Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эколого-генетическая характеристика гадюковых змей (Reptilia, viperidae) в Нижнем Поволжье и на сопредельных территориях

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Эколого-генетическая характеристика гадюковых змей (Reptilia, viperidae) в Нижнем Поволжье и на сопредельных территориях"

00344498Э

Ефимов Роман Вячеславович

ЭКОЛОГО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГАДЮКОВЫХ ЗМЕЙ (ИЕРТИЛА, У1РЕЯЮАЕ) В НИЖНЕМ ПОВОЛЖЬЕ И НА СОПРЕДЕЛЬНЫХ ТЕРРИТОРИЯХ

03 00 16-экология 03 00 15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических на) к

2 4 И ЮЛ 2008

Саратов - 2008

003444989

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет им И Г Чернышевского» на кафедре морфологии и экологии животных

Научный руководитель- доктор биологических наук, профессор

Завьялов Евгений Владимирович

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

Тырнов Валерии Степанович

доктор биологических наук, профессор Ильин Владимир Юрьевич

Ведущая организация - Зоологический институт РАН

Защита состоится «_2j> июля 2008 г в 9 00 часов на заседании диссертационного совета Д 212 243 13 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет им Н Г Чернышевского» по адресу 410012, г Саратов, ул Астраханская, 83, учебный корпус №5, аудитория №61, факс (8452) 511635, E-mail biosovet@sgu ru

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке имени В А Артисевич ГОУ ВПО «Саратовский ГУ»

Автореферат разослан <(3Pj> мая 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета

Невский С А

Общая характеристика работы

Актуальность исследования Одним из важнейших событий в науке XX в стало открытие двойной спирали ДНК Впоследствии это привело к интенсивному развитию молекулярной генетики, становлению которой способствовала международная научная программа «Геном человека» Появились самостоятельные научные направления генная диагностика, генная терапия, генная систематика, генная инженерия, занимающие передовые позиции в медицине и биологии Молекулярная генетика позволила углубить представления о механизмах наследования и эволюции организмов, заложив тем самым основы фи-логенетики и генной систематики Особое значение генная систематика приобрела при решении спорных вопросов относительно таксонов, систематический статус которых не был установлен Данное направление интенсивно развивается в отношении змей, ящериц и черепах Географические популяции пресмыкающихся зачастую характеризуются сходными морфологическими признаками, когда без применения методов молекулярной генетики решение спорных вопросов их систематики становится затруднительным (Горбунова и др , 1997, Чемерис и др , 1999, Калябина-Хауф и др , 2004, Семенова и др , 2004, Venter et al, 2001, Garrigues et al, 2005, Ursenbacher et al, 2006, Huang et al, 2007)

К группе рептилий, вопросы филогенетического родства, систематики и распространения которых остаются до конца не выясненными, относятся га-дюковые змеи (Vipendae) На современном этапе развития эколого-таксоно-мических исследований повышенный интерес среди этих животных проявляется к гадюке Никольского (Vípera (Pellas) mkolskii Vedmederja, Grubant, Rudaeva, 1986), которая широко распространена в Европе В настоящее время не существует единого мнения в отношении ее таксономического статуса Некоторые авторы выделяют гадюку Никольского в качестве самостоятельного вида, другие рассматривают на уровне подвида обыкновенной гадюки или включают ее в состав комплекса «Vípera berus» в качестве черной морфы (Ведмедеря и др , 1986, Кудрявцев и др, 1998, Бакиев и др , 2004, Grubant et al, 1973, Joger at al, 1997, Milto et al, 2005, Zinenko et al, 2005, Kotenko, 2006)

Гадюка Никольского занесена в Красную книгу России и Украины как малоизученный вид Сведения о состоянии его популяций в Нижнем Поволжье ограничены не известен таксономический статус окраинных поселений, поэтому с приемлемой точностью не выявлены границы распространения змей Отсутствуют достоверные данные о возможности гибридизации близкородственных видов гадюк в природе и их экологической сегрегации в зонах симпат-рического обитания Не разработаны методы оперативной диагностики видовой принадлежности рептилий в природе и лабораторных условиях Указанные проблемы не позволяют определить категорию редкости и природоохранный статус вида, приступить к разработке действенных мероприятий по сохранению популяций этих животных, особенно на периферии ареала

Использование только морфологических, экологических и кариологиче-ских методов не позволяет дать однозначные ответы на поставленные вопросы (Бакиев и др , 2004, Кайбелева и др , 2005) В связи с этим на современном этапе большое значение приобретают эколого-таксономические приемы и подходы, основанные на анализе молекул ДНК Использование данных методов позволяет уточнить таксономический статус некоторых видов гадюковых змей, а значит значительно приблизиться к пониманию процессов и явлений их морфологической изменчивости под действием комплекса абиотических факторов среды На основе применения молекулярно-генетического анализа возможно также установление генетической структуры популяций гадюк, а также выявление механизмов, лежащих в основе эволюции изучаемых змей

Цель и задачи исследования Целью работы явилось выявление распространения и экологической сегрегации гадюковых змей в Нижнем Поволжье, определение таксономического статуса их популяций с использованием моле-кулярно-генетических маркеров В ходе реализации цели исследования решались следующие задачи

- оценка таксономического статуса гадюки Никольского (Vípera nikolsku) в Нижнем Поволжье и на сопредельных территориях на основе анализа нуклео-тидных последовательностей митохондриальных генов,

- установление генетической структуры популяций гадюк Никольского и обыкновенной с использованием анализа микросателлитных локусов, выявление факторов внешней среды, участвующих в ее формировании,

- определение границ ареала гадюки Никольского на территории Нижнего Поволжья и на сопредельных территориях,

- выявление механизмов экологической сегрегации гадюк Никольского и обыкновенной в зонах симпатрии, уточнение гипотетической модели дивергенции и пространственного распространения видов рода Vípera,

- разработка экспресс-технологии идентификации популяций гадюковых змей (V berus и V nikolsku), таксономическое положение которых по комплексу морфологических и биохимических признаков затруднено

Научная новизна Определен таксономический статус гадюки Никольского и выявлена северная граница ее распространения на территории Нижнего Поволжья на основе анализа нуклеотидных последовательностей митохондриальных генов Впервые секвенированы митохондриальные гены 12S рибосомной РНК, НАДН-дегидрогеназы и цитохром с оксидазы для гадюки Никольского, для обыкновенной гадюки (Vípera berus) определена нуклеотидная последовательность митохондриальных генов 12S рРНК и цитохром с оксидазы Получены данные о генетической изменчивости популяций гадюковых змей, что позволило уточнить гипотетические модели дивергенции и расселения видов рода Vípera Выявлены экологические факторы, определяющие генетическую и морфологическую изменчивость географических популяций гадюковых змей

Научно-практическая значимость На основе результатов анализа нуклеотидных последовательностей митохондриального гена 12S рибосомной РНК

разработана универсальная технология идентификации экземпляров гадюк Никольского и обыкновенной в зонах их симпатрического обитания Заложены методические основы анализа генетических особенностей популяций восточной степной гадюки (Vípera renardn) с использованием микросателлитных ло-кусов Материалы диссертации вошли в «Практикум по молекулярной биологии (методы биоинженерии)», рекомендованный для использования в вузах при подготовке специалистов естественнонаучного профиля Результаты диссертационной работы используются при проведении практических занятий по молекулярной биологии для студентов биологического факультета Саратовского государственного университета

Апробация работы Материалы исследования докладывались и обсуждались на Четвертой конференции герпетологов Поволжья (Тольятти, 2007 г), 3-й Московской конференции по вычислительной молекулярной биологии (Москва, 2007 г), 49-й научной конференции Московского физико-технического института (Долгопрудный, 2006 г), 6-й Международной конференции по биоинформатике регуляции и структуры генома (Новосибирск, 2008 г), студенческих научно-практических конференциях Саратовского государственного университета «Исследования молодых ученых и студентов в биологии» (Саратов, 2005-2006 гг)

Публикации По теме диссертации опубликовано 10 работ, три из которых в изданиях перечня ВАК РФ

Декларация личного участия автора Автор лично проводил экспериментальные исследования, выявлял молекулярные механизмы, лежащие в основе формирования структуры популяций Анализ полученных данных, их интерпретация и оформление выполнялись автором самостоятельно В совместных публикациях вклад соискателя составил 50-80%

Основные положения, выносимые на защиту

1 Гадюка Никольского является самостоятельным видом, наиболее близким в генетическом и морфологическом отношениях к обыкновенной гадюке

2 Распространение гадюки Никольского в Поволжье связано преимущественно с интразональными ландшафтами долин рек Донского бассейна, в отличие от обыкновенной гадюки она редко встречается на водораздельных пространствах вне связи с пойменными местообитаниями

3 Межпопуляционная генетическая изменчивость обыкновенной гадюки имеет клинальную зависимость в направлении от Республики Мордовия до Пермского края по градиенту комплекса абиотических факторов

4 В условиях внутривековой динамики климатических показателей (преимущественно среднегодовой температуры и количества осадков) гадюка Никольского проявляет тенденцию к расселению на север

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 141 странице и включает 47 рисунков и 16 таблиц Работа состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и приложения Библиографический указатель включает 104 источника, из которых 42 на иностранных языках

Содержание работы

Во Введении обосновывается актуальность исследования, его практическая и теоретическая значимость, сформулированы основная цель и задачи, а также пути их реализации

Глава 1 ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ В ЭКОЛОГИИ И СИСТЕМАТИКЕ ГАДЮКОВЫХ ЗМЕЙ (обзор литературы) Приводится эколого-морфологическая характеристика гадюки Никольского, представляются различные точки зрения относительно ее систематического положения Материалы главы включают результаты эколого-морфологических, биохимических и молекулярно-биологических исследований Представлена история становления и актуальность молекулярно-генетических методов в систематике Описаны современные методы молекулярной биологии, используемые для определения таксономического статуса животных, растений и микроорганизмов Особое внимание уделяется анализу нуклеотидных последовательностей, позволяющему определять степень родства на генетическом уровне, а также анализу микросателлитных локусов, обладающих высоким уровнем полиморфизма, что традиционно используется в популяционных исследованиях

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В главе представлены методы выделения ДНК, проведения полимеразной цепной реакции, определения нуклеотидной последовательности и анализа микросаллитных локусов Предложены приборная база и реактивы для выполнения данной работы Указаны пакеты прикладных программ, используемых для расчета генетических дистанций, построения «филогенетических деревьев», оценки уровня гетерозиготности и др

Материалом для данной работы послужили полевые сборы, осуществленные в Саратовской, Самарской, Пензенской, Новгородской, Тульской областях, республиках Мордовия, Чувашия, Удмуртия и в Пермском крае с 2003 по 2007 гг, которые хранятся в Зоологическом музее Саратовского университета и Зоологическом институте РАН (таблица) В качестве материала использовали заспиртованные образцы печени гадюк Тотальную ДНК из них выделяли по методике (Sambrook et al, 1989), применяемой в отношении рептилий Тотальную ДНК из крови извлекали с использованием набора «Diatom Prep 100» (ГенЛаб) в соответствии с методикой фирмы изготовителя

Для проведения полимеразной цепной реакции использовали олигонуклео-тидные праймеры, подобранные по нуклеотидным последовательностям, имеющимся в базе данных Genebank (Франция) Секвенирование очищенных двухцепочечных ПЦР продуктов митохондриальных генов проводили по методу Сенгера (Sanger et al, 1977) Электрофоретическое разделение продуктов

секвенирующей реакции осуществляли с помощью автоматического 8-капиллярного ДНК-секвенатора SEQ 2000XL (Bekman Coulter) Для выравнивания секвенированных нуклеотидных последовательностей митохондриаль-ных генов использовали профаммы Clustal W и BioEdit Sequence Alignment Editor Для построения дендрограмм применяли пакет прикладных программ MEGA 4 Molecular Evolutionary Genetics Analysis (Tamura et al, 2007)

Геофафическая и количественная характеристика сборов гадюк использованных в анализе

№ Код Место сбора Вид Кол-во Источник

1 Sar Саратовская область V mkolsku 23 ЗМ СГУ, ЗИН РАН

2 Sam Самарская область V mkolskiP 15 ЗМ СГУ, ЗИН РАН

3 Chuv Республика Чувашия V berus 5 ЗМ СГУ, ЗИН РАН

4 Pen Пензенская область V berus 3 ЗМСГУ

5 Мог Республика Мордовия V berus 7 ЗМ СГУ

6 Per Пермский край V berus 7 ЗИН РАН

7 Udm Республика Удмуртия V berus 6 ЗИН РАН

8 Tul Тульская область V berus 9 ЗИН РАН

9 Nov Новгородская область V berus 5 ЗИН РАН

10 Vol Волгоградская область V renardi 2 ЗМСГУ

Анализ флуоресцентно-меченых продуктов амплификации микросател-литных локусов проводили с помощью генетического анализатора 3130XL (Applied Biosystems), вычисление частот аллелей и определение коэффициента инбридинга — с использованием программы GenAIEx 6 Генетические расстояния между популяциями гадюк и построение «филогенетического дерева» проводили с использованием программы Phylip 3 65

Глава 3 ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РОДСТВА ГАДЮКОВЫХ ЗМЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК

В главе представлены результаты анализа нуклеотидных последовательностей трех митохондриальных генов НАДН-дегидрогеназы (субъединица 2 -ND2), цитохром с оксидазы (субъединицы 3 - COIII) и 12S рибосомной РНК На начальном этапе исследований была поставлена задача оценить уровень генетических различий между обыкновенной гадюкой и гадюкой Никольского На основе анализа данных литературы по распространению гадюковых змей, в работе использовались рептилии из Саратовской и Самарской областей По морфологическим признакам все экземпляры были определены как гадюки Никольского Однако в соответствии с данными литературы, экземпляр из Самарской области должен был быть отнесен к обыкновенной гадюке В связи с этим он рассматривался как вариант с неопределенным таксономическим статусом

Для проведения полимеразой цепной реакции были подобраны следующие олигонуклеотидные праймеры на ген НАДН-дегидрогеназа S'-GCATTTTCATGACCACCACC-S7 S'-GAGTGAGGGGTAAGATAGAG-S' на ген цитохром с оксидаза S'-AATGACTCACCAGCTACACC-S' S'-GGAGCCTCATCAGTATACTG-S' на гена 12S рРНК

S'-CTCAACAACAGTGAGACAGCC-S' S'-GGTGTGTACGCTCTTCATTGC-S'

Нуклеотидная последовательность гена НАДН-дегидрогеназы субъединицы 2 обычно используется для изучения молекулярной филогении животных и, в частности, змей (Garrigues et al, 2005) Поэтому, для определения таксономического статуса гадюки из Самарской области использовалось сравнение именно нуклеотидных последовательностей митохондриального гена НАДН-дегидрогеназы На основе сравнения признаков гадюк из Саратовской и Самарской областей, а также змей, взятых из базы данных Genebank (У berus, V ursina, V a aspis, V am ammodytes), были выявлены их филогенетические связи Для этого использовали дистанционный метод (NJ) Экземпляры из Саратовской области представлены на «филогенетическом дереве» в виде отдельной группы с высоким уровнем достоверности - 99% (рис 1) Все остальные экземпляры располагаются на определенном расстоянии от данной группы Следует отметить, что наиболее близкими к данной выборке являются экземпляры гадюки из Самарской области и У berus из базы данных Gene bank

92

99

V berus* -&m2

99

Sar2

100

Sar4

■ Vursinn*

- Va asps*

- V amanrrod/tes*

001

Рис 1 Филогенетические связи, выявленные на основе анализа нуклеотидной последовательности фрагмента гена НАДН-дегидрогеназы с использованием дистанционного метода (NJ) нуклеотидные последовательности, взятые из базы данных Gene bank

Результаты анализа нуклеотидной последовательности митохондриального гена НАДН-дегидрогеназы свидетельствуют о генетическом сходстве гадюк Никольского из популяций с территории Саратовской области Как видно из схемы филогенетических связей, эти экземпляры образовали отдельный кластер, по сравнению со всеми остальными экземплярами, используемыми в анализе Змеи из Самарской области попали в одну группу с V berus из базы данных Gene bank Отличия между данными экземплярами составили всего два нуклеотида Данный уровень различий свидетельствует о высоком сходстве экземпляров гадюк из Самарской области и обыкновенной гадюки

Необходимо отметить, что первоначально экземпляр гадюки из Самарской области по морфологическим признакам был отнесен к V mkolsku Однако результаты молекулярно-генетических исследований показали его высокое сходство с обыкновенной гадюкой Подобные результаты были получены и при сравнении нуклеотидной последовательности цитохром Ь, когда по морфологическим признакам гадюки идентифицировались как V mkolsku, хотя на основе молекулярно-генетического анализа они попадали в группу «F ¿eras» (Бакиев и др , 2004) На этом основании можно предположить, что гадюки из Самарской области, территориально располагающиеся выше границы Канев -Курск - Тамбов - Бузулук, уже не входят в ареал гадюки Никольского, а являются черной морфой обыкновенной гадюки

Полученные результаты указывают на тот факт, что гадюки из Саратовской и Самарской областей являются представителями различных таксономических групп Гадюки из саратовского Правобережья территориально, морфологически и генетически (на молекулярном уровне) определяются как гадюки Никольского Рептилии самарских популяций по морфологическим признакам диагностируются как гадюки Никольского, но по географической приуроченности их популяций должны относиться к обыкновенной гадюке Молекуляр-но-генетические данные подтверждают принадлежность самарских экземпляров к обыкновенной гадюке

На следующем этапе работ анализировались нуклеотидные последовательности митохондриального гена цитохром с оксидазы (субъединица 3 - СО III) Учитывая результаты сравнения митохондриального гена НАДН-дегидрогеназы, для анализа цитохром с оксидазы было предложено расширить выборку гадюк из Саратовской и Самарской областей Также дополнительно в исследования были включены экземпляры обыкновенной гадюки из Пензенской области и Республики Мордовия В качестве внешней группы использовалась восточная степная гадюка (Vípera renardii) из волгоградской популяции Для построения «филогенетического дерева» использовали 20 экземпляров гадюк из Нижнего Поволжья и сопредельных территорий Как и для гена НАДН-дегидрогеназы экземпляры из Саратовской и Самарской областей по

результатам сравнения цитохром с оксидазы образовали отдельные группы (рис 2) Вместе с этим в «самарскую» группу также вошли экземпляры из Пензенской области и Республики Мордовия

Ser3 — Sar5 Sar2 i Sari SciiJ Saf*5 Sar7 SarS Sa-9 SarlO

Sam1 SarrQ Sam3 R=rn1 Per2 РепЗ f ta-1

Mcr3

Рис 2 Филогенетические связи, выявленные по данным нуклеотидной последовательности фрагмента гена цитохром с оксидазы СО III с использованием дистанционного метода (NJ)

Полученные результаты выявили строгую специфичность гадюк из Саратовской области, которые по морфологическим признакам были отнесены к гадюке Никольского Незначительные отличия в виде отдельных мутаций были обнаружены у трех экземпляров V mkolskn из Лысогорского и Ртищевского районов Саратовской области Представленные материалы подтверждают выдвинутое на предыдущих этапах работ предположение о высокой генетической специфичности змей из Саратовской области и принадлежности их к гадюке Никольского

Гадюки, предварительно идентифицированные по морфологическим признакам как обыкновенные из Пензенской области и Республики Мордовия, образовали отдельную группу, отличающуюся от гадюк Никольского из Саратовской области Змеи из Самарской области были также отнесены к группе обыкновенных гадюк, хотя морфологические признаки указывали на их принадлежность к гадюке Никольского

Большинство полученных данных указывают на то обстоятельство, что «самарские» гадюки находятся в зоне симпатрического обитания номинативного подвида обыкновенной гадюки и гадюки Никольского Тем не менее, эти

образцы проявляют сходство по нуклеотидной последовательности, что позволяет предположительно отнести их к обыкновенной гадюке Экземпляр восточной степной гадюки образовал отдельный кластер, что свидетельствует о принадлежности данного экземпляра к самостоятельному виду

На следующем этапе работ анализировались нуклеотидные последовательности митохондриального гена 12Б рибосомной РНК Учитывая результаты сравнения митохондриального гена НАДН-дегидрогеназы и цитохром с окси-дазы, было предложено еще более расширить выборку гадюк из Саратовской и Самарской областей до 15 и 14 экземпляров соответственно Также дополнительно в анализ были включены экземпляры обыкновенной гадюки из Пензенской и Тульской областей, Пермского края, республик Мордовия, Чувашия и Удмуртия В качестве внешней группы использовалась восточная степная гадюка из волгоградской популяции

Полученные результаты вновь подтвердили строгую специфичность гадюк из Саратовской области, которые по морфологическим признакам были отнесены к гадюке Никольского (рис 3) Незначительные отличия в виде отдельных мутаций были обнаружены у трех экземпляров V ткоЬкп из Аркадакско-го района (окрестности с Летяжевка, пойма р Хопер) Саратовской области Данные результаты по сравнению нуклеотидной последовательности 12Б рРНК подтвердили предположение о принадлежности «саратовских» змей к гадюке Никольского Единственное исключение составил экземпляр гадюки с территории урочища Моховое болото (Новобурасский район Саратовской области), который не попал в данную группу По морфологическим признакам он был определен как V ткоЬкп, а по результатам сравнения нуклеотидных последовательностей гена 12Б рРНК как V Ьегш В данной ситуации следует уточнить, что данный экземпляр был ювенильного возраста и, вероятно, ошибочно при внешней диагностике был отнесен к гадюке Никольского Это связано с тем, что первогодки гадюк Никольского и обыкновенной имеют морфологическое сходство, особенно проявляющееся в окраске тела (Завьялов и др , 1998, Кудрявцев и др, 1998)

Следует отметить, что сходство результатов, полученных при анализе всех трех генов, свидетельствует о достоверности сделанных выводов Во всех сравнениях восточная степная гадюка образовывала отдельный кластер Она находилась практически на равном генетическом расстоянии от гадюк Никольского и обыкновенной Обнаружен высокий уровень молекулярного единообразия внутри популяций изучаемых видов Большинство нуклеотидных замен, по которым экземпляры отличались внутри кластеров, были единичны и не характеризовали группировки в целом Однако популяция обыкновенной гадюки с территории Тульской области двумя нуклеотидными заменами отличается от остальных популяций обыкновенных гадюк Данные нуклеотидные

замены отмечены у всех исследованных экземпляров, в связи с чем «тульских» обыкновенных гадюк следует рассматривать как обособленную группу, однако имеющую уровень генетических отличий 0 3%, что не превышает межпопуля-ционный уровень (Калябина-Хауф и др , 2004)

64 I

ч.ъ-з

San Per

-Регб

Sarll Г.Ь Chiv Шп1 Per

-Td

44

96

■ Sam12

100

Sar

70

Sar22 S3f4 ' Sai21 Vd

0 005

Рис 3 Филогенетические связи, выявленные по данным нуклеотидной последовательности фрагмента гена 12S рРНК с использованием дистанционного метода (NJ)

Принимая во внимание гипотезу о стабильной дивергенции митохондри-альной ДНК, соответствующей 1 млн лет на 2 5% генетических различий, обособление популяции Тульской области от основной ветви произошло примерно 120 тыс лет назад Данное явление, предположительно, может быть связано с наступлением ледников на юг в течение плейстоцена, которое отрезало их от основной группы и способствовало формированию обособленной популяции

В целом средний уровень различий между гадюкой Никольского и обыкновенной гадюкой по трем митохондриальным генам равен 2 36% Принимая во внимание литературные данные по генетическим дистанциям между видами одного рода для рептилий (0 51%), уровень различий между данными гадюками свидетельствует об индивидуальности гадюки Никольского (Avise et al, 1982) Поэтому этих змей следует рассматривать в качестве самостоятельного вида гадюк

Глава 4 ВНУТРИВИДОВАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ И ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ СЕГРЕГАЦИЯ ГАДЮКОВЫХ ЗМЕЙ

В настоящее время гадюка Никольского является одним из самых распространенных представителей рода Vípera на территории Саратовской области Выявленные различия между саратовскими популяциями гадюк и остальными исследованными представителями указанного таксона позволили подтвердить обоснованность выделения гадюки Никольского в качестве самостоятельного вида Наряду с этим заключением большой интерес представляет анализ различий между отдельными популяциями гадюк Никольского и обыкновенной Данная проблема связана с вероятностью гибридизации номинативного подвида обыкновенной гадюки и монотипической гадюки Никольского

На первом этапе для оценки полиморфизма гадюки Никольского на территории изучаемого региона с использованием микросателлитных локусов осуществлялся подбор олигонуклеотидных праймеров для амплификации необходимых участков ДНК На основе результатов обзора литературы были подобраны 9 пар олигонуклеотидных праймеров Однако всего три пары оказались наиболее подходящими для исследования гадюк Наиболее информативным представляется микросателлитный локус 7-87, с помощью которого исследовались выборки гадюк

На основе применения указанного локуса было проанализировано 82 экземпляра гадюк Следует отметить, что из 23 «саратовских» образцов 19 в своем составе имели аллель размером 152 п н Один экземпляр с территории Но-вобурасского района Саратовской области характеризовался наличием аллелей 176 и 184 п н Два экземпляра (Sar 17, 19) являются гомозиготными с аллелями размером 184 п н У одного экземпляра (Sar 3) обнаружены аллели, не встречающиеся среди других «саратовских» гадюк Размер аллелей для данного экземпляра составляет 166 и 190 п н Аллель 152 п н оказался высокоспецифичным для гадюки Никольского Вместе с этим, практически все экземпляры обыкновенных гадюк содержали аллели размером от 176 до 192 п н, что указывает на обособленность популяций гадюк Никольского из Саратовской области и обыкновенных гадюк из более северных территорий

Нельзя не отметить и тот факт, что один экземпляр из Тульской области и два из Республики Мордовия содержали аллель 152 п н, характерный гадюке Никольского из Саратовской области Вероятно, данное явление возникает в результате симпатрического обитания и гибридизации между гадюкой Никольского и обыкновенной гадюкой Это свидетельствует о высоких адаптивных возможностях гадюки Никольского, которые в условиях внутривековой динамики климата проявляет тенденцию к расселению на север (рис 4)

В отношении изучаемых рептилий из Пермского края, республик Чувашии, Мордовии и Удмуртии выявлено разнообразие аллелей по микросател-

Ижевск.

йИ

Казан«"

Рязань

Саранск

Самара

Тамбов

§_- южная тайга

- подтаежные леса 1 ". | - широколиственные леса I - лесостепь ] - степь

1 - опустыненная степь

.Украина

КАЗАХСТАк

Волгоград

Рис. 4. Гипотетическая схема распространения, динамики ареала и направления генетической изменчивости гадюковых змей:

_ - предполагаемая (на основе генетических исследований) северная граница распространения

гадюки Никольского;

- направление расселения гадюки Никольского;

- зона вероятной гибридизации (V. Ьегия х V. ткокки)\

- межпопуляционная клинальная изменчивость в пределах ареала обыкновенной гадюки (направление увеличения длины аллелей)

литному локусу 7-87. При этом отмечена тенденция увеличения длины аллелей в направлении от Республики Мордовия до Пермского края.

Вероятно, данное явление определяется градиентом экологических условий при смене природных зон: от широколиственных лесов (республики Мордовия и Чувашия), к подтаежным лесам (Республика Удмуртия) и тайге (Пермский край). Вместе с этим, гадюки с указанных территорий проявляют высокий уровень генетического полиморфизма по сравнению с гадюками из Самарской, Пензенской и Новгородской областей. Это может быть обусловлено значительной амплитудой абиотических факторов, когда при продвижении в пределах ареала гадюковых змей в восточном направлении от Республики Мордовия до Пермского края существенно снижается среднегодовая температура воздуха (от +3.0 до +1.9°С) и повышается среднегодовое количество осадков (от 450 до 600 мм).

Принимая во внимание результаты, полученные при анализе нуклеотид-ных последовательностей и микросателлитного локуса, становится возможным создать гипотетическую модель расселения и формирования современного ареала изучаемых гадюк (см рис 4) При этом необходимо придавать ведущее значение процессам экогенеза в четвертичном ледниковом периоде, которые оказали максимальное влияние на формирование видовой структуры рептилий (Калябина-Хауф и др , 2004) В тот период основные колебания климата были приурочены к среднему плейстоцену (700 тыс лет назад), когда происходило продвижение ледников на юг с цикличностью приблизительно 100 тыс лет, а также наступление непродолжительных теплых межледниковых периодов Принимая во внимание гипотезу о стабильной скорости эволюции митохонд-риальной ДНК (2 5% на 1 млн лет) (Калябина-Хауф и др , 2004, Wilson et al, 1985, Kocher et al, 1989), дивергенция гадюк Никольского и обыкновенной происходила во временном интервале около 700-750 тыс лет назад (1 8%)

В данной связи можно предположить, что в ходе генезиса герпетофауны гадюка Никольского заняла территорию лесостепной зоны южнее 52-54° с ш , а обыкновенная - зону широколиственных лесов, а затем проникала далее на север и восток Так как последний из указанных видов находился в условиях циклически глобально изменяющегося климата (смена ледниковых и межледниковых периодов), у него происходило постепенное увеличение длины аллелей микросателлитного локуса, что в последующем привело к проявлению клинальной изменчивости по данному признаку Напротив, гадюка Никольского в пределах продолжительного промежутка времени эволюционировала в относительно стабильных экологических условиях, что подтверждается наличием у нее коротких аллелей микросателлитного локуса

Дивергенция и экологическая сегрегация гадюк Никольского и обыкновенной продолжалась и в голоценовый период, о чем свидетельствует анализ митохондриальной ДНК В связи с этим предположим, что в основе механизмов адаптации и дифференциации указанных видов в зонах симпатрического обитания лежит биотопическая приуроченность Гадюка Никольского в своем распространении в изучаемом регионе связана с пойменными ландшафтами долин малых рек Волжского и Донского бассейнов, она избегает остепненные целинные участки и агроценозы, крайне редко встречается на водораздельных пространствах Обыкновенная гадюка предпочитает смешанные леса с полянами, болота на водоразделах и в долинах рек Однако, несмотря на наличие экологической сегрегации, в зонах симпатрического обитания отмечаются особи, характеризующиеся признаками гибридогенного характера (по результатам анализа микросателлитного локуса) Данное обстоятельство свидетельствует о возможности гибридизации между гадюками Никольского и обыкновенной в ситуациях, когда экологические ниши видов хоть и незначительно перекрываются в пространственном отношении, а также в ходе расселения рептилий

Глава 5 РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ГАДЮКОВЫХ ЗМЕЙ

В главе предложена низкозатратная технология идентификации гадюк, таксономическое положение которых затруднено на основе морфологических и биохимических характеристик В основе данной технологии лежит аллель-специфичная ПЦР Выявленные нуклеотидные замены в митохондриальном гене 12S рибосомной РНК у гадюк Никольского и обыкновенной были положены в основу технологии генотипирования При конструировании олигонук-леотидных праймеров для аллель-специфичной ПЦР нуклеотидная замена вводилась во второе положение на З'-конце

Для подтверждения работоспособности технологии идентификации гадюк с использованием аллель-специфичной ПЦР она была проверена на экземплярах гадюк, таксономический статус которых уже был определен с использованием секвенирования митохондриального гена 12S рРНК Проведенные экспериментальные исследования показали работоспособность технологии идентификации гадюк Данная технология позволит за более короткое время и с меньшими материальными затратами проводить идентификацию гадюк Вместе с этим, при наличии соответствующей приборной базы, данные исследования возможно проводить непосредственно в полевых условиях Это позволит забирать биологический материал и выпускать животных обратно в среду их обитания, что будет способствовать сохранению гадюковых змей и в целом биологического разнообразия региона

ВЫВОДЫ

В результате осуществленных исследований впервые секвенированы нуклеотидные последовательности митохондриальных генов 12S рРНК, НАДН-дегидрогеназы и цитохром с оксидазы для гадюки Никольского (Vípera nikol-sku), для обыкновенной гадюки (Vípera berus) определена нуклеотидная последовательность митохондриальных генов 12S рРНК и цитохром с оксидазы, что позволило сделать следующие выводы

1 Подтверждена видовая самостоятельность популяций гадюки Никольского, приуроченных в своем обитании к основной части ее ареала Сравнительный анализ митохондриальных генов 12S рибосомной РНК, НАДН-дегидрогеназы и цитохром с оксидазы указывает на отличия нуклеотидных последовательностей митохондриальных генов у гадюковых змей Среднего Поволжья, что позволяет отнести их к меланистической форме обыкновенной гадюки Вероятное время дивергенции рода Vípera в отношении гадюк Никольского и обыкновенной приходится на средний плейстоцен (около 700 тыс лет назад)

2 Область распространения гадюки Никольского в Поволжье простирается в волжской долине на север до нижней зоны Саратовского водохранилища (южнее

г Хвалынска Саратовской области), в западном направлении граница ареала проходит по территории южных административных районов Пензенской области, волжская долина является восточным пределом распространения вида

3 Выявлено наличие на территории Поволжья (северные районы Правобережья Саратовской области) популяций гадюковых змей, результаты анализа нуклеотидных последовательностей митохондриального гена 12S рибосомной РНК и микросателлитного локуса 7-87 которых указывают на гибридогенный характер их происхождения (V berus * V mkolskii) Это свидетельствует о возможности перекрывания пространственных ниш гадюк в зоне их симпатриче-ского обитания

4 Определены признаки (аллель 152 п н), позволяющие диагностировать популяции гадюки Никольского в основной части ареала В зонах гибридизации регистрация у гадюковых змей выявленного признака позволяет предположить высокие адаптивные возможности гадюки Никольского Определена межпопуляционная клинальная изменчивость в пределах ареала обыкновенной гадюки по микросателлитному локусу 7-87, проявляющаяся в северовосточном направлении в отношении увеличения длины аллелей

5 Разработана экспресс-технология (на основе результатов сравнения нук-леотидной последовательности митохондриального гена 12S рРНК) идентификации популяций гадюковых змей (V berus и V mkolskii), таксономическое положение которых по комплексу морфологических и биохимических признаков затруднено Предлагаемая методика основана на детекции единичных мутаций с использованием аллель-специфичной полимеразной цепной реакции

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ * - публикации в изданиях перечня ВАК РФ

1 Ефимов Р В ПЦР-амплификация и секвенирование генов НАДН-дегидрогеназы ND2 и 12S РНК гадюки Никольского Vípera mkolskii II Исследования молодых ученых и студентов в биологии - Саратов, 2005 - Вып 3 -С 35-38

2 Ефимов Р В Применение автоматического секвенирования для определения таксономического статуса гадюк // Тр 49-й науч конф Московского физико-технического институтата (факультет аэрофизики и космических исследований) М , 2006 - С 23

3 Беликов В А , Ефимов Р В , Завьялов Е В , Кузнецов П Е , Табачишин В Г , Шляхтин Г В , Кайбелева Э И Генетическая дивергенция, некоторых видов гадюк (Reptilia Viperidae, Vípera) по результатам секвенирования генов НАДН-дегидрогеназы и 12S рибосомной РНК // Современная герпетология -2006 -Т 5/6 - С 41^9

4 * Беликов В А, Ефимов Р В , Назаров А К, Кузнецов П Е ПЦР-амплификация и секвенирование генов НАДН-дегидроегназы и 12S рибосо-

мальной РНК гадюки Никольского (Vipera mkolsku) // Вестник Саратовского госагроуниверситета им НИ Вавилова -2006 -№3 - С 3-7

5 Ефимов Р В , Завьялов Е В , Беликов В А , Табачишин В Г Предварительные данные о генетической дифференциации нижневолжских популяций гадюки Никольского (Vipera mkolsku, Viperidae) по результатам секвенирова-ния генов 12S рибосомной РНК и цитохромоксидазы III // Современная герпетология -2007 -Т 7, вып 1/2 - С 69-75

6 Efimov R V , Zavialov Е V , Tabachisan V G Analysis of genetic divergence of different Vipera species (Reptilia Viperidae, Vepera) from gene sequention of cytochrome oxidase subunit III and 12S ribosomal RNA // Proceedings of The 3-rd Moscow Conference On Computational Molecular Biology - M , 2007 - P 324225

7 Ефимов P В , Завьялов E В , Табачишин В Г Сравнительная генетическая характеристика поволжских популяций обыкновенной гадюки (Vipera berus) и гадюки Никольского (Vipera mkolsku) по результатам секвенирования генов 12S рибосомной РНК и цитохромоксидазы III // Актуальные проблемы герпетологии и токсинологии - Тольятти, 2007 - Вып 10-С 56-60

8 * Ефимов Р В , Завьялов Е В , Беликов В А , Табачишин В Г Генетическая дивергенция популяций Vipera berus и Vipera mkolsku (Reptilia Viperidae, Vipera) Нижнего Поволжья и сопредельных территорий по результатам секвенирования генов цитохромоксидазы III И 12S рибосомной РНК // Генетика -2008 - Т 44, № 2 - С 283-286

9 Efimov R V Zavialov Е V , Tabachishan V G Features of microsatellite loci in population of some kinds of adders (Viperidae, Vipera) // The 6-th International Conference on Biomformatics of Genome Regulation and Structure. - Novosibirsk, 2008 -C 93

10 Аспекты экологической сегрегации и технология видовой идентификации гадюковых змей (Reptilia Viperidae, Vipera) в Поволжье на основе геноти-пирования//Поволжскийэкол журн 2008 №2 С 56-61

Подписано в печать 29 05 2008 Формат 60*84 шб Бумага офсетная № 1 Гарнитура Тайме Печать офсетная Уел печ л 1,25 Тираж 100 экз Заказ 91

Отпечатано в типографии ООО «Тироль» 410005 Саратов, ул Чернышевского, 203

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ефимов, Роман Вячеславович

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1 ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ В ЭКОЛОГИИ И СИСТЕМАТИКЕ ГАДЮКОВЫХ ЗМЕЙ (обзор литературы).

1.1 Эколого-морфологическая характеристика гадюки Никольского.

1.2 Цитологическая и молекулярно-биологическая характеристика гадюковых змей.

1.3 Развитие систематики от морфологии до молекулярной биологии.

1.4 Методы молекулярной биологии, используемые для определения таксономического статуса и выяснения родственных отношений.

1.4.1 Биохимические маркеры.

1.4.2 Г^Р-анализ.

1.4.3 Методы, основанные на полимеразой цепной реакции.

1.4.3.1 ЯАРБ, АРЬР-анализ.

1.4.3.2 Анализ полиморфизма повторяющихся последовательностей.

1.4.3.3 Анализ полиморфизма нуклеотидных последовательностей.

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Материалы и реактивы.

2.2 Приборная база.

2.3 Методы исследования.

2.3.1 Выделение ДНК.

2.3.2 Проведение полимеразной цепной реакции.

2.3.3 Проведение электрофореза в агарозном геле.

2.3.4 Экстракция ДНК из агарозного геля.

2.3.5 Секвенирование ПЦР продуктов по Сенгеру.

2.3.6 Фрагментный анализ микросателлитных локусов.

2.3.7 Анализ нуклеотидных последовательностей и микросателлитных локусов.

Глава 3 ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РОДСТВА ГАДЮКОВЫХ ЗМЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК.

3. 1 Обоснование выбора молекулярно-генетических маркеров для исследования генетического родства гадюк.

3.2 Подбор олигонуклеотидных праймеров для амплификации, митохондриальных генов.

3.3 Исследование генетического родства гадюк с использованием митохондриального гена НАДН-дегидрогеназы (Субъединицы 2 -N02).

3.4 Исследование генетического родства гадюк с использованием митохондриального гена цитохром с оксидазы (Субъединицы 3 — СО III).

3.5 Исследование генетического родства гадюк с использованием митохондриального гена 12Б рибосомной РНК.

Глава 4 ВНУТРИВИДОВАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ И ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ СЕГРЕГАЦИЯ ГАДЮКОВЫХ ЗМЕЙ.

4.1 Исследование внутривидовой вариабельности гадюки Никольского и обыкновенной гадюки с использованием микросателлитных локусов.

4.2 Разработка сценария расселения и формирования ареалов гадюки

Никольского и обыкновенной гадюки.

Глава 5 РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ГАДЮКОВЫХ ЗМЕЙ.

5.1 Подбор олигонуклеотидных праймеров для генотипирования гадюковых змей.

5.2 Экспериментальная проверка работоспособности технологии генотипирования гадюковых змей.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Эколого-генетическая характеристика гадюковых змей (Reptilia, viperidae) в Нижнем Поволжье и на сопредельных территориях"

Одним из важнейших событий в науке XX в. было открытие двойной спирали ДНК. В последствии это привело к интенсивному развитию такого направления как молекулярная генетика. Особое значение в молекулярно-генетических исследованиях приобрел разработанный в 1975 г. метод секвенирования ДНК, который привел к молекулярно-биологическому пониманию сущности гена, его структуры и функции. Логическим развитием молекулярной генетики становится Международная научная программа «Геном человека», позволившая вывести науку на новый уровень развития. Начинают появляться отдельные направления в генетике, такие как генная диагностика, генная терапия, генная систематика, генная инженерия и др., вышедшие на первый план в медицине и в биологии (Горбунова и др., 1997; Чемерис и др., 1999; Venter et al., 2001).

Особое значение молекулярная генетика приобрела в медицине. Происходит более глубокое понимание вопросов этиологии и патогенеза большинства заболеваний. Широкое распространение приобретает диагностика заболеваний, имеющих в своей основе наследственный компонент. Появляется новое направление — предиктивная диагностика, позволяющая предсказать вероятность развития заболевания, и соответственно принять меры по его профилактике. И как логичное продолжение этого направления - разрабатываются современные лекарственные препараты, воздействующие на генетический аппарат, позволяющие лечить до настоящего времени неизлечимые заболевания (Горбунова и др., 1997).

Современные разработки молекулярной генетики находят применение в судебно-медицинской экспертизе. Результаты ДНК-анализа являются доказательной базой в большинстве судебных процессов. Во многих странах уже существуют банки ДНК, позволяющие быстро идентифицировать человека. 5

Аналогичная технология используется и при доказательстве биологического отцовства (Пименов и др., 2001).

Развитие молекулярной генетики послужило мощным импульсом для развития биотехнологии. В основе данного направления лежит создание нового продукта или получение уже известного продукта путем переноса генетического материала. В настоящее время биотехнология получила широкое применение в промышленном производстве различных биологически активных веществ (Гловера, 1988; Горбунова и др., 1997; Глик и др., 2002).

Следует отметить, что молекулярная генетика позволила углубить представления о механизмах наследования и об эволюции организмов, заложив тем самым основы филогенетики и генной систематики. По результатам сравнения генов и геномов делается заключение о генетическом родстве организмов. Чем больше имеется отличий в нуклеотидных последовательностях сравниваемых генов, тем дальше в генетическом родстве находятся организмы (Антонов, 2005).

Особое значение генная систематика приобрела при решении спорных вопросов относительно таксонов, систематический статус которых до конца не установлен. С данной проблемой часто сталкиваются исследователи, когда невозможно при использовании традиционных методов морфологического анализа оценить таксономическое положение организма. Принимая во внимание тот факт, что все морфологические признаки закодированы в последовательности ДНК, использование для систематики генетического материала позволяет более глубоко понять процессы эволюции и на их основе сделать заключение о систематическом положении. Важную роль в таксономии рептилий в последнее время приобрело сравнение нуклеотидных последовательностей ми-тохондриальных генов. Особенно интенсивно данное направление развивается в отношении змей, ящериц и черепах. Географические популяции пресмыкающихся зачастую характеризуются сходными морфологическими метрическими и меристическими признаками, когда без применения методов молекулярной генетики решение спорных вопросов их систематики становится затруднительным (Калябина-Хауф и др., 2004; Семенова и др., 2004; Garrigues et al., 2005; Ursenbacher et al., 2006; Huang et al., 2007).

К группе рептилий, вопросы филогенетического родства, систематики и распространения которых остаются до конца не выясненными, относятся га-дюковые змеи (Viperidae). На современном этапе развития эколого-таксоно-мических исследований повышенный интерес среди этих животных проявляется к гадюке Никольского (Vípera (Pelias) nikolskii Vedmederja, Grubant, Rudaeva, 1986), которая широко распространена в Европе. В настоящее время не существует единого мнения в отношении ее таксономического статуса. Некоторые авторы выделяют гадюку Никольского в качестве самостоятельного вида, другие рассматривают на уровне подвида обыкновенной гадюки или включают ее в состав комплекса «Vípera berus» в качестве черной морфы (Ведмедеря и др., 1986; Кудрявцев и др., 1998; Бакиев и др., 2004; Grubant et al., 1973; Joger at al., 1997; Milto et al., 2005; Zinenko et al., 2005; Kotenko, 2006).

Во многих работах, выполненных в последнем десятилетии, отсутствует стройная аргументация в подтверждение той или иной точки зрения. Более того, зачастую даже невозможно определить, какую же позицию занимает тот или иной исследователь, не признающий видовой самостоятельности Vípera nikolskii, в отношении статуса «черных гадюк» вообще и изучаемых локальных географических группировок в частности.

Гадюка Никольского занесена в Красную книгу России и Украины как малоизученный вид. Сведения о состоянии ее популяций в Нижнем Поволжье ограничены: не известен таксономический статус окраинных поселений, поэтому с приемлемой точностью не выявлены границы распространения змей. Отсутствуют достоверные данные о возможности гибридизации близкородственных видов гадюк в природе и их экологической сегрегации в зонах симпат-рического обитания. Не разработаны методы оперативной диагностики видовой принадлежности рептилий в природе и лабораторных условиях. Указанные проблемы не позволяют определить категорию редкости и природоохранный статус вида, приступить к разработке действенных мероприятий по сохранению популяций этих животных, особенно на периферии ареала.

Использование только морфологических, экологических и кариологиче-ских методов не позволяет дать однозначные ответы на поставленные вопросы (Бакиев и др., 2004; Кайбелева и др., 2005). В связи с этим на современном этапе большое значение приобретают эколого-таксономические приемы и подходы, основанные на анализе молекул ДНК. Использование данных методов позволяет уточнить таксономический статус некоторых видов гадюковых змей, а значит значительно приблизиться к пониманию процессов и явлений их морфологической изменчивости под действием комплекса абиотических факторов среды. На основе применения молекулярно-генетического анализа возможно также установление генетической структуры популяций гадюк, а также выявление механизмов, лежащих в основе эволюции изучаемых змей.

Целью работы явилось выявление распространения и экологической сегрегации гадюковых змей в Нижнем Поволжье, определение таксономического статуса их популяций с использованием молекулярно-генетических маркеров. В ходе реализации цели исследования решались следующие задачи:

- оценка таксономического статуса гадюки Никольского (Vípera nikolskií) в Нижнем Поволжье и на сопредельных территориях на основе анализа нук-леотидных последовательностей митохондриальных генов;

- установление генетической структуры популяций гадюк Никольского и обыкновенной с использованием анализа микросателлитных локусов, выявление факторов внешней среды, участвующих в ее формировании;

- определение границ ареала гадюки Никольского на территории Нижнего Поволжья и на сопредельных территориях;

- выявление механизмов экологической сегрегации гадюк Никольского и обыкновенной в зонах симпатрии, уточнение гипотетической модели дивергенции и пространственного распространения видов рода Vípera-,

- разработка экспресс-технологии идентификации популяций гадюковых змей (V. berus и V. nikolskii), таксономическое положение которых по комплексу морфологических и биохимических признаков затруднено.

Для оценки таксономического статуса гадюки Никольского предлагается использовать сравнение нуклеотидных последовательностей митохондриаль-ных генов. Сравнение необходимо проводить с обыкновенной гадюкой, являющейся наиболее таксономически близким животным. Для этого выбираются митохондриальные гены, которые наиболее оптимально позволят выявить генетические различия между данными таксонами. Далее определяется первичная структура данных генов и с использованием пакета прикладных программ оценивается таксономическое положение гадюк (Joger at al., 1997).

Для установления генетической структуры популяций гадюк предлагается использовать анализ микросателлитных локусов гадюк. Для этого все использованные в анализе гадюки целесообразно разбивать по отдельным популяциям, после чего выявляются индивидуальные аллели, характерные для каждой популяции в отдельности. На основе результатов микросателлитного анализа делается заключение о различиях между исследованными популяциями, и выявляются вероятные экологические факторы, вызывающие данные различий (Villarreal et al., 1996; McCracken et al., 1999, Carlsson et al., 2004; Manier et al., 2005).

Для определения границ распространения гадюки Никольского предлагается использовать результаты сравнения нуклеотидных последовательностей митохондриальных генов, как гадюки Никольского, так и обыкновенной гадюки с различных мест обитания. В этом случае важное значение приобретает анализ гадюк с территорий, где вероятно обитают оба вида.

Для выявления механизмов экологической сегрегации гадюк Никольского и обыкновенной в зонах симпатрии, уточнение гипотетической модели дивергенции предлагается использовать результаты анализа микросателлитных локусов. Вместе с этим, анализ нуклеотидных последовательностей митохондриальных генов позволяет определять вероятное время дивергенции видов и соответственно разрабатывать сценарии распространения организмов в связи с событиями четвертичного периода.

Для разработки универсальной технологии идентификации гадюк предлагается использовать возможности полимеразной цепной реакции. Данная технология основана на использовании аллель-специфичной ПЦР к мутациям, отличающим гадюку Никольского от обыкновенной гадюки, выявленным при секвенировании митохондриального гена 12Б рибосомной РНК. Данная технология позволит за более короткое время и без использования дорогостоящего секвенирования проводить идентификацию спорных экземпляров гадюк (Ко-фиади и др., 2006).

В данной работе предполагается провести комплексную оценку эколого-таксономического статуса гадюки Никольского, а также определение границ ее распространения с использованием анализа нуклеотидных последовательностей митохондриальных генов гадюк. Для выявления генетических особенностей популяций гадюки Никольского и обыкновенной гадюки будет проведен анализ микросателлитных локусов, проявляющих высокий уровень полиморфизма. Будет разработана технология идентификации популяций гадюко-вых змей (К Ъегш и V. ткоЬки), таксономическое положение которых по комплексу морфологических и биохимических признаков затруднено.

Заключение Диссертация по теме "Экология", Ефимов, Роман Вячеславович

выводы

В результате осуществленных эколого-генетических исследований выявлены экологические факторы, определяющие распространение и участвующие в формировании эпигенетического ландшафта географических популяций змей; впервые секвенированы нуклеотидные последовательности митохондри-альных генов 12S рРНК, НАДН-дегидрогеназы и цитохром с оксидазы для гадюки Никольского (Vípera nikolskií)\ для обыкновенной гадюки (Vípera berus) определена нуклеотидная последовательность митохондриальных генов 12S рРНК и цитохром с оксидазы, что позволило сделать следующие выводы:

1. Подтверждена видовая самостоятельность популяций гадюки Никольского, приуроченных в своем обитании к основной части ее ареала. Сравнительный анализ митохондриальных генов 12S рибосомной РНК, НАДН-дегидрогеназы и цитохром с оксидазы указывает на отличия нуклеотидных последовательностей митохондриальных генов у гадюковых змей Среднего Поволжья, что позволяет отнести их к меланистической форме обыкновенной гадюки. Вероятное время дивергенции рода Vípera в отношении гадюк Никольского и обыкновенной приходится на средний плейстоцен (около 700 тыс. лет назад).

2. Область распространения гадюки Никольского в Поволжье простирается в волжской долине на север до нижней зоны Саратовского водохранилища (южнее г. Хвалынска Саратовской области); в западном направлении граница ареала проходит по территории южных административных районов Пензенской области; волжская долина является восточным пределом распространения вида.

3. Выявлено наличие на территории Поволжья (северные районы

Правобережья Саратовской области) популяций гадюковых змей, результаты

122 анализа нуклеотидных последовательностей митохондриального гена 12Б рибосомной РНК и микросателлитного локуса 7-87 которых указывают на гибридогенный характер их происхождения (V. Ьегш х V. ткоккИ). Это свидетельствует о возможности перекрывания пространственных ниш гадюк в зоне их симпатрического обитания.

4. Определены признаки (аллель 152 п.н.), позволяющие диагностировать популяции гадюки Никольского в основной части ареала. В зонах гибридизации гадюковых змей проявляются высокие адаптивные возможности гадюки Никольского, способствующие ее расселению. Определена межпопуляционная клинальная изменчивость в пределах ареала обыкновенной гадюки по микросателлитному локусу 7-87, проявляющаяся в северо-восточном направлении в отношении увеличения длины аллелей.

5. Разработана экспресс-технология (на основе результатов сравнения нуклеотидной последовательности митохондриального гена 128 рРНК) идентификации популяций гадюковых змей (V. Ьегш и V. ткоЬки), таксономическое положение которых по комплексу морфологических и биохимических признаков затруднено. Предлагаемая методика основана на детекции единичных мутаций с использованием аллель-специфичной полимеразной цепной реакции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ефимов, Роман Вячеславович, Саратов

1. Абрамсон, Н.И. Филогеография: итоги, проблемы, перспективы / Н.И. Абрамсон // Вестник ВОГиС. 2007. - Т. - № 2. - С. 307-331.

2. Ананьева, Н.Б. Земноводные и пресмыкающиеся: Энциклопедия природы России. / Н.Б. Ананьева, Л.Я. Боркин, И.С. Даревский, Н.Л. Орлов М.: Изд-во «ABF». - 1998. - 576 с.

3. Антонов, A.C. Геномика и геносистематика /A.C. Антонов // Природа. -1999.-№6.-С. 19-26.

4. Антонов, A.C. Геносистематика: от Э. Чаргаффа и А.Н. Белозерского до наших дней / A.C. Антонов // Молекулярная биология. 2005. - Т. 39. - № 4. -С. 581-589.

5. Бакиев, А.Г. Змеи Волжско-Камского края / А.Г. Бакиев, В.И. Гаранин, H.A. Литвинов, A.B. Павлов, и др. Самара: Издательство Самарского научного центра РАН. - 2004. - 192 с.

6. Белозерский, А.Н. Биохимия нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов / А.Н. Белозерский. -М.: Наука. 1959. - 372 с.

7. Белозерский, А.Н. Состав нуклеиновых кислот и систематика / А.Н. Белозерский, A.C. Спирин // Известия АН СССР (сер. биол.). 1960. -№ 1. - С. 64-81.

8. Ведмедеря, В.И. К вопросу о названии черной гадюки лесостепи Европейской части СССР / В.И. Ведмедеря, В.Н. Грубант, A.B. Рудаева // Вестник Харьковского ун-та. Харьков. 1986. - № 288. - С. 83-85.

9. Беликов, В.А. Генетическая дивергенция некоторых видов гадюк

10. Reptilia: Viperidae, Vípera) по результатам секвенирования генов НАДНдегидрогеназы и 12S рибосомальной РНК / В.А. Беликов, Р.В. Ефимов,124

11. Е.В. Завьялов, П.Е. Кузнецов и др. // Современная герпетология. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та. 2006. - Т. 5/6. - С. 41-49.

12. Глик, Д. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак. М.: Мир. - 2002. - 589 с.

13. Гловера, Д. Клонирование ДНК. Методы / Д. Гловера. М.: Мир.- 1988. -538 с.

14. Горбунова, В.Н. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний / СПб.: «Специальная литература». 1997. — 287 с.

15. Завьялов, Е.В. Распространение и особенности биологии Vipera nikolskii в северной части Нижнего Поволжья / Е.В. Завьялов, В.Г. Табачишин // Проблемы общей биологии и прикладной экологии. Саратов: СГУ. 1997. - № 1. — С. 168-170.

16. Завьялов, Е.В. Пресмыкающиеся Энциклопедия Саратовского края / Е.В. Завьялов, В.Г. Табачишин, Г.В. Шляхтин. Саратов: Приволж. кн. изд-во. -2002.-С. 191-193.

17. Зиненко, А.И. Гибриды первого поколения между гадюкой Никольского, Vipera Nikolskii, и обыкновенной гадюки, Vipera berus (Reptilia, Serpentes, Viperidae) / А.И. Зиненко // Vestnik zoologii. 2003. - № 37 (1). - С. 101-104.

18. Иванов, В.И. Генетика. Учебник для вузов / Под ред. академика РАМН В.И. Иванова. М.: ИКЦ «Академкнига». - 2006. - 638 с.

19. Иванов, В.И. Геномика-медицине. Научное издание / Под ред. академика РАМН В.И. Иванова и академика РАН JI.JI. Киселева. М.: ИКЦ «Академкнига». - 2005. - 392 с.

20. Иванов, П.Л. Индивидуализация человека и идентификация личности: молекулярная биология в судебной экспертизе / П.Л. Иванов // Вестник российской академии наук. 2003. - № 12. - Т. 73. - С. 1085-1097.

21. Ковеза, О.В. Выявление и картирования полиморфных RAPD-маркеров генома гороха (Pisum Sativa L.) / O.B. Ковеза, З.Г. Кокаева, Ф.А. Коновалов, С.А. Гостимский // Генетика. 2005. - Т. 41. - № 3. - С. 341-348. (1)

22. Ковеза, О.В. Создание и изучение SCAR-маркеров у гороха {Pisum Sativa L.) / О.В. Ковеза, С.А. Гостимский // Генетика. 2005. - Т. 41. - № 11.— С. 1522-1530. (2)

23. Кофиади, И.А. Методы детекции олигонуклеотидных полиморфизмов: аллель-специфичная ПЦР и гибридизация с олигонуклеотидной пробой / И.А. Кофиади, Д.В. Ребриков // Генетика. 2006. - Т. 42. - № 1. - С. 22-32.

24. Кубанцев, Б.С. Распределение и численность пресмыкающихся в северных районах Нижнего Поволжья / Б.С. Кубанцев, H.H. Колякин // Всесоюзное совещание по проблемам кадастра и учета животного мира: Тезисы докладов. Уфа. 1989. - Вып. 3. - С. 280-282.

25. Кудрявцев, C.B. Ядовитые змеи: доступно о самом главном / C.B. Кудрявцев, C.B. Мамет. — М.: «Книжный дом «Университет». — 1998. — 44 с.

26. Кузнецова, М.В. Молекулярная филогения оленьих / М.В. Кузнецова, М.В. Холодова, A.A. Данилкин // Генетика. 2005. - Т. 41. - № 7. - С. 910918. (1)

27. Кузнецова, О.И. Исследование растений-регенерантов гороха (Pisum sativum L.) с помощью молекулярных RAPD и маркеров ISSR-маркеров / О.И. Кузнецова, O.A. АШ, Г.А. Хартина, С.А. Гостимский // Генетика. 2005. — Т. — 41.-№1.-С. 71-77. (2)

28. Лазебная, И.В. Генетическая изменчивость ядерной рибосомной ДНК насекомых отряда тараканы (Blattaria): филогенетический анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов / И.В. Лазебная, Д.В. Муха // Генетика. 2003. - Т. 39. - С. 474-477.

29. Ленинджер, А. Основы биохимии / А. Ленинджер. — М.: Мир. 1985.Т. 2.- 368 с.

30. Майр, Э. Принципы зоологической систематики / Э. Майр. М.: Мир. -1971.-456 с.

31. Олейник, А.Г. Дифференциация мальмы Salvelinus malma Азии и северной Америки по данным ПЦР-ПДРФ-анализа митохондриальной ДНК / А.Г. Олейник, Л.А. Скурихина, В.А. Брыков, П.А. Крейн, Д.К. Венбург // Генетика. 2005. - Т. 41. - № 5. - С. 626-634.

32. Орлова, В.Ф. Природа России: жизнь животных. Земноводные и пресмыкающиеся. / В.Ф. Орлова, Д.В. Семенов. М. - 1999. - 480 с.

33. Пименов, М.Г. Научные и практические аспекты криминалистического ДНК-анализа: Учебное пособие. М.: ГУ ЭКЦ МВД России. - 2001. - 144 с.

34. Радченко, O.A. Изменчивость нуклеотидных последовательностей гена цитохрома b митохондриальной ДНК гольцов рода Salvelinus / O.A. Радченко // Генетика. 2004. - Т. 40. № 3. - С. 320-333.

35. Ратнер, В.А. Молекулярная эволюция / В.А. Ратнер // Соросовский образовательный журнал. 1998. - № 3. С. 41-47.

36. Салменкова, Е.А. Генетическая дивергенция гольцов рода Salvelinus Кроноцкого озера (полуостров Камчатка) / Е.А. Салменкова, В.Т. Омельченко, O.A. Радченко, Н.В. Гордеева и др. // Генетика. 2005. - Т. 41. - № 8. - С. 1096-1107.

37. Семенова, С.К. RAPD-изменчивость средиземноморской черепахи Testudo graecaL. (Testudinidae) / C.K. Семенова, A.B. Корсуненко, В.А. Васильев, C.JI. Перешкольник и др. // Генетика. 2004. - Т. 40. - № 12. - С. 16281636.

38. Сингер, М. Гены и геномы: в 2 т. / М. Сингер, П. Берг. М.: Мир. - 1998. -2 т. —391 е.: ил.

39. Спирин, A.C. А.Н. Белозерский и становление молекулярной биологии / A.C. Спирин // Молекулярная биология. 2005. - Т. 39. - № 4. - С. 532-537.

40. Спирин, A.C. Изучение видовой специфичности нуклеиновых кислот у бактерий / A.C. Спирин, А.Н. Белозерский, Н.В. Шугаева, Б.Ф. Ванюшин // Бихимия. 1957. - № 22. - С. 744-754.

41. Табачишин, В.Г. Современное распространение и некоторые аспекты экологии гадюки Никольского на севере Нижнего Поволжья / В.Г. Табачишин, И.Е. Табачишина, Е.В. Завьялов // Поволж. экол. журн. 2003. - № 1. - С. 82 — 86.

42. Фортэ, A.B. Филогения видов яблони рода Malus на основе оценки морфологических признаков и молекулярного анализа ДНК / A.B. Фортэ, А.Н. Игнатов, В.В. Пономаренко, Д.Б. Дорохов, Н.И. Савельев // Генетика. 2002. - Т. 38.-№ 10.-С. 1357-1369.

43. Хедрик, Ф. Генетика популяций / Ф. Хедрик. М.: Техносфера. - 2003.592 с.

44. Чемерис, A.B. Секвенирование ДНК/ A.B. Чемерис, Э.Д. Ахунов, В.А. Вахитов. М.: Наука. - 1999. - 429 с.

45. Шляхтин, Г.В. Методика полевых исследований экологии амфибий и рептилий / Г.В. Шляхтин, В.Л. Голикова Саратов: Изд-во Сарат. ун-та. —1986.-78 с.

46. Шляхтин, Г.В. Животный мир Саратовской области. Кн. 4. Амфибии и рептилии. / Г.В. Шляхтин, В.Г. Табачишин, Е.В. Завьялов, И.Е. Табачишина -Саратов: Изд-во Сарат. ун-та. 2005. - 116 с.

47. Шляхтин, Г.В. Распространение пресмыкающихся ceM.Viperidae и Colubridae на территории Саратовской области / Г.В. Шляхтин, В.Г. Табачишин, Е.В. Завьялов // Тезисы докладов: Первой конференции герпетологов Поволжья. 1995. - Тольятти. - С. 61-63.

48. Щелкунов, С.Н. Генетическая инженерия: Учебно-справочное пособие. — 2-е изд., испр. и доп. / С.Н. Щелкунов. — Новосибирск: Сиб. унив. изд-во. — 2004.-496 с.

49. Avise, J.C. A comparative summary of genetic distances in the Vertebrates // J.C. Avise, C.F. Aquadro, M.K. Hecht, B. Wallace, et al. / Evolutionary Biology. New York-London.-1982. V. 15.-P. 151-185.

50. Botstein, D. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms / D. Botstein, R.L. White, M. Skolnick, R.W. Davis // The American Journal of Human Genetics. 1980. - № 32. - P. 314-331.

51. Buntjer, J.B. Phylogeny of bovine species based on AFLP fingerprinting / J.B. Buntjer, M. Otsen, I.J. Nijman, M.T.R. Kuiper and J.A. Lenstra // Heredity. -2002.-№88.-P. 46-51.

52. Ferquel, E. Reappraisal of Vipera aspis Venom Neurotoxicity / E. Ferquel, L. Haro, V. Jan, I. Guillemin, S. Jourdain et al. // PLoS ONE. 2007. - № 11. - P. 118.

53. Glazko, G. Eighty percent of proteins are different between humans and chimpanzees / G. Glazko, V. Veeramachaneni, M. Nei, W. Makalowski // Gene. -2005.-№14.-P. 215-219.

54. Groot, T.V.M. Molecular genetic evidence for parthenogenesis in the Burmese python, Python molurus bivittatus / T.V.M. Groot, E. Bruins, J.A.J. Breeuwer // Heredity. 2003. - № 90. - P. 130-135.

55. Herrmann, H. Molecular phylogeny and systematics of viperine snakes I. General phylogeny of European vipers {Vipera sensu stricto) / H. Herrmann, U. Joger, G. Nilson // Proc. Syxth Ord. Gen. Meet. S. E. H., Budapest 1991. - P. 219224.

56. Hille, A. Heterologous amplification of microsatellite markers from colubroid snakes in European natricines (Serpentes: Natricinae) / A. Hille, A.W. Janssen,

57. S.B.J. Menken, M. Schlegel et al. // The Journal of Heredity. 2002. - № 93(1). -P. 63-66.

58. Huang, S. Molecular phylogeography of endangered sharp-snouted pitviper (Deinagkistrodon acutus; Reptilia, Viperidae) in Vainland China // S. Huang, S. He, Z. Peng, K. Zhao, E. Zhao // Molecular phylogenetics and evolution. 2007. - № 44. - P. 942-952.

59. Hubby, J.L. A molecular approach to the study of genie heterozygosity in natural populations. I. The number of alleles at different loci in Drosophila pseudoobscura / J.L. Hubby, R.C. Lewontina // Genetics. № 54. - 1966. - P. 577594.

60. Joger, U. The phylogenetic position of Vipera barani and V. Nikolskii within the Vipera berus complex / U. Joger, P. Lenk, I. Baran, W. Böhme et al. // Herpetologia bonnensis. 1997. - P. 185-194.

61. Kellog, E.A. The structure and function of Rubisco and their implications for systematic studies / E.A. Kellog, N.D. Juliano // American journal of botany. 1997. -V. 84(3).-P. 413-428.

62. Kocher, T.D. Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals: Ampliphication and sequencing with conserved primers / T.D. Kocher, W.K. Thomas, A. Meyer, S.V. Edwards et al. // Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 1989. -V. 86.-P. 6196-6200.

63. Manier, M. K. Population genetic analysis identifies source-sink dynamics for two sympatric garter snake species (Thamnophis elegans and Thamnophis sirtalis) / M.K. Manier, S. J. Arnold // Molecular Ecology. 2005. - № 14. - P. 3965-3976.

64. Martin, P.G. Angiosperm taxonomy studied using sequences of five macromolecules / P.G. Martin, D. Boulter, D. Penny // Taxon. 1985. № 34. - P. 393-400.

65. McCracken, G. F. Microsatellite markers and multiple paternity in the garter snake Thamnophis sirtalis / G.F. McCracken, G.M. Burghardt, S.E. Houts // Molecular Ecology. 1999. -№ 8. - P. 1475-1479.

66. Milto, K.D. Distribution and morphological variability of Vipera berus in Eastern Europe. / K.D. Milto, O.I. Zinenko // In: Herpetologia Petropolitana, Ananjeva, N., Tsinenko, O., Eds, Saint-Petersburg. -2005. P. 64-73.

67. Nedospasov, A.A. Age changes of Vipera berus venom amidolytic activity / A.A. Nedospasov, E.V. Rodina// Toxicon. V. 30. - № 11. - P. 1505-1508.

68. Nilson, G. Vipera nikolskii Vedmederja, Grubant et Rudaeva, 1986 / G. Nilson., C. Andren // Atlas of Amphibians and Reptiles in Europe / Muséum National d'Histoire Naturelle. Paris. 1997. - P. 396 - 397.

69. Sambrook, J. Molekular cloning: A laboratory Manual / J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis // Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989. - 381 p.

70. Sanger, F. DNA Sequencing with chain-termination inhibitors / F. Sanger, S. Nicklen, A.R. Coulson // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - V. 74. - P. 54365467.

71. Tabatschischin, W.G. Zur präzisierung der südlichen Grenze des Verbreitungsareals der Waldsteppenotter (Vípera nikolskii) im europäischen Teil Russlands / W.G. Tabatschischin, E.W. Sawjalow // Mauritiana (Altenburg). 2004. Bd. 19, heftl.P.83-85.

72. Tamura, K. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) Software Version 4.0 / K. Tamura, J.l. Dudley, M. Nei and S. Kumar // Molecular biology and evolution. 2007. - № 24(8). - P. 1596-1599.

73. Tegelstrom, H. Paternity Determination in the Adder (Vípera berus) DNA Fingerprinting or Random Amplified Polymorphic DNA? / H. Tegelstrom, M. Hoggren // Biochemical Genetics. - 1994. - Vol. 32. - Nos. 7/8. - P. 132-137.

74. Venter, J. C. The Sequence of the Human Genome / J. C. Venter, M. D. Adams, E. W. Myers et al., // Science. -2001. V. 291. - P. 1304-1351.

75. Vos, P. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting / P. Vos, R. Hohers, M. Bleeker, M. Reijans // Nucleic acids research. 1995. - V. - 23. - № 21. P.4407-4414.

76. Welsh, J. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers / J. Welsh, M. McClelland // Nucleic Acids Research. 1990. V. 18. - № 24. - P. 7213-7218.

77. Williams, J.G.K. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers / J.G.K. Williams, A.R. Kubelik, K.J. Livak, J.A. Rafalski and S.V. Tingey // Nucleic Acids Research. 1990. V. 18. - № 22. - P. 6531-6535.

78. Wilson, A.C. Mitochodnrial DNA and two perspectives on evolutionary genetics / A.C. Wilson, R.L. Cann, S.M. Carr // Biol. J. Linn. Soc. 1985. - V. 26. -P. 375-400.

79. Woese, C.R. Bacterial evolution / C.R. Woese // Microbiological reviews. — 1987. -№51. -P. 221-271.