Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ГАПЛОПРОДУКЦИИ В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ ПЫРЕЯ СИЗОГО AGROPYRON GLAUCUM (DESF)

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "ЗАКОНОМЕРНОСТИ ГАПЛОПРОДУКЦИИ В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ ПЫРЕЯ СИЗОГО AGROPYRON GLAUCUM (DESF)"

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ГАПЛОПРОДУКЦИИ В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ ПЫРЕЯ сизого ЛСЯОРУЛОА' вЬА исиМ ДОБР)

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2003

Работа выполнена в лаборатории экспериментального мутагенеза Института цитологии и генетики СО РАН г. Новосибирск.

Научный руководитель; кандидат биологических наук Чекуров В.М.

Институт цитологии и генетики СО РАН г. Новосибирск

Официальные оппоненты; доктор биологически* наук Тарасе нко Н.Д.

Институт цитологии и генетики СО РАН г. Новосибирск

доктор биологических наук Карначук P.A.

Томский Государственный Университет г.Томск

Ведущее учреждение; Сибирский институт физиологии растений СО РАН, г.Иркутск

Зашита диссертации состоится iCciua ,?. с 2003 г. на утреннем заседании диссертационного совета (Д-003.0П.01) при Институте цитологии и генетики СО РАН ио адресу: 630090, г.Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10, Тел / факс; (3832) 331278. e-mail: dissov@bionet. nsc.ru

С диссертацией можно о знакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН, ('.Новосибирск.

Автореферат разослан;

2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

А.Д. Груздев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Использование методов культуры клеток и тканей для ускорения селекционного процесса и обогащения генофонда зерновых злаков приобретает в современных условиях особое значение. Уникальная способность молодых микроспор воспроизводить в условиях in vitro целостный организм открывает большие возможности экспериментального получения гаплоидных растений в культуре пыльников и обеспечивает быстрое получение гомозиготных линий из гетерогенных гибридных популяций. Методы экспериментальной гаплоидии перспективны а генетических исследованиях: геномном анализе, получении анеуплонлов, изучении действия генов на клеточном уровне. Гаплоиды являются уникальным обектом для клеточной селекции и генетической инженерии растений.

Для зерновых злаков разработано несколько методов получения гаплоидов среди которых более эффективным для массового получения растений-регенерантов является метод культуры изолированных пыльников и микроспор. Этой проблеме посвящено множество экспериментальных работ и обзорных статей и монографий (Бутенко, 1975; Хохлов н др., 1976; Суханов, 1983; Дьячук, Дьячук, 1989; Picard et al., 1990). Однако, несмотря на перспективы метода культуры пыльников, использование его на многих культурах, ограничено. Так, не разработана эффективная система получения гаплоидов при культивировании пыльников различных генотипов зерновых культур (Heberle-Bors, 1998; Foroughi-Wehr, 1979). Не решены проблемы регенерации и альбинизма. Остаются неясными механизмы, обусловливающие смену программы развития микроспор с нормального пути созревания на вегетативный путь развития, через эмбриоидо и каллюсогенез - в гаплоидное растение.

Особую трудность представляет применение гаплоидной техно логин к перекрестноопыляющимся культурам, в частности, к многолетним травам. Так, попытки получения гаплоидов в культуре пыльников у растений 5 видов рода Agropyron (пырей) не привели к успеху, - у одного из видов Л, repens, было индуцировано развитие многоклеточных структур внутри микроспор, но дальнейшего развитая не происходило (Zenkteler et al., 1978); у видов A. deseriorum и A. cristatum удалось получить андрогенные каллюсы, которые не регенерировали (Marburger and Wang, 1988); у пырея удлиненного A, etongaium были получены альбиносные гаплоиды, но не было ни одного случая регенерации зеленых растений (Размахнин и др., 1989).

Большое селекционное значение такой культуры, как пырей обусловлена тем, что представители этого рода обладают многими пенными свойствами: высокой морозостойкостью, засухо- и солеустойчивостью, высоким содержанием белка в зерне, устойчивостью к вредителям и болезням, которые желательно было бы передать культурным злакам. Из многочисленных видов пырея, наибольшее применение в селекции нашли два: пырей удлиненный A, elongatum и, особенно, пырей сизый Л. £/лысим(Цишш, 1954; Синеговец, Лапченко, 1975; Li & Sun, 1980).

Пырей - перекрестноопыляющаяся культура, обладающая высокой гетерозиготностью и гетерогенностью, которые усложняют процесс расщепления гибридных форм, а также выделение форм, сочетающих нужные признаки. Отсюда вытекает необходимость использования в скрещиваниях с пшеницей, растений пырея, гомозиготных по хозяйственно-полезным признакам. Очевидно, что создание гомозиготных линий пырея позволило бы осуществить контролируемое введение

чужеродной генетической информации в геномы культурных злаков и расширить набор методов, применяемых в селекции дайной культуры в кормовом направлении.

Цель и задачи исследования: Целью диссертационной работы является изучение закономерностей процессов морфогенеза и регенерации растений в культуре пыльников пырея сизого, разработка гаплоидной биотехнологии этой культуры.

Дня достижения згой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние компонентов питательных срез, условий культивирования и некоторых признаков донорных растений на процесс гаплопродукции в культуре пыльников пырея сизого.

2. Сравнить способность к гаплоггролукцик у кроссбредных и инбредных растений пырея.

3. Разработать и усовершенствовать гаплоидную биотехнологию в культуре пыльников пырея для получения морфогенных эмбриондов, каллюсов и растеннй-регенерантов.

4. Использовать усовершенствованную методику андрогенеза in vitro для тестирования генотипов пырея по гашюпродуктнвным параметрам.

5. Создать линии андрогенных гаплоидов, удвоенных гаплоидов и родительских растений пырея сизого и изучкгь их скрещиваемость с пшеницей н морозостойкость.

6. Внедрить полуденные линии в селекционные программы по созданию ценных морозостойких форм пшенично-пырейиых гибридов и сортов пырея.

Новизна исследования. В популяции пырея сизого впервые обнаружены несколько генотипов (1 % от исследованных") с высокой способностью к гаплопродукции в культуре пыльников зеленых андрогенных растений хорошего качества; 10 % генотипов продуцировали альбиносы и единичные зеленые растения; 39 % генотипов продуцировали только альбиносы. Разработаны составы питательных сред, существенно увеличивающие выход андрогенеза. Показано, что применение комплексного набора сред - более предпочтительно для получения гаплоидов из большой выборки генотипов пырея, ввиду специфичности требований отдельных генотипов к средовому составу. На основе разработанной гаплоидной биотехнологии впервые получены андрогенные гаплоиды и удвоенные гаплоиды пырея сизого. Создана генетическая коллекция (более 500 растений и семенной материал) андрогенных линий пырея.

Введение новых числовых параметров андрогенеза, таких как морфогенность пыльцы М, регенерантность андрогенных структур R, средняя оценка гаплоидов Б и синтетического параметра "гаплопродукгивное качество пыльны" Q позволило более полно харектеризоваггь генотипы пырея по способности к андрогенезу.

Установлено, что по сравнению с кроссбредными генотипами дикого типа, в выборке инбредных генотипов пырея сизого средние числовые параметры андрогенеза в несколько раз ниже. Выдвинуто предположение, что гаплоидный геном пыльцы инбредных растений имеет в среднем более серьезные нарушения, по сравнению с кроссбредными растениями. Таким образом, для получения андрогенных линий пырея сизого предпочтительно выбирать в качестве доноров кроссбредкые растения или растения с неглубоким инбридингом.

Впервые показана возможность применения метода андрогенеза в качестве теста на селекционную ценность генотипов пырея при отдаленной гибридизации с пшеницей. Генотипы пырея сизого с высоким "гаплопродуктнвным качеством пыльцы" имели повышенную гибрндизационную способность (больший процент завязываемости и прорастаемость гибридных зерен).

Практическая значимость. Разработаны метод создания андро генных гомозиготных линий и метод тестирования растений пырея сгаого по характеристикам андрогенеза. Создана коллекция линий андрогенных гаплоидов, удвоенных гаплоидов и родительских растений пырея сизого с высокими гаплопродуктивными параметрами. Разработана методика тестирования растений по морозостойкости. Показано, что большая часть полученных линий обладает высокой и сверхвысокой морозостойкостью по сравнению с лучшими образцами озимой пшеницы. Это, в сочетании с высокой скрещиваемостью с пшеницей, позволяет с высокой долей уверенности рекомендовать полученный коллекционный материал для использования в селекционно-генетических исследованиях и в селекционных программах по созданию зимостойких форм озимой пшеницы и других культур, скрещивающихся с пыреем, а также для создания зимостойких кормовых сортов пырея.

Вклад автора. Оновная часть работы сделана автором. Эксперименты по отдаленной гибридизации проводились совметно» к.б.н. В.Е.Козловым,

Апробация работы. Результаты исследований по диссертационной работе доложены на: I Всесоюзной конференции по онтогенетике высших растений (Кишинев, 1989); Всесоюзной конференции по биотехнологии (Целиноград, 1990); Втором Российском симпозиуме по биотехнологии (Пущино, 1993); Международной конференции молодых ученых и специалистов "Новые методы' интенсификации сельского хозяйства" (Шортанды, 1995); XVIII Международном генетическом конгрессе (Пекин, 1998); Международной конференции по гаплоидам кукурузы (Краснодар, 2000); Международной научно-практической конференции "Зеленая революция Лукьяненко" (Краснодар, 2001); 17-ой Международной конференции по регуляторам роста растений (Брно 2001); 28-ой ежегодной конференции американского общества регуляции роста растений (2001); 6-ой Международной конференции "Регуляторы роста и развития в биотехнологиях (Москва, 2001); VIH генетико-селекционной школе (Новосибирск, 2001); I Международном биотехнологическом конгрессе (Москва, 2002), 2-ой конференции Московского общества' генетиков . и селекционеров (Москва, 2003), I Цетральпо-Азиатской конференции по пшенице (Алматы, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 145 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 332 работы. Содержит 24 рисунка и 15 таблиц.

Благодарности, Считаю своим долгом выразить искреннюю признательного моему научному руководителю к.б.н. В.М. Чекурову за внимательную и потоянную поддержку исследований и консультации, всему коллективу лаборатории экспериментального мутагенеза Института цитологии и генетики СО РАН за техничекую помощь и совместное обсуждение результатов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования послужила коллекция форм пырея сизого из Восточного Казахстана. Семена были собраны В.М. Чекуровым и В.М. Шепелевым в 1971 году с дикорастущей популяции в условиях естественного отбора на высокую зимостойкость, К 1983 году В.М, Чекуровым и А,М. Орловой была создана коллекция из более 2000 растений различной степени инбридинга (I0, I] , I¡, Ij),

которая выращивалась на поле селекционно-генетического комплекса Института цитологии и генетики СО РАН.

В работе был »пользован модифицированный метод (СЬекигоу & ЯагтакМт, 1989) культивирования ¡п у'мго изолированных пыльников злаков на твердых авизованных средах на основе Р-8 и П-2 (Лукьянюк, Игнатова, 1986; СЬиап& Оиуап& 1978) и общепринятые цитологические методы. В опытах по отдаленной гибндизации использовали свежесобранную пыльцу пырея сизого. Скрещивание проводили в полевых условиях с применением принудительного способа опыления кастрированных колосьев. Морозостойкость растений озимой пшеницы и гаплоидов пырея на стадии трех листьев определяли по времени промораживания до необратимой потери тургора тканей по собственной методике.

Принятые "ЧТ9ШТННТ ППГ - пшекично-пыреПныЙ гибрид. 1« - неннбредированное поколите, - второе и третье поколения инбридинга,

Термины и чистовые параметры ащф^теиеза. используемые в работе: ЭК - эмбрионом и калл юсы, р 11 (еЛа - частота индукции андрогенеза (синоним • ЭК-генеза) для данного генотипа, где (е - количество ЭК на )00 культивируемых пыльников, Га — процент андрогениых пыльников. Например, если Р - 30/20, это значит, что у данного генотипа индуцировано 30 ЭК на 20 из 100 пыльников. Дня выборки ю п растений вычисляется средняя частота андрогенеза;

М - коэффициент морфогенкости пыльцы;

М » количество индуцированных эмбрноидов I количество индуцированных каллюсов.

Я - регенерантность андроклннных структур;

11 =- процент ЭК, регенерировавших андрогеиные растения,

Е га - средняя оценка андрогениых растений-регенерантов, равняется сумме оценок

регенератов, деленной на количество трансплантатов: Еш - Ее / п

В первых экспериментах по выбору эффективных сред для индукции андрогенеза у пырея мы испытали 9 питательных сред, из них 7 сред, различающихся по концентрации сахарозы и составу фитогормонов и 2 среды с различным содержанием картофельного экстракта и сахарозы (табл.1). Обнаружено, что только в двух вариантах произошла индукция анрогенеза; у 0.7% пыльников на среде Р-8, содержащей 3% сахарозу и 3% картофельный экстракт (КЭ) и у 6.2% пыльников на среде П-2, содержащей 9% сахарозы и 50% КЭ. Результаты эксперимента показывают, что пырей сизый - культура более требовательная к условиям культивирования, чем пшеница, у которой индукция авдрогенеза наблюдается при низких концентрациях сахарозы и без обязательного присутствия в среде картофельного экстракта. Вывод из анализа данных таблицы I следует однозначный —для андрогенеза пырея требуются одновременно высокая концентрация сахарозы и картофельного экстракта.

Гт °

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выбор питательной среды для индукции андрогенеза.

Таблица 1. Влияние различных концентраций сахарозы, фитогормонов

и картофельного экстракта на андрогенез у пырея сизого

Индукционная среда Количество пыльников

высажено Эмбриогенкых

шт. Шт. %

Р-8" + 3% сахароза 162 0 0

р-8* + 9% сахароза 162 0 0

Р-8 + 9% сахароза + различные Фитогормоны** 810 0 0

Р-8* + 3% сахароза + 3% КЭ 162 1 0.7

П-2* (9% сахароза + 10% О) 162 10 6,2

Примечание: * добавлены 2ч'[ Л| 2 40 + 0 5мгл книетмн. ** 5 кярнан тип I) 2мг.'л 2 40 * 0 1мг/л АБК; Г*г'л 2,40 + 0.1 иг/л кииетаи + 6 иг/п Гнбберрос; 3) Ыг/д ИУК + 2мг/л кинетин {2епк(е1ег « Л. 1975); 4) 0,5 мг/д БАП + 1мг/л ИУК (СКаигуеЖ & ЗЬагтпа, 1985); 5)0,5мг/лЕАП +1 мг/д ИУК + 1 мг/л кинетин + 0,5 мг/л ГК (ОэЬа Нао е! а!, 1986). КЭ - картофельный экстракт.

Сравнительный анализ способности к теплопродукции в кроссбрсдной и инбредной выборках пырея сизого

В следующем эксперименте мы исследовали способность к андрогенезу в двух выборках кроссбредных и инбредных растений пырея. Для индукции андрогенеза применили среду П-2, а для регенерации - 5 сред с различными

фитогормоиами.

Результаты показали, что параметры андрогенеза в кроссбредной выборке значительно превосходили те же параметры в инбредной выборке (Табл. 2). Превышение составило; по средней частоте индукции андроклинных структур - в 22,5 раза; по проценту генотипов, регенерировавших альбиносные и зеленые растения - в 1.9 и 1,7 раза и по средним оценкам зеленых и альбиносных растений - в 4,2 и 3,7 раза, соответственно. Таким образом, для получения андрогенных линий пырея сизого предпочтительно выбирать в качестве доноров кроссбредные растения.

Показано, что такие фитогормоны, как НУК, кинетин, гиббереловал кислота и бензаминопурин оказывают положительное влияние на регенерацию андрогенных растений. Применение набора из пяти регенераинонных сред позволило в 3,5 раза повысить процент генотипов, регенерирующих зеленые андрогенные растения по сравнению с регенерацией на без гормональной среде.

Таблица 2. Параметры андрогенеза у кроссбредных и ннДреднь» растений пырея «пого

Поколение инбридинга Изучено геноти-пае % додрогениих генстп пав Рто М % генотипов, регенеркро» вщмх гаплоидные Еип

Апьбнно Зеленые Альбнно Зеленые

1о 42 57 22/10 3 90 22 1.6*0.3 0.18±0.09

Ти 32 52 9/5 17 46 15 (Ш±0.0? 0.05±0.02

Изучение закономерностей галл о продукции у пырея сизого на питательных средах с различными сахарамн и фитогормонамн

Полученные в предыдущем эксперименте результаты показали, что около 55% генотипов пырея сизого на индукционной среде с ауксином 2.4 О, с высоким содержанием сахарозы и картофельного экстракта способны к образованию акдроклинных структур в культуре пыльников. В то же время средняя частота индукции была не высокая - от 9 до 20 эмбриондов и калл юсов на 100 пыльников. Только от 8 - 12 % генотипов удалось получить зеленые регенсранты, причем выживаемость у ник была низкая. Поэтому мы продолжили работу по усовершенствованию метода анарогенеза.

Учитывая то, что увеличение концентрации картофельного экстракта в индукционной среде приводило к значительному повышению частоты андрогенеза, мы выяснили химический состав основного компонента картофельного экстракта -крахмала. Как известно, крахмал является полисахаридом и существует в форме а-амилозы и амилопектина. В клетках растений крахмал гидролизуется ферментами: а-амнлазой и р-амилазой до мономеров а-глюкозы и дисахзрнда мальтозы. Таким образом, можно предположить, что индукционный эффект картофельного экстракта связан с молекулами мальтозы, входящей в состав крахмала.

Для проверки этого предположения мы исследовали влияние различных Сахаров (мальтоза, сахароза, мелибиоза, лактоза) на выход андрогенеза в культуре пыльников А^1аисит, В качестве регенерационкых сред были применены 5 сред К1 - К5. Нами были получены паспортные характеристики андрогенеза для каждого генотипа. Эти характеристики, ввиду большого числа комбинаций индукционных и регенерациэнных сред (25 комбинаций) удобно представлять в виде матриц (Рис.1).

Геь'гг.'Л НА кнлухцпоиныхсрыах.

Оценка гаплошюй Ш), полученных и* сриич:

ЕЫ

11-2

(1-3

1М

11*5

IV

С-1 р К.! К-1 (1.1 4-1

1 км? - 4 4

II о

ш

IV О

ЗД21 - •

I м И-! Я-1 И-З

1 «■и У 1« V

II 1 5' 5*

Ш 5« 5* 5* 5-

IV ¿Зн'и - - - а- -

»и 4* 4« 4.5* 5-

Рис.1. Матрицы паспортных характеристик андрогенез* Абонент на различных средах

• зеленое растение; в остальных случаях указана оценка альбииосных растений

Полученные данные свидетельствуют о высокой специфичности взаимодействия генотип-среда, обусловленной большой генетической гетерогенностью растений пырея. Таким образом, становится очевидной необходимость индивидуального подбора индукционных сред для генотипов пырея сизого.

Сравнение статистических параметров ацдрогенеэа при индукции на пяти индукционных средах (Табл.2) показало, что по сравнению с индукцией на среде I,

Таблица 2. Характеристики андрогенеза лрн индукции на различных средах

Индукционная среда { (I Iii IV V I-V

Исследовано генотипов 42 42 42 42 42 42

% андрогенных генотипо» 50 40 3S 20 40 74

Ср. частоте индукции Fm 35/14 140/23 84/25 7W1S 12/3

% генотипов, давших: Альбиносы 21 34 21 10 10 57

Зеленые 3 5.7 8.4 0 0 13.5

Ср. оценка: Альбиносы 0,76 1,73 0.88 0.37 0.27

Зеленые 0.053 0.11 0.0S3 0 0

Примечание: ' % от исследованных генотипов

** данные по суммарной регенерации на S средах (R-1 - R-5)

содержащей сахарозу и принятой за стандарт, при индукции иа средах II и III, содержащих мальтозу и мелибиозу, выход андрогенных структур по большинству . параметров более высок. Превышение составило, соответственно:

(II) (Ш)

по частоте андрогенеза Fm-----в 4 — 2.4 раз

по % генотипов, давших зеленые гаплоиды- в 1.9 - 2.8 раз

по средним оценкам альбиносов-------— в 2.3 • 1.2 раз

по средним оценкам зеленых гаплоидов — в 2.1 - 1.6 раз

Цитологический анализ показал, что на среде с сахарозой в.андрогенез вступают единичные микроспоры с замедленным развитием, тогда как мальтоза индуцирует ускоренное андрогенное развитие у большинства микроспор (Рис.2а).

Через 50 суток инкубации у многих генотипов (Рис,2Ь) наблюдали прямой морфогенез гаплоидных растений на индукционных средах с мальтозой и мелибиозой. При индукции на сахарозе и лактозе случаев прямого морфогенеза не отмечено. Тис им образом, мы подтвердили наше исходное предположение о высокой андрогенезной активности мальтозы, сравнимой с активностью мелибиозы.

Интересные данные были получены нами при сравнении регенерационной способности эмбриоидов и калл юсов, индуцированных на средах с сахарозой н мальтозой. На рисунке 2с показано, что при пассаже одинакового количества ЭК различных генотипов пырея на безгормональную ре генерационную среду, в варианте с индукцией на сахарозе, процент ЭК, регенерировавших гаплоидные растения намного ниже и сами растения отстают в развитии по сравнению с вариантом с индукцией на среде с мальтозой. Это подчеркивает эффективность мальтозы для получения андрогенньк растений-регенерантов пырея.

Рис.2. Развитие анарогенных структур через 10 (а) и 50 дней (Ь), после инокуляции пыльников на индукционную среду с сахарозой (5) и мальтозой (М); с) Различная регеиерашкжная способность ЭК, индуцированных на средах с сахарозой (Э) и мальтозой (М).

Изучение корреляции некоторых признаков пырея скзогосо способностью К гаплопродукцни в культуре пыльников

В связи с трудоемкостью метода андрогекеза в применении к большому количеству генотипов, важно выяснить, существует ли корреляция числовых параметров аадрогенеза с какими-либо признаками донорных растений. Установление таких корреляций существенно бы облегчило создание андрогенных линий. В следующей работе мы сравнили некоторые параметры растений-доноров в двух классах генотипов; с низкой (бе < 60) и высокой > 60) частотой ЭК-генеза на среде с сахарозой.

В результате нами выявлен парадоксальный факт: растения пырея сизого из класса с более высокой частотой андрогенеза (Ре>60) обладали ухудшенными признаками по сравнению с растениями из класса с низкой Ре (Табл.4).

Таблица 4. Параметры раетсикв в классах с высокой и «мзкой частотой ЭК - генеза

Классы Вегетативная Выживаемость Самофер- % Средняя

растений мощнось % тильность аномальных оценка

(баллы) (зерен/колос) колосьев Гаплоидов

Ге'хЮ 1 20 1.2 90 13

Fe<60 2.4 90 3.6 24 3.5

* Ре- частота ЭК - генеза, обозначает количество индуцируемых эмбриондоа и калл юсов, на 100 высаженных пыльников

Так, вегетатррная мощность, выживаемость, самофертильность и средняя оценка гаплоидов в классе растений с Ре>б0 имели уменьшенные числовые характеристики, соогасгеяю в 2.4, 4.5, 3 и 2,7 раз, тогда как % аномальных колдуь^д был в 3.7 раз выше.

При более подробном анализе средних оценок растений-регенератов, в разных по частоте индукции андрогенеза на сахарозе классах генотипов была выявлена обратно-пропорциональная зависимость средних оценок гаплоидов от частоты индукции анорогенеза (Рис.3).

Ет

'К 4 ■

е.-с

Альбиносы ■ Зеленые гаплоиды

0-10 10-20 20-40 40-60 60-80 80-200 Ре

РнсЛ. Средняя оценка (Ет) гаплоидов в разных по частоте индукции андрогенеза на сахарозной среде (Ре) классах генотипов

На гистограмме видно, что лучшими оценками обладают как альбнносные, так и зеленые гаплоиды, полученные от генотипов с некоторой средней (Ре<20) частотой индукции ЭК-генеза. Отклонение в большую сторону от данного значения Ре приводило к уменьшению средних оценок гаплоидов; генотипы с Ре>100 продуцировали только альбиносы с низкими оценками. При индукции на среде с мальтозой такого явления нами не обнаружено.

Полученные данные говорят о том, что экспериментальное повышение частоты эмбрион до- и каллюсогенеза без понимания механизмов индукции может привести к отрицательному результату. В то же время, многие исследователи пытаются применять самые разнообразные приемы повышения частоты ЭК-генеза, включая обработку растительного материала химичссхи-активньши веществами, обладающими гаметоиндными свойствами, облучение микроволновым, рентгеновским и радиоактивным излучением и др. Мы же, полагаем, что на некоторых индукционных средах, специфичных для отдельных видов растений, качественные гаплоиды могут быть получены только от генотипов с низкой частотой индукции ЭК-генеза, не превышающей некоторого порогового значения.

Анализируя полученные данные, мы пришли к выводу, что такие характеристики андрогенсза у пырея сизого, как частота ЭК-генеза fe на индукционной среде П-2 с сахарозой, морфогенность пыльны М, оценка гаплоидов Е и процент эмбриоидов и каллюсов, регенерировавших растения К, отражают некое «гаплопродуктивное

качество пыльцы» Q, которое, в первом приближении, можно подсчитать по следующей формуле:

М -Е R

Q в -

Ге

Таким образом, можно заключить, что метод андрогенеза in vitro позволяет не только получать андрогенные гаплоидные линии, но и тестировать генотипы по их гаплопродуктивному качеству, которое, в свою очередь может отражать качество гаплоидного генома (Размахнии с coast., 2003; Razmakhniri & Chekurov, 2003).

Проведенное нами тестирование генотипов A. glaucum по способности к гаплопродукции в культуре пыльников показало (Рис.4), что очень малая доля генотипов в популяции имеет высокие характеристики андрогенеза. Нами был обнаружен всего один генотип (генотип А, 0,3% от исследованных), способный к гаплопродукции исключительно зеленых гаплоидов на большинстве испытанных сред н еще два генотипа (генотипы В и С, 0,6% от исследованных), продуцирующих 10 - 50 % зеленых гаплоидов от общего числа регенерантов. Около 10% генотипов продуцировали только единичные зеленые гаплоиды.

50%

10% 0,6% 03%

Щ 100% зеленых регенерантов — 30% клены*. 50% альбиносы

в основном альбиносы и единичные зеленые

sffi! >00% альбиносы нвандрогеиныв

Рнс.4. Распределение генотипов по способности к гаплопродукции в популяции Agropyrort glaucum.

Подтверждение применимости вводимых параметров андрогенезя в опытах по отдаленной гибридизации пырея с озимой пшеницей

Применимость в практической работе вводимых нами параметров андрогенеза была подтверждена нами в эксперименте по отдаленной гибридизации с озимой пшеницей . генотипов пырея, контрастно различающихся по способности к теплопродукции.

В таблице 5 приведены сравнительные оценки результатов гибридизации по таким парамерам, как % завязываемости гибридных зерен, процент, прордега^я семян и введенному нами параметру Р. равному произведению процента завязываемости на средний вес одного зерна. Параметр Р - удачно объединяет в себе качественную и количественную оценки урожая семян - чем больше его величина, тем удачнее гибридная комбинация.

Таблица 5. Гнбркдизационная способность и характеристики аедрогенеза у пырей сизого

Генотип пырея Ра* Рр" % завязывания гибрид, зерен % про-раст.анни гибрид, зерен р«»#

Альбина Зелены* Альбине Зеяенде

А 24 >300 0 100 0 100 34 95 401

8 5 >300 0 10 80 . 20 20 90 350

С 50 >300 30 0 90 10 17 50 260

8 130 >300 0 0 50 0 14 0 112

Г 200 >300 20 0 90 0 0 0' 0

АхБ 133 2100 0 0 10 0 14 0 58

Примечание: * Ра ■ частота ЭК-генеза на срсяс с сахарозой " Рр - частота ЭК-теиеэа на среде с мальтозой

Р - •/• замзываии» х средний кс одного зерна 1Я - % ЭК, регенерировавших гаплоиды после индукции на средах с сахарозой (а) . и ыалноэной (О

Из таблицы видно, что генотипы А, В и С, обладающие относительно низкой частотой индукции ЭК-генеза на среде с сахарозой и способные к гаплопролукции зеленых анарогенных растений (т.е. имеющие высокое гаплопроду ктивное качество пыльцы) проявили и лучшие гибридизационные свойства (Р = 400, 350 и 260, высокая прорастаемость гибридных семян). Генотипы 5 н Р с более низким гал непродуктивным качеством пыльцы имели низкие значения параметра Р(Р =112 и Р = 0) и низкую прорастаемость семян, т.е. обладали ухудшенными гнбридкзационными свойствами. При,опылении пшеницы пыльцой созданного нами гибрида между генотипом пырея А с высоким качеством гаплопродукции и

генотипом 3, имеющим низкое качество теплопродукции, значение пароаметра Р снижалось ло 58, т.е. било в 7 раз меньше, чем у лучшего из родителей, следовательно качество пыльцы у такого гибрида ухудшено.

Таким образом, показана эффективность использования предлагаемых нами параметров акдрогенеза для отбора перспективных в гибридизационном отношении генотипов пырея.

Получение гаплоидных н гомодяллондных ацдрогенных линий А^1аисит

Для получения большего количества зеленых гаплоидов, мы провели массовую инокуляцию 2400 пыльников трех генотипов А, %1тсит\ А, В и С, обладающих высокой способностью к галлопродукиии зеленых растений в культуре пыльников, на наиболее эффективную индукционную среду И, содержащую мальтозу.

У всех трех генотипов наблюдался множественный ЭК-генез. Для генотипа А подтверждена способность к 100% регенерации зеленых растений. Генотипы В и С продуцировали около 20% зеленых и 80% альбиносных регенерантов. Цитологический анализ показал, что полученные растения-регенеранты были истинными гаплоидами (п=21).

В поле било высажено 54 гаплоидных растения. Через 3 года, выжили 8, причем 4 растения приобрели признаки диплоидного фенотипа. Цитологический анализ подтвердил наличие у них диплоидного набора хромосом (2 п = 42). Таким образом, нами показано спонтанное удвоение хромосомного набора у гаплоидов А^!аисит, при длительном выращивании в полевых условиях без обработки колхицином.

Структурный анализ показал, что только два гомодиплоидных растения: Ов-2 и Ой-З имели высокие продуктивную кустистость и самофертильность. Более урожайным был удвоенный гаплоид ОО-З, у которого завязалось 24 зерна на растение. У удвоенного гаплоида 00-2, завязалось 10 зерен на растение. Удвоенный гаплоид 00-1 имел только один колос с завязываемостью 1 зерно на колос, а удвоенный гаплоид имея 3 колоса, был стерильным.

На следующий гол чз 8 андрогеиных растений выжило 3. Среди них были два удвоенных гаплоида Бй-З и БО-4 и один гаплоид. Растения БО-З и ОС-4 имели более мощный фенотип, чем в предыдущем году, число колосьев на растение увеличилось с 12 до 22 у Ой-З н, с 1 до 9 у Ой4, На рисунке 5а показаны донорное растение, галлона и удвоенный гаплоид 00-3 через год после спонтанной диплошшзации.

По сравнению с прошлогодними данными у удвоенных гаплоидов, кроме увеличения продуктивной кустистости в 2-9 раз значительно увеличились и другие параметры. Так, для 1X3-3, по высоте стебля, длине колоса, количеству зерен на коло£ и весу 1000 зерен превышение составило соответственно, в 1.3, 1,3, 4,6 и 1.3 раза; получено 334 зерна с растения (в среднем 15 зерен на колос). Для СЮ-4 превышение составило по высоте стебля и длине колоса в 1,2, и 1.3 раза, а количество зерен на растение увеличилось с нуля до 236 (в среднем 26 зерен на колос). Таким образом, в течение нескольких лет после высадки гаплоидных растений пырея в поле, происходили либо постепенные, либо скачкообразные изменения в клетках растений, которые привели, в одних случаях к ухудшению и элиминации растений, а в других случаях к усилению и восстановлению, в том числе фертнльности от полной стерильности гаплоидов и удвоенного гаплоида 00-4 до высокой фертнльности.

Рис.5. Колосья гаплоидного (1) гомодиляоидного (2) и донорного (3) растений пырея сизого

Нужно отметить, что средняй длина колоса удвоенных гаплоидов DG-3 и DQ-4 была выше, чем у родительского растения в 1.2 раза. На рисунке 5 показаны колосья гаплоида, удвоенного гаплоида и донорного растения пырея. Из полученных семян зтих растений были выращены 129 растений, которые составили первичную коллекцию первого семенного поколения удвоенных гаплоидов пырея.

В дальнейших, приведенных в диссертации экспериментах нами была изучена способность к андрогенезу у удвоенных гаплоидов, растений семенного поколения удвоенных гаплоидов и семенного поколения растений с высокими параметрами андрогенеза. Были индуцированы сотни тысяч эбриоидов и каллюсов; часть из них пассированы на регенерационные среды и, в результате, получены около 500 зеленых гаплоидов Л. g/aucum. Эти растения были подробно паспортизованы по параметрам андрогеиеза. Кроме этого, при высадке гаплоидов из пробирок в почву, часть из них была подвергнута тесту на морозостойкость. В качестве эталонов морозостойкости брали растения озимой пшеницы. Результаты показали, что гаплоиды A.ghucum проявляют широкий полиморфизм по морозостойкости (Рис.6), но большинство гаплоидов были очень высоко морозостойки и по времени промораживания в 30 - 70 раз превосходили самые морозостойкие оорта озимой пшеницы.

Результатом проделанной работы явилось создание достаточно многочисленной генетической коллекции гаплоидов, а так же семенного поколения удвоенных гаплоидовь и родительских растений пырея сизого, обладающих качественными андрогенезными характеристиками и рядом других ценных признаков, среди которых можно выделить главные: высокую скрещиваемость с пшеницей и морозостойкость. Это позволяет с высокой степенью надежности использовать полученные линии для создания новых форм пшенично-пырейных гибридов и сортов пырея.

■ растения озимой пшеницы Я гаплоиды A.glaucum

Рис. 6. Морозостойкость га пл он до в A.glaucum и растений озимой пшеницы

М - время промораживания (мин) до необратимой потери тургора тканей

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основе изучения взаимодействия генотип-среда и цитологических особенностей процессов морфогенеза нами создана модельная система культуры изолированных пыльников пырея сизого Agropyron glaucum in vitro и усовершенствована гаплоидная технология, которая может быть использована в практической селекции.

Мы установили, что одним из главных факторов, обусловливающих специфичность процессов каллюсо- и эмбриоидогенеза при культивировании пыльников является степень кнбредности допорных растений. Так, при сравнении способности к андрогенеэу in vitro у кроссбредных и инбредных растений пырея сизого нами показано, что выход андрогенеза у кроссбредных растений был значительно более высок, чем у инбредных, Частота индукции эмбриоидов и каллюсов в кроссбредной выборке растений была в 2-2.5 раза выше, чем в инбредной. Важно отметить, что при этом преобладал эмбриоидный тип развития, тогда, как у инбредных растений развитие чаще происходило по менее дифференцированному пути - через каллюсогенез. Процент генотипов, регенерировавши* гаплоидные растения у кроссбредных растений был выше в 1.8 раз, а средняя оценка гаплоидов - в 4 раза. Полученные данные показывают, что микроспоры у инбредных растений имеют значительно меньшую способность к морфогенезу in vitro, чем у инбредных. Это заставляет по-новому взглянуть на феномены инбредной депресин и гетерозиса. Важным для практики является вывод, что для получения андрогенных линий пырея сизого целесообразно брать в качестве доноров кроссбредные растения, или растения с неглубоким инбридингом.

Другим важным фактором оказалось взаимодействие генотип-среда в культуре пыльников пырея. Для различных генотипов были характерны специфичность реакции индукции андрогенеза и регенерации гаплоидов на определенных питательных средах, В то же время, нами найдены несколько комбинаций индукционных и регенерациоиных сред, обеспечивающих высокий выход андрогенеза у большего числа генотипов. Показано, что применение индукционных сред, содержащих такие дисахариды, как мальтоза и мелибиоза, и регенерационных

сред, содержащих фигогормоиы: КУК, гиббереловую кислоту и кинетнн значительно увеличивает выход андрогенеза по сравнению со стандартными условиями индукции на среде П-2 с сахарозой и регенерации на без гормональной среде.

Следует обратить внимание на то, что генотипы Л.$!аисит, обладающие высокой частотой эмбриоцао- и каллюсогенеза (ЭК-генез) на среде с сахарозой, имели пониженные фенотип ические к хозяйственно-важные характеристики. Падение наблюдалось по таким параметрам, как вегетативная мощность, выживаемость и самофертильность. В то же время, у таких генотипов был повышен процент колосьев с аномальной формой. Анализ регенерационных характеристик в культур« пыльников показал, что качественные гаплоиды с высокими оценками могут быть получены только от генотипов пырея сизого с относительно низкой частотой ЭК* генеза на индукционной среде с сахарозой. Обнаружена обратно пропорциональная зависимость оценок гаплоидов от индуцнбельности новообразований. При индукции на мальтозе такого явления нами не обнаружено.

Разработана методика тестирования генотипов пырея по впервые вводимому нами синтетическому числовому параметру «гаплопродуктивное качество пыльцы», зависящему прямо пропорционально от морфогенносги пыльны, регеиерантиости новообразований и средней оценки гаплоидов и имеющему обратно-пропорциональную зависимость от частоты ЭК-генеза иа среде с сахарозой. Высказано предположение, что параметр «гаплопродуктивное качество пыльцы» может отражать качество гаплоидного генома в микроспорах.

Применимость введенных нами параметров андро генеза была подтверждена в опытах по отдаленной гибридизации пырея с пшеницей. Показано, что генотипы, обладающие высоким качеством гаплопродукции проявили и лучшие гибридизацнонные свойства, оцененные по эавязываемости зерен, их среднему весу и проценту прорастаемостн. Таким образом, предлагаемые нами подходы могут быть реально использованы для отбора перспективных в габридизациоином отношении линий пырея.

Результатом проделанной работы явились важные теоретические и практические разработки метода ацдрогенеэа т У!1го. С помощью усовершенствованной гаплоидной технологии удалось создать многочисленную генетическую коллекцию (более 500 растений и семенной материал) из трех групп растений пырея сизого: гаплоидные растения, удвоенные гаплоиды, донорные растения, обладающие высокими акдрогенезными параметрами и скрещиваемостью с пшеницей и растения семенного потомства от этих растений. Изучены морозостойкость и андрогенезный потенциал в выборке растений из полученной коллекции. Установлено, что большинство растений обладали очень высокой морозостойкостью и по времени промораживания в 30-70 раз превосходили самые морозостойкие сорта озимой пшеницы. Результаты нашего исследования свидетельствуют об огромном значении метода андро генеза, который, кроме использования для ускоренного создания полностью гомозиготных линий, может служить мощным орудием для тестирования генотипов растений. Полученные нами линии используются в исследовательских и селекционных программах по созданию морозостойких форм пшенично-пырейных гибридов и кормовых сортов пырея. Теоретические подходы и методические разработки усовершенствованной гаплоидной технологии могут быть адаптированы к использованы и для других важных сельскохозяйственных культур и видов растений.

выводы

1. На основе изучения взаимодействия генотип-среда и цитологических особенностей процессов морфогенеза создана модельная система культуры изолированных пыльников пырея сизого in vitro и усовершенствована гаплоидная технология, которая может быть использована в практической селекции пырея.

2. Установлено, что одним из главных факторов, обусловливающих специфичность процессов каллюсо- и эмбриоидогенеза при культивировании пыльников является степень инбредностн донорных растений. Показано, что выход андрогенеза и качественные характеристики андрогенных гаплоидов у кроссбредных растений значительно более высоки, чем у инбредных, поэтому для получения андрогенных линий пырея сизого целесообразно брать в качестве доноров кроссбредные растения, или растения с неглубоким инбридингом.

3. Выявлено большое значение взаимодействия генотип-среда в культуре пыльников пырея. Для различных генотипов были характерны специфичность индукции андрогенеза и регенерации гаплоидов на определенных питательных средах. Показано, что применение индукционных сред, содержащих мальтозу и мелибиозу, и регенерационных сред, содержащих фнтогормоиы: НУК, гиббереловую кислоту и кинетнн, приводит к значительному увеличению выхода андрогенеза, по сравнению со стандартными условиями индукции на среде П-2, содержащей сахарозу, и регенерации на безгормональной среде.

5, Установлено, что высокий индукционный эффект мальтозы и мелибпозы обусловлен наличием в их составе ^-глюкозы, которая выполняет в клетках растений важную функцию - связывание гормона стресса АБК в неактивный комплекс.

6. Обнаружено, что генотипы пырея с высокой частотой эмбриоидо- и каллюсогенеза (ЭК-генез) на среде с сахарозой, обладали пониженными фенотипическими и хозяйственно-важными характеристиками, а сами эмбрноиды и каллюсы таких генотипов имели низкую ре генерационную способность.

7. Разработана методика тестирования генотипов пырея по числовым параметрам андрогенеза, в том числе по впервые вводимому нами параметру «гаплопродуктивное качество пыльцы», зависящему прямо пропорционально от морфогенности пыльцы, ре генерационной способности эмбриоидо в и каллюсов и средней оценки гаплоидов и имеющему обратную зависимость от частоты ЭК-генеза на среде с сахарозой. Высказано предположение, что параметр андрогенеза «гаплопродуктивное качество пыльцы» может отражать качество гаплоидного генома в микроспорах. Предлагаемый нами метод тестирования может быть использован для отбора перспективных в гибридизационном отношении линий пырея.

8, С помощью усовершенствованной гаплоидной технологии и применения метода андрогенеза, как теста создана многочисленная генетическая коллекция (более 300 растений и семенной материал) гаплоидных, гомодиплокдных и донорных растений пырея сизого. Показано, что полученные гаплоиды пырея обладают очень высокой морозостойкостью и по времени промораживания в 30-70 раз превосходят самые морозостойкие сорта отмой пшеницы. Созданные линии пырея используются в исследовательских и селекционных программах Института цитологии и генетики СО РАН.

Публикации по материалам исследования

1. Chekurov V,M. and Razmakhnin E.P. Effect of inbreeding and growth regulators on the in vitro androgenesis of wheat grass, Agropyron glaucum H Plant Breeding, 1999, Vol. 118. P. 571-573.

2. Размахнин Е.П., Чекуров B.M Использование андрогенезного теста и регуляторов роста растений в получении пщеннчно-лиренных гибридов // Пшеница и тритикале. Материалы международной научно-практической конференции "Зеденаяреволюция Лукьяненко", посвященная 100-летию со дня рождения П.П. Лукьяненко. Краснодар, 27 мая, 2001г. С. 597-603.

3. Чекуров В.М., Размахнин Е.П., Козлов В.Е. Новые подходы к получению пшенично-пырейных гибридов // В сб. Повышение эффективности селекции и семеноводства сельскохозяйственных растений. Доклады и сообщения VIH генети ко-се ле кцио иной школы, Новосибирск, 11-16 ноября, 2001 г, С. 447-451,

4. Razmakhnin Е.Р., Chekurov V.M. A detrimental effect of inbreeding on in vitro androgenesis of Agropyron glaucum SI Proc. 18th Int. Genet. Congr., Bcijine, 10-15 Aug., 1998. P. 143.

5. Razmakhnin E.P., Chekurov V.M. Androgenesis in wheatgrass Agropyron glaucum anther culture. Inducing effect of various sugars and growth regulators // Proc, 2nd Russian Symp. Trends in Plant Biotechnology. Puschino, 18-20 May, 1993, P, 209.

6. Размахнин Е.П., Ту л л ер Д.М.. Беляев С.Н., Первушин Н.П., Чекуров В.М. Влияние различных сред на выход кал л юсов, эмбрион лов, зеленых и альбиносных растений в культуре пыльников пырея сизого Agropyron glaucum и удлиненного Agropyron elongation i! Онтогенетика высших растений. Тез, докл. Всес, науч. конфер. (17-18 октября 1989г.). Кишинев. Штиинца, 1989. С. 342.

7. Galieva E.R., Razmakhnin Е.Р., Khrístolubova N.B., Chekurov V.M. Utaastrucíural organization of chloropiasts of green and albínous regeneran! plants of wheatgrass// Abstr. 1-st Int. Conf, Actual Problems of Agricult, Intensification. Short handy, June 22-25, 1993. P, 79.

8. Razmakhnin E.P., Chekurov V.M, Correlation of some characters of wheatgrass Agropyron glaucum with hap I op reduction ability in anther culture U Abstr. 1-st Int. Conf. Actual Problems of Agricult. Imensiflcation.ShortbardyJune 22-25, 1993.P. 78.

9. Chekurov V.M., Razmakhnin E.P. Novel biological preparations from conifers and fungi: applications in plant biology and agriculture U Proc. 28th Annua! Conference of the Plant Growth Regulation Society of America, Miami Bcach. Florida, t-5 July, 2001.

10. Чекуров B.M, Размахнин Е.П., Размахнина T.M. Эффект применения регуляторов роста в получении андрогенных линий пырея сизого Agropyron glaucum tí Материалы I Межлуна роли ого конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития». Москва. 14-18 октября, 2002 г. С. Í 30-131.

11. Размахнин Е.П,, Размахни на Т.М., Чекуров В.М, Применение меггода андрогенеза для создания генетической коллекции линий пырея сизого И Актуальные проблемы генетики. Материалы 2-ой конф. Московского общества генетиков и селекционеров им, Н,И Вавилова, посвященной 115-летию со дня рождения ак, 1 1 11 Вавилова, Москва, 20-21 февраля, 2003г. С, 319-321.

12. Razmakhnin El1., Chekurov V.M. Development of haploid biotechnology for wheatgrass Agropyron glaucum (Desf.) // Abstr, 1st Central Asian Wheat Conference. A!maty, June 10-13, 2003. P. 524,

Мб 165

Подписано к печати 25.09 2003г.

Формат бумаги 60 х 90. Печ, л.1. Уч. изд. л. 0.7

Тираж 100 экз Заказ 87

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лзэрентьева.Ю.