскохозяйственной биотехнологии,- Целиноград. -1991. -С. 57.

2. Беккужина с. С., Никифорова И. Д. Влияние засоления на Формирование эмбриоподобных структур в культуре пыльников яровой пшеницы. / Тезисы докладов II Всероссийского симпозиума "Новые методы биотехнологии растений",- Пущино. -199а

3. Беккужина С. С., Никифорова И. Д. Клональное размножение и тестирование на солеустойчивость растений-ре-генерантов яровой пшеницы. / Тезисы докладов II Всероссийского симпозиума "Новые методы биотехнологии растений".- Пущино. - 1993.