Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспериментальный андрогенез и клеточная селекция пшеницы на устойчивость к стрессам

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Экспериментальный андрогенез и клеточная селекция пшеницы на устойчивость к стрессам"

РГ6 од

' МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА II ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ .АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи БЕККУЖИНА Сара Сабденовна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ АНДРОГЕНЕЗ И КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ ПШЕНИЦЫ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К СТРЕССАМ

Специальность 03.00.23 — биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Л\ о с к в а — 1993

Работа выполнена в лаборатории генетической и клеточ' ной инженерии Отдела и Кафедры сельскохозяйственной био технологии МСХА.

Научный руководитель •—кандидат биологических наук

И. Д. Никифорова

Официальные оппоненты — доктор биологических наук,

профессор И. П. Ермаков,

кандидат биологических наук А. В. Мезенцев

Ведущее учреждение —Институт физиологии

растений РАН.

Защита состоится « /О.» июня 1993 г. в 14.3(

на заседании специализированного ученого совета Д. 120.35.0^ в Московской сельскохозяйственной академии имени К. А Тимирязева.

Адрес: 127550 г. Москва И-550, ул. Тимирязевская 49, сектор защиты диссертаций.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке МСХА.

Автореферат разослан « » мая 1993 года.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук А. С. Лосева.

А

Поди, в печ. 30.04.93 г.

Объем 1 п. л. Зак. 277

тпографил МГУ Л

Тир. ЮС

Актуальность проблемы. Проблема создания новых сортов хозяйственно-ценных видов растений, сочетающих в себе комплексную устойчивость к экстремальным факторам среды с высокой продуктивностью,является важнейшей задачей селекционных программ. Изменения климатических условий на земном шаре требуют постоянного улучшения сортов сельскохозяйственных культур. Длительное нарушение технологии орошения приводит к засолению почв и, как следствие этого, к снижению уродавности сельскохозяйственных культур. Для создания новых сортов и гибридов сельскохозяйственных растений применяются, как традиционные методы селекции, так и методы биотехнологии.

Метод экспериментальной гаплоидии ужэ нашел применение э селекционной практике. С его помогаю в России и за рубежом уже получены сорта таких важных зерновых культур, как рис, ячмень, пиеница. Получение гомозиготных линий методом культуры пыльников или изолированных микроспор позволяет существенно сократить сроки селекции. Однако низкая эффективность выхода гаплоидных структур, недостаточная изученность физиологических и цитсэмбриологических механизмов эмбриогенеза, ограниченные возмотости регулирования этого процесса пока не позволяют широко применять эту технологию.

Наиболее эффективным, на наш взгляд, может оказаться привлечение комплекса методов биотехнологии для решения те-' оретических и практических задач селекции. Сочетание методов клеточной селекции и клонального размножения с последующим переведением новых устойчив!« Форм в гомозиготное состояние будет способствовать не только созданию большого генетического разнообразия и отбору перспективных форм, но и углублению представлений о генетических и физиологических механизмах устойчивости.растений к стрессам.

Цель и задали. Целью данной работы было оценить возможность проведения селекции на устойчивость к засолению на уровне гамет методом культуры пыльников. Кроме того,на базе метода ююнальиого'размножения разработать технологию, позволяющую сочетать вегетативное размножение пшеницы с од-

повременным тестированием на устойчивость к засолению на уровне целого растения.

Для достижения поставленных целей бьио необходимо выполнить следующие задачи:

- провести оптимизацию условий культивирования пыльников пшеницы;

- изучить влияние условий засоления на формирование андроклинных структур в культуре пыльников пшеницы;

I - получить дигадлоидные растения;

- изучить возможность клонального размножния пшеницы;

- изучить влияние засоления на процесс клонального размножения различных генотипов .пшеницы и выделить устойчивые формы.

Научная новизна Впервые показана возможность сбразова-шш эмОриоидов и каллусов в культуре пыльников пшеницы в условиях засоления. Подобраны гашцентрацш селектирующего 4актора,'позволяющие проводить селекции по разным схемам. Сделан первый шаг в разработке технологии гаметной селекции на устойчивость к засолению. Показано, что среди расте-ннй-регенерантов, полученных ранее методами клеточной селекции. существуют 4ормы, продемонстрировавшие толерантность к засухе или засолению. Впервые предложен способ микроклоналького размножения пшеницы в стрессовых условиях, позволяюйиЯ наряду с тестированием на устойчивость к засолению размножать устойчивые формы.

Практическая значимость. Разработка технологи! гаметной селекции на Сазе культуры пыльников позволит получать константные устойчивые линии пшеницы, что существенно сократит сроки селекции. Предложенный способ тестирования и размножения пшеницы позволяет совершенствовать технологию клеточной селекции и повысить ее э£4ективность. Полученные дигаялоадше формы пшеницы переданы в Каз}ШЗериового хозяйства для создания на их основе новых сортов.

Апробация работы. Результаты исследования представлены на II Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии

растений"1993 года.на конференции молодых ученых Московской сельскохозяйственной академии им. К. Л. Тимирязева в 1992 .и 1993 годах,на Всесоюзной научной-конференции по биотехнологии в Целинограде, на заседании Кафедры сельскохозяйственной биотехнологии ТСХА.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано три работы.

Обтем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов и обсуждения и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 120 страницах текста, содержат 14 таблиц, 9 рисушсов и 15 фотографий.4 Библиография содерякт 215 источников, отечественной и зарубежной литературы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объектов исследования были использованы сорта яровой мягкой пшеницы (ТгИлсит аезиуигп) селекции Северо-Казахстанского селекционного центра - Целинная-21 (Ц -21) и Целинная-юбилейная (Ц-Ю), а также сорт Саратовс-кая-29 (С -29) и Московская-35 (М-35). Кроме того,объектами исследования служили второе семенное поколение линий, полученных ранее в Лаборатории генетической и клеточной инженерии МСХА (Дяюзеф 1991.) в результате клеточной селекции на устойчивость к засолению - АССК1, полученная из сорта Д-21 и ВССКб, полученная из сорта Ц-Ю, а,такие шестое семенное поколение линий 1-6 и 1-34, полученных ранее в ИФР РАН из сорта Ц -Ю методом клеточной селекции ка устойчивость ; к водному стрессу. !

До норные растения для культуры пыльников выращивали в полевых условиях на Кафэдре селекции МСХА. В осенне-зимний период растения выращивали в теплицах кафедры селекции и семеноводства ТСХА, а также в теплицах НПО Подмосковье,где температура поддерживалась в интервалах 22-25'С и фотопериод 16-18 часов. • у "

Для вычленения пыльников использовали растения в фазе труОкования. Срезанные колосья подвергали холодовой предобработке (+4*С). Кроме того,проводили предобработки донорных растений посредством опрыскивания их на корню (за 7 дней до срезки) растворами фигогормошв (ИУК и БАЛ), а также феру-ловой или акаиитовой кислотами. Обозначали их- ИУК1, БАШ, АК1 и СИ. Кроме предобработки растений на корню использовали, двойную обработку,когда физиологлческиактивные вещества добавляли в воду при холодовой предобработке срезанных колосьев, обработанных теми хе веществами на корню. Такие варианты обработки обозначали- ИУК2.ВАП2,АК2 и Ф2. .

Для культивирования пыльников использовали традиционно применяемые для этой цели составы сред- N6, С-17, ¿лайдза, картофельная среда Р2, VI4 жидкие или с добавлением агара. Кроне того, эти .среды модифицировали добавлением картофельного экстракта, пшеничного крахмала.гидролизата казеина, аминокислот и различных моносахаридов. В общей сложности нами Ото испытано 15 вариантов сред. Культивирование проводили в темноте при температуре 26'С. Через 30 дней после инокуляции пыльников образовавшиеся андроклинные структуры переносили на среду Блайдза для регенерации растений. Пз ыере. роста регенерантов и образования у них хороших корней переносили их в сосуды со средой Кнопа и выращивали до фазы кущения, после чего подвергали диплоидизации колхицином (0,02 7. колхицина) (Дьячук,1989). После диплоидизации растения переносили в сосуды с почвой и выращивали до созревания.

В экспериментах по клоиадьному размножению Пшеницы за основу была взята работа Матвеева НА. и Сидорова Е А. 1989. Пяти-семи дневные стерильные проростки пшеницы срезали, оставляя 1-1,5 см. высотой и помещали на среду МС с добавлением 2 мг/л гиСберелловой кислоты и 0,5 иг/л кинетина. Культивировали при 22- 25'С и 15 часовом фогопериоде в те- .. чение 30 дней. После чего, образовавшиеся дополнительные по' беги переносили на среду УС без гормонов для укоренения. При проведении этих экспериментов ё стрессовых условиях' в /

- 6 -

среды добавлял)! различные концентрация NaCl.

Все эксперименты проводили в трёхкратной повторкости и число эксплантов в одной точке превышало 30. Все экспериментальные данные проанализированы и статистически обработаны по общепринятым методам (Доспехов, 1977; Дьячук,1989 ).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. • '

Раздел 1. Экспериментальный андрогенез для селекции яровой, пшеницы.

Проблема получения мутантов наггаплоидном уровне давно привлегаег.днимание исследователей. Это объясняется правде всего тем, чтб на гаплоидном уровне можно выявить рецессивные мутации, а при удвоении числа хромосом можно получить константные дигаплоидиие формы, что чрезвычайно ваэтго, как для фундаментальных генетических исследования, так и для практической селекции. Существует исследования, в которых при использовании мутагенеза в системе протопластов из мезофилла листа гаплоидных растений были получены ауксотроф-ные и биохимические мутанты (Carlson 1973, Gebhardt et al 1981). Применение подобной техники для зерновых в настоящее время невозможно из-за методических трудностей Однако, сочетание гаплоидной техники с техникой клеточной селекции в применении к зерновым культурам может служить одним из подходов к достижению той ж цели. - способствовать получению измененных, константных форм.

Данная работа является частью исследований проводимых в Лаборатории генетической и клеточной.инженерии Кафгдры биотехнологии МОХА, в задачи которой входит создание методами in v'itro высокопродуктивных форм яровой пшеницы, устойчивых к экстремальным Факторам окружающей среды. В наши задачи входило разработать систему для отбора устойчивых к засолению iJopm на гаплоидном уровне при культивировании пыльников используя при этом кроме комерческих сортов фор-

ш. полученные' методами клеточной селекции на устойчивость к засолении.

1.1. Влияние холодовой предобработки на культуру пыльников пшеницы.

Известно, что холодовая предобработка срезанных колосьев увеличивает выход андроклинных структур в культуре пыльников различных видов растений. ГЬзтому первым этапом назей работы было выяснение оптимальных сроков .холодовой обработки для изучаемых сортов. Были использованы три сорта пшеницы: Целинная-21, Московская-35 и Саратовская-29; и три продолжительности периода обработки 0,6 и 10 дней. Полученные результаты свидетельствуют, что. сорта различаются между собой по эффективности андрогенеза. Так в условиях нашего эксперимента, для сорта Саратовская-29 максимальный выход эмбриоподобных структур наблюдался при использовании необработанных холодом растений. Тогда как для сорта Московская -35 оптимальным периодом« обработки было 6 дней,а для Целин-ной-21 - 10 дней. Таким образом, нами установлено, что су-адэствует сортоспецифическая реакция культуры пыльников на Холодову» обработку и установлены оптимальные сроки этой обработки.

Так как основная' работа в дальнейшем проводилась с сортами Ц-21 и Ц-Ю,а .также с линиями, полученными из этих сортов мы использовали 10 дневную холодовую обработку колосьев.

1.2. Влияние генотипа и условий культивирования на эффективность культуры пыльников.

Для определения роли генотипа в ответе на условия культивирования пыльники четырех сортов пшеницы культиви-/ ровади на трех вариантах сред, традиционно применяемых в культуре пыльников: Мб,Р2 и С-17. Результаты эксперимента

приведены в таблице 1.

Таблица 1. Влияние генотипа на эффективность культуры пыльников пшеницы,

Сорт

Среда

число высаж пыльников

эффект, андраген. х

Ц-21

N6 Р2 С17

190 230 360

3,6 +1.3 8.6 ±1.3

С-29

Р2 С17

230 500 500

2.6 +1.1 1.0 ±0.4 1,0 ±0.4

М-35

. Ц-Ю

N6 ?2 С17

N6 Р2.

200 600 600

500 300

2,0. ±0.9 3,0 ±0.6

1,3 ±0.4

/

/'_ .

5,6 ±1.3

/

Из представленных данных видно,/Что среди испытанных сортов Целинные сорта оказались наиболее отзывчивым на условия культивирования. Однако, эффективность выхода гаплоидных структур существенный образом зависит от состава питательной среды. Почти для всех сортов картофельная среда Р2 была оптимальной при культивирования пыльников. Однако, опыт, дальнейшей работы показал,что результаты очень сильно варьировали в зависимости от сорта и состояния картофеля, из которого готовился экстракт. Ввиду нестабильности

о

- в -

получаемых результатов нам пришлось отказаться от сред с картофельным экстрактом и в основном использовать модифицированную среду N6.

1. 3. Влияние предобработок донорного растения на эффективность андроклинии в культуре пыльников.

; Известно, что в некоторых случаях предобработка донорных растений биологически активными веществами способствует повышению эффективности культивирования пыльников (Куо, Нагас1а 1988. ,Кучко,Маруненко 1986). С целью повышения эффективности выхода гаплоидных структур мы использовали опрыскивание колосьев донорных растений до срезки (за 7 дней) и добавление в воду при холодовой обработке растворами индо-лилуксусной кислоты (ИУК2), 6-бензиламинопурина (6- БАШ), феруловой (С£) и аканитовой (АК2) кислот. Результаты данного эксперимента, проведенного на сорте Целинная-21, представлены в таблице 2. •

Предобработка донорных растений веществами различной природы в нашем эксперименте в большинстве случаев привела к снижению частоты выхода андроклинных структур. Однако, обработка растений, в некоторых случаях, существенно увеличила выход регенерантов из образовавшихся структур (сы. рис.1).

Интересно» что .обработка только аканитовой кислотой при невысоком выходе гаплоидных структуре5,1 и 4%) приводит к шзывенмо ыорфогенноя способности образовавшихся структур.

Известно, что технология получения гаплоидных форы складывается из двух чрезвычайно сложных и труднорегулиру-емых этапов. Первый - это перепрограммирование микроспор с гаметофитного пути развития на спорофитный с предпочтительным развитием по пути прямого эмбриогенеза Вгорой -регенерация растений из структур, образовавшихся на первом этапе. Гистологические и гистохимические исследования эмб-

Рис.

1 Влияние предобработки растений - доноров на регенерацию растения ив гаплоидных структур.

контрольные растения.

обработка растений на корни аконитовой кислотой, обработка растений на корню и срезанных колосьев

аконитовой кислотой.

обработка растений на корню и срезанных галосьев 8-Сеноиламинопурином.

обработка растений корню й срезанных колосьев феруловой кислотой! / . обработка растений на корню и срезанных колосьев индолилуксусной кислотой. '

Р^: -

ш! -

Ж? -

да -

Таблица 2. Влияние предобработки растений физиологичес-киактивными веществами на эффективность андрогенеза.

Кол-во Кол-во г

Среда Обработка андроген. андроген.

пыльников структур стр.

N6 - ISO 7 3.6 11.3

Р2 - 230 20 . 8,6 11.8 ,

KS се 160 4 2,5 11.2

Р2 «г 160 5 3,1 11.3

Р2 АК1 86 5 5,1 12.0

N6 АК2 250 11 4.4 +1.2

Р2 АК2 150 6 4,0 +1.6

N6 ИУК2 160 4 2.5 +1.2

Р2 МУК2 170 18 9.4 12.3

N6 БАП2 100 6 6.0 12.3

Р2 БАГЕ . 170 9 5.2 11.7

риоидов, образовавшихся в культуре пыльников Brassica juncea ( Kiran S. et al 1989) показали аномальное развитие эмбриоидовСнедоразвитая апикальная или корневая меристемы), препятствующее нормальному их прорастанию. Вероятно, в нашем 'случае, предобработка донорных растений в некоторых случаях способствовала более гармоничному развитию эмбри-оидоз в культуре пыльников.

Кроме того,для различных видов растений ( особенно для ячменя) существует проблема регенерации зеленых растений ввиду высокой частоты появления альбинных форм. В культуре пыдышков пшеницы проблема альбинизма не стоит так остро. В наших экспериментах была получена только одна альбинная форма у сорта Целинная-21. .

Таким образом, заключая подготовительный этап нашей работы можно заключить,что использованные в работе сорта

обладают не высокой эффективностью в культуре пыльников при том, что выявлена сортовая специфика ответа на условия культивирования. Следует отметить, что сорт Целинная-21 продемонстрировал наибольшую отзывчивость в культуре пыльников. Сорт Целинная-юбилейная оказался менее эффективным. Несмотря на предпринятые попытки модификаций сред (было испытано 15 вариантов) и различных обработок донорных растений, нам не удалось существенным образом поаысить выход змбриоидов и каллусов в кулйгуре пыльников пшеницы. Однако положительным результатом можно считать обнаруженную возможность повышения -уровня регенерации растений из гаплоидных структур при обработке донорных растений аканитоаой кислотой_________

1. 4. Особенности андрогенеза у потомства растений-регенератов, полученных методами клеточной селекции.

В наш задачи входило переведение в гомозоготное состояние расгениП-регенерангов, полученных я результате клеточной селекции и показавших свою перспективность-в лабораторных или полевых испытаниях. Для этого использовали семена растений-регенерантов второго семенного поколения для АССК1 и ВССКб,которые били получены при селекции на устойчивость, к засолению, или шестого семенного поколения для форм 1-6 и 1-34, полученных методом клеточной селезоцш из сорта Целинная-юбилейная на устойчивость к водному стрессу и в полевых испытаниях в Красноярском аграрном университете продемонстрировавших высокую продуктивность в сочетании с . устойчивостью к корневой гнили. Пыльника'культивировали на различных питательных средах. Результаты данного эксперимента приведены в таблице 3.

Из представленных данных видно, что потомство растений -регенерантов различается между собой по ответу на условия культивирования. Гак форма АССК1 не отличается от исходного сорта Ц-21 по эффективности образования гаплоидных струк-

Таблица 3. Влияние генотипа на эффективность андрогенеза.

Число Число г

генотип Среда андроген. андроген.

пыльников структур структур

W14 200 2 1,0 ±0.7

Ц-21 VI4-2 200 4 2,0 to. 9

1 N6-6 400 15 3,8 ±0.9

АССК1 VI4 100 1 1.0 ±0.9

N6-6 160 6 3,8 ±1.5

VI4 150 0 0

Ц-Ю N6-6 700 9 1.2 ±0.4

V14 100 7 7,0 ±2.0

ВССКб V14-2 100 1 1,0 +0.9

N6-6 200 21 10 ±0.7

V14 300 2 0.6 +0.4

1-6 V14-2 300 0 0

, N6-6 400 ■ 9 2,2 ±0.7 •

VI4 300 0 0

1-34 VI4-2 300 1 0.3 +0.3

N6-6 400 22 5,5 ±1.1

тур. Однако среди рстенерантов полученных из сорта Целинная-юбилейная наблюдается значительное разнообразие по ответу на условия культивирования. Выделяется своей высокой эффективностью форма ВССКб, причем это свойство проявляется на двух вариантах сред (N6-6 и VI4). Линия 1-34 так*» превзошла по способности к формированию ¿здр0|шинных структур ис-

ходный сорт(Ц-Ю). Оптимальной для всех форм в этом эксперименте была среда N6-6.

Таким образом, на основании представленных данных можно заключить, что среди растений-регенерантов могут встречаться формы,обладающие более высокой способностью к образованию гаплоидных структур чем исходный сорт. Следовательно, в результате сомаклональной вариабельности могут быть затронуты гены, контролирующие процесс смены программы с гаметофитного на спорофйтный путь развития в культуре пыльников.

1.5. Влияние засоления на развитие" андроклинных структур --------в культуре пыльников пшеница

Ввиду того, что среди растений-регенерантов использованных в наших экспериментах были формы, полученные из устойчивых к засолению клеточных линий, было интересно изучить влияние засоления на частоту образования андроклинных структур в культуре пыльников. В эксперименте были использованы линии АССК1 и ВССКб полученные из сортов Ц-21-. и Ц-Ю соответственно. Растения были высеяны в поле в два срока (в мае, как обычно, и в июле 1992 года) для того,чтобы иметь две ловторности в условиях одного года. Концентрация соли была выбрана из рассчета на порядок ниже, чем используется при селекции соматических клеток. Результаты эксперимента приведены в таблице 4.

Данные, представленные в таблице 4 свидетельствуют о том,что формирование эмбриоподобных структур в стрессовых условиях у различных генотипов происходит с разной интенсивностью. Причем, увеличение концентрации соли в среде-ведет к снидению эффективности андрогенеза у всех испытанных форм. Концентрация 0,05%. НаС1 приводит к снижению эффекТив- ' ности вдвое, то есть является полулетальной концентрацией. Только у линии АССК1 концентрация соли 0,05Х снижает эф-

- 13 -

Таблица 4. Влияние засоления на эффективность

андрогенеза в культуре пыльников пшеницы.

Генотипы Среда N6-6 ишь сентябрь

кол-во ЛЫЛЫ1. У. . сгрукт. кол-во пыль». X струет.

1 1 - 500 0,8 iO. 4 200 2,5 ±1.1

ц-ю '-Ю.05ШС1 500 0 300 1,3 +0.6

+0,1 XHaCl 500 0 300 0,5 ±0.4

- 100 10,0 ±3.0 100 11,0 ±3. 1

B0CKG +0,05XNaCl 100 4,0 tl.9 100 6,0 ±2.3

+0,1 XNaCl 100 2,0 +1.4 100 2,0 +1. 4

- 200 2,5 +1.1 200 5,0 +1. 5

Ц-21 +0,05*NaCl 500 1,8 +0.5 300 2,0 +0. 8

+0,1 ZNaCl 500 1.2 +0.4 300 1,0 +0. 3

- 100 ' з!о +1.7 60 5,0 +2. 8

АССК1 +0,05ZNaCl 40 2.5 +3.4 50 4,0 +2. 7

+0,1 ZMaCl 40 • 0 . 50 0

Активность андрогенеза только на 207. от контороля. К сожалению, ограничения в количестве семян от-растений-реге-нерантов не позволило нам увеличить масмтаб выборки, что повысило бы достоверность результата. Однако, тот фагаг, что результаты июльского и сентябрьского вариантов, несмотря на различия в абсолютных значениях, имеют общую тенденцию, позволяет предположить, что линия АССК1 мохет обладать бодьией толерантностью к засолению, чем исходный сорт Целинная-21.

Многочисленные исследователи анрогенеза на различных видах растений подчеркивают, что на э^ктивность культуры

Рис. 2 Особенности побегообразования в условиях in vitro у различных генотипов яровой мягкой пшеницы.

|| - X растений не образующие дополнительных побегов Р[- X растений образукщих 1-3 дополнительных побега | [(- X растений образующих 4-5 дополнительных побегов X растений образующих б - 7. дополнительных побегов X растений образующее 8-10 дополнительных побегов

- 18 -

Для выявления различий в характере размножения мы проанализировали полученный материал с точки зрения частоты встречаемости проростков а различной эффективностью кущения Результаты такого анализа представлены на рисунке 2.

Исходные сорта и линия ВССК6 практически не различаются между собой по характеру размножения. Модальные классы составляют проростки,образующие по 2-3 или 3-5 дополнительных побегов (до 902). Однако, у линии АССК1 появились побеги способные образовывать „от 6 до 10 дополнительных побегов. Таким образом, выявляются генотипические различия в характере размножения.

фи размножении во втором цикле мы обнаружили, что коэффициент размножения у большинства генотипов возрастает. Ре зультаты этого эксперимента представлены в таблице 7.

Таблица 7. Образование дополнительных побегов во втором цикле размножения яровой пшеницы.

число .число коэф.

Генотипы эксплантов доп. побегов размнож.

-. Ц-21 53 253+3.5 4,7

АССК1-2 10 70+1,8 7,0

Ц-Ю 34 244+2,9 7.1

ВССК6-2 .16 ^ ,80+1,3 5.0

Возрастание -коэффициента размножения во втором цикле южно на нал взгляд объяснить с одной стороны адаптацией к' условиям культивирования и отбраковкой форм не дающих дополнительных побегов, а с другой стороны отбором форм, обладающих высокой кустистостью. Для выяснения этих' механизмов необходимы дополнительные исследования.

2.2. Укоренение дополнительных побегов.

Укоренение полученных после размножения побегов для многих видов растений является сложной проблемой, требующей

специальной разработки. Ввиду того, что для укоренения рас-тений-регенерантов пшеницы, полученных в культуре соматических клеток, нет необходимости в добавлении гормонов спо; собствуюпщ укоренению, мы для укоренения использовали среду МО без гормонов. В таблице 8 приведены данные-по укоренению дополнительных побегов пшеницы в двух циклах размножения.

Таблица 8. Способность к укоренению дополнительных побегов в двух циклах размножения пшеницы.

! I цикл I II цикл Генотипы ' I_I_

1 1 1 2 3 1 1 1 2 3

Ц-21 . 60 ' 5310,7 88 200 110±1,4 55

АССК1-2 52 10*0, 4 19 50 25±1,6 50

ц-ю ■ 42 34*1,2 80 200 92+0,9 46

• ВССК6-2 47 ШО,5 34 80 35+1,3 44

1 - число побегов

2 - число укоренившихся побегов 3-Х укоренения. 4

• Из представленных данных видно, что в первом цикле размножения укоренение, у побегов исходных сортов значительно выше, чем у семенного поколения растений-регенерантов. Однако, во втором цикле размножения процент укоренения у этих линий возрастает, в то время как способность к укоренению у дополнительных побегов сортов Целинная-21 и Целинная-юбилейная снижается. Представленные данные свидетельствуют, что процесс укоренения дополнительных побегов при размножении пшеницы тага®, как и укоренение других видов растений,требует дополнительных исследований. Тем ке менее, полученные таким образом растения были перенесены в торфоперегнойные горшочки с песком для адаптации и в "последующем выращивали в почЕе до созревания. Следует отметить.

что при развитии в почве растения сохраняли сортовые признаки. Отличительным признаком этих растений являлась повышенная продуктивная кустистость. У линии АССК1-2 количество продуктивных побегов в почве составляло 6 побегов, а у исходного сорта Ц-21 всего 3.

Основываясь на полученных данных, можно провести расс-чет по эффективности применения метода клонального размножения пшеницы. При коэффициенте размножения равном 5 за один год (6 циклов) мы „можем получить более трёх тысячь растений. Такая технология значительно сократит затраты времени на размножение материала,•полученного методами биотехнологии.

2. 3. Влияние засоления на процесс вегетативного размножения различных генотипов пшеницы.

Ранее в работах по клеточной селекции пшеницы на устойчивость к засорению (Джозеф 1991) было показано, что устойчивость на клеточном уровне не всегда приводит к устойчивости целого растения. Существует проблемы тестирования . растений-регекерантов на устойчивость к засолению. Поэтому мы решили использовать систему размножения для тестирования растений, проводя размножение в стрессовых условиях. Для этого использовали теже генотипы, которые размножали в присутствии различных концентраций КаС1 ( 0; 0,2; 0,4; 0,6 и 0,8 X ЫаС1). Результаты данного "эксперимента представлены в таблице 9.'

Из представленных данных видно, что с повышением концентрации солк у всех генотипов увеличивается число погибших проростков, хотя у сортов это увеличение происходит быстрее, достигая более 502 при 0,8Х N301. Увеличение концентрации* соли в среде приводит и к снижению коэффициентов размножения. Однако, обе линии, полученные из клеточных линий устойчивых к засрлению продемонстрировали.большую толерантность к соли по способности образовывать дополнительные

- 21 -

■ Таблица 9. Особенности вегетативного размножения пшеницы в условиях засоления.

кол-во кол-во кол-во коэффиц.

Генотипы зксплант. непро- дог.олн. размнок.

рос ших пророст.

Ц-21 О 120 /0 411+1,4 3,4

0,2 ХИаС1 120 40*0,3 134+1,8 • 1.1

0,4 -. 120 60*0,3 160+1,6 1.3

0,6 - 120 53+0,2 107*0,8 0,8 ■

0,8 - 120 70+1,0 60+0,6 0,5 .

АССК1-2 0 10 0 52+1,3 5.2

0,2 Д)аС1 . 7б . 0 230+1,8 3.2

0.4 - 70 7+0,2 216+0.7 3.0

0,6 - 70 .14+0,3 . 156+0.5 2,2

0.8 - 70 1 20+0,5 140+0.8 2.0

Ц-Ю 0 120 0 380+1,9 3.1

0,2 2МаС1 120 20+2,6 251+2,0 2.0

0.4 - 120 47+1,4 • 197+0,9 "1.5 '

' .0.6 , - 120 58+0,8 115+1,7 0.9

0.8 - 120 73+1,1 84+0,9 0,7

ВССК6-2 0 10 0 47*2,3 4,7

0.2 ЖаС1 100 8+0,5 31212,0. 3,1

0.4 - 100 141:0,6 24911,7 2,4

О.б - 100' 24+0,8 21611,8 2,1

0.8 ' 100 40+0,7 1 142+0,9 м

. I .

побеги в стрессовых условиях. Сравнение распределения характера кушения в стрессовых условиях покавало.что увеличение концентрации соли в среде приводит у исходных сортов к лре-

• - 22 -обладанию доли иекустящихся побегов. Б то время, как у полученных линий характер размножения в солевых условиях различался. Так для линии АССК1 при всех испытанных концентрациях соли характерно преобладание (до 70Z) побегов» образующих 2-3 дополнительных побега. Линия BCCKß при повышении концентрации до 0,6Z NaCi сохраняет достаточно большую долю - эксллантов (20Z), способных образовывать до семи дополнительных побегов. Можно предположить, что такие различия в ответе на солевой стресс обусловлены гетерогенностью линии ВССКб-2, вызванной расщеплением при семенном размножении материала.

15а основании полученных данных можно заключить, что растения-регенеранты, полученные из устойчивых клеточных линий более толерантны к соли по способности образовывать 'дополнительные побеги в стрессовых условиях. Следовательно, признак приобретенный в результате сомаклоналыюй вариабельности, отобранный на клеточном уровне, сохраняется при переходе от клеточного уровня на уровень целого растения, передается в поколениях и проявляется при размножении в стрессовых условиях.

' .. ВЫВОДЫ

1. Впервые предпринята попытка проведения гаметной селекции яровой пшеницы (Triticum aestivum) на устойчивость к засолению, используя культуру пыльников.- Полученные результаты позволяют рассчитывать на успешную разработку комплексной технологии создания новых устойчивых-форм пшеницы.

2. Установлены концентрации селектирующего Фактора при селекции на гаплоидном уровне. Обнаружено, что концентрация 0,05% NaCl является полулетальной для сортов пшеницы использованных в эксперименте.

3. Выявлена роль фиеиологичгского состояния' догорного растения на процесс формирования гаплоидных структур в культуре пыльников к предложены способы повышения уровня

регенерации растений из этих структур путем предобработки ¡¡опорных растеннй.

4. Предложен способ сочетающий возмомюсти одновремен юго тестирования на солеустойчивость на уровне целого растения с возможностью размножения устойчивых генотипов. |

5. Показано, что растения-регенеранты, полученные из остойчивых клеточных линий проявляет большую толерантность с стрессам, чем исходные сорта, что указывает на. перспективность развития работ по клеточным технологиям для селении яровой пшеницы.

6. Гомозиготные формы, полученные в культуре пьишников гереданы в Каз. НШЗэрнового хозяйства для испытаний и по-пучения на их основе новых сортов.

Работы, опубликованные по теме диссертации.

1. 'Беккужина С.С., Никифорова И.Д. Оптимизация условий шхода андрогенных гаплоидов в - культуре пыльников яровой мягкой пшеница / Тезисы, докладов Всесоюзной научной' конференции по сельскохозяйственной биотехнологии,- Целиноград.-1991. -С. 5?.

2. Беккужина С. С., Никифорова И. Д. Влияние засоления ш 'формирование эмбриоподобнык структур в культуре пыльни-юв яровой пшеницы. / Тезисы докладов II Всероссийского сим-юзиума "Новые методы биотехнологии растений". - Пущино. ■1993.

3. Беккужина С. С., Никифорова И. Д. Клональное заэмножение и тестирование на солеустойчивость растений-ре-'енерантов яровой пшеницы. / Тезисы докладов II Бсероссийст -юго симпозиума "Новые методы биотехнологии растений". - Пу-цийо. - 1993.