Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспериментальная малярия: новые модели полного жизненного цикла возбудителя малярии группы "VIVAX" (P. Y. YOELII) и исследование роли позвоночного хозяина

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Экспериментальная малярия: новые модели полного жизненного цикла возбудителя малярии группы "VIVAX" (P. Y. YOELII) и исследование роли позвоночного хозяина"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ МЕДИЦИНСКОЙ ПАРАЗИТОЛОГИИ И ТРОПИЧЕСКОМ _ МЕДИЦИНЫ ИМЕНИ Е. И. МАРЦИНОВСКОГО

АМАНМУРАДОВ Аманмурад Хайтбаевич

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МАЛЯРИЯ: НОВЫЕ МОДЕЛИ ПОЛНОГО ЖИЗНЕННОГО ЦИКЛА ВОЗБУДИТЕЛЯ МАЛЯРИИ ГРУППЫ

И ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ПОЗВОНОЧНОГО

ХОЗЯИНА 03.00.19— Паразитология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

«VIУАХ» (Р. У. УОЕШ)

Москва 1990

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е. И. Марцнновгкого МЗ СССР.

доктор биологических наук, ст. н. с. Акиншина Г. Т.

доктор биологических наук, проф. Дьяконов Л. П., доктор биологических наук, ст. н. с. Беэр С. А.

Ведущая организация — НИИ медицинской паразитологии Л. М. Исаева Министерства здравоохранения УзССР, отдел протозойпых заболевании.

в «... » часов на заседании специализированного совета

Д.074.39.01 при Институте медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е. И. Марнинсвского Министерства здравоохранения СССР по адресу: 119830, г. Москва, ул. Малая Пироговская, д. 20.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Научный руководитель

Официальные оппоненты:

Защита состоится

1991 года

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета

Коновалова С

Актуальность проблещи. Актуальность работы обусловлена нерешенностью проблемы противорецидивной терапии трехдневной малярии, что является одной из основных причин недостаточной эффективности противоэпидемических мероприятий в борьбе с этой инфекцией. До сих пор одним из наименее изученных вопросов современной маляриологии продолжает оставаться изучение тканевой фазы развития возбудителей малярии, хотя расшифровка закономерностей развития именно этих стадий лежит в основе рационализации радикального лечения и профилактики рецидивов.

Стабильность и прогностическая ценность являются основными требованиями к "экспериментальным моделям. Они могут быть обеспечены только использованием моделей полного жизненного цикла, зключающего передачу возбудителя через переносчика. Имеющиеся татературные данные свидетельствуют, что адекватные экспериментальные модели полных жизненных циклов возбудителей малярии г'руппы "тлйлхх " не разработаны

а?.^975 ;Ьапс(аи с соапт. ,1979 ; Алексеев, 1985,1986 ; Лысенко, [986,1988 ;М<жЗ с соавт. ,1988 ;Меи с соавт. ,1981,1985 и др.). Известные ограничения моделирования инфекции на обезьянах обус-1авливают необходимость разработки экспериментальных моделей малярии грызунов.

Исследование многообразия взаимоотношений малярийных паразитов грызунов с позвоночными хозяевами и переносчиками продвигается сравнительно медленно ввиду трудности применения сравнительного анализа данных, полученных, как правило, на разных ;таммах каждого вида возбудителей, разных позвоночных хозяев и ггаммах комаров. Это привело к обильному накоплению очень разно-ючивых фактов, которые трудно сравнивать из-за отсутствия стандартизации моделей и методов исследования. Требуют решения

- г -

вопроси подбора оптимальных позвоночных хозяев, адаптированных к разным штаммам возбудителя и переносчика. Практически очень мало известно о влиянии хозяина на гаметогенез и на процесс постспорозоитного развития в печени. Наиболее разноречивы сведения в отношении сроков образования гаметоцитов, продолжительности их циркуляции в крови позвоночного хозяина, их морфофункционального созревания и гибели. Не-<

известна также динамика заражаемости комаров возбудителями малярии млекопитающих в связи с хронобиологией полового и бесполого развития возбудителя в позвоночном хозяине. Остаются неизвестными ведушие параметры и их взаимосвязи у позвоночного хозяина, определяющие не только эффективность заражения переносчика, но и его готовность к передаче возбудителя.

Весьма перспективным видом возбудителя для решения указанных вопросов является возбудитель малярии млекопитающих группы "у^лх"-Р1а.$тос(1иуч. уое.1н уое&11 | вызывающий в естественных условиях осг рое и хроническое течение инфекции, воспроизводимое в эксперименте, массивную продукцию шиэонтов в печени при острой инфекции, а также характеризующийся менее длительной спорогонией по сравнению с широко используемой моделью малярии, вызываемой Р.?>е>дке1 . '

Цель и задачи исследования. Основной целью работы является разработка оптимальной технологии моделирования полного жизненного цикл) возбудителя малярии грызунов (Р.у.уоеШ штамм 265ВУ) для создания моделей острой и хронической малярийной' инфекции 1п у1го и ±н талм)

В соответствии с основной целью в работе решались следующие задачи:

- провести направленный поиск и осуществить сравнительную оценк; разных позвоночных хозяев для подбора оптимального донора для эараже ния комаров в зависимости от хронобиологии бесполого и полового развития возбудителя ;

- подобрать оптимальную взаимоадаптированную пару позвоночный коплнн - переносчик, тестируемую не только по заражаемости комаров,

- о ~

но я по их готовности к передаче возбудителя;

- определить роль ведущих параметров позвоночного хозяина в иихийв взаимодействия з системе возбудитель - позвоночный хозяин - перенос»'»'

- расширить криобанк возбудителей малярии млекопитающих за счет криостоков Р.у.уоеЕ^ с различными функциональными характеристиками и наработать стандартные партии криостоков для моделирования полного жизненного цикла этого возбудителя.

Научная новизна. Разработаны новые модели полного цикла возбуди теля малярии группы "лп.'Удх "(Р.у.уое1н ) с использованием маловирулентного штамма, являющиеся базовыми для проведения исследований но разработке подходов к расшифровке механизмов латенции при малярии.

Впервые предложена и апробирована модель полного цикла Р.у.уое Ш. с использованием в качестве позвоночного хозяина африканского )ры зуна Ма^отув - близкого к естественному хозяину. Доказа-

на возможность использования этой годели для исследования разных типов постспорозоитного развития возбудителя в клетках печени.

На основании разработанного метода многофанторюго анализа взаимосвязей параметров позвоночного хозяина и переносчика осуществлена стабилизация н определена прогностическая ценность наиболее вэаимо-адаптироаанной модели Р.у.уоеЕ^ - Aft.ste13iUn.si ВА$ЕЬ - аутбредные мыши МБН-3 для воспроизведения полного цикла.

Выявлено, что критерием оптимальной взаимоадаптации в системе дь ляется' прямая коррелятивная взаимосвязь гаметоцитемии (на оптимуме заражавшего кормления комаров) со спорозоитным, но не ооцистным индексом.

Практическая значимость. В результате проведенных исследований разработаны методические рекомендации по созданию референс-криобанка возбудителей малярии, технология моделирования полного жизненного цик ла возбудителя малярии группы " и обеспечены исследования

постспорозоитного развития т -т-^о Р.у.уое1-н 265ВУ - наиболее адекватной модели для исследований параяитохозяиннмх взаимоотношений

при острой и хронической инфекции. Работа выполнена в соответствии с заданиями 01.04.10 (осуществить поиск и разработку моделей развития тканевых стадий малярийных паразитов) и 01.04.11 (создать крио-банк возбудителей малярии) отраслевой научно-технической программы С-16, договором о научно-техническом сотрудничестве с Ч0ФР по теме 7-5 "Усовершенствование методов лечения малярии" и программой сотрудничавшего с ВОЗ центра по трехдневной малярии.

Разработанные модели полного цикла возбудителя внедрены в практику отдела эпидемиологии и экологии трансмиссивных паразитарных болезней ИМПиТМ им.Е.И.Марциновского МЗ СССР и в лаборатории малярии и оппортунистических паразитозов Института здравоохранения тропиков (Прага).

Положения диссертации, выносимые на защиту:

- инициация инфекции с помощью стабильных криостоков от гомологичного позвоночного хозяина со спорозоитной инфекцией является основой стабилизации и воспроизводимости моделей полного цикла возбудителя;

- оценка прогностической ценности модели малярии позвоночного хозяина дпя воспроизведения полного цикла развития паразита осуществляется не по заражаемости переносчика, а по его готовности к передаче возбудителя;

- отсутствие выраженных взаимосвязей в бесполом и половом развитии возбудителя в позвоночном хозяине, равно как и их строгая синхронизация, являются существенными ограничениями при выборе инфицированных позвоночных хозяев в качестве оптимальных доноров для заражения переносчика.

Апробация работы. Результаты работы доложены и обсуждены на 1У— конференции молодых ученых Туркменского мединститута (1988), на Ученом Совете ИМПиТМ (1988), коллоквиумах отделения биологии па-рачитов, методов диагностики и культивирования ИМПиТМ (1987-1989), Научной конференции молодых ученых ТНШММ Ю ТССР (1990), на засевший С! г 11 '• ц и .т: и: I и р о в я нн о я комиссии по предварительной экспертизе

диссертации ЙШЪТМ ш.Е.й.Марцнновсксго (1S90).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Структура диссертации и объем. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, G глав собственных исследований, заключений по главам, выво-доа. Текст иллюстрирован 22 таблицами, 21 рисунком и 3 микрофотографиями. Список литературы содержит 135 наименований, в том числе 116 работ зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы я методы исследования. В работе использованы парази-тологэтеские, криобиологические, культуральные, цитологические, энтомологические и математические методы исследования.

Иаловирулеитный штамм P.y.yoedii 265ВУ получен из Франции от проф.И.Ландо (I.LerioUu}. В.качестве переносчика был использован отобранный из 6 штаммов Arv.stepPien&i BASEL, полученный из Швейцарии. Веды позвоночных хозяев, пол, возраст н объем использованных животных приведены в тпбл.1; типы моделирования инфекции у разных позвоночных хозяев я критерии оценки - табл.2. Паразитемия, гаметоците-аяя, ооцистный и спорозоитный индексы определялись по общепринятым методам. Мазки крови и препараты культур гепатоцитов окрашивались по Роыаиовскоиу-Гимза, последние - с последующей дифференцировкой в ацетои-ксилоловых сносях. Все препараты просматривали и фотографировали а микроскопах "PHO.Warsaawa" и Биолам Л-212 с 1шмерсионной системой (увеличение 90 х 10; 100 х 10). Для определения наличия взаимосвязи нежд, ставдартнзуе»2аш параметрами позвоночных хозяев и таковы-иа пзрег:оечкка рассчитаны с помощью ЭВМ попарные коэффициенты корре-лгциа м применен множественный регрессионный анализ. Значимость мио-жесгганногл коэффициента корреляции оценивалась по критерию Фишера.

Разработка технологии получения стандартных криостоков и подбора позвоночного хозяина.

Получение экспериментальных моделей полного жизненного цикла

Таблица I.

ОБЪЁМ

исследований по изучению позвоночных хозяев при моделировании полного цикла Р.у.уоеШ 265ВУ

Позвоночные хозяева Общее число инфицированных животных Число животных, использованных для заражения комаров

Мерозоитная инфекция Споро-зоитная Всего Кол-во про- Мерозоитная инфекция Споро-зоитная Всего

замороженная кровь (крио) свежая кровь (1 кров пассаж) инфекция смотренных мазков крови замороженная кровь (крио) свежая кровь (I кров пассаж) инфекция

крысы многососковые. £¡¡>(32-36 г) 87 64 109 260 1869 35 ' 39 39 " ИЗ

МБН-3 аутбредные белые мыши. ££(18-20 г) 168 23 37 .2^8 у 681 67 8 10 85

МБН-2 аутбредные белые мыши £$(18-20 г) 321 24 10 355 983 141 9 2 152

ВАЬВ/С инбредные белые мыши. §§(18-20 г) 35 15 10 60 246' 24 4 4 32

Всего 611 126 166 903 3779 267 60 55 382

P.y.yoeiii прэдускатрявает стандартизации ведущих параметров позвоночного хозяина с цельв получения оптимального донора для переносчика An.stepR.enii . Дяд получения воспроизводимой модели полного цикла, в порву» очерэдь кы разработали технологию получения стандартизованных криостокоа крови от одного животного, обеспечивающую проведение сравктадх экспзрпнентов. Для получения крностоков использовались яснзопшз того se вида после заражения спороэонтами (доза не вшэ 2,25 х 10®- ). Наиболее вакным оказался точный выбор момента развития инфекции в крови, когда паразитемия была в пределах 15-2056, а инкрогакетоцяты находились на О, Г и П стадиях развития (соответственно классификации I.Landau , 1979). Замораяивание осуществлялось s узкшс пластикозых трубочках определенного диаметра (1*5 и 2 им) н длинн'(20 км), что позволяло получить, в средней, от одного животного материал для 10-15 экспериментов по полному циклу возбудителя (доза: 7,06 х ш краостока на I аивотное). Каздый опыт по воспроизведете) цикла длится 3 недели, поэтому данная технология позволяла в течение 7-8 месяцев ставить опыты с одним криостоком, что обеспечило возможность сравнительного анализа данных разновременных сксперимзитов. Всего наработано 34 партии криостоков.

Следующим атапои был подбор позвоночного хозяина - грызуна, так как до кетах исследований этот этана был адаптирован во Франции в лаборатории проф.Ландо лишь к одному хозяину - ютам типа "Swiss выращенным в частном пятоюшке для этой лаборатории. С этой целью та провели изучение динамики инфекции у разных позвоночных хозяев и выявили оптшлалышх для переносчика доноров с адекватной 1шициацией иифйкцни. !1ы предполагали, что тип инфекции, т.е. источник её инициации, имеет существенное значение для стандартизации подели. Было проведено сравнение разных типов инфекции - нерозоитной (или ииэонт-ной) - гсриопассая ила I кровяной пассая й спорозоитной (внутривенное введение спор:?зонтов) - по следутедам параметрам: паразитемия, гаке-

- а -

тоцитемия, соотношения микро- и макрогаыетоцитов, длительность течения инфекции, количество пиков в бесполом и половом" развитии и их взаимосвязь. Определены оптимальные сроки заражения комаров с целью получения максимально стабильного завершения спорогонии. Последнее являлось предварительным критерием взаимоадаптированности возбудителя, переносчика и позвоночного хозяина.

I— модель: мыши аутбредкые белые МБН-3 - мерозоитная инфекция (крио)

У мышей, зараженных размороженной кровью от гомологичного хозяина, паразиты обнаруживались в среднем через 26 часов после заражения (Рис.1). Обычно инфекция имела однопиковый характер, редко - 2-3 пика. Паразитемия росла медленно, достигая 4-556 к 4-^5 суткам после заражения. Затем темп её роста увеличивался, за 1-2 суток она могла достичь 10-13%. Обычно пик паразитемии отмечался на 6-12 сутки, затем паразитемия резко снижалась, и через 2-3 дня паразиты не обнаруживались, Длительность острого течения инфекции, в среднем, 16 дней, после чего наступало самокупирование инфекции.

Гаметоциты (стадии 0 и I) появлялись в крови спустя 1-2 дня после обнаружения бесполых стадий и исчезали за 1-3 дня до самокупяро-вания инфекции. Их количество нарастало в течении 1-4 дней до 0,30,4%, затем уровень гаметоцитемии или стабилизировался в течение 23 суток, или сразу наступало кратковременное падение. После этого этапа отмечен более значительный пик (до 0,8%), котор/й чаще все го совпадал с пиком общей паразитемия. Характерно для данной модели, что I— пик гаметоцитемии наступал на 4-6 день, т.е. предшествовал максимальному пику паразитемии и совпадал с начальным периодом медленного роста паразитемии. На этом этапе пика или стабилизации уровня гаметоцитоа в популяции преобладали микрогаметоциты О, I и П стадии развития и начинали появляться Ш стадии, которые после пика паразитемии превалировали в популяции. Несмотря на колебания в количестве гаметоцитов в динамике развития паразитемии у отдельных мышей

~ э ~

( ^ <,5 1.0 0,6 дни

/ / А Ч

/ <

.у /

/ ✓ ✓ 4 \

I 2. а к 5 6.7 8 9 10 II 12 1Э

РисЛ. Динамика параэитемии и гаметоцнтеыии у аутбредных белых ыьяей МБН-3, зараженных криостокоы (А, Б, В - мши 2ПГ, 212Г, 215Г; Г - среднее . 21ХГ-215Г) ,•

ПА - паразитемня; ГА - гаметоцитемия

Масштаб (Рие.1-4): ГА/ПА - 1:10

даже внутри одного опыта, общий-характер её цикличности был очень стабилен для этой модели МШ-3.

При анализе данных по оценке ннфективности гаметоцитов и подбору оптимальных доноров для заражающего кормления комаров выявлена высокая степень адаптации данного хозяина в системе: гаметоциты оказались инфективными практически у 100? животных. Ооцистный индекс *

на выборке с положительными и отрицательными опытами на 57 животных составил, в среднем, 62,3+3,2%, спорозоитный индекс - 35,2+4,

2— модель: мыши аутбредные белые ИБН-3 - спорозоитная инфекция

После заражения мьшей МШ-3 спорозоитамп паразиты появлялись в крови только на 3-4 день (Рис.2). Параэитемия развивалась медленнее, чем при мерозоитной инфекции: к б дня она достигала лишь 1-3%. Максимальный пик инфекции - на 8-10 сутки, когда параэитемия достигала, в основном, 4-6%, редко - 12%. Зрелые гаметоциты обнаруживались через 6-7 суток после заражения, и продолжительность их обнаружения была на 3-4 дня меньше, чем бесполых стадий развития. В противополоз ность мерозоитной инфекции,прн спорозоитной инфекции ЫБН-3 пики развития гаметоцитезога совпадают, в основном, с пиками развития паразм-темии, а не с её медленным подъемом. Эта закономерность обусловила трудности в использовании модели спорозоитиой инфекции для стандартизации модели полного цикла. Время заражающего кормления комаров должно быть выбрано очень точно, так как момент совпадения первых пиков паразитемии и гаметоцитемии должен быть прогнозирован. Поэтому мы не рекомендуем модель спорозоитной инфекции для стандартизация модели полного цикла возбудителя, хотя признаем всю её значимость для получения стабильных криостоков и изучения факторов, влияющих на постспоролоитное развитие паразита.

модель: мыши аутбредные белые МЕН-2 - мерозоитная инфекция (крио)

После заражения мышей МБН-2 размороженной кровью бы~о обнаружено сходное по цикличности с ¡¿ЕН-З течение инфекции. Паразиты обна-

Рис.2. Динамика паразитемии и гаметоцитемии у мышей МЕН-3, зараженных внутривенно спорозоитами (А, Б, 3 - индивидуальные мыши 378Г-380Г; Г - средние значения).

руживались чаще на день послв заражения. Инфекция имела такие однопиковый характер, однако нарастание параэитемии было несколько более медленным, чем при мерозоитной инфекции МБН-3, хотя максимальные значения на пике были в тех же пределах - 13-185?. Самокупирование инфекции происходило на 17-18 день, очень редко - через 10-12 дней. Гаметоциты появлялись в крови через 3-4 суток после заражения. Первый«пик в их количестве отмечался через 5-7 суток после заражения, чтр совпадало с этапом медленного подьема паразитении. Однако, в противоположность МБН-3 гаметоцитемия у МБН-2 имела ыелковолновый характер - незначительные подъемы чередовались со спадами. Это характеризует нестабильные взаимоотношения между цикличностью параэитемии и гаметоцитемии, что осложняет подбор оптимальных доноров для заражения комаров.

Оценивая пригодность модели по заражаемости комаров, следует отметить значительный разброс итоговых данных по ооцистному индексу • от 22,2 до 85,7%, и более низкий спо'розоитный индекс - от 12,5 до 28,6%. Однако даже при завершении спорогонии среднее количество оо-цист на I желудок часто было низким (колебания от 3,4 до 38,9; в среднем - 10,1). Важно отметить также, что модель МБН-2 по сравнению с МБН-3 характеризовалась большими вариациями в сроках заражавшего кормления на комарах (от 3 до 7 дней после заражения), что значительно ограничивает возможности её стандартизации.

4^5 и 533 модели; мыши белые инбредные ВАЬВ/С - . мерозоитная (крио) и спорозоитная инфекции

Для сравнения с аутбредными мышами МБН-3 и МБН-2 были апробированы инбредные мыши ВАЬВ/С. Мыши ВАЬВ/С оказались в той же степени чувствительны к инфекции, как и МБН (100% заражаемость), при инициации как размороженной кровью, так и спорозоитами. На мышах ВАЬВ/С было воспроизведено типичное в отношении цикличности течение инфекции, однако модели мерозоитной и спорозоитной инфекции характеризовались синхронизацией пиков паразитемии и гаметоцитемии, что ограничивает их применение для стандартизации модели полного цикла.

Кроме того, данная линия мышей оказалась мало устойчивой к сопутствующим инфекциям, особенно к широко распространенному вирусу эктро-миелни.

625 модель; Ма.<1от>?с (многососковая крыса)

- африканский грызун, наиболее близкий к естественному хозяину, был впервые использован нами для моделирования инфекции Р.у.уоеШ 265ВУ, Согласно существующем представлениям, естественные хозяева наиболее чувствительны к спорозоитной инфекции. Тем не менее, учитывая полученные нами данные по стабилизации модели полного цикла с использованием белых мышей и 'ограничения использования модели спорозоитной инфекции, мы первоначально попытались инициировать инфекцию с помощью стандартизованных криостоков крови как гомологичного хозяина - , так и гетерологичного - аут-

бредных мышей МБН-3.

После заражения размороженной кровью мерозоитная инфекция развивалась примерно в те же временные интервалы, однако на более низких уровнях паразитемии, чем у мышей. Появление паразитов наблюдалось через 2-4 суток после заражения, первый пик паразитемии - 4-5 день,, второй (если случается) - 9-10 день после заражения. Уровень паразитемии на пиках инфекции обычно составлял 4-6%, инфекция самокупировалась через П-16 дней. Важно отметить значительные вариации в цикличности паразитемии как у крыс внутри группы (опыта), так и между разными опытами, даже при заражении одним и тем же яриостоком. Гаме-тоциты обнаруживались через сутки после появления первых паразитов и имели от одного до нескольких пиков в своем развитии. Отсутствовали характерные для данного типа инфекции у мышей взаимосвязи паразите--мии и гаметоцитемии,- оба процесса были полностью асинхронны относительно друг друга.

Оценка инфективности гаметоцитов в разные сроки после заражения крыс (4-8 сутки) выявила низкую заражаемость комаров по ооцистному индексу, что варьировало в широких пределах (от 0 до 42,8%; в средн.-

12,9+3,6$). Однако спорозоитный индекс бал практкческк равен 0, -т.к. даже в случае образования ооцист их количество та I желудок было очень низким (в средн.- 3,1+0,1). С-тсутствье выраженных взаимосвязей в бесполом и полово« развитии не поэволклк определить оптимальные сроки заражающего коршгекия и использовать эту модель для воспроизведения полного цикла возбудителя.

7.55 модель: .мерозоктиая инфекция;-

(I кровяной пассаж)

При заражении свекеК кровьв характер течения инфек-

ции по данным паразктемик был сходен с кабладвекки прк заражении крнс размороженной кровью, однако особенность» этой кодслк инфекции является появление паразитов ка 1-2 суток ракыае к более синхронизированное взаимодействие полового к бесполого развития по сравнению с крко-инфекцией. Это было"наиболее выражек^ при зсрагеккк свежей кровью от донора со спорозокткой кнфекцкей, когда первый пак гаметоцитемкн совпадал с I— пиком паразитсг'ч (Рис.З). Такая я-ес-псск синхронизация максимумов пвразитемии и гаиетоцитешк услошзяле отбор оптимальных доноров для заражения кошаров, что ык наблюдали такие не моделях ЫБН-2 и ВА1В./С. Характерно, что даже прг: значительной зарааенки комаров по ооцистноцу индексу, количество ооцкст иг I комара чаще очень низкое. Анализ одной из выборок опытов, поставленных: на 28 донорах, показал, что в средней социстшй индекс - 33,1 ¿£,1/6, спорогоитный -15,5+5,1%, е. количество ооцист на одкк нелудок - 12,4+3,2. Однако при анализе всех опытоб средние показатели оказались значительно ниже

(табл.25. • .

Такик образои, иоде л г мерозоктной игфекцик ие могла

быть стандартизована для получешу: стсбклыюГ. спорогонии у переносчика.

с>~ модель: М.м&аЕклв^ - спорозоитпек инфекция

После внутривенного введения спорозоктоь первые паразиты ыогли бить обнаружены на 3-4 суткк после зара&синс (Ркс.4), к через .5-6

суток их количество достигало пика, коториз редко превышал 6%.

12Э406Т09Ю

ПА/ В «í

И

1 V к

\

/ 1 i Чи ' !

в

05- 9

Oh h

op э

0,2 г

ûl i

ДНЦ -s— 0

2 Э 4 5 6 7 в 9 10 1

пд/ -1 ¿7 г и?

/

J I i 1 \ д

F ч V- \

1/ « г ч, \

I 2 5 h 5 6 7 3 Э Ю

I 2 3 4 5 6 7 6 9 ¡O ¡I 12 15

Ж

I 2 5 4 3 8 та 3

Я Э 4 5 5 7 8 9 ЮН 12

Рис. 3. Динамика' патепитемии и гаметоцитемии при меролситной инфекции (1-ый кровяной пассаж от t.EH-3 со спсрслоит-ной ин£екиией) у Mwtcmv* nat.aíensiS (А,Б,В,Г.,Д - мши • 402Г 403Г,405Г,40бГ,407Г.- соответственно ; Е - сродное ь-

Таблица 2

Сравнительная оценка разных видов позвоночных хозяев в качестве доноров гаметоцитов Р.у.yoeS.it

'265ВУ для заражения переносчика Агх^грйеага ВА5Е1

Вид хозяина, инфекции Опыты на позвоночных хозяевах Оценка,заражаемости комаров Хооцисты) Оценка заражаемости комаров(спорозоиты)

Все- •ПГ) с ооцис-тамн со споро- •ЗОИТЯМИ отриц. опыты Вскрыто комарор с 00-цис- ооци-стннй среднее КОЛ-ВО Вскрыто комаггав со спо-розои- 1епоро-зсит—

абс. | % ■ абс. % абс./% тами индекс (%) ооцис? НС I комара (всего) тами !НЫГ! ¡«щеке

лЕН-3

Мерозокткая иясЬзкция 88 84 95,5 50 65,9 4/4,5 611 455 74,5 52,2 515 140 27,2

« С) ■разморо-;&э?шая 82 80 97,6 55 67,1 2/2,4 577 432 74,9 53,1 515 140 27,2

о. свежая о 4 66,7 3 50,0 2/33,3 34 23 67,6 33,5 - - -

Слорозоитная-ЭДКЕуИЗ______ Ю 8 60 7 70,0 • 2/20,0 57 48 84,2 52,5 60 18 30,0

¡1!еос ю ззоитная гкция 74 37 50,0 10 13,5 37/50,0 529 ИЗ 21,4 9,5 419 16 3,8

л Я о- л размороженная 35 16 45,7 2 5,7 19/54,3 234 29 12,4 3 т 196 2

свежая 39 21 53,8 8 20,5 18/46,2 295 84 .28,5 11,6 223 14 6,3

Спорозоитная из&екция 39 30 76,9- 15 38,5 9/23,1 238 134 56,3 23,6 309 . 29 '9,4

17 -

0,3 к

0Д5 35

о,г 3 2,5

0,15 а

1.5

0,05 Дни 1 <?5 о

ПА/ г Б. ИХ

у

I

/

/ \

Г / \\

—_ /1/

0/1

0,35

0,3

0/5

0.1

О,05

о;5 э

1 2. Э 4 5 6 Т 8 9 к (О

ПА/ Д

.

I

о 51

ок 4

оъ 02

1 а э 5 6 7 в 9 1С 1

па/ Г т 02 0,1

/

I а з ь 5 б т в э го »

■0,1 Дни

ПА'/ Е г«

оц

0,3

92 Ф

I 0. э 4 5 в 7 в 3 ю II

I г Э 4 5 6 Г 8 9 юн

Рис. 4. Динамика патзитемии и гаметоиитемии у М,па1а?еп5^3, внутривенно спорозоитами (А,Е,В,Г,Д,Е -

крысы

2

Пасло пика обычно следовало резкое снижение паразитеши и через 10-II суток паразиты в крови не обнаруживались. Синхронизация гшков в развитии бесполых и половых форм на подели ü.watü'ttAsis была наиболее выраженной. Обычно продолжительность обнаружения гаиетоцитов, в средней, 5 суток, причем, лишь в течение первых '¿Л суток после их появления основную часть их популяции составляли 0, I и П стадии р&звитяк.

Оценка инфективности гаиетоцитов у разных крыс, несмотря на отмеченную цикличность ь развитии половых и бесполых стадий, выявила неоднозначность их использования для заракаицаго кормления комаров. Так, заражающее кормление бшо неудачник (по сиорозоитноцу индексу), если скорость подтипов к падений наразитешш и гаыетоцитемии была очень ровной, или инфекция развивалась на низком уровне паразитеыни и ниела один пик вг развитие. Ваяно сткогнть, что к етих случаях осцистшй индекс йог бить очень рисок - до 100;«, ко количество ооцн-ст на I комара било счет. - от едшиэтних до 16-26. Учитывая

полученные данные,, модель споразоитной кнфокцик у M.n.ataiUn.»if била, в основное, нами кспольоооани для получена« криостоков и исследований постспорозоитиого рззвнтия возбудителя in vivo и ¿n Titho .

Прогностическая роль ведущих параметров позвоночных хозяек в оценке аф^октиааости.зарааивмости переносчика и готовности ого к передаче возбудителя , . •

Сравнение разных видов позвоночных хозяев по эффективности использования их в кйчэстае.доноров инфективных гаиетоцитов для стандартизации модели полного цикла возбудителя выявило, что инфектив-ность гаиетоцитов оказывается различной при развитии у разных позвоночных хозяев таксе, как у одного хозяйка, но прг; разных типах инфекции - мерозонткой клк саороэоитной <«чбл.2). Гшетоциты, образо-РЕьгкеск по ходу саорозокткоК иифекцн« V tfo.tfto»w, оказались более югфективны (мкрюпш* wtshc - :¿6,3fS* cttofwomwtrtl - 9,4Я>), чей га-цетоциты при «вро.юлгяои >шфс>.«!К»гм даже гезае t кровяного пассажа

лась и по этим параметрам не только оптимальной, но и более стабильной (ооцистный индекс - 84,2% и 74,5%; спорозоитный - 30% и 27,2% -соответственно).

Для определения стабильности и прогностической ценности оптимальной модели полного цикла P.y.yoeEii 265ВУ - аутбредные мши MFH-3 - Ал. stepfienai BASEL, проведен многофакторный анализ роли изученных параметров позвоночного хозяина в прогнозе заражаемости перенос чика (ооцистный индекс, интенсивность ооцистообразования у одного комара) и его готовности к передаче (спорозоитный индекс) (табл.3).

Таблица 3.

Взаимосвязи параметров позвоночного хозяина ШЗН-З (мерозоитная инфекция - крио) и переносчика (An-stepfcervei BAJEL) на основании множественного регрессионного анализа

Исследуемые параметры *2 Ч'З

РГ 0,058 (-)0,050 (-)0,150

Р2 0,238 0,397 0,301

РЗ 0,154 0,179 0,188

Р4 0,421 0,229 0,257

Р5 (-)0,434 (-)0,I8I (-)0,136

Регрессион-1ШЙ анализ 4 (P2»P4»Í")P5) {(р2,(-)р5)

<*2 0,603

0,671 0,722

к = 52 = 0,231

Условные обозначения: pJ - паразитемия; р^ - гаметоцитеыия;

ро - доля «икрогаметоцитов в обшей популяции гаметоцитов ; р4 - длительность течения инфекции ; рд - возраст комаров ; ^т - ооцистный ^р - СПОрОЗОИТНЫЙ индекс; индекс;

- количество ооцист на I комара

При мерозоитной инфекции бияа выявлена достоверно более высокая степень прямой связи гаметоцитемии со спорозоитным индексом ()-=0,ЗЭ7), чем с ооцистным индексом (г =0,238). Для прогноза спорозоитного индекса в большей степени важно было учитывать среднее количество

ооцист на одного зараженного комара (|* =0,722 и 0,603 - соответственно), чем ооцистный индекс.. Прогнозом для спорозоитного индекса достоверно является совокупность 2- количественных параметров -гаметоцитеыия (прямая связь), возраст комаров (обратная связь) и качественных параметров - наличие молодых щизонтов (стадия 10-12 ядер)(прямая связь) и гаметоциты II,Ш стадий (обратная связь). При спорозоитиой инфекциг ни один из исследуемых параметров не являлся достоверно прогностическим для оценки готовности переносчика к передаче возбудителя, что подтвердило обоснованность выбора модели веро-зокгной инфекции МБН-3 для стандартизации в качестве оптимального позвоночного хозяина для моделирования полного цикла.

Разработка и стандартизация новых моделей полного цикла Р.у. уоеЕй возбудителя* малярик группы п.Г1та.х" позволили осуществить конечную цель нашей ра-боты - обеспечить исследования постспорозомтио-го развития возбудителя в клетках печени ¿.ч с использованием

близкого к естественному позвоночного хозяина - М.ааЛаСй'лясв . Было получено разнотипное развитие экзоэритроцитарных форм Р.у.уоеЕ*.* 265ВУ в системе культур первично изолированных гепатоцитов крыс ■\Wi4tai- и М.кэЛа£ен.а** , инокулированных епорозоитамм из слюнных желез Ал.йЬьрКеп.«'. Не все спорозоиты, проиикиие в гепатоцит, развивались в одном темпе: наряду с развиоазкяжмся в разной тейпе шизон-таии в течение всего периоде; наблюдений (8 суток) в культура наблзя-дались одноядерные паразиты. По темпу деления ядер оизонтоа было шдолено три типа экзоэржроцнтаркич» развития - активный, медленный и умеренный, иричеи соотношение паразитов с разный типом развитии; в популпцик ио1\ло варьировать,

ВнВОДЫ

I, На основании проведенных комплексных исследований по- биологии и экспериментальному моделирование развития возбудителя малярии млекопитающих группы "учлга%" (Р, у,уое£¿4 265В/) раз^иботаны новые экспериментальные модели полного жизненного цчкла паразита с исполт.зо-

ванием переносчика Anopsias stepii.en.si BASEL и разных позвоночных хозяев, включая близкого к естественному хозяину африканского грызуна - Mastomy^ hataiensi£ .

2. Установлено, что в основе стандартизации моделей полного жизненного цикла возбудителя и сравнительного анализа разновременных экспериментов должна быть технология инициации инфекция с помоиью стабильных криостоков крови от одного животного (гомологичный хозяин) со спорозоитной инфекцией.

3. Выявлено, что при инициации мерозоитной 'Инфекции от криостоков крови и при спорозоитной инфекции у разных позвоночных хозяев (аут-бредные мыши МБН-2 и МВН-3, инбредные мши BALB/C, крысы M.txalaltn.-

инфекция развивается однотипно в отноиении цикличности паразитемии, однако степень выраженности пиков паразитемии, время их проявления, стабилизации или спадов - различны, что в значительной степени определяет период инфективности гяметоцитов.

4. Показано, что воспроизводимость разработанных моделей Р.у.уое-Ш 265ВУ - аутбредные мыли МЕН-3 и P.y.yoeiii. 265ВУ - Ma stores riatate.n.sis (многососковые крысы) обеспечивается использованием одного штамма возбудителя, как и позвоночного хозяина, и последовательным подбором и стабилизацией следуюших параметров позвоночного хозяина: пол, возраст, источники и пути заражения; хронобиология пизогонии и гаметогонии, продолжительность течения инфекции и количество пиков.

5. Установлено, что оптимальными донорами являются те, у которых максимум инфективности гаметоцитов достигается обычно на стадии I пика гаметоцитемии на фоне умеренного подъема паразитемии до наступления первого её пика (модель мерозоитной инфекции МБН-3).

Отсутствие выраженных взаимосвязей в бесполом и половом развитии возбудителя, равно как и совпадение пиков в развитии паразитемии и гаметоцитемии, являются существенными ограничениями моделей при подборе доноров для заражения переносчика (все модели МБН-2, BALB/C, M.na.taltnsii и спорозоитной инфекций МЕН-3),

6. Появление большого количества гаметоцитов, особенно Пий стадий, как и изменение их соотношения в сторону макрогаметоцитов, совпадало с чрезмерной интенсивностью ооцистообразования (200 осцист

на Г комара), что приводило к снижению спорозоитного индекса.

7. Выявлена более вксочая степень адаптации возбудителя в системе аутбредные мшш МБН-3 - An.^tepPie^si BASEL по сравнения с системой M.aatatenii^ - An.stepKensi BASEL , реализующаяся в сильно? положительной корречяиии между длиной гяметоцатгмирр и соответствуют«* максимальным -тячонисм спороюитного индекса.

8. На основе множественного регрессионного анализа выявлены кор~ релирую'.ше признаки для оценки стабильности и прогностической цен- . мости оптимальной модели полного цикла Р.у.уоеЫ 265ВУ - аутбредные миаи ЗСН-З - Ah.stepKe.nftt BASEL:

- при мероюитно;" инфекции выявлена достоверно более высокая степень прямой корреляционной связи гамегоцитемии со спорозоитным индексом и интенсивностью ооцистообразования, чем с ооцистным индексом;

- прогностическим показателем для спороэоитнога индекса является б больней степени интенсигность ооцистообразования, чем ооцистный индекс ;

- прогностической совокупность» параметров для спорозоитного индекса являются: гаметоците-мия (прямая связь), возраст комаров (обратная связь), наличие молодых пшзонтов в популяции (прямая связь) и гаме-тоцчтов П,Ы стадий (обратная связь) ;

- при спорозоитной инфекции ни один из исследуемых параметров не является достоверно прогностическим для оценки готовности переносчика к передаче возбудителя.

У. На основе разработанных моделей полного цикла P.y.yoefil 265ВУ и стандартизации ведущих параметров острой инфекции впервые осуществлено моделирование длительного разноскоростного развития паразитов мяловиру/ентного штдмма 265ВУ на тканевой стадии в системе Р.у.уое-Ш - гепатоцит in vitro . Полученные модели in vit>o использованы для оценки состава популяции спорозоитов и исхода взаимодействия в системе паразит - клетка (хозяин).

10. Разработанные подходы к моделированию и определению стабильности и прогностической ценности моделей Малярии могут найти широкое применение:

- дчя оценки патогенности штаммов возбудителя и прогноза исхода взаимодействия с разными видами и штаммами позвоночных хозяев ;

- для анализа степени взаимной адаптированности в системе паразит -позвоночный хозяин - переносчик ;

- для расшифровки механизмов лат'енции и её реактивации;

- для моделирования направленного воздействия на разные элементы системы с целью получения разных типов малярийной инфекции.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Разработанные модели полного цикла возбудителя малярии группы "vivax"(P.y.ycetit ) могут быть использованы в медицинских учреждениях, связанных с проблемами тропической медицины, при разработке 'ундаментальных и прикладных исследований латенции при малярии.

- 23 -

ВНЕДРЕН IE РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИКУ Разработанная оптимальная технология моделирования полного цикла P.y.yoeEii 265ВУ для создания моделей острой и хронической малярийной инфекции ih vivo и in vitro внедрена в практику научно-.исследовательских работ в отделе эпидемиологии и экологии трансмиссивных паразитарных болезней ИМПиТМ им.Е.И.Марциновского МЗ СССР и в лаборатории малярии и оппортунистических паразитозов Института здравоохранения тропиков (ЧСФР, Прага).

Материалы работы использованы в Методических рекомендациях по созданию референс-криобанка возбудителей малярии человека и животных. Рационализаторское предложение $99 от 26.04.89 г. "Способ приготовления мазка крови для цитохимического исследования мононуклеар-ных клеток" внедрено в практику исследований отдела иммунологии ИМПиТМ им.Е.И.Марциновского.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Аманмурадов А.Х. Некоторые особенности хронобиологии развития возбудителя малярии грызунов P.y.yoeEii//В сб.: Материалы 1У— научной конференции молодых ученых Туркменского мединститута.- 1988.-С. 26-27.

2. Аманмурадов А.Х. Моделирование развития P.y.yoeEii у разных позвоночных хозяев//Мед.паразитол.- 1990.- ','6.- С.20-22.

3. Катосова Р.К., Аманмурадов А.Х., Подопригора Г.И., Акиншина Г.Т., Сабгайда Т.П. Динамика активности сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов и её корреляционных связей при экспериментальной малярии// Мед.паразитол.- 1990.- №6,- С.17-19.

4. Кукина И.В., Акиншина Г.Т., Орлов B.C., Федянина Л.В., Аманмурадов А.Х., Ануфриева В.Н., Дилевская Л.М. Культивирование возбудителя малярии грызунов (P.y.yoeEii шт.265ВУ) ih -vitt-o в клетках печени//Бюлл.ВИЭВ $75 "Поиск молодых" Матер,конф.молодых ученых.-1990 г.

'j. п/, in-'-.¡iin i 0.1., h*<ku>a I.V.. Orlov V.b., Fe^yarnna L.U., t\n.>iwir.;l">; A.tl.. ■ hivJY leva U.H., Di Itvskaua L.M. New •»vj»?rti«..tibii in у thro '".» „l^ia i'nf i,t<idH*s of "uwa.x group" ,;!■! i:;r it' ;: ■)'■:■ bporovjoit** <P. berghvi. P. y. a«l 11) -{...¡••■¡К* <Hi:,b-ws mt-jletisia). // Bui. Soc. Fr.

!-;<--ji•:■ 1. - Uii Conor. InK->;Tt, P.irasiiol. - Paris. -¡■'(•¡(i. - л."¡f - p.

(■:, л: in'.fii:i.4 G.T.. ivikuvj !.'.',, Or!>v V.S.. Fedviomno L.U.. Аакмши'л.к*' A.H.. Anofr Irva U.H., Dil«*vakasia L.M. p I и- -.пи i.! ii ч'-'lii viv-iii Ыр'.-к of ex'x-ryHii'xy He !■ -v.'i> ii'ivi'*" in vsU-o nir\i--l I lritj. // Bui. Fr.

¡.„h.I. - >Л! C'w;r. !*[nri>rn. Parasitol. - Paris. -ww. - л.'*ib ro ;M, - p. :'.rn.

03.00.19

Аманмурадов Амакмурад Хайтбаескч

Экспериментальная малярия: нсзые модели полного жизненного цикла возбудителя малярии группы ''-уч-уах" (P.y.yoelii) и исследование роли позвоночного хозяина

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Объём 1,0 п.л. Тираж 100 экз. зак. 1666 Twi.UB СССР