Эколого-биологические характеристики бактерий низкотемпературных пещер Сибири, Дальнего Востока и Западного Кавказа

Овсянкина, Софья Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Эколого-биологические характеристики бактерий низкотемпературных пещер Сибири, Дальнего Востока и Западного Кавказа
ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Эколого-биологические характеристики бактерий низкотемпературных пещер Сибири, Дальнего Востока и Западного Кавказа"

На правах рукописи

Овсянкина Софья Владимировна

Эколого-биологические характеристики бактерий низкотемпературных

пещер Сибири, Дальнего Востока и Западного Кавказа

03.02.08 - экология (биология)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

31 ОКТ 2013

Красноярск - 2013

005536752

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет».

Научный руководитель доктор биологических наук, доцент

Хижняк Сергей Витальевич

Официальные оппоненты: Тирранен Ляля Степановна,

доктор биологических наук, старший научный сотрудник, ФГБУН Институт биофизики СО РАН, с.н.с. в группе советника РАН

Гаевский Николай Александрович,

доктор биологических наук, доцент, ФГАОУ ВПО «Сибирский федеральный университет», профессор кафедры водных и наземных экосистем

Ведущая организация ФГБУН КНЦ СО РАН, Международный

научный центр исследования экстремальных состояний организма при Президиуме КНЦ СО РАН

Защита диссертации состоится «21» ноября 2013 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 220.037.04 при ФГБОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет» по адресу: 660049, г. Красноярск, проспект Мира, 90. Факс: (391)227-36-09.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет».

Автореферат разослан «

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор , ) Г. А. Демиденко

Актуальность проблемы. В настоящее время в мире наблюдается растущий интерес к использованию психрофильных и психротолерантных микроорганизмов в биотехнологии (Margesin, Schinner, 1994; Russell, 1998; Gerday et al., 2000; Lettinga et al., 2001; Margesin et al., 2003; Liu et al., 2011). Показано, что психрофильные и психротолерантные микроорганизмы представляют интерес с точки зрения защиты растений (Subramanian et al., 2011), биоремедиа-ции в условиях низких температур .(Gratia et al., 2009), поиска низкотемпературных ферментов (Gerday et al., 2000; Siddiqui and Cavicchioli, 2006; Feller, 2013). До сих пор основными источниками психрофильных и психротолерантных изолятов остаются Антарктика и Арктика (Kotsyurbenko, 2005; Кочкина и др., 2007; Wang et al., 2009; Ganzert et al., 2011), в отдельных случаях - альпийские почвы (Zhang et al., 2010). Исследования, проведённые в Красноярском государственном аграрном университете, показали, что карстовые пещеры Средней Сибири являются уникальным природным источником психрофильных и психротолерантных бактерий и грибов (Хижняк и др., 1999, 2001, 2003, Несте-ренко, 2007; Хижняк, 2009). Показано, что психрофильные и психротолерантные бактерии сибирских пещер представляют большой практический интерес для сельскохозяйственной биотехнологии в качестве безопасного для теплокровных биологического средства защиты растений от болезней при низких температурах начала вегетационного периода (Хижняк и др., 2009; Ланкина, 2010; Илиенц, 2011). Присутствие психрофильных и психротолерантных микроорганизмов отмечено также в пещерах Урала (Кузьмина и др., 2012).

Однако карстовые пещеры, сходные по своим физико-химическим, микроклиматическим и геологическим характеристикам с пещерами Сибири и Урала, широко распространены практически по всей территории бывшего Советского Союза. В этой связи представляется актуальным провести сравнительное изучение эколого-биологических характеристик бактерий, входящих в состав микробных сообществ карстовых пещер разных регионов, а также сравнить потенциал этих сообществ в качестве источника психрофильных и психротолерантных штаммов с потенциалом холодных поверхностных и подземных вод.

Целью настоящего исследования является сравнительное изучение эколого-биологических характеристик бактерий, входящих в состав микробных сообществ низкотемпературных пещер Сибири, Дальнего Востока и Западного Кавказа.

Основные задачи:

1. Изучить влияние температуры на скорость роста бактерий, входящих в состав микробных сообществ пещер Сибири, Дальнего Востока и Западного Кавказа.

2. Изучить влияние температуры на скорость роста бактерий, входящих в состав микробных сообществ холодных поверхностных и подземных вод Красноярского края.

3. Сравнить таксономический состав Психрофильных и психротолерант-ных бактерий в пещерах Средней Сибири, Дальнего Востока, Западного Кавказа и в холодных поверхностных и подземных водах Красноярского края.

4. Сравнить потенциал изучаемых пещерных сообществ и сообществ холодных поверхностных и подземных вод в качестве источников психрофильных и психротолерантных штаммов для сельскохозяйственной и экологической биотехнологии.

Научная новизна. Впервые показано присутствие психрофильных и психротолерантных бактерий в пещерах Западного Кавказа и Дальнего Востока и определён уровень их генетического сходства с известными видами. В составе автохтонной микробиоты пещер Сибири обнаружены представители родов, ранее в пещерах региона не отмечавшиеся (p.p. Flavobacterium, Pedobacter, Janthinobacterium). Впервые проведено сравнительное изучение влияния температуры на скорость роста психрофильных и психротолерантных бактерий, выделенных из пещер Средней Сибири, Западного Кавказа и Дальнего Востока. Установлено, что по температурным кривым роста психрофильные и психрото-лерантные бактерии пещер Западного Кавказа и Дальнего Востока аналогичны бактериям из сибирских пещер.

Установлено, что биологическое разнообразие психрофильных и психро-толерантные бактерий, выделяемых из низкотемпературных поверхностных и подземных вод, существенно ниже, чем в пещерных экосистемах.

Продемонстрирована возможность использования психрофильных и психротолерантных бактерий, выделенных из пещер Западного Кавказа и Дальнего Востока, в качестве биофунгицидов для защиты зерновых культур от корневых гнилей и альтернариоза в условиях Сибири. Из пещер Красноярского края, Западного Кавказа и Дальнего Востока выделены 11 психрофильных и психротолерантных бактериальных штаммов, проявляющих высокую антагонистическую активность в отношении одновременно представителей р. р. Alternaría, Bipolaris и Fusarium.

Защищаемые положения:

1. В карстовых пещерах Западного Кавказа и Дальнего Востока присутствуют адаптированные к низким температурам бактерии, по своим экологическим особенностям аналогичные бактериям, населяющим пещеры Сибири, однако отличающиеся от последних по таксономическому составу.

2. Биологическое разнообразие психрофильных и психротолерантных бактерий, выделяемых из низкотемпературных поверхностных и подземных вод Красноярского края, ниже, чем в исследуемых пещерных экосистемах.

3. Бактериальные сообщества пещер Западного Кавказа и Дальнего Востока наряду с сообществами пещер Сибири могут быть использованы в качестве источника штаммов для биологической борьбы с гельминтоспориозом, фузариозом и альтернариозом в условиях континентального климата, характерного для России.

Практическое значение работы. Выделенные из пещер штаммы, проявляющие антагонизм в отношении фитопатогенных грибов р. р. Alternaria, Bipolaris и Fusarium, используются в работах в рамках трёхстороннего Соглашения о научно-техническом сотрудничестве между Beihang University (Beijing University of Aeronautics and Astronautics, Пекин, КНР), Красноярским государственным аграрным университетом и Сибирским государственным аэрокосмическим университетом имени академика М.Ф. Решетнёва в области разработки биологических методов защиты растений в биорегенеративных системах жизнеобеспечения и в условиях закрытого грунта от 20.10.2011 (Справка от 25.05.2012). Штаммы L1-2 и UOZK-2 (в соавторстве с к.б.н. Панкиной Е.П., д.б.н. Хижняком C.B.) депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, г. Москва (регистрационные номера Ас-1832 и В-10596 соответственно) и в настоящее время проходят процедуру патентования в качестве основы препаратов для биодеградации органических отходов антропогенного происхождения при низких температурах в условиях пещер (штамм L1-2) и для защиты зерновых культур от корневой гнили и листовой пятнистости (штамм UOZK-2). Углеводородокисляющие штаммы НЗа, НЗб, Н5, Н6 использованы в работах по биологической деструкции полиэтилена в рамках российско-китайского проекта «Исследование микроорганизмов и механизма биодеградации полиэтилена в связи с разнообразием микробных популяций на примере пищеварительного тракта Sitotroga cerealella (Olivier)» (отчёт по гранту 10-08-91157-ГФЕН_а), а также в работах по биологической ремедиации загрязнённых мазутом почв пос. Кедровый Емельяновского района Красноярского края (Справка от 05.06.2012). Выделенные из низкотемпературных экосистем Средней Сибири, Западного Кавказа и Дальнего Востока изоляты психрофиль-ных и психротолерантных бактерий используются в преподавании дисциплины «Биотехнология» для специальностей 110102, 110203 на кафедре защиты растений и биотехнологии ФГБОУ ВПО «КрасГАУ» (Акты внедрения от 5.09.2011).

Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 18 работ, в том числе 3 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Материалы исследований были представлены: на XII Международной научной школе конференции студентов и молодых ученых «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий» (Абакан, 2009); П (Омск, 2010, 1-е место) и III (Краснодар, 2010, 6-е место) этапах Всероссийского конкурса на лучшую научную работу среди студентов, аспирантов и молодых ученых Минсельхоза РФ; XLVIII Международной научно-студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2010); IV Международной научной конференции молодых ученых «Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых» (Новосибирск, 2010); III Международной (заочной) научно-практической конференции молодых ученых «Инновационные тенденции развития Российской науки» (Красноярск, 2010); Международной научно-практической конференции «Инновационные подходы в ветеринарии, биологии и экологии» (Троицк, 2010); II Международной научной конференции молодых ученых «Актуаль-

ные проблемы науки и техники» (Уфа, 2010); конкурсе Красноярского регионального отделения Российского аграрного движения на «Лучший инновационный проект в сфере АПК» (Красноярск, 2010, лауреат); конкурсе инновационных работ «Лучший инновационный проект в сфере сельскохозяйственных наук» (Красноярск, 2010, 1-е место); III и IV общегородских ассамблеях «Красноярск. Технологии будущего» (Красноярск, 2010, 2011); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее» (Москва, 2011); Международной научно-практической конференции «Аграрная наука - основа инновационного развития АПК» (Курган, 2011); 7-й международной научно-практической конференции «Найновите постижения на европейската наука» (София, 2011); Международной заочной научной конференции «Проблемы современной аграрной науки» (Красноярск, 2011); 3-м Байкальском микробиологическом симпозиуме с международным участием «Микроорганизмы и вирусы в водных экосистемах» (Иркутск, 2011); 39th COSPAR Scientific Assembly (Mysore, 2012).

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 191 странице текста, содержит 98 рисунков и 12 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов и их обсуждения, практических рекомендаций, выводов и списка литературы, содержащего ссылки на 223 источника, из которых 105 - на иностранных языках.

Личный вклад автора. Анализ образцов, эксперименты, обработка и интерпретация полученных результатов выполнены лично автором. Образцы из пещер и низкотемпературных источников Средней Сибири собраны автором. Образцы из пещеры Сарма предоставлены участниками исследовательской экспедиции «Арабика-2010» (спелеосекция СФУ и Красноярский спелеоклуб), из пещеры Снежная - С.Е. Мазиной (спелеосекция МГУ). Образцы из пещеры Кузнецовская и пещеры Лисья предоставлены к.б.н. Д.А. Сидоровым (Биолого-почвенный институт РАН, Дальневосточное отделение).

Секвенирование гена 16S рРНК бактериальных изолятов выполнено в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (г. Пермь), во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (г. Москва).

Благодарности. Работа выполнена при частичной поддержке РФФИ (грант 10-08-91157-ГФЕН_а от 2010 г.). Автор выражает искреннюю благодарность д.б.н. C.B. Хижняку за методическое руководство, к.б.н. Д.А. Сидорову -за образцы грунта из пещер Лисья и Кузнецовская, П.В. Рудко, В.В. Сухачеву, Н.В. Кинчиной и другим участникам экспедиции «Арабика-2010» - за образцы грунта из пещеры Сарма, к.б.н. С.Е: Мазиной - за образцы грунта из пещеры Снежная, к.с.-х.н. В.К. Пурлауру - за помощь в сборе образцов для выделения фитопатогенных грибов, к.х.н. A.C. Романченко - за помощь в проведении атомно-силовой микроскопий.

Глава 1. Психрофильные микроорганизмы ' как компонент биосферы

В главе 1 проводится обзор современного состояния изученности психро-фильных микроорганизмов. Согласно литературным данным, в основном психрофильные микроорганизмы выделяют из различных объектов Антарктики, горных ледников, тундровых почв Арктики. Океаны также являются естественной средой обитания психрофильных бактерий (Жизнь микроорганизмов в экстремальных условиях, 1981; Громов, Павленко, 1989; Kotsyurbenko, 2005; Современная микробиология, 2005; Wang et al., 2009; Hoover, Pikuta, 2010; Ganzert et al., 2011). Изучение микробиоты пещер Средней Сибири показало, что в пещерах региона присутствуют естественные микробные сообщества, представленные психрофильными и психротолерантными бактериями и грибами (Хижняк и др., 1999, 2001, 2002, 2003, 2009, 2011; Нестеренко, 2007; Лан-кина, 2010; Илиенц, 2011). Психрофильные и психротолерантные микроорганизмы обнаружены также в пещерах Урала (Кузьмина и др., 2012).

Глава 2. Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили изоляты бактерий, выделенные автором из микробных сообществ низкотемпературных (температура воздуха и грунта +4...+6 °С) карстовых пещер Средней Сибири - Ледяная (720/32), Карауль-ная-2 (540/34), Женевская (6020/90), Гондурас (3780/150); Кавказа - Сарма (13000/1760), Снежная (26000/1753) и Дальнего Востока - Кузнецовская (40/7), Лисья (88/15) (в скобках показаны протяжённость и глубина пещеры, м), а также низкотемпературных (температура воды +2...+12 °С) источников и водотоков - р. Енисей, Лалетина, Моховая, Беркутовский, карстовых источников в верховьях р. Болгаш, грунтовых вод из наблюдательных скважин ОАО «Крас-ноярскнефтепродукт». Выделение изолятов из образцов и их лабораторные исследования выполняли по методикам, принятым при изучении пещерных микроорганизмов (Нестеренко, 2007; Хижняк, 2009). Время генерации бактерий при разной температуре определяли путём подсчёта клеток в микроколониях. Удельную скорость роста ц определяли как log2(n)/r, где п - среднее число клеток в микроколониях, образовавшихся за время т (час). Для построения теоретических кривых зависимости скорости роста от температуры использовали типовую модель CRatkowskv et al., 1983; Franzmann et al., 1997) n = ( b ■ (Г - Тш) • {I - ехр[с • {T - Г™,)]} },2 где Tmm и Tm!¡x - соответственно минимальная и максимальная температуры роста, ц - удельная скорость роста, b и с - константы. Выделение микроорганизмов, способных использовать углеводороды и пестициды, проводили методом поверхностного рассева в чашки Петри на минеральной среде с добавлением соответственно нефтепродуктов или пестицидов в качестве единственного источника углерода. Воздействие бактерий на полиэтилен изучали с помощью сканирующего мультимодового зондового микроскопа Solver Р47, используя программу управления микроскопом «NOVA». Антагонистическую активность изолятов оценивали по подавлению прорастания конидий (Билай и

др., 1982; Chand, 2002; Pratt, 2006; Nechet et al., 2006; Нестеренко, 2007; Хижняк и др., 2009) фитопатогенных грибов Bipolaris sorokiniana, Alternaria sp, Fusarium sp, выделенных автором из поражённых органов пшеницы.

Глава 3. Биологические особенности и таксономический состав бактерий, выделенных из пещер и низкотемпературных водных источников

В современной литературе нет чёткого определения психрофильных и психротолерантных микроорганизмов, что объясняется отсутствием выраженных границ между этими группами. Поэтому для подобных микроорганизмов широко используется термин «cold adapted» («адаптированные к холоду») (Margesin, Schinner, 1999; Sánchez et al., 2009; Yu et al, 2009; Nam, Ahn, 2011). В данной работе определение «психрофильные» используется в качестве аналога термина «cold adapted». Из всех изучаемых сообществ нами выделены психрофильные изоляты с верхним температурным пределом ниже +29.. .+35 °С (рис. 1, табл. 1).

—Теоретические значения ♦ Усреднённые экспериментальные значения

Рисунок 1 - Типичные температурные кривые роста психрофильных бактерий, выделенных из пеи^ер Средней Сибири (на примере штамма Ж1), Кавказа (на примере штамма Срм1), Дальнего Востока (на примере шталша В 1.3), низкотемпературных источников (на npwiepe штамма Kucml)

Обращает на себя внимание уход теоретических температурных кривых роста в область отрицательных температур. Ранее подобный феномен был отмечен для бактерий из антарктических и арктических местообитаний (Franzmann etal., 1997).

Таблица 1 - Температурные характеристики психрофильных бактерий, выделенных из изучаемых сообществ, в сравнении с мезофильными изолятами*

Показатель СС ЗК ДВ НВ М

Время генерации при +4 °С, ч 9,0...41,7 9,0... 18,0 7,7...38,5 18,5...76,8 20,0...169,7

Теоретическая минимальная -10,2...-3,1 -11,5...+0,27 -И,7...-1,7 -4,0...-1,1 -0,18...+7,3

температура, °С

Верхний температурный +29...+32 +31...+35 +30...+34 +30...+35 +38...+45

предел, °С

Диапазон оптимальных +21...+29 +20...+30 +25...+29 +22...+30 +28...+31

температур, °С

Время

генерации при оптимальной 2,2...3,9 1,0...1,9 1,3...2,5 2,0...2,3 0,77...5,7

температуре, ч

Примечание: СС - пещеры Средней Сибири; ЗК - пещеры Западного Кавказа; ДВ - пещеры Дальнего Востока; НВ - низкотемпературные водотоки, источники и грунтовые воды; М - мезофильные водные бактерии.

При температурах, близких к верхнему пределу роста, у всех изученных психрофильных штаммов наблюдаются морфологические нарушения, которые можно классифицировать следующим образом: увеличенные или уменьшенные в объеме, вздутые клетки; удлиненные и гигантские клетки; бесформенные клетки разного размера (рис. 2).

Рисунок 2 - Типичные морфологические нарушения у изучаемых бактерий при температуре, близкой к верхнему температурному пределу (Н- нормальные клетки при низкой температуре, А - аномальные клетки)

Можно предположить, что эти нарушения связаны с утратой способности к делению и нарушениями синтеза клеточной стенки.

При температурах, близких к температурному оптимуму, как правило, наблюдается минимальное варьирование бактерий по удельной скорости роста. По мере отклонения температуры от оптимума и, соответственно, снижения среднего значения скорости роста увеличивается коэффициент её осцилляции. Данный эффект отмечается для изолятов, выделенных из всех изучаемых источников (рис. 3).

Рисунок 3 - Примеры связи между средней удельной скоростью роста фшш - левые оси), и коэффициентом её осцилляции ( —♦— правые оси); скорость роста выражена в процентах от её значения при оптимальной температуре; СС, ЗК и ДВ - места выделения соответствующих штаммов

(см. табл. 1)

Относительная встречаемость психрофильных изолятов в изученных водотоках соответствует встречаемости психрофильных изолятов в пещерах либо уступает ей. Так, в пещерных сообществах доля психрофильных изолятов составляет от 58 до 99 % от числа колоний при общей численности бактерий 104- 107 КОЕ/г для грунтов и 102-10s КОЕ/мл для водоёмов. В изученных водотоках доля психрофилов составляет от 0 до 95 % от числа колоний при общей численности бактерий 103-104 КОЕ/мл. При этом изоляты, выделяемые из пещерных сообществ, обладают пониженными температурами роста в сравнении с изолятами из водных сообществ. Только один водный изолят (L1-2, р. Arthrobacter, место выделения - р. Лалетина) обладает температурными характеристиками роста, сопоставимыми с пещерными изолятами.

В отличие от образцов из пещеры «Сарма», в образцах из пещеры «Снежная» не обнаружено психрофильных бактерий. Это можно объяснить исторически длительной изоляцией пещеры от внешней среды снежной «пробкой» на входе,- крупнейшим в Европе подземным ледником и глыбовыми завалами в верхней части пещеры, исключавшими поступление с поверхности органического вещества, которое могло бы поддерживать в пещере автохтонное микробное сообщество.

Таксономический состав психрофильных изолятов представлен в таблице 2. Обращает на себя внимание различие в таксономическом составе изучаемых сообществ. В сообществах сибирских пещер широко представлены спорообразую-щие бактерии р. р. Bacillus, Paenibacillus, Sporosarcina, которые в сумме составляют 40 % изолятов, в то время как в сообществах пещер Кавказа, Дальнего

Востока и низкотемпературных водоёмов психрофильные спорообразующие бактерии не выявлены.

Таблица 2 - Родовой состав психрофильных бактерий в изучаемых сообществах

Род СС ЗК ДВ НВ

БкУоЬайепиш X X

1апШтоЬас1егшт X

Рзеискнпопав X X X X

Рес1оЬас1ег X

АгйгоЬа^ег X X X X

РзеискэсЬгоЬасЬгит X

РаетЬасШив X

8рогозагста X

ВасШиэ X

8р1шщорух18 X

Мюскюоссш X

Асте1:оЬас1ег X

РЬпососсив X

Неидентифицированные АсИпоЬайепа X X

Примечание-. «X» означает присутствие данного рода, обозначения - см. табл. 1; в данных по Сибири объединены данные автора и данные Е.П. Панкиной (2011).

Кластерный анализ сообществ по частотам встречаемости представителей разных родов показывает, что сообщества пещер образуют общий кластер, резко отличающийся от сообществ низкотемпературных водотоков. При этом разные способы кластеризации дают сходные результаты (рис. 4).

Метод "ближайшего соседа" Евклидово расстояние

Метод "дальнего соседа" Евклидово расстояние

ои 58

44 42

Метод Варда Евклидово расстояние

НВ ДВ ЗК СС

Рисунок 4 - Кластеризация сообществ по встречаемости представителей разных родов (по оси ординат - расстояние; обозначения - см. табл. 1)

Изоляты, выделенные из пещер и водотоков, имеют генетическое сходство с известными видами на уровне 97-100 % по гену 16Э рРНК. Почти все эти виды являются новыми, описанными в 2000-2011 гг. Среди видов, сходных с изучаемыми изолятами по гену 168 рРНК, есть как мезофилы, так и психрофи-лы. Последние были выделены из антарктических почв, Южного океана (океанические воды между побережьем Антарктиды и Южным полярным кругом), альпийских почв и высокогорных ледников в 2005-2011 гг. При этом в пещерах Средней Сибири обнаружены штаммы, генетически сходные с антарктическими и гималайскими видами; в пещерах Западного Кавказа - штаммы, сходные с антарктическими и альпийскими видами; в низкотемпературных водотоках региона - штаммы, сходные с антарктическими видами; в пещерах Дальнего Востока не обнаружено штаммов, сходных с видами из известных низкотемпературных местообитаний (табл. 3).

Таблица 3 - Происхождение видов, с которыми обнаружено генетическое сходство изучаемых штаммов

Место выделения известных видов СС ЗК Дв нв

Антарктика + + +

Гималаи +

Альпы +

Почва + + +

Водоёмы + + + +

Продукты, растения, сточные воды, донные отложения + + + +

Примечание: «+» - означает, что в изучаемом сообществе обнаружены изоляты, генетически сходные с известными видами из соответствующего местообитания; обозначения - см. табл. 1.

Приведённые в таблице 3 данные, на наш взгляд, свидетельствуют о различии в исторических путях формирования пещерных сообществ в разных регионах. Известно, что пещеры Средней Сибири и Кавказа формировались в неогене в тот же период, в который происходило формирование Саян, Гималаев, Кавказа, Альп (Цыкин, 1993). Вероятно, в формирование пещерных сообществ Средней Сибири и Западного Кавказа внесли вклад виды, параллельно участвовавшие в формировании высокогорных сообществ соответственно Альп и Гималаев. После адаптации к высокогорным условиям эти же виды могли принять участие в колонизации Антарктиды (рис. 5).

[Высокогорная псгкрофильная форма

[ Пещерная пснхрофшьная форма

Перенос в Антарктику воздушными массами

Рисунок 5 - Гипотетическая схема, объясняющая генетическое сходство пещерных изолятов с высокогорными и антарктическими видами

Пещеры Дальнего Востока, вероятно, заселялись местными водными и почвенными бактериями, не участвовавшими в формировании высокогорных сообществ.

Глава 4. Потенциал бактериальных сообществ Дальнего Востока и Кавказа в качестве источника штаммов для сельскохозяйственной

биотехнологии

Ранее было показано, что пещерные сообщества Средней Сибири представляют интерес в качестве источника эффективных в широком диапазоне температур и безопасных для человека и теплокровных животных штаммов для биологической борьбы с болезнями растений (Панкина, 2011).

Наше исследование не выявило существенных различий между сообществами Дальнего Востока, Средней Сибири и Кавказа ни по частоте встречаемости штаммов-антагонистов, ни по их антибиотической активности в отношении фитопатогенных грибов (рис. б). Факторный и дискриминантный анализ также не позволил разделить сообщества по способности подавлять фитопато-генные грибы (рис. 7).

80 60 40 -I 20

Bi polaris

Fusarium

Alternaría

100 99 -98

dBR _

Blpolaris

Fusarium

Alternarla

I Штаммы из пещер Сибири в Штаммы из других пещер

Рисунок б - Среднее (А) и максимальное (Б) подавление прорастания конидий, %, в кулътуралъном фштрате изучаемых штаммов (разведение 1:1)

Среди штаммов, проявивших антагонизм в отношении фитопатогенных грибов, 50 % способны к колонизации корней проростков пшеницы (рис. 8). Это позволяет рассматривать данные штаммы в качестве потенциальных агентов для борьбы с болезнями растений в гидропонных системах. Способность к колонизации корней отмечена для штаммов из всех изучаемых сообществ. Таким образом, пещеры Дальнего Востока и пещеры Кавказа, наряду с пещерами Сибири, можно с успехом использовать в качестве источника психрофильных штаммов для сельскохозяйственной биотехнологии.

Factor 1:36,52°/.

Root 1

Рисунок 7-Проекция штаммов на главные компоненты (А) и на оси дискриминации (Б) по воздействию на фитопатогенные грибы: 51 - штаммы из пещер Сибири, О - штаммы из других пещер

Рисунок 8 - Развитие штаммов Срм1 (пещера Сарма, Западный Кавказ) и К1 (пещера Караульная-2, Средняя Сибирь) в прикорневой зоне проростков пшеницы (К - корневые волоски, Б - бактерии)

Штаммы К13, КВ, КЗа из пещеры Караульная-2; Ж5 из пещеры Женевская; Г1, Г2, ГЗ из пещеры Гондурас; В7.6, В9.1ж, В1.3 из пещеры Кузнецовская проявили способность использовать метсульфурон-метиловые, клодина-фоп-пропаргиловые, феноксапрон-П-этиловые гербициды, спироксамин-тебуконозол-триадименоловые фунгициды, дельтаметриновые, альфа-циперметриновые инсектициды в качестве единственного источника углерода, что позволяет рекомендовать их для биоремедиации почв и водоёмов от указанных пестицидов в условиях Сибири.

Глава 5, Изоляты, выделенные из низкотемпературных грунтовых вод, загрязнённых нефтепродуктами

Из нефтезагрязненных грунтовых вод выделены 4 штамма, способные использовать летучие и нелетучие углеводороды в качестве единственного источника углерода. При росте клетки находятся непосредственно в нефтепродуктах и лишь в небольшом количестве переходят в водную фазу; наблюдается также сорбция паров углеводородов на клетках, что видно по светлой окраске клеток при наблюдении в фазовом контрасте (рис. 9). Это говорит о гидрофоб-ности поверхности клеток.

Все штаммы проявили способность к деструкции полиэтилена высокого давления, что подтверждается результатами атомно-силовой микроскопии. После воздействия на полиэтилен всеми изучаемыми культурами наблюдается изменение его поверхности в виде появления характерных пиков (рис. 10).

Рисунок 9-Рост углеводородокисляющик штаммов в летучих (1) и в нелетучих (2) углеводородах; сорбция летучих углеводородов на поверхности клеток (3)

Рисунок 10 -Трёхмерные изображения поверхности образцов полиэтилена, построенные по результатам атомно-силовой микроскопии: 1 - исходная плёнка; 2 - плёнка, подвергшаяся воздействию углеводородокисляющик бактерий, выделенных из грунтовых вод

Два штамма идентифицированы как представители р. Arthrobacter, два -как представители р. Rhodococcus. Оптимальная температура роста варьирует в пределах +30 ... +35°С, верхний температурный предел роста несколько выше +35°С. Таким образом, данные штаммы, хотя и выделены из низкотемпературных грунтовых вод, не являются истинными психрофилами. Тем не менее, температурные пределы роста позволяют использовать их для биоремедиации неф-тезагрязнённых почв и водоёмов в условиях Сибири.

Выводы

1. В пещерах Западного Кавказа и Дальнего Востока присутствуют псих-рофильные и психротолерантные бактерии, по своим температурным характеристикам роста аналогичные психрофильным бактериям, обитающим в пещерах Средней Сибири.

2. В изученных низкотемпературных поверхностных и подземных водах также присутствуют психрофильные и психротолерантные бактерии, однако их биологическое разнообразие существенно ниже, а температурные границы роста - выше, чем у пещерных изолятов. Таким образом, низкотемпературные поверхностные и подземные воды не могут служить альтернативой пещерным сообществам при поиске штаммов для низкотемпературной биотехнологии.

3. Таксономический состав психрофильных и психротолерантных бактерий в пещерах Западного Кавказа, Средней Сибири и Дальнего Востока различается. Тем не менее, по таксономическому составу пещерные сообщества образуют общий кластер, резко отличающийся от кластера, образуемого психро-филышми и психротолерантными бактериями низкотемпературных поверхностных и подземных вод.

4. Не выявлено существенных различий между сообществами Дальнего Востока, Средней Сибири и Кавказа ни по частоте встречаемости штаммов-антагонистов, ни по их антибиотической активности в отношении фитопато-генных грибов Bipolaris sorokiniana, Alternaría sp, Fusarium sp. В ходе исследований выделено 11 штаммов психрофильных бактерий, которые можно рекомендовать к испытаниям в качестве биофунпщицов для борьбы с корневыми гни-лями зерновых и альтернариозом в условиях Сибири.

5. Выделенные из пещер штаммы К13, К8, КЗа, Ж5, Г1, Г2, ГЗ, В7.6, В9.1ж, В 1.3 могут быть использованы для биоремедиации почв и водоёмов от метсуль-фурон-метиловых, клодинафоп-пропаргиловых, феноксапрон-П-этиловых гербицидов, спироксамин-тебуконозол-триадименоловых фунгицидов, дельтамет-риновых, альфа-циперметриновых инсектицидов в условиях Сибири, а выделенные из нефтезагрязнённых грунтовых вод штаммы НЗа, НЗб, Н5, Нб - для биоремедиации почв и водоёмов от нефтяного загрязнения, а также для биологической деструкции полиэтилена.

Практические рекомендации

1. Красноярскому НИИСХ Россельхозакадемии рекомендуем провести полевые испытания изолятов К1, КЗа, К5, К8, Ж5, ЖЗ, ГЗ, Срм1, Срм11, В9.16, Ld-15 в качестве биофунгицидов для защиты зерновых культур от корневых гнилей и аль-тернариоза в условиях Сибири.

2. Лаборатории космической биологии и биорегенеративных систем жизнеобеспечения Пекинского аэрокосмического университета и ФГБОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет» рекомендуем провести испытания указанных изолятов в качестве безопасных для человека биологических средств защиты растений в замкнутых системах жизнеобеспечения в рамках соглашения о научно-техническом сотрудничестве от 20.10.2011.

3. Кафедре инженерной экологии ФГБОУ ВПО «Сибирский государственный аэрокосмический университет им. академика М.Ф. Решетнева» рекомендуем использовать штаммы НЗа, НЗб, Н5, Н6 в работах по биоремедиации нефтезагрязнённых почв пос. Кедровый и других аналогичных объектов.

4. Рекомендуем использовать штаммы Срм4, Срм5, Срм11, В1.3, В9.16, В9.1ж, ГЗ, Г2, Ld-17, L1-2, Кист1, А61 психрофильных и психротолерантных бактерий в лабораторных работах по изучению влияния температуры на скорость роста микроорганизмов при преподавании дисциплин микробиологической, биотехнологической и экологической направленности в ФГБОУ ВПО «КрасГАУ».

Основные положения диссертации опубликованы в работах:

Издания, рекомендованные ВАК РФ:

1. Овсянкина (Воробьева), C.B. Психрофильные и психротолерантные микроорганизмы пещеры Сарма / C.B. Овсянкина (Воробьева), И.Р. Илиенц, C.B. Хижняк// Вестник КрасГАУ.-2011.-Вып 7.- С. 112-118.

2. Теремова, М.И. Углеводородокисляющие бактерии как потенциальные деструкторы полиэтилена высокого давления / М.И. Тремова, C.B. Овсянкина (Воробьева), А.С. Романченко, А.Г. Кучкин, C.B. Хижняк // Вестник КрасГАУ. -2011.-Вып. 11.-С. 133-138.

3. Овсянкина (Воробьева), C.B. Влияние температуры на рост психрофильных бактерий, выделенных из пещер Дальнего Востока, Средней Сибири и Западного Кавказа / C.B. Овсянкина (Воробьева), C.B. Хижняк, JI.T. Харламова // Вестник КрасГАУ. -2012. -Вып. 9,- С. 117-121.

Из публикаций в других изданиях основными являются:

4. Овсянкина (Воробьева), C.B. Численность различных физиологических групп гетеротрофного бактериопланктона р. Енисей в зимний период / C.B. Овсянкина (Воробьева), C.B. Хижняк // Молодые ученые - науке Сибири. - Красноярск, 2008. - Вып. 3. - С. 46-49.

5. Овсянкина (Воробьева), C.B. Современный уровень загрязнения водоемов пещеры «Ледяная» аллохтонными бактериями // C.B. Овсянкина (Воробьева), С,В. Хижняк // Экология Южной Сибири и сопредельных территорий: мат-лы XII Междунар. науч. школы конф. студентов и молодых ученых. - Абакан, 2009 -Т. 1.- Вып. 13.-С. 140-141.

6. Овсянкина (Воробьева), C.B. Численность различных физиологических групп гетеротрофного бактериопланктона реки Лалетина (Заповедник «Столбы» Красноярского края) / C.B. Овсянкина (Воробьева) // Студент и научно-технический прогресс: мат-лы XLVIII Междунар. науч.-студ. конф. - Новосибирск, 2010. - С. 80.

7. Ланкина, Е.П. Микробные сообщества экстремальных местообитаний как источник продуцентов антибиотиков для борьбы с болезнями животных и человека // Е.П. Ланкина, C.B. Овсянкина (Воробьева), И.Р. Илиенц // Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых: мат-лы IV Междунар. науч. конф. молодых ученых; - Новосибирск, 2010. - С. 85-88.

8. Овсянкина (Воробьева), C.B. Микробные сообщества олиготрофных местообитаний как потенциальный источник продуцентов антибиотиков // C.B. Воробьева, Е.П. Ланкина, И.Р. Илиенц // Инновационные тенденции развития Российской науки: мат-лы III Междунар. (заочной) науч.-практ. конф. молодых ученых. - Красноярск: Изд-во КрасГАУ, 2010. - С. 36-37.

9. Овсянкина (Воробьева), C.B. Микробные сообщества водных экосистем Алтае-Саянской горной области как источник продуцентов антибиотиков для борьбы с болезнями животных / C.B. Овсянкина (Воробьева), C.B. Хижняк // Инновационные подходы в ветеринарии, биологии и экологии: мат-лы Междунар. науч.-практ. конф. - Троицк: Изд-во УГАВМ, 2010. - С. 60-62.

10. Овсянкина (Воробьева), C.B. Психрофильные и психротолерантные бактерии в поверхностных водотоках Сибири / C.B. Овсянкина (Воробьева), C.B. Хижняк // Актуальные проблемы науки и техники: мат-лы II Междунар. науч. конф. молодых ученых. - Уфа: Нефтегазовое дело, 2010. - С. 96-97.

11. Овсянкина (Воробьева), C.B. Микробные сообщества поверхностных водотоков и карстовых полостей Алтае-Саянской горной области как потенциальный источник продуцентов антибиотиков / C.B. Овсянкина (Воробьева), Е.П. Ланкина, C.B. Хижняк // Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее: мат-лы Всерос. симпозиума с междунар. участием. - М., 2011. - С. 27.

12. Баранов, М.Е. Загрязнение нефтепродуктами как фактор формирования микробного сообщества почв / М.Е. Баранов, C.B. Овсянкина (Воробьева) // Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее: мат-лы Всерос. симпозиума с междунар. участием. -М., 2011. - С. 15.

13. Овсянкина (Воробьева), C.B. Бактериальные сообщества карстовых полостей как потенциальный источник психрофильных и психротолерантных микроорганизмов / C.B. Воробьева, C.B. Хижняк // Аграрная наука - основа инновационного развития АПК: мат-лы междунар. науч.-практ. конф. - Курган: Изд-во Курганской ГСХА, 2011. - Т. 2. - С. 381-385.

14. Теремова, М.И. Использование метода атомно-силовой микроскопии в изучении биодеструкции полиэтилена высокого давления / М.И.Теремова, С.В. Овсянкина (Воробьева), С.В. Хижняк, А.С. Романченко, М.Б. Баранов // Найновите постижения на европейската наука: мат-лы 7-й междунар. науч.-практ. конф. - София: Бял Град-БГ ООД, 2011. - Т. 25. - С. 25-30.

15. Хижняк, С.В. Автохтонная и аллохтонная микробиота карстовых пещер и подземных водоемов Средней Сибири / С.В. Хижняк, Е.В. Нестеренко, Е.П. Панкина, И.Р. Илиенц, С.В. Овсянкина (Воробьева), А.А. Кимм, А.И. Воронов // Микроорганизмы и вирусы в водных экосистемах: мат-лы 3-го байкальского микробиол. симпозиума с междунар. участием. - Иркутск, 2011. -С. 139-140.

16. Fu, Y. Karaulnaya-2 cave as source of cold-adapted strains for plants protection in the bioregenarative life support systems / Y. Fu, S.V. Ovsyankina (Vorobieva), S.V. Khizhnyak, L.T. Harlamova // Мат-лы Междунар. заоч. конф. по проблемам агрокомплекса. - Красноярск, 2011. - URL: http://www.kgau.ru.

17. Kang, W. Screening and identification of biocontrol bacteria for vegetable cultivation in space / W.Kang, H. Liu, Y. Qin, S.V. Khizhnyak, S.V. Ovsyankina (Vorobieva), L.T. Harlamova // 39th COSPAR Scientific Assembly. - Mysore, India, 2012. - URL: http://www.cospar-assembly.org.

18. Khizhnyak, S.V. Karst caves as a source of microorganisms for biological control of plant pathogens in bioregenerative life support systems / S.V. Khizhnyak,

H. Liu. E.P. Lankina, Y. Fu, S.V. Ovsyankina (Vorobieva), L.T. Harlamova,

I.R. Ilients, E.V. Nesterenko, W. Kang // 39th COSPAR Scientific Assembly. -Mysore, India, 2012. - URL: http://www.cospar-assembly.org.

Санитарно-эпидемиологическое заключение № 24.49.04.953.П..000381.09.03 от 25.09.2003 г. Подписано в печать 15.10.2013 Формат 60x84/16 Бумага тип. № 1. Печать-ризограф. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 772 Издательство Красноярского государственного аграрного университета 660017, Красноярск, ул. Ленина, 117 19

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Овсянкина, Софья Владимировна, Красноярск

ФГБОУ ВПО "Красноярский государственный аграрный университет"

На правах рукописи

Овсянкина Софья Владимировна

ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ БАКТЕРИЙ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНЫХ ПЕЩЕР СИБИРИ, ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА

И ЗАПАДНОГО КАВКАЗА

03.02.08 — экология (биология)

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н., профессор Хижняк C.B.

0«О1«г87У

Содержание

Введение 4

Глава 1. Психрофильные микроорганизмы как компонент биосферы 7

1.1 Биологические особенности психрофильных и психротолерантных микроорганизмов 7

1.2 Места обитания психрофильных и психротолерантных микроорганизмов 15

1.3 Биологическое разнообразие психрофильных и психротолерантных микроорганизмов 18

1.4 Практическое использование психрофильных и психротолерантных микроорганизмов 20

1.5 Карстовые пещеры как среда обитания психрофильных и психротолерантных микроорганизмов 22

Глава 2. Объекты и методы исследования 26

2.1. Карстовые пещеры Средней Сибири 26

2.2. Карстовые пещеры Западного Кавказа 33

2.3. Карстовые пещеры Дальнего Востока 37

2.4. Низкотемпературные источники и водотоки 37

2.5. Грунтовые воды с высоким содержанием органического вещества 45

2.6. Методы исследования 46

Глава 3. Биологические особенности и таксономический состав бактерий, выделенных из пещер и низкотемпературных водных источников 54

Глава 4. Потенциал бактериальных сообществ Дальнего Востока и Кавказа в качестве источника штаммов для сельскохозяйственной биотехнологии 129

Глава 5. Изоляты, выделенные из низкотемпературных грунтовых вод, загрязнённых нефтепродуктами 153

Выводы 163

Практические рекомендации 165

Библиографический список 166

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время в мире наблюдается растущий интерес к использованию психрофильных и психротолерантных микроорганизмов в биотехнологии (Margesin, Schinner, 1994; Russell, 1998; Gerday et al, 2000; Lettinga et al., 2001; Margesin et al., 2003; Liu et al, 2011). Показано, что психрофильные и психротолерантные микроорганизмы представляют интерес с точки зрения защиты растений (Subramanian et al, 2011), биоремедиации в условиях низких температур (Gratia et al, 2009), поиска низкотемпературных ферментов (Gerday et al, 2000; Siddiqui and Cavicchioli, 2006; Feller, 2013).

До сих пор основными источниками психрофильных и психротолерантных изолятов остаются Антарктика и Арктика (Kotsyurbenko, 2005; Кочкина и др, 2007; Wang et al., 2009; Ganzert et al., 2011), в отдельных случаях - альпийские почвы (Zhang et al., 2010).

Исследования, проведённые в Красноярском государственном аграрном университете, показали, что карстовые пещеры Средней Сибири являются уникальным природным источником психрофильных и психротолерантных бактерий и грибов (Хижняк и др., 1999, 2001, 2003, Нестеренко, 2007; Хижняк, 2009). Показано, что психрофильные и психротолерантные бактерии сибирских пещер представляют большой практический интерес для сельскохозяйственной биотехнологии в качестве безопасного для теплокровных биологического средства защиты растений от болезней при низких температурах начала вегетационного периода (Хижняк и др., 2009; Панкина, 2010; Илиенц, 2011). Присутствие психрофильных и психротолерантных микроорганизмов отмечено также в пещерах Урала (Кузьмина и др., 2012).

сравнительное изучение эколого-биологических характеристик бактерий, входящих в состав микробных сообществ карстовых пещер разных регионов, а также сравнить потенциал этих сообществ в качестве источника психрофильных и психротолерантных штаммов с потенциалом холодных поверхностных и подземных вод.

Основные задачи:

3.Сравнить таксономический состав психрофильных и психротолерантных бактерий в пещерах Средней Сибири, Дальнего Востока, Западного Кавказа и в холодных поверхностных и подземных водах Красноярского края.

Личный вклад автора. Анализ образцов, эксперименты, обработка и интерпретация полученных результатов выполнены лично автором. Образцы из пещер и низкотемпературных источников Средней Сибири собраны автором. Образцы из пещеры Сарма предоставлены участниками исследовательской экспедиции "Арабика-2010" (спелеосекция СФУ и Красноярский спелеоклуб), из пещеры Снежная - С. Е. Мазиной

(спелеосекция МГУ). Образцы из пещеры Кузнецовская и пещеры Лисья предоставлены к.б.н. Сидоровым Д.А. (Биолого-почвенный институт РАН, Дальневосточное отделение).

Благодарности. Работа выполнена при частичной поддержке РФФИ (грант 10-08-91157-ГФЕН_а от 2010 г.). Автор выражает искреннюю благодарность д.б.н. C.B. Хижняку за методическое руководство, к.б.н. Сидорову Д.А. за образцы грунта из пещер Лисья и Кузнецовская, П.В. Рудко, В.В. Сухачеву, Н.В. Кинчиной и другим участникам экспедиции "Арабика-2010" за образцы грунта из пещеры Сарма, к.б.н. С.Е. Мазиной за образцы грунта из пещеры Снежная, к.с.-х.н. В.К. Пурлауру за помощь в сборе образцов для выделения фитопатогенных грибов, к.х.н. Романченко A.C. за помощь в проведении атомно-силовой микроскопии.

ГЛАВА 1 ПСИХРОФИЛЬНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ КАК КОМПОНЕНТ БИОСФЕРЫ

1.1 Биологические особенности психрофильных и психротолерантных

микроорганизмов

В зависимости от отношения к той или иной температуре все микроорганизмы делятся на три основные группы: мезофилы, термофилы и психрофилы (Заварзин, Колотилова, 2001; Современная микробиология, 2005; Лысак, 2007; Сахно, Трифонова, 2009; Гусев, Минеева, 2010).

Мезофилы - наиболее распространенная группа микроорганизмов, развивающихся в температурных пределах от +5..+10 до +40..+50°С. Типичным представителем мезофилов является Е. coli, оптимальная температура роста которой +37°С.

К термофильным относят микроорганизмы, которые растут при температуре выше +45..+50 °С.

Микроорганизмы, способные нормально расти при низких (0..+20°С) температурах, называют психрофильными (Заварзин, Колотилова, 2001; Современная микробиология, 2005; Лысак, 2007; Margesin, Neuner, Storey, 2007; Сахно, Трифонова, 2009; Гусев, Минеева, 2010).

Бактерии, способные к росту при 0°С впервые были выделены в 1887 г. Форстером. Термин «психрофилы» был предложен Шмидтом-Нильсеном в 1902 г. для обозначения бактерий, способных относительно быстро расти при температурах, близких к точке замерзания воды (Лях, 1976). Однако этот термин стали применять не только для прокариот, поскольку некоторые представители грибов, водорослей, насекомых, рыб и, по-видимому, некоторые растения могут существовать в условиях низких температур (ниже +5°С) (Намсараев, Абидуева, Лаврентьева и др., 2008).

Среди микроорганизмов, способных к росту при низких температурах, выделяют две физиологические группы — облигатные психрофилы и факультативные психрофилы (иногда называемые психротрофами) (Monta,

1975; Лях, 1976; Квеситадзе, 1990; Заварзин, Колотилова, 2001; Нерусов, Бонч-Осмоловская, Горленко и др., 2004; Ленгелер, Древе, Шлегель, 2005; Ермилова, 2007; Намсараев, Абидуева, Лаврентьева и др., 2008). Они различаются по своим экологическим нишам и механизмам адаптации к холоду.

Облигатно психрофильные микроорганизмы растут при температурах ниже +20°С (оптимум ниже +15°С), вплоть до отрицательных значений температур (Громов, Павленко, 1989; Заварзин, Колотилова, 2001; Нерусов, Бонч-Осмоловская, Горленко и др., 2004; Margesin, Neuner, Storey, 2007; Ермилова, 2007; Намсараев, Абидуева, Лаврентьева и др., 2008; Современная микробиология, 2009). При этом при низких температурах данные микроорганизмы способны осуществлять полный цикл развития. Так, например, в морских осадках обнаружены психрофильные Clostridium, способные образовывать споры при 0°С (Громов, Павленко, 1989). Выделенные из пещер Сибири психрофильные грибы р. Мисог в условиях микрокультуры при +4°С проходят полный цикл развития от споры до споры за 4-5 суток, при +10°С - менее чем за 3 суток (Илиенц, 2011).

Существует много исследований, зафиксировавших рост микроорганизмов при температурах ниже 0°С (Russell, 1990; Margesin, Neuner, Storey, 2007). Около 100 работ цитирует Шмидт-Лоренс (SchmidtLotenz, 1967). Наблюдали рост бактерий, грибов и дрожжей при температурах от -1 до -24°С (Elliott, Michener, 1965; Schmidt-Lotenz, 1967; Носкова, 1972; Лях, 1976). Кочкиной Г.А., Иванушкиной Н.Е., Акимовым В.Н. и др. (2007) показана способность к росту при -2°С Geomycesраппогит из криопэгов и морских отложений Арктики. Обнаружены микробные сообщества в почвах тундры способные к росту при -39°С (Panikov, Flanagan, Oechel et al., 2006). Скорость развития микроорганизмов в переохлажденных растворах может быть достаточно высокой. Так, для Bacillus cryophilus при температуре культивирования -5°С было установлено

время удвоения, равное 6 ч (Нерусов, Бонч-Осмоловская, Горленко и др., 2004).

Важной особенностью «истинных» психрофилов являются их низкие максимальные температуры роста, если сравнить их с температурными максимумами мезофилов. Различные исследователи отмечали исключительную термочувствительность многих морских микроорганизмов, не выдерживающих вполне «умеренных» температур (Лях, 1976). У

психрофильных бактерий Vibrio psychroerythrus (Hagen et al., 1964; D'Aoust,

Kushner, 1972), Bacillus psychroerythrus при повышении температуры нарушалось деление, образовывались нитчатые формы, изменялась структура клеточной стенки и цитоплазматической мембраны, происходила утечка в среду внутриклеточных метаболитов, начинался лизис клеток (Громов, Павленко, 1989). Разнообразные нарушения морфологии клеток с их последующей гибелью при культивировании при температуре +26°С и выше отмечено для психрофильных бактерий и грибов, выделенных из пещер Средней Сибири (Нестеренко, 2007; Хижняк, 2009; Ланкина, 2010; Илиенц, 2011; Ланкина, Хижняк, 2012).

Максимальные температуры роста психрофилов могут быть ниже +15..+20°С. Анализ 488 бактерий, изолированных из антарктических морей, показал, что 37,5% этих организмов не может расти при +15°С, а на 63,5% температура +20°С оказывает летальное действие (Wiebe, Hendricks, 1971). Штаммы Candida, изолированные Лоуренсом (1959), не могли развиваться уже при +21°С и быстро погибали при +30°С. Новозеландская исследовательница (di Mtnna, 1960, 1966) выделила в Антарктиде штаммы Candida scottii, у которых температура +15..+16°С подавляла рост, а для большинства (102 штамма) была максимальной (Лях, 1976). Выделенная из антарктического озера хемоавтотрофная метаногенная бактерия Methanogenium fngidum не способна к росту уже +18..+20°С (Franzmann et al., 1997).

Психроактивные (психротрофные, психротолерантные)

микроорганизмы, также растущие при 0°С, в отличие от психрофилов имеют более высокие оптимальную (+25..+30°С) и максимальную (около +35°С) температуры роста. Они приспособлены к сезонным изменениям климата и имеют селективные преимущества перед стенотермными видами, поскольку активны и в теплое, и в холодное время года (Лях, 1976; Громов, Павленко, 1989; Квеситадзе, 1990; Заварзин, Колотилова, 2001; Нерусов, Бонч-Осмоловская, Горленко и др., 2004; Ермилова, 2007; Намсараев, Абидуева, Лаврентьева и др., 2008).

В ряде случаев невозможно провести чёткую границу между психрофильными, психротрофными (психротолерантными) и мезофильными микроорганизмами. Так, изучение микробных сообществ пещер Средней Сибири (Хижняк и др., 1999, 2001, 2002, 2003; Нестеренко, 2007; КЫгЬпуак а1., 2001, 2003, 2008) показало, что, по отношению к температуре пещерные изоляты можно разделить на три группы.

Первую группу составляют облигатно психрофильные формы, не способные к росту при температуре выше +24..+26°С. Температурный оптимум развития микроорганизмов данной группы лежит в районе +15..+20°С. Это свидетельствует о том, что указанные микроорганизмы являются адаптированными к характерным для сибирских пещер низким температурам представителями автохтонной микробиоты пещер.

Вторую группу выделяемых в пещерах микроорганизмы составляют способные к росту при +4°С мезофильные формы с температурным оптимумом выше +30°С. Очевидно, данные микроорганизмы представляют собой аллохтонную микрофлору, попадающую в пещеры с поверхности. Тем не менее, их способность к росту при +4°С позволяет существовать в пещерах региона в физиологически активном состоянии и размножаться, внося свой вклад в формирование микробных сообществ карстовых полостей.

Кроме того, достаточно большую группу составляют психротолерантные изоляты, по своему отношению к температуре занимающие промежуточное положение между облигатно психрофильными и мезофильными формами. Психротолерантные изоляты различаются между собой по конкретным температурным оптимумам, что позволяет рассматривать их как спектр эволюционно переходных форм от мезофильных к психрофильным (Нестеренко, 2007; Хижняк, 2009).

В связи с отсутствием ярко выраженных границ между психрофильными и психротрофными (психротолерантными) микроорганизмами в современной зарубежной литературе обе эти группы часто объединяют термином "cold adapted" ("адаптированные к холоду").

Главной специфической чертой психрофильных организмов является их способность расти со значительно большими скоростями, чем мезофилы, при температурах ниже +10°С. При этом облигатные психрофилы имеют более высокий темп размножения, чем факультативные (Лях, 1976). Наиболее заметно различие между мезофилами и психрофилами при температурах 0..+10°С, когда несбалансированность метаболизма, вызванная низкими температурами, может полностью подавлять функцию клеточного деления у мезофилов (Ingram, 1965; Jackson, 1974).

Жизнь в низкотемпературных условиях требует широкого спектра адаптаций к таким явлениям, как увеличение вязкости воды и липидов, замедление биохимических реакций, укрепление водородных связей, повышенная растворимость газов, кристаллизация воды при отрицательных температурах (Margesin, Feller, Gerday et al., 2002; Amico, Collins, Marx et al., 2006; Rodrigues, Tiedje, 2008).

Психрофильные микроорганизмы адаптированы к низкой температуре благодаря высокому содержанию в липидах мембран полиненасыщенных жирных кислот, обеспечивающих достаточную текучесть и транспортную активность мембран при низкой температуре (Воробьева, 2004; Ермилова, 2007; Современная микробиология, 2009; Margesin, Feller, Gerday et al., 2002;

Amico, Collins, Marx et. al., 2006; Rodrigues, Tiedje, 2008), а также синтезу криопротекторов (например, глицерола). За счет веществ, препятствующих образования кристаллов льда, микроорганизмы способны переживать замораживание (Воробьева, 2004; Ермилова, 2007; Современная микробиология, 2009). Исследования микробных сообществ Байкала показали, что при воздействии замораживания-оттаивания сохраняется активность и выживаемость микроорганизмов (Максимов, Щетинина, Крайкивская и др., 2006).

Флоровой Г.М., Гумеровой П.А., Романенко JI.A. (2011) проведен липидный анализ десяти штаммов Shewanella, выделенных из образцов морского льда прибрежной зоны Японского моря, обнаружены помимо основных фосфолипидов (фосфатидилэтаноламин, фосфатидилглицерин, дифосфатидилглицерин), неизвестный фосфоаминолипид, который по-видимому, является характерным признаком бактерий данного рода.

Жирнокислотный состав липидов бактерий - это индивидуальное свойство определенных таксонов. Однако существует закономерная связь жирнокислотного состава липидов данной формы с особенностями ее отношения к температуре. Чем выше температура, при которой растет бактерия, тем обычно длиннее цепи входящих в ее липиды жирных кислот и тем меньше содержание ненасыщенных и антеизо-разветвленных кислот. У многих форм функционируют регуляторные механизмы, обеспечивающие увеличение относительного содержания ненасыщенных кислот в липидах при снижении температуры роста — это так называемая гомеовязкостная адаптация. Способностью к гомеовязкостной адаптации обладают как мезофилы, так и психрофилы и психротолеранты, однако при одной и той же температуре содержание ненасыщенных жирных кислот у психрофилов выше, чем у мезофилов (Громов, Павленко, 1989).

Низкие температуры плавления мембранных липидов психрофильных бактерий, несомненно, необходимое, но единственное условие для их развития �

Информация о работе

Овсянкина, Софья Владимировна
кандидата биологических наук
Красноярск, 2013
ВАК 03.02.08

Диссертация

Эколого-биологические характеристики бактерий низкотемпературных пещер Сибири, Дальнего Востока и Западного Кавказа - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы