Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспериментальное обоснование применения альфа-адренблокаторов и биологически активных веществ для направленной коррекции тромботических осложнений

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Экспериментальное обоснование применения альфа-адренблокаторов и биологически активных веществ для направленной коррекции тромботических осложнений"

.. МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТЛУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ш. м.в. ломоносом

Биологический факультет

ч-- На правах рукописи

ГРИГОРЬЕВА Марина Евгеньевна

Уда 612.115.12:577.175.343

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ШЫЕНЕНШ </~АМШШОКАТОРОЗ И БИОЛОШШЖИ Щ1ШШ , ВЕЩЕСТВ ДШ НАПРАВЛЕННОЙ КОРРЕКЦИИ . ТРСМЭТШЕСКИХ ОСЯСИНЕНИЙ •

Специальность ОЗ. ч/О. 13 фиэвологш человека и животных

. 1а т о ре $ер ат • диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1922

Работа выполнена в лаборатории физиологии и биохимии свертывания крови кафедры физиологии человека и животных биологического факультета Московского государственного университета' им.М.В.Ломоносова (заведующий -• академик АМН СССР И.П.Адаарин).

Научный руководитель -

Официальные оппонент -

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Т.М.Калшевокая

доктор биологических наук, старший научный сотрудник ' ' ■ Ю.А. Шарова

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Е.Г.Киреева

Ведущее учреждение - Всесоюзный гематологический научный центр МЗ СССР. ' ^

Защита состоится "Л? "^/¿^'¿А/^ 1992 года в Большой биологической аудитории в

:

часов на,заседании специализированного совета Д. 053.05.35 в ^Московском государственном ,, университете им. М.В.Ломоносова по адресу: Москва, 119899, •

V * 4 -

'.■•Ленинские гори, (ЛГУ, Биологический факультет.

1 N

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М«В.Ломоносова.

' Автореферат разослан

1992 года.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Б.А.Уыарова

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблема. Несомненно, одной из актуальных проблем современной медицины остается проблема широкого распространения тромботичеоких и тромбогеморрагических осложнений сердечно-сосудистых и других заболеваний.

Согласно классическому представлению причины тромботичеоких ослож шй могут быть связаны с нарушением целостности сосудистой стенки, нарушением тока крови и нарушением соотноше-ия элементов .крови (Струков А.и., Струкова С.М., 1990, Breddin et al. , 1989). К факторам, предрасполагающим к тромбообразованию, можно отнести травму, оперативное вмешательство, возраст, нарушения обмена и др.

Основным осложнением тромболитической терапии наряду с крово-, точивостью являются ретромбозы. Показано, что эффективность терапии тромбозов, тромбамболий и других предтромбогаческих и тромботичеоких состояний современными антикоагулянтндаи и тромболитичесними средствами в большинстве случаев ограничивается серьезной побочной реакпией-активаиией свертывания. Частота ретромбозов при введении в кровоток препаратов плазмина, а также различных активаторов длаз-миногена,достигает 30-52$ ( Collen d» . 1980).

Впервые феномен повышения свертываемости крови и торможнеяия фибршолиза при введении плазмина (фибринолизина) животным - так называемая компенсаторная реакпия - описан в журнале " Nature " Б.А.Кудряиовкм и Т.М.Калишевской в I9S3 г. Экспериментально установлено, что эта реакшш системы гемостаза блокируется фентоламином, иммуносимпатэктомией и хирургической десимпатизашей (Калишевская Т.М., 1982). Следовательно, реакпия гиперкоагуляции на плазмин не является фатальной, т.к. существуют пути ее рмгкологической профилактики. Одним из таких путей может быть.'в.зелоние совместно о тромболитиками гепарина, который отдаляет проявление компенсаторной

реакции (Кудряшов Б.А., 1975). Более физиологичной является блокада этой реакции на у* овне еС -адренорепедторов сосудов о помощью е( -адрекоблокаторов.

Блокахоры -адренореиепторов широко применяются при лечении ряда патологий и, прежде всего, различных сердечно-сосудистых заболевании, что требует знания всего спектра действия этих препаратов. Тем не менее, данные о влиянии о( -адреноблокаторов на систему гемостаза практически отсутствуют.

Учитывая все за в против применения антикоагулянтных, фибрино-литических и адреноблокирувдих средств для профилактики и лечения тромйогических осложнений, необходимо продолжать поиск как новых прей-ратов-(в частности, рехуляторных пептидов), так и новых комбинаций вышеназванных средств для использования их с большей эффективностью.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение механизмов возникновения побочных тромботических осложнений при тромболитической и антикоагулянтной терапии биологически активными веществами белковой, полисахарвдной и пептидной природы и путей ■х преодоления. Исходя из этого были поставлены следующие задачи:

- учитывая адренергаческу» природу компенсаторной реакции системы гемостаза на плазмин, изучить влияние с/, -адреноблокаторов на

\

ее^реализашк;

; - исследовать влияние неселективного (дигидроэрготоксин) и селективных (празозия, йохнмбин) о( -адреноблокаторов на систему гемостаза интактнцх кивотных и животных с экспериментальным тромбозом;

- на разных моделях тромбоза изучить возможность использования неселективных и селективных сС -адреноблокаторов с целью повыаения эффективности применения фибранолитиче^ких и алтакоагулянтшсс средств в противотромботической и тршболитической терапии;

- провести сравнительный анализ влияния аргинил-вазопрессина и

3.

его аналогов на состояние системы свертывания крови интактных животных и изучить механизмы увеличения активности активаторов плазмино-гена (ААП) и усиления лрокоагуллнтншс свойств крови под действием этих пептидов.

Научная новизна. При использовании неселективного и се. активных -адреноблокаторов показано участие о( -адренореиепторов в осуществлении реакции гиперкоагуляшш на плазмин (фибринолизин) и ведущая роль -^-адренореиепторов. Установлено, что введение ди-гццроэрготоисина (ДЭТ). и празозина приводит в выбреду активаторов . ' плазминогена Из сосудистой стенки, увеличе-чю фибринолиза и анти-коагулннгной активности крови, оС ^-Адреноблокатор йохимбин не обладает выраженным действием на фибринолиз, При исследовании фибри-иолатической активности комбинации ДЭТ или празозина с плазмином ' показано, что данные блокагоры блокируют реакцию гиперкоагуляшш на плазмин, усиливая и значительно пролонгируя его фибринолитические эффекты. ' ■

С использованием модифицированной чодели венозного тромбоза по Весслеру и анализа гистологических препаратов тромбов с реконструкцией их структуры установлена высокая эффективность тромболити-ческого действия сочетаниого применения плазмина и о( -адреноблокаторов (ДЭТ и празозина). На двух моделях тромбоза (модели тр<~чбооб-разования в артерио-венозном мунте и модг та тромбоза в яремной вене крыс) показана возможность повышения эффективности как тромболити-.ческих (плазмин), гак и антикоагулянтных (не^пакшюкэдэовашшй (НФГ) и низкомолекулярный (ШЛГ У гепарин) средств с целью предотвращения тромбообразования при использовании ДЭТ или празозина. ШГ, используемый в различных экспериментальных условиях, имеет определенное

\

преимущество перед БФГ, обладая более выраженным протиаотромботиче-ским эффектом.

При сравнительном анализе влияния на состояние системы гемосга-

за вазопрессина и его аналогов установлено, что наиболее значительное и длительное успение ААП вызывает внутривенное введение вазопрессина, и показана ведущая роль центральных М-холинорепепторов в этом процессе. Показано, что при инъекции лишенного гормональной активности аналога вазопрессина дез-глишш-айид-аргияил-вазопресси-иа {ДГАВП) наблюдаются значительное усиление прокоагулянтных свойств крови и торможение фибршолиза. Установлено участие адренергических леханизмов в осуществлении этих реакций.

Практическое значение. Результаты наших исследований углубляют представления о механизме осуществления компенсаторной реакции системы гемостаза яа плазмин. Выявленная в работе роль <р( -адренорецеп-торов, в частности, ¿(^ -и их подтипов, в регуляции системы

гемостаза представляется важной для успешого применения с1 -адрено-блокаторов при течении сердечно-сосудистых и других заболеваний, связанных с тромботичесними осложнениями»

Выявление возможных путей блокады реакши гшеркоагуляшш при использовании фибринолитических средств (в частности, плазмина) и

усиления и пролонгирования их пряного действия, а также действия «

антикоагулянтов (НФГ и НМГ), открывает новые возможности для применения этих средств в тромболитической и противотромботичеспой терапии. Впервые примененный.нами для этих целей о(. ^.-адреноблокатор празозин, обладающий рядом преимуществ по сравнению с неселективпы-ыи о( -адреноблокаторами, может являться препаратом выбора при терапии тромбозов, проводимой при ряде патологий, в частности, при сердечной недостаточности.

Изучение действия вазопрессина и его аналогов и, прежде всего, используемого в клинической психиатрии ДГАВП,"выявило возможность тромботических осложнений при его применении. Результаты исследований механизмов усиления ААП и увеличения свертывающего потенциала крови позволяют использовать эти пептиды для направленной коррекции

нарушений в системе гемостаза.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на конферен-шш "Противотромботическая терапия в клинической практике. Вопросы фибринолиза и тромболиза" (Ялта, 1988), на патофизиологическом съезде "Нарушение механизмов регуляции и их коррекция" (Кишинев, 1989),

на заседании кафедры физиологии человека и животных МГУ от 18 декаб-

!

ря 1991 года.

отруктура и объем работы;''Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов исследования» их обсуждения, выводов, -списка использованной литературы. Работа изложена на 185 страницах машинописного текста, содержит 5 таблип и 34 рисунка. Список литературы включает 274 названий.

«

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получали препараты: плазминоген из человеческой плазмы методом аффинной хроматографии на лизин-сефарозе ("pharmaoia ".Швеция) ( Deutsch et al, » и Дефицитную ~о фактору УШ плазму крыс

( Salem et al., 1985). Плазмин получали активацией плазмзшогена каталитическими количествами сфрепгокшазы ("Behring да ФРГ) при молярном - соотношении плазминоген/стрептокиназа 1:0,05 (Попова Г.Ю., 1991).

Использовали следующие методы ангш»-а препаратов: концентрацию. плазминогена определяли спектрофотометрически, принимая %280 I см3 .=17,0; определяли казеинолтаическую активность плазмина (Баскова И.П., 1976) и фибриноллтиче скую активность в условных единицах (Андреенко Г.В., 1979).

Состояние системы гемостаза оценивали комплексом общепринятых методов (Андреенко Г.В. и др., 1980), проводили тромбоэластографиче-ский анализ (Балуда В.П. и др., 1980). Анти-факгор Па активность п Плазме крови определяли ПО прописи " Boohringer•Mannheim "(ФРГ),

V . • "..■:'

6.

используя высокоспешфичньй хроыогенный субстрат тромбина То s - gi у-Pro-Arg -pNA. АсОН (хроыозим ТН) этой же фирмы. Определяли актив- -ность фактора УШ ("Haemoetaalo *', 1985) и активность 5*-нуклеоти-дазы в плазме крови (Зубаиров Д.М. и др., 1987).

Опыты по внутривенному введению препаратов проводили на 1200 белых беспородных крысах обоего пола массой 180-200 г« Исследуемые препараты и О.Э^-й u аС1 вводили в v.juguiario и через определеи-•ые промежутки времени из противоположной вены .брали кровь. 'Моделирование тромбоза проводили по модифицированному методу Acida в артерио-веиозном шунте (Банков Г.В. и др., 1988) и по методу v/es -sler et eO,CC959). Статистическую обработку результатов проводили по ' методу Сгьюде нта-Фшера и с использованием непараметрических методой вариационной статистики.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

I. Изучение блокады адрекерпгческих влияний на уровне с^-адре-норецепторов при использовании фибринолитстеских средств. •

Перед выполнением этой серии экспериментов проводили подбор эф-.¿ек-швных доз блокагоров, обеспечивающих блокаду гипертензивного и гиперкоагуляшонного действия норадреналина (2,3x10"'' М/кг) и фенлл-эфрина (5x10" ^ М/кг) -агоднстов и í/r-адренорецепторов. Для ДЭТ ('\Spofk ", • ЧССР) эта доза I мг/кг, для празозина ("Orloa Финляндия) - 2 мг/кг, для йохимбина ("Пика ФРГ) - 5 мг/кг. Надо.отметить, что вводили не физиологические, а фармакологические

'У

дозы ¿локаторов и других используемых препаратов.

Исследование механизмов, обеспечивающих антикоагулянтное.действие о( -адрекоблокаторов показало, что ДЭТ ухе через 10 мин после введения вызывает увеличение тромбинов^го времени (ТВ) на 18+7$ (р <0,001) по сравнению с исходным фоном, принятым за 100$. Через 120 niih после введения ДЭТ ТВ было повышено на 55%(р ^ 0,001) (рис.1,¡

г- «-

«е

I

7.

\ Рис. I. Изменение а . ! показателей системы : свертывания крови при внутривенном введении . , о( -адреноблокаторов . ! (а - ДЭТ; б - празозш; в - йохимбин),

I

/—к

---V,"

. .,____I

По оси абсцисс - время после введения;по оси ординат - изменение суммарной (СФА), неферментативной (НФЛ), ферментативной (ФФЛ) -фибринолитической активности, активности активаторов плазминогена (ЛАП), тромбинового времени (ТВ) и концзитрашш фибриногена (Ф-ген) в % к контролю. ч

Здесь и на последующих рисунках: » •

.-р $0,05; ..- р« 0,01; ... 0,001.

При блокаде ^ -адренореиепторов селективными <^-адреноблокаторами празозином и йохяыдшим антикоагулянтная активность крови была повышена на 12-14$ по отношению к исходной в течение всего периода наблюдения (рис. I, б,в). При исследовании влияния ¿локаторов на показатели, характеризующие фибринолиз, установлено, что ДЭТ и празо-зин вызывают повышение фибринолитической активности эуглобулияовой фракгши плазмы крови как ферментативной, так и неферментативной рироды. Как видно из рис. 1,а>на 10-й мин после введения ДЭТ АМ была повышена более чем в 4 раза (р 0,01) по отношению к исходной и оставалась увеличенной на протяжении всего периода наблюдения, ■ возвращаясь к исходному уровню к 3-му часу эксперимента. При блока' де ^ ^адренореиепторов празозином АЛЛ возрастала почти вдвое (р <0,01) н возвращалась к исходному фону в конце 1-го часа. Йохим-бин не вызывал достоверных изменений фибринолитической активности и ААП в крови, хотя к'60-й мин наблюдения СФА. и НфА были увеличены на 32+6,3^ и 25+4,3$ соответственно (рис. 1,в). Надо отметить, что под влиянием ДЭТ и празозина наблюдалось незначительное снижение концент-рашш, фибриногена плазмы крови и антиплазминовой активности.

_При сравнительном анализефибринолитических эффектов, вызываемых плазышюм в сочетании с различными о( -адреноблокаторами, установлено,, что эффективными.средствами, тормозящими компенсаторнув реакцию на плазмин, продляющуюся снижением антикоагулянтной и фибринолитической активности крови, являются о( -адреноблокагор ДЭТ и \

о( ^-адреноблокатор празозин. Из рис. 2 можно видеть, что названные 1 с^-адреноблокаторы блокируют развитие реакции гшеркоагудаыяи на плазмин и, кроме того, вызывают освобоаденне сосудистого акттатора ' плазыиногена, значительно пролонгируя литические свойства.плазмина. . «/¡¿-.Адревоблокатор йохимбин'в, этом отношении бил малоэффективен. Было показано, что Дри введении о^-адреноблокаторов, а именно ДЭТ и празозина, блокируется'поступлеш1е.;;в>кровоток тканевого троыбо-

«ЗА

АЛИ

* зю

203 ' ЮС

а

К '

"з 207

о и 30

«я о

О {О ЯГ

60 кан

I N3

!

I газ 1

I т

1

а,

I

Э'-пхпдливдаи

2 {СО

пал

-I 4

О «

о {о та

60 миг/

Рис.2.Изменение биохимических показателей системы гемостаза при введении плазмина в сочетании с ¿К-адреноблокаторами. По оси абсцисс - время после введения; по оси ординат - изменение в % ферментативной (ФФА) и неферментативной (НФА) фибринолитичес'кой активности, активности активаторов плазмияогена (ААП) и активности 5'-нуклеотидазы (I - физ.р-р + плазмин, 2 - ДЭТ+плазмин, 3 - празо-зия+плазмин, 4 - йохимбин-н плазмин). \

о

пластина. Об усиленном поступлении в кровяное русло троыбопластина после введения плазь,.ша свидетельствуют наш данные о значительном (в 3 раза по сравнению к исходной) росте активности маркерного фермента - 5'-нуклеотидазы (рис. 2).

П. Использование о1 -адреноблокаторов для повышения тромболи-тичеокой и противотромботической эффективности плазмина, гепарина ц его низкомолекулярных форм. Учитывая влияние адреноблокаторов на систему гемостаза,было предпринято исследование с целью поиска наиболее эффективной их комбинации с антикоагулянтными и фибрино-литическими средствами для профилактики тромбообразования и лизиса • . экспериментальных тромбов у крыс.

Моделирование венозного тромбоза проводили по методу Тсеза1ег et а1» (1959) введением контактно-активированной снворотхш с. предварительной инъ.кпией атропина (I мг/кг). Используемый наш модифицированный метод экспериментальных тромбозов давал возможность их образования в 100$ случаев. Моделирование тромбоза сопровождалось \ изменениями в крови по типу диссемшшрованного внутрисосудистого свертывания (рис. 3): в конце 1-го часа эксперимента наблюдалась гиперкоагуляппя со снижением фибринолиза и ААБ на 36+6,7$ по сравнению с уровнем ЛАП у интактннх животных, ускорением ЛЧТВ и значительным, на 17.7+23,6%, возрастанием б'-нуклеотидазной активности, свидетельствующем, как уке. упоминалось, о массовом поступлении в кро-. воток троыбопластина., Все исследуемые группы препаратов вводили через 60 мин после начала моделирования тромбоза, т.е. на фоне сформировавшихся тромбов, и оценивали массу оставшихся тромботичеоких масс визуально, по четырехбальной шкале и гистологическим методой, через I или 2 часа после инъекции лидирующих веществ.

Как можно видеть из рис. 3, введение на фоне тромбоза плазмина в дозе 600 ПЕ (1,9-3,8хЮ~® М/кг) приводит к гиперкоагуляции и

1

I

| гл

(Я

5а

ЗЯ

5?;

/а

к >

/А .

/ !

/23 час.

*

у да

р-—X" 2

0/2 3*ос, } «.

на

Г

Т_—I <

/

3

Рис.3.Изменение показателей-системы гемостаза при тромбообразовашга

и троыболизисе плазмином на фоне <7(-адгеноблокаторов.. По оси абсцисс - время исследования; по оси ординат - изменение' в %:' а - фибринолитической активности, б - активности активаторов йлазми-ногена, в - активированного частичного тромбопластинового времени, г - активности 5'-нуклеотидазы. Стрелкой отмечено введение агрогпи-.. и контактно-активированной сыворотки, звездочкой - введение препаратов (I - физ.р-р+плазмин, 2 - ДЭТ+ плазмин,' 3 - празозин+плазмин).

¡о

торможению фибринолиза ухе через I час после инъекшш. Комбинация плазмина с ДЭТ или и^аэозиноы усиливала фибринолиз в 2-3 раза по отношению к предтроыботическому фону и приводила к стойкой гипокоа-гуляпии. Анализ гистологических препаратов оставшихся после лизиса экспериментальных тромбов с реконструкцией их структуры позволяет наглядно оценить эффективность используемых для тромболизиса препаратов, Из рис. 4 видно, что сам плазмин обладал низкой логической активностью и вызывал незначительное уменьшение размеров тромбов по сравнению с контролем при спонтанном лизисе. Средний балл тромбо-тических масо после тромболизиса одними ¿локаторами составлял 1,5-2. Значительно лучший литический эффект наблюдался при использовании плаь..,ина в-сочетании с >( -адреноблокаторами, Средний балл оставшихся тромботических масс - 0,65-0,75 (рис. 4). При этом тромбы лизи-ровались полностью в 75-82$ случаев.

Следующая часть нашей работы была посвящена проблемам профилактики троыбообразования, поскольку именно возможность предотвращения , тромботических осложнений является наиболее актуальной для клиники \ тромбозов. Мы исследовали эффективность профилактики тромбообразова-:ия ллазмином, гепарином или его низкомолекулярной формой в сочетаниях с -адреноблокаторами, используя для этих целей две модели троыбообразования - по Весслеру и в артерио-венозном шунте, приме-ня£ метод прямой регистрации кровяного давления в шунте в последнем случае. Для того, чтобы оценить эффективность профилактики тромбооб-разоадния в течении времени, исследования проводили в двух вариан- I тех -\тромбообразование моделировали на Х5-ой мин после введения . исследуемых препаратов и в более отставленный период времени. За ' время троыбообразования (ВТ) при использовании второй модели тромбо-. за принимали момент от начала кровотоку в шунте до достижения наименьшего значения кровяного давления. В контрольной серии экспериментов у животных, получавших внутривенно дважды 0,9$ раствор ИаИ,

гдита.т III

О * *>

с л о н гланий а л з и с

ввя^я'^^етя с

имГ' »■! и

»''■'йй'.Й'^^1

Щ

• ИЗ.Р-* ♦ шзив

1эт + пдлзаяя

Д 3 Т •» О ВЗ.Р-Г

г

1

ирьзозий * ш з к я н

ПРА303КН+ СИ З.Р-1-

через 1 чей

поем ввоишш првивритоа

ч»р«з 2 часа поели ВБвлеяяя цреирето»

- тросйстп пекл» ШССИ

| | - вроевгг сосуда,саоведщ* от

1рскЗоппесяа масс

Рис. 4. Тромболитическая активность исследуемых препаратов.

наблюдалось снижение кровяного давления в шунте на 40-50 мм.рт.ст. через 2,33+0,1 мая поело начала кровотока в шунте.

В первой серии экспериментов профилактику тромбообразования осуществляла сочетании введением плазмина (600 ПЕ/кг) и <Х -адре-коблокаторов. Кровоток в шунте восстанавливали через 15 или 120 ■ мкк после инъекции.'препаратов. Под влиянием плазмина, при моделировании тромбоза через 15 мин'после его введения, ВТ увеличивалось на I45/Ï по сравнешпо с контролем (рис. 5,А) и составляло 5,67+0,15 мин, а через 120 мин не отличалось от контрольного. Как mosiio видеть кз рис. 5, при введении плазмина на фоне «¿-адреноблокаторов наблюдалась еще больная тенденция к удлинению ВТ. При восстановлении кровотока в шунте через 15 мин после ннъекшш плазмина и ДЭТ или плазмина и празозина ВТ увеличивалось на 318^ и 277$ по сравнению с контролем, а через 120 мин - на и 42% соответственно. Таким образом, результаты этой серии экспериментов показывают, что плазмик в сочетании о cL -адреноблокаторами удлиняет ВТ почти в 2 раза по сравнению с действием одного плазмина. Кроме того, применение cL -¿локаторов пролонгирует его литическое действие.

Во второй серии экспериментов профилактику тромбообразования осуществляли введением НМГ (" Seleus ", США; 4,4 КД) или НФГ • , (" serra ", ФРГ) в дозе 40 US? ЕД/кг и с( -адреноблокаторов в возмогших вариантах. Кровоток в шунте восстанавливали через 15 или 180 мин после инъекшш препаратов. Из рис. 6 можно видеть, что при одинаковой введенной дозе при моделировании тромбоза как на 15-ой, так и на 180-ой мин после инъекции НМГ, по сравнению с НФГ, вызывает почти в 2 раза большее удлинение ВТ от контрольного (р<:0,001), Использование в профилактических целях комбинаций НМГ или НФГ с с( . -адреноблокаторами обнаружило значительно лучший эффект. При моделировании тромбообразования через 15 мин после сочетанного введения 1Ш' к ci-адреноблокаторов ВТ увеличивается в 4-5 раз по сравне-

И

1

f

Рис.5. Профи.-1ктика тромбообразования в артериочвенозном шунте плазмином ¡1 его комбинациями с с^-адреноблокаторами.

100

По оси абсиисс - время после введения препаратов: А - 15 мин. Б- 120 мин; по оси ординат - изменение времени тромбообразования (в % к контроли)(Г-фнз.р-р4фиэ.р-р,2-сриз.р-р+плазшш1 3 -ДЭТ+^лазмин, 4-празозин+плазмин, 5-ДЭТчфиз.р-р, 6-празозинчфнз.р-р).Показана достоверность различий в грушах животных, получавши плазмин на фоне физ.-р-ра и плазмин на фоне блок, оров.

Рис.6. Профилактика ■ 1 тромбообразования в артерио-венозном ' j шунте у крыс НФГ и HMD и их комбкнаш!я..л с ! р<-адреноблокаторами. .

По оси абсиисс - время после введения препаратов (начало тромбообразования) : А - 15 мин; Б - 180 мин; по оси ординат - изменение времени троыбообразоваШзя {% к контролю) (I - физ.р-р+ физ.р-р, 2 - НМГ+ физ.р-р, 3 - НФГ + физ.р-р, 4 - НМГ + ДЭТ, 5 - НФГ+ДЭТ, 6 -EV1T+ празозин, 7 - НФГ +празозин); Показана достоверность различий в группах . животных,получавших НМГ (НФГ) на фоне физ.р-ра и на фоне блокаторов; в скобках дана достоверность различий в группах, получавших НОГ и НМГ. ' '

• 16. ;

нию с контролем, а при инъекции НФГ и блокаторов — в 3-3,5 раза. Эта . тенденция сохраняется и при восстановлении кровотока в шунте через 180 мин после введения препаратов. Кроме того, необходимо еще раз . подчеркнуть, что введение.НМГ. как на фоне физиологического раствора, j ®ак и на фоне блокаторов приводит, к более значительному удлинению ] ВТ (р -¿0,001),' чем инъекция НФГ в тех ке условиях. . ]

При использовании модели тромбоза по Весслеру эффективность j профилактики тромбообразования предлагаемыми препаратами, оценивали ' визуально по четырехбальной шкале. Полученные"результаты подтверж- ; . дают изложенный выше материал. Параллельное изучение биохимических показателей свертывания крови показало; что применение блокаторов при моделировании тромбоза усиливает антикоагулклтные и фибрияоли-тическке. свойства крови. . ' . • , '

Ш. Изучение механизмов изменения фибрииолитической и про- ' •

коагудянтной активности крови при внутривенном введении вазопрес-

сина и его аналогов. Спектр препаратов, используемых в тромболити-

ческой терапии,не ограничивается представленнши нами. Ведется

, поиск новых средств, обладающих высоким фибринолитическим действием,

в частности, регуляторных пептидов. К ним относятся вазопрессин и

его синтетический аналог ДЦАЗП ( An се 111 et al. ,1989). Наиболее

известно применение этих пептидов для коррекции нарушений процессов

, свертывания крови пр^лечении больных гемофилией А и болезнью Вил-

лебранда ( Lathagen et al., 1990; Wilson et оЛ.. , 1986).. Однако,

наблюдаемое параллельно увеличению содержания фактора УШ зиачитель-

а о

. ное усиление AA1I и наличие противоречий по этому поводу требует > дальнейшего изучения вопроса об усилении фибринолиза. Из данных ли' тературы известно об участии холинергических структур в освобождении тканевого активатора плазминогена под влиянием вазопрессина и МАВП ( ' coliuci et al. , 1584). Тем не менее, поскольку остается откры-

тым вопрос о центральном или периферическом механизме выделении активаторов под влиянием вазопрессина, целью данной серии экспериментов было установить возможность участия этих структур в реахшиях системы гемостаза па появление данного пептида в крови.

Для блокады периферических и центральных холинорепепторов использовали атропин (I мг/кг), а периферические холинорепепторы блокировали меташшом (0,5 мг/кг). Максимальное блокирующее действие атропина проявляется на 60-ой мин, а меташша - через 20 мин после инъекции (Машковекий, 1984, Никольская и'др., 1975), поэтому введение вазопресси-а осуществляли на пике действия этих препаратов.

Наиболее эффективная доза вазопрессина ("Serva " ФРГ) составляет 4 мкг/кг, при этом максимальные изменения прокоагулянтиой и фибршюлитической активности наблюдаются через I мин после введения вазопрессина. Поэтому использовали данную дозу пептида с дальнейшим исследованием биохимических показателей системы свертывания крови в указанное время.

При внутривенном введении вазопрессина как на фоне атропина, так п на фоне меташна прокоагудлнтные реакции пептида практически полностью сохраняются. На 1-ой мин после введения пептида наблюдалось увеличение активности.фактора УШ на 11?°% (р <0,001). Как. видно из рис. 7, лишь частично эту реакцию блокировал атропин, а на фоне меташна 'вазопрессии сохранял свое действие. Усиление фиб-ринолитических свойств крови, при ияъекшш вазопрессина, судя по • полученным результатам, связано с активацией центральных холинерги-ческих структур, поскольку введение пептида на фоне блокады !.4-хо-линоренептороо атропином заметно снижает фибринолитичесиую активность крови и, прежде всего, МП, тогда как на фоне меташна эффект пептида полностью-сохраняется (рис. 7).

При сравнительном анализе влияния вазопрессина и его нескольких аналогов на систему гемостаза установлено, что Наиболее atmit-

»ö «u ш

Рис. 7. Изменение биохимических показателей системы гемостаза при введении вазопрессина (ЛВП) на фоне атропина или метапина.

По оси ординат - изменение в $ активности фактора УШ (ФУШ), фибршюлитической активности (ФФА) и активности активаторов плазминогена (ААП) (I - значение показателей интакгкых животных, принятое за 100%, 2 - введение ЛВП на фоне физ.р-ра, 3 - введение ABU на фоне атропина (меташна), 4 - введение одного атропина (мегашша)).

• ■ . -19.' ¡'

тельное усиление МЛ вызывает внутривенное введение вазопрессча. ! Полностью лишенный гормональных свойств аналог вазопрессина ДГАВП i,'. (Ип-т органического синтеза, г. Рига), оказывает на систему свертывания крови несколько отличное от вазопрессина и ДДАВЛ влияние. j. Результаты наших экспериментов показали, что ДГАВП в дозе 4 мкг/кг í вызывает увеличение активности фактора УШ в течение всего периода \ . |. наблюдения, при этом эффект достигает максимума к 30-ой мин наблюде- ¡,: ния, тогда как при инъекции вазопрессина и' ДДАВП уже к 5-ой мин мы ' регистрировали снижение этого показателя. Необходимо отметить, что [■ ДГАВП после незначительного усиления фибринолиза на первых минутах ; вызывает его снижение и резкое падение ААП к 15-30-ой f'H наблюдения ¡ (до 25+6$, р 0,001). Кроме того, наблюдается значительное (на ! 110+19,6$) увеличение концентрации растворимых комплексов фибрин- ! мономера (рис. 8). ¡

Учитывая, что данный пептид используется в психиатрии для коррекции нарушений краткосрочной памяти при травмах головного мозга, ' старческом маразме, болезни Альигеймера ( yan вгее et al. , 1988, sael et al. > 1987) и то, что увеличение содержания фактора У1" мо- ;

жет быть связано, по данным литературы, с активашей А-адренореиеп- !

- .]

VOpOB ( Coxall et al.v, 1987, Hampton et al. . 1987), МЫ попытались • ! использовать / -адреноблокатор индерал, чтобы,снять мощное прокоа- _ j гулянтное действие ДГАВП, которое может в определенных условиях при- . вести к нежелательным тромботическим ослозшешшм. Как можно видеть j из рис. 8,' предварительное введение ивдерала (I мг/кг) почти пол- ¡ ностьга снимает прокоагулянтное действие ДГАВП, а также несколько ; усиливает фибринолиз." Причем, эти изменения достоверно (р 0,01) отличаются от таковнх, наблюдаемых после введения одного пептида. -Адреноблокатор ДЭТ, в меньшей степени влияя на прокоагулянтное дей- : ствие пептида, вызывает более значительное усиление фибринолиза за счет большего увеличения ААП (рис. 8).

Рис.8.Изменение показателей системы гемостаза при введении дез-гли-шгл-алвд-аргияил-вазопрессина на фоне адреяоблокаторов. По оси орда; нат - изменение показателей в %; а - активированное частичное тромбе ' пластиковое время, б - активность фактора УШ, в - растворимый фибрив • г - фибринодигическая активность, д - активность активаторов плазмия , гена. (I - значение показателей интактных животных, принятое за 1005? ', 2 - введение ДГАВП на фоне физ.р-ра, 3 - введение ДГАВП на фоне ДЭГ, 4 - введение ДГАВП на фоне индерала). В скобках показана достоверность различий между группами животных,получавших ДГАВП на фоне- ад-реноблокаторов и па"ионе физ.р-ра.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты представленных выше экспериментов показывают, что эффективными средствами, тормозящими компенсаторную реакш гипер-коагуляшш на плазмин, являются -адреноблояатор ДЗТ и блокатор г/ j-адренореиепгоров празозин. Это указывает на участие </-адреноре-иепторов в осуществлении этой реакции. Анализируя полученный экспериментальный материал, мокно говорить о неодинаковой роли и адренорепепторов в физиологической рефляции системы гемостаза, в частности,о ведущей роли cl j-адрекорепепторов в освобождении актиза-' торов плазминогена стенкой сосудов. Блокада оС 2-адрепореиепторсв йохимбином увеличивает антикоагулянтную активность кро: не связанную с изменением фибринолитических свойств.

ДЗТ и празозин усиливают и ?"<ачательао пролонгируют фпбринол::-тические эффекты плазмина, а их сочетания с НМГ или НОГ значительно улучшают эффективность противотромботического действия гепаркков, что показано на двух моделях трог.боза. Представленные данные псзвс-ляют говорить о перспективности использования для тромболизпса к профилактики тромбообразования не только ДЭТ, но и о^-адрепобл .а-тора празоэина, тем более, что празозин имеет ряд преимуществ. В. отличие от неселективных -адреноблокаторов, увеличивающих венозный возврат крови к сердцу, он не оказывает выракенного действия на зе- • нозный тонус ( Wood et al., 1976) и, тем самый, не увеличивает венозный возврат к сердцу. Это дает возможность попользовать его с меньшими неблагоприятными последствия,",'.л, например, у больных с диагнозом сердечной недостаточности и инфарктом миокарда. При хирургических операциях, в акушерской практике, при опасности тромбозов глубоких вен нижних конечностей, вероятно, с наибольшей эффективностью можно использовать сочетания плазмина, НФГ или НГ.1Г с ДЗТ. Эти комбинации в данном случае, помимо благоприятного влияния на гемостаз, улучшают также реологию крови "и уменьшают венозный стазСКаккаг т13зэ).

Как уже отмечалось, ведется поиск новых препаратов, обладающих высоким фибринолитическим действием, о целью использования их в тром-болитической терапии, а именно, регулягорных пептидов ( тотсЪоЪт ot al. , 1987).

Однако, несмотря на значительное усиление ААП при инъекции ва-зопрзссина, учитывая неизбежное усиление.прокоагулянтных свойств крови и мощное антидиуретическое действие пептидов, мы полагаем, что применение вазопрессина и ДДАВД в тромболитической терапии при наличии других антикоагулянтных и фибринолитических средств.является нецелесообразным. Кроме того, поскольку аналог вазопрессина ¿I' 'ЗП находит применение в психиатрии, особенно у людей пожилого возраста, полученные нами данные необходимо учитывать при использовании пептида в клинике, т.к. его применение в. определенных условиях ;до>:;ет привести к тромбозу. Мы предлагаем использовать, его на фоне предварительного введения fi -адреноблокаторов.

Таким образом, полученные результаты позволяют полагать, что использование в клинической практике сС -адреноблокаторов с фибри- ' политическими.или антикоагулянтными средствами может быть наиболее эффективно только после общего обследования больного с учетом показателей гемодинамики и исходного состояния системы гемостаза. При использовании вазопрессина и его аналогов необходимо также учитывать их гормональное действие и возраст пациентов.

ВЫВОДЫ

1. Введение фибринолитических препаратов, таких как плазмин и фибри-нолкэин, вызывает в организме развитие реакции гиперкоагуляции. Блокаде ото.': реакши кеселективным ci-адреноблокатором дигидроэрготок-спном свидетельствует об участии /-адренореиепторов в осуществлении oro;: peaK:j:v,i.

2. Ьлокьтор cí т-адрекореиепторов празозин блокирует развитие реак-

ции гиперкоагуляции на плазмин (фибринолизин). ;

3. Дигидроэрготоксин и празозин увеличивают антикоагулянтную активность крови и усиливают фибринолиз,вызывая выброс активатора плазми-ногена из сосудистой стенки.Это их свойство.такке как способность г блокады реакции гиперкоагуляции на введение фибринолитическкх средств, : может быть использовано для профилактики и лечения различных тромбо- ; тических осложнений. ''

4. При сравнительном анализе эффективности действия нефракционироЕан-ного,низкомолекулярного гепарина и их сочетаний с -адреноблокатора-

л

ми показано,что с наибольшим успехом для предотвращения троыбообразо-вания мокно использовать комбинации нхзкоиолекуляриого гепарина с ДЭТ или празозином.

5. Наиболее значительное усиление активности активаторов плазминогс-на при изучении влияния регуляторных пептидов на систему свертывания крови обнаружено при инъекции вазопрессина.Показана ведущая роль центральных Ы-холинорецепторов в реализации этой реакции.

6. При внутривенном введении аналога вазопрессина дез-глицил-амид-аргинил-вазопрессина показано значительное усиление прокоагулянткых свойств крови и торможение фибринолиза и возможность предотвращения этих реакций при использовании оС и у9-адреноблокаторов.

•СПИСОК РАБОТ,ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Голубева Н.Г..Калишевская Т.Ы..Башков Г.В..Григорьева М.Е.Елияние (Х-адреноблокаторов на систему гемостаза.-Физиол.журн. ,1963,т.34,

№ 5,с.Ю8-НЗ.

2. Голубева М.Г..Соловьева (Григорьева)М.Е.Изменение реакций системы гемостаза на вазопрессин с помощью холиноблокаторов.-Б сб."Нарушение механизмов регуляции и их коррекция" .Москва,19Ь9,т.Ш,с.1218.

3. Голубева М.Г. .Калишевская T.Li. ,СоловьеБа(Григорьева)Ы.Е.Влияние вазопрессина и его аналогов на свертывание крови у крыс.-Флэиол.гурн.. 1990,т.36,№ 3,с.25-30.

4. Голубеза М.Г..Калишевская Т.М. .Бапков Г.В.,Соловьева(Григорьева)Ы.Е. Повыаение эффективности фибринолитического действия плаэиина с поиощьо

терапия в клинической практике.Вопросы фибринолиза и тромболиза",Москва,1990,с.52.

5. Голубева М.Г..Калишевская Т.М.,Соловьева(Григорьева)!!.Е..Воскресенская 0.Г.Участие адренорецепторов в реакциях системы гемостаза на введение дез-глицил-амид-аргинйл-вазопрессина.-Вестник МГУ,1991,№ 4,

с.29-33.

6. Григорьева Н.Е. .Калипевсн-ая Т.М. .Голубева М.Г.Влияние плазшша и его ,мбинаций с о(-адреноблокаторами на тромболизис.-Вестник МГУ (з печати).

7. Григорьева М.Е..Калишевская Т.Н. .Голубева Ы.Г.Влияние плазмина и его комбинаций с о(. -адреноблокаторами (ДЭТ и празозин) на профилактику тромбообразования.-Физиол.журн. (в печати).

8. Калишевская Т.М..Голубева М.Г..Башков Г.В..Григорьева М.Е.Участие о1г и ^-адренорецепторов в осуществлении компенсаторной реакции системы гемостаза на плазмин.-Физиол.курн.,1988,т.34,№ 5,с.113-119.

9. Калишевская Т.М..Голубева М.Г.,Соловьева(Григорьева)М.Е.Участие хо-ликорецепторов в реакциях системы гемостаза на вазопрессин.-Физиол. „.урн. ,1969,т.35,№ 5,с.9-Г4.

10.Калишевская Т.М..Голубева М.Г.,Башков Г.В.,Соловьева(Григорьева) М.Е.Механизмы развития ретроибозов при троыболитической терапии и их профилактика.-В сб."Нарушение механизмов регуляции и их коррекция", Москва,1589,т.III,с.1228.

11.Калишевская Т.Ы..Голубева М.Г..Соловьева (Григорьева)М.Е.Тромбозы, ретромбозы.их профилактика и лечение.(обзор)-Вестник МГУ,1990,№ 2,

селективного (/■ 1-адреноблокатора празозина.В сб."Противотромботическая

с.3-16.