Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эколого-биохимические взаимодействия бычков-подкаменщиков (Cottoidei) озера Байкал в репродуктивный период

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Эколого-биохимические взаимодействия бычков-подкаменщиков (Cottoidei) озера Байкал в репродуктивный период"

•у ОД На правах рукописи

гтз С

- 9 т/1 1997

- 9 Н!Г ':

Валеева Надежда Иннокентьевна

Эколого-биохимические взаимодействия бычков-подкаменщиков (Cottoidei) озера Байкал в репродуктивный период

03.00.16 - экология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Иркутск 1997

Работа выполнена в лаборатории экологии рыб Научно-исследовательск го института биологии при Иркутском государственном университете.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Кожова О.М.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук , профессор '

Гутник И.Н. кандидат биологических наук, с.н.с. Козлова Т.А.

Ведущее учреждение: Иркутский .'.медицинский государственный универс тет

Защита состоится " и.Юи—Ч-_ 1997 г.

в Л >с часов на заседании диссертационного совета Д.063.32.06 Иркутского государственного университета по адресу 664003, г.Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5, биолого-почвенный факультет ИГУ, ауд. 219.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Иркутского государственного университета.

Автореферат разослан .-¿¿¿^и 1997 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета //Г,« Е.С.Купчинская

Актуальность проблемы. Одной из интенсивно развивающихся в последние годы областей экологии является биохимическая экология, изучающая сложные взаимодействия между организмами, опосредованные химическими веществами, которые ими продуцируются. Нарушение эколого-биохимиче-ских взаимодействий в результате антропогенного пресса может привести к смещению относительного равновесия экосистем и понижению их устойчивости. Поэтому, для рационального использования природных ресурсов необходимы всестороннее изучение и учёт этих взаимодействий.

Одним из таких эколого-биохимических взаимодействий является внутривидовая химическая коммуникация в период размножения, поддерживающая жизнеспособность популяции и обеспечивающая стабильность показателей её воспроизводства. Она осуществляется с помощью половых феромонов, которые обеспечивают распознавание пола, поиск полового партнёра, определение готовности его к размножению и синхронизацию размножения (Соколов и др.,1983).

В последние годы такого типа взаимодействия интенсивно исследуются у животных различных систематических групп.

Наиболее детально изучены половые феромоны у насекомых. Химическая структура половых феромонов млекопитающих установлена лишь у нескольких видов (Соколов,Зинкевич,1986;Новиков,1988).

Половые феромоны рыб наименее изучены. Только в последние десятилетия усилился интерес исследователей к изучению участия феромонов в репродуктивный период (Liley,1982;Stacey, 1983;Van den Hurk, 1983; Голубев 1984;Sorensen, 1986;Дмитриева,Остроумов, 1991 ;Касумян, 1994).Однако предпринятые попытки выделения и идентификации половых феромонов рыб оказались успешными лишь для самцов (Resink, 1987;Кацель и др.,1991).

В настоящее время установлено, что химические сигналы в репродук-гивый период выделяются особями обоего пола, однако репродуктивная феромональная система, под которой мы понимаем половые феромоны, выделяемые и самцом и самкой, не идентифицирована ни для одного вида. Половые феромоны самок "близко" охарактеризованы (методами ЭОГ и РИА) только у двух модельных видов: данио-рерио и золотой рыбки. Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение эко-того-биохимических взаимодействий самка—>самец бычков-подкаменщиков Cottoidei озера Байкал в период размножения.

В связи с этим в работе ставились следующие задачи:

1. Выделить и установить химическую структуру компонентов поло-зой феромональной системы (ПФС) самки бычка-желтокрылки (БЖ) с це-тью расшифровки репродуктивной феромональной системы вида Cottoco-nephorus grevvingki Dyb..

2. Выяснить роль компонентов ПФС самки БЖ в экологии размноже-шя вида.

3. Изучить видоспецифичность ПФС самок бычков-подкаменщиков.

4. Изучить возможность использования половых феромонов для получения гибридов рыб.

В качестве объекта исследования практически важный эндемичный представитель ихтиофауны озера Байкал - бычок-желтокрылка - выбран не случайно. Во-первых, в Байкале обитает три разновременно нерестующих генерации этого вида (мартовская.майская и августовская), что способствовало ускоренному проведению исследований. Во-вторых, нерестовое поведение БЖ детально изучено и дана этолого-физиологическая характеристика его феромональных субстратов (Черняев, 1984;Остроумов, 1987). В-третьих, подробно рассмотрены физиологические аспекты и хемосенсорное обеспечение химической коммуникации БЖ (Клименков,1990;Николаева, 1990;Дмитриева,1991) и, наконец, компоненты ПФС самца БЖ были выделены и идентифицированы в НИИ Биологии при ИГУ (Кацель и др., 1991).

Существование в Байкале хорошо изученных (Талиев,1955;Коряков, 1972;Сиделёва,1993) близкородственных бычков-подкаменщиков создало благоприятную возможность для изучения видоспецифичности ПФС. Научная новизна. Нами проведено комплексное изучение эколого-биохи-мических взаимодействий самка-»самец бычков - подкаменщиков озера Байкал в период размножения с использованием этологических, физиологических, биохимических и физико-химических методов. Впервые выделены половые феромоны самок рыб на примере БЖ. Установлено, что ПФС самки включает два компонента, выполняющих различные функции в репродукции вида. Выяснена роль этих компонентов в эколого-биохимических взаимодействиях самка-»самец в период нереста. Обнаружен и выделен компонент стимулирующий созревание половых продуктов самцов БЖ. Выделен компонент, индуцирующий половое возбуждение и нерестовое поведение у самцов. Установлено химическое строение компонентов ПФС самки БЖ.

Полученные данные позволили расшифровать репродуктивную фе-ромональную систему вида СоиосотерЬогиз дге\ут£1а ОуЬ.. Впервые экспериментально доказано участие половых феромонов в гибридизации рыб и, возможно, в видообразовании. Идентифицирован один компонент ПФС самок близкородственных видов: песчаной широколобки (РагасоПш кеэ-экп ОуЬ.) и каменной широколобки (РагасоИиБ кпеп ОуЬ.). Установлено что видоспецифичность ПФС изученных рыб, возможно, определяется концентрацией тестостерона.

Практическое значение. Разработанная схема выделения и идентификацш и применяемые методические подходы в изучении механизмов функциони рования компонентов ПФС самки БЖ могут быть использованы для иден тификации половых феромональных систем других видов рыб.

Идентифицированный праймер-компонент ПФС самки БЖ может быть использован для стимуляции созревания половых продуктов самцов при искусственном рыборазведении. Идентифицированный релизер-ком-

юнет ПФС самок бычков-подкаменщиков может быть использован для голучения гибридов высокопродуктивных видов в селекционной практике. Разработанная экотехнология получения гибридов рыб может быть примерна как в промышленном, так и в аквариумном рыбоводстве. Нами полу-гено положительное решение о выдаче патента по заявке на изобретение Способ получения гибридов рыб".

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на 1ятой конференции молодых учёных ИГУ (Иркутск, 1987), международной сонференции по экологии Сибири "Сиб-Эко-93" (Иркутск, 1993), второй ме-кдународной Верещагинской байкальской конференции (Иркутск, 1995), международной конференции "Проблемы экологии: Чтения памяти профе-:сора М.М. Кожова" (Иркутск, 1995), международной конференции "Эко-югически чистые технологические процессы в решении проблем окружаю-цей среды" (Иркутск, 1996).

1убликации. По результатам исследований опубликовано 8 работ. Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, 6 г лав литературный обзор, материалы и методы, 4 главы по результатам собст-¡енных исследований), заключения, выводов, списка использованных источников, включающего 130 наименований, в том числе 94 иностранных. Люота изложена на 152 страницах машинописного текста, иллюстрирова-1а 27 рисунками и 24 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Материалы и методы.

Этлов рыб и подготовка их к опытам. В работе использовали три вида бай-<альских бычков-подкаменщиков: бычок желтокрылка- СоиосошерЬогив ^геичг^кл (БуЬ.). песчаная широколобка - Рагасоииэ ке$51еп (БуЬ.), камен-тя широколобка - Рагасоиив кпеп (ВуЬ.).

Рыб отлавливали в местах нерестилищ на юге озера Байкал, в бухте эольшие Коты. После вылова самцов и самок содержали раздельно в 600л эассейнах с проточной байкальской водой.

Сбор феромональных субстратов: Смыв с икры (СИ). Исходным раствором для биотестирования и экстракции служил смыв с текучей икры (V стадия развития гонад), полученный добавлением 100 мл Н2 О воды к 10 г икры. Перед подачей в аквариум исходный раствор разбавляли до концентрации 1x10-*% (об.).

Вода из-под самок (ВС). Для сбора ВС 20 зрелых самок с текучей икрой помещали в Юл ёмкость. Воду аэрировали при помощи компрессора. Через ;утки ВС использовали для биотестирования или экстракции. Экстракция. Экстракцию СИ или ВС проводили порциями по 500мл, добавляя к ним по 150мл растворителя. Для полного извлечения веществ проце-

дуру повторяли трижды. Экстракты упаривали под вакуумом при темпера туре 40" С (эфирный экстракт при 25° С) и сушили в эксикаторе над Р: Оз. Тонкослойную хроматографию (ТСХ) фракций и стероидов проводили н кизельгелевых ("Merk" ФРГ 5x10см) и силикагелевых "Армсорб КСК-Г пластинах (5 х20 см) в системах бензол-хлороформ (1:2) и бензол-ацето: (8:2). Для проявления пластин использовали смесь нас. раствора SbCb СНСЬ и уксусного ангидрида в соотношении 8 : 2. Соединения экстрагирс вали с пластин метанолом.

Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) фракций СИ ВС проводили на отечественном аналитическом жидкостном хроматограф "Милихром" на колонке (62 х2мм) с сорбентом Nucleosil Ci« (5 мкм). Детек цию проводили в УФ - диапазоне при 240, 254 и 280 нм. Спектроскопия сернокислых хромогенов стероидов. К сухим остаткам элк атов, выделенных методом ВЭЖХ фракций (~5 мкг), и стероидов добавля ли 2 мл Нг SÜ4 (осч). Через 2 часа регистрировали спектры абсорбции сер нокислого хромогена против контроля - конц. Н2 SO4 (осч) в диапазоне 22 - 660 нм, на спектрофотометре "Specord".

Масс-спектрометрия. Масс - спектры выделенных фракций и стероидов ре гистрировали на приборе LKB - 2091/PDP - 11/34 прямым вводом образц при ионизирующем напряжении 70 В и температуре 300" - 320° С. Приготовление растворов тестируемых веществ. Исходные растворы други стимулов готовили перемешиванием 0,5 - 1 мг вещества в 100мл диет. вод1 в течение часа. Полученный раствор разбавляли водой до концентрации 1 10-12 М (с учётом разбавления в аквариуме).

Характеристика используемых реактивов. В работе использовали стероид! фирмы "Sigma", смесь изомеров фарнезола фирмы "Fluka" (Швейцария). Биотестирование. Поведенческие эксперименты выполняли на биостанци НИИ Биологии при Иркутском госуниверситете (бухта Большие Коты, ю озера Байкал).

Изучение поведенческих реакций самцов БЖ в период нереста (март май,август) проводили в 40л аквариумах с имитированным "гнездом", пр« дставляющим собой плоский булыжник, приподнятый над дном. В кажды аквариум помещали по одному самцу (V стадия зрелости гонад). Затем дс бавляли 100мл стимула. За развитием поведенческой реакции у рыб следи ли в течение часа. Феромональную активность стимула оценивали по ра: работанной нами шкале, основанной на нерестовом поведении самцо (табл.1).

Эксперименты по стимуляции созревания гонад у самцов проводил также в 40л проточных аквариумах, (0.2 л/мин). Всего было проведено бс лее 850 поведенческих экспериментов, в которых было использовано окол 700 самцов БЖ. Для сбора СИ использовали более 1000 самок. Статистическая обработка результатов. Результаты экспериментов оценк вали с использованием Т - критерия Стьюдента.

Таблица 1.

Шкала для оценки феромональной активности стимулов

_Реакция самцов_Балл

1 .Тестирующие движения (периодическое открывание рта) 1

2. Вентилирующие движения плавниками 2

3. Поза привлечения самки в "гнездо"

(самец напрягает грудные плавники и мелко вибрирует) 3

4. Поза вымета половых продуктов (самец переворачивается

на бок и совершает колебательные движения на боку)_4_

Глава 2. Половые феромоны самок бычка-желтокрылки

Выделение компонентов ПФС самки БЖ. Нами экспериментально было доказано, что в СИ самок БЖ (V стадия зрелости гонад) содержатся компоненты ПФС, которые вызывают демонстрацию элементов нерестового поведения самцов: "позы привлечения самки в "гнездо"и "позы вымета половых продуктов". Мы проводили поэтапное выделение компонентов ПФС самки БЖ. Первый этап включал фракционирование СИ экстракцией растворителями повышающейся полярности. После отделения и упаривания экстрактов, полученные фракции испытывали в поведенческом тесте. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Реакции самцов БЖ на химические стимулы (п=20)

Стимул Поведенческая активность Достоверность _в баллах X + Бх_Р_

Экстракт гомогената

эпишуры (контроль) 1.48 ±0.64 —

Вода из-под самок БЖ 7.12 ± 0.31 > 0.01

Смыв с икры (100° С. 5 мин) 7.12 ± 0.68 > 0.01

Смыв с икры 7.64±0.82 > 0.01

Фракции СИ:

ГГексановая 7.42 ±0.48 > 0.01

2.Эфирная 5.34 ±0.73 > 0.01

3. Хлороформная 4.24 ±0.44 н.з

4.Этилацетатная 2.34 ±0.31 н.з

5.Водный остаток 2.04 + 0.53 н.з

п - количество опытов, Х- среднее значение, Бх - среднее квадратичное от-

клонение. н.з.- незначимая величина.

Из таблицы 2 видно, что компоненты ПФС, содержавшиеся в СИ. присутствуют во фракциях 1 и 2. На кизельгелевых пластинах в системе бе-

нзол-ацетон 8:2 эти фракции разделились на 3 и 9 пятен, соответственно. Фракция 1 была более активной и содержала общие пятна с фракцией 2. поэтому для дальнейшего выделения использовали только фракцию 1. Из таблицы 2 также следует, что компоненты ПФС не являются белками или пептидами, так как термообработка СИ при 100° С (5 мин) практически не изменяла его феромональную активность. Компоненты ПФС не являются глюкуронидами стероидов, т.к. водный остаток не обладал активностью.

Второй этап заключался в разделении фракции 1 методом ТСХ на си-ликагелевых пластинах в системе бензол-ацетон (8:2). Для выяснения поведенческой активности хроматограмму фракции 1 разделили на 7 зон. Полученные фракции испытывали в поведенческом тесте. В качестве контроля использовали чистый силикагель - фракция 1.7. Результаты поведенческого теста приведены в таблице 3.

Таблица 3.

Реакция самцов БЖ на фракции 1.1 - 1.7 (п=20)

Фракция ЯГ Поведенческая активность Достоверность

Х + Бх Р

СИ (контроль) 7.62 ±0.54 ...

Фракция 1.1 0.00 2.04 ±0.74 н.з

Фракция 1.2 0.11 7.12 ± 0.53 <0.01

Фракция 1.3 0.20 4.28 + 0.46 н.з.

Фракция 1.4 0.29 8.04 ±0.34 <0.01

Фракция 1.5 0.35 3.04 ±0.41 н.з

Фракция 1.6 0.47 3.12 ± 0.22 н.з

Фракция 1.7 2.24 + 0.64 н.з

Я!-хромато графическая подвижность.

Из таблицы 3 видно, что активность в поведенческом тесте проявляли фракции 1.2 и 1.4.

Третий этап включал разделение активных фракций 1.2 и 1.4 методом ВЭЖХ. ВЭЖХ - анализ показал, что фракции 1.2 и 1.4 содержат по 4 компонента. Компоненты собирали по пикам, сушили и оценивали их феромональную активность. Данные представлены в таблице 4. Из таблицы 4 видно, что активность в поведенческом тесте проявляли компоненты 1.2.2 у 1.4.4.

Таким образом, удалось выделить 2 компонента ПФС самки БЖ. Воздействия этих компонентов было достаточным, чтобы вызвать у сам цов различные фазы нерестового поведения.

Идентификация компонентов ПФС самки БЖ. ВЭЖХ - анализ в систем! метанол-вода (8:2) в присутствии "свидетелей" показал, что компонент 1.2..' имеет время удерживания 2'52", которое совпадает с таковым для 17а

Таблица 4.

Реакции самцов БЖ на компоненты 1.2.1 - 1.4.4 (п=20).

Фракция Поведенческая активность X + Sx Достоверность Р

СИ (контроль) 7.44 ±0.44

Компонент 1.2.1 4.37 ±0.84 н.з.

Компонент 1.2.2 7.54 ±0.34 < 0.01

Компонент 1.2.3 5.36 ± 1.04 н.з

Компонент 1.2.4 4.82 ±0.76 н.з.

Компонент 1.4.1 5.44 ±0.68 н.з.

Компонент 1.4.2 3.44 ±0.71 н.з.

Компонент 1.4.3 3.12 ± 0.56 н.з

Компонент 1.4.4 8.16 ±0.26 <0.01

гидроксипрогестерона. Компонент 1.4.4 имеет время удерживания 3' 15". совпадающее с таковым для тестостерона.

Для компонентов 1.2.2 и 1.4.4 получены абсорбционные спектры их сернокислых хромогенов, которые являются характеристичными для более 150 стероидов. Абсорбционный спектр сернокислого хромогена компонента 1.2.2 имеет два максимума в области 289 и 431 нм и минимум в области 337нм. Такой спектр характерен для сернокислого хромогена 17а-гидрок-сипрогестерона (Юдаев,1961).

Абсорбционный спектр сернокислого хромогена компонента 1.4.4 имеет небольшой минимум в области 236 нм и максимум в области 298 нм. Наблюдаемый спектр совпадает со спектром поглощения сернокислого хромогена тестостерона (Юдаев,1961).

Для окончательной идентификации компонентов 1.2.2 и 1.4.4 мы использовали масс-спектрометрию. Масс-спектр компонента 1.2.2 включает пик молекулярного иона М+ с т/е 330 и основные пики с т/е 302<1340', 287<:%">. 269 <1179\ 244<>22У>, 229<2I7S\ 176<|:84>, 147(13%>, 124<lft75>, 105"955», 93<22;м>, 91(.м:8).55(зз5!)44(Н)<юо)_ Масс-спектр компонента 1.2.2 по основным пикам идентичен библиотечному масс-спектру 17а-пщроксипрогестерона. имеющего молекулярную массу 330. Масс-спектр компонента 1.4.4 состоит из пика молекулярного иона М+ с т/е 288 и других пиков с т/е 246 <|08:>, 203 (389) ]76 ( 547)_ 147(79»)j 24(:i65)jo5(x:7)i95(io94)i55(i654)i57(i>5)i44(i()ooo)_ Полученный масс-спектр компонента 1.4.4 по основным пикам идентичен масс-спектру тестостерона, имеющего молекулярную массу 288.

Таким образом, использование методов ВЭЖХ, абсорбционной спек гроскопии и масс-спектрометрии позволило идентифицировать феромона-ггьно активные компоненты 1.2.2 и 1.4.4 как 17а-гидроксипрогестерон и тестостерон. соответственно.

Схема выделения и идентификации компонентов ПФС самки БЖ представлена на рисунке 1.

Функциональные свойства компонентов ПФС самки БЖ. Нами установлено, что ПФС самки БЖ включает, по-крайней мере, два компонента, 17а-гидроксипрогестерон (ГП) и тестостерон (Т). Для изучения функционального значения компонентов ПФС самки БЖ, исследовали действие ряд£ стимулов на НП самцов БЖ. Результаты представлены в таблице 5.

Из таблицы 5 видно, что наибольшей поведенческой активносгьк сравнимой с компонентом 1.4.4, обладали Т и ГП. Меньшей поведенческое активностью обладал эстрадиол. Однако мы его не обнаружили в гексанс вой фракции СИ. В таблице 5 также приведены результаты тестировани?

Таблица 5.

Реакция самцов БЖ на химические стимулы (п=20)

Стимул Поведенческая активность Достоверность _Х+Бх_Р_

Компонент 1.4.4 7.96 ±0.64 —

Тестостерон 8.20 ±0.26 <0.01

17а-гидроксипрогестерон 7.40 ±0.52 < 0.01

17а,20р-дигидроксипрогестерон 3.48 ±0.24 н.з

Простагландин Р:,, 3:52 ±0.27 н.з.

Эстрадиол 6.80 ±0.48 < 0.01

Глюкуронид эстрадиола 4.02 ±0.32 н.з.

Андростендион 3.12 ±0.34 н.з.

Этиохоланолон 2.82 ±0.44 н.з.

Смесь фарнезолов 3.46 ±0.55 н.з.

других соединений, предполагаемых в качестве половых феромонов у дру гих видов рыб. Ни один из них не вызывал стереотипные элементы НП у самцов БЖ. Мы также оценили способность компонентов ПФС БЖ вызывать различные фазы НП самцов. На рисунке 2 представлены гистограммы, отражающие поведенческую активность выделенных компонентов. В ответах самцов на ВС и СИ преобладали в большей степени позы вымета половых продуктов, чем позы привлечения самки в "гнездо". ГП вызывал в большей степени позы привлечения самки "в гнездо", тогда как в ответе на Т преобладали позы вымета половых продуктов. На основе способности Т вызывать высшую фазу НП, его можно считать афродизиаком - веществом, вызывающим половое возбуждение парнёров и НП.

Было установлено, что компонент 1.2.2 является праймер-компонен-том ПФС самки БЖ, способным вызывать гипертрофию мочевого пузыря у самцов и появление в нём белого осадка (элементов сперматогенных клеток). Поэтому мы изучили праймерный эффект некоторых стероидов. Результаты представлены в таблице 6.

Из таблицы 6 видно, что самым активным стероидом, проявляющим праймерное действие, является 17а-гидроксипрогестерон. 17а,20Р-Дигид-роксипрогестерон и этиохоланолон, известные как праймерные феромоны у других видов рыб, вызывали слабую стимуляцию созревания самцов БЖ.

Установлено, что максимальная активность праймер-компонента. 17а-гидроксипрогестерона, наблюдается при концентрации 10 - 1013 М.

В итоге проведённого исследования нами расшифрована ПФС самки БЖ и изучено её функционирование (рис. 3).

80

60

40

|

I 20

I

!

3.

23

вода из-под оаиок

СИ Т ГП

| [ Поза привлечения

Поза выквта половых продуктов Рис. 2 Поведенческая реакция самцов на компоненты ПФС самки

Таблица 6.

Стимуляция созревания самцов БЖ некоторыми стероидами (1х10-'2М)

(п=10)

Стимул Объём мочевого пузыря в мл Кол-во самцов с осадком в моче в %

Исходный объём 0.22 ±0.03 20%

Контроль (без стимуляции) 0.24 ±0.04 20%

Фракция 1.2.2 0.46 ± 0.06 80%

17а-гидроксипрогестерон 0.50 ±0.04 90%

Тестостерон 0.32 ±0.02 40%

17а,20р-дигидроксипрогестерон 0.27 ±0.04 30 %

Этиохоланолон 0.25 + 0.03 30 %

Таким образом, впервые для одного вида идентифицирована структура компонентов ПФС как самца, так и самки на примере БЖ, что позволило создать полную картину эколого-биохимических взаимодействий между особями в период размножения, а именно, расшифровать репродуктивную феромональную систему вида СоиосотерЬогш grewingki ОуЬ. (рис.3)

Репродуктивная феромональная система вида СоМосотерЬогиэ grewingki (бычок-желтокрылка) и её функционирование

Половая феромональная система самца ( Кацель и др.. 1991)

сГ

С Из СН,

н5о-с—см-сНг—СНг—А

но-см^сн—с-снг-снг-4н — ¿н, ,

фарнезол (аттрактант)

он

9

• привлечение

овуляция

11Р-гидрокситестостерон (праймер-компонент)

тестостерон (афродизиак) Половая феромональная система самки

СГ сн'

нерестовое поведение

гипертрофия мочевого-пузыря и спермиация

17а-гидроксипрогестерон (праймер-компонент

нерестовое поведение

тестостерон (афродизиак)

Рис.3

Глава 3. Половые феромоны самок некоторых представителей РагасоКиз

Выделение компонентов ПФС самок песчаной (ПШ) и каменной (КШ) шн-роколобок. С целью изучения видоспецифичности ПФС мы провели фракционирование СИ самок ПШ и КШ (рис. 1, 1 этап). Методом поведенческо

го тестирования установили, что наиболее поведенчески активными являлись гексановые фракции (Р > 0.01). Методом ВЭЖХ в системе метанол-во-да(8:2) мы обнаружили в гексановых фракциях СИ ПШ и КШ компонент с временем удерживания 3'15". В этой же области элюировал тестостерон. Хроматографическое разделение гексановых фракций в градиенте ацето-нитрил-вода (30 - 100 %) показало, что в обоих фракциях присутствует компонент с временем удерживания 6'55", которое совпадает с таковым для тестостерона.

о 4 8 12

т-:-"Л-*т-

4 8 12 Ш

0

Рис.4 Разделение гексановых фракций воды из-под самок БЖ (а); КШ (б); ПШ (в) и стероидов (г): 7а-ОНТ (1), 1 ф-ОНТ (2), ПГ (3), Т (4) методом ВЭЖХ. Элюция: 500 мкл метанол-вода (6:4), метанол-вода-ацетонитрил (7:2:1). УФ-детектирование при 240 нм. А=0.8.

Таким образом, разделение гексановых фракций методом ВЭЖХ в двух системах позволило идентифицировать один компонент ПФС самок ПШ и КШ - тестостерон, который вызывал у самцов половое возбуждение и нерестовое поведение, т.е. функционировал, как релизер-компонент и выполнял функции афродизиака.

Мы изучили методом ВЭЖХ гексановую фракцию воды из-под самок БЖ.ПШ и КШ в системе для разделения гидроксилированных производных тестостерона. Хроматограммы показаны на рисунке 4. В воде из-под самок БЖ мы идентифицировали два компонента, которые по времени удерживания отнесли к ГП (7'50") и Т (В'ОО"). Концентрация этих стероидов в ВС БЖ, оценённая по площади пиков, составляла около lxlO sM и lxlO-9 М, соответственно.

На представленных хроматограммах воды из-под самок ПШ иКШ (рис.4) пики в области 8'00" по времени удерживания были отнесены к тестостерону.

Таким образом, у самок трёх видов байкальских бычков-подкаменщиков в феромональных субстратах был обнаружен тестостерон, который вызывал у самцов стереотипные элементы НП. Ранее тестостерон был обнаружен в мочеполовой жидкости самцов БЖ (Кацель и др., 1991) и вызывал элементы НП самок БЖ.

Следовательно, этот стероид является бисексуальным феромоном бычков-подкаменщиков.

Глава 4. Использование половых феромонов для получения гибридов

В данной работе было обнаружено, что тестостерон является компонентом ПФС у трёх видов бычков-подкаменщиков. Нами была выдвинута гипотеза о том, что половые феромоны могут принимать участие в гибридизации видов рыб, а может быть и в видообразовании. Поэтому мы предприняли попытку получить жизнеспособные межвидовые гибридные формы Cottoidei в экспериментальных условиях, используя тестостерон - компонент их половой феромональной системы. В экспериментах мы использовали 4 вида гетероспецифичных пар: самка ПШ и самец БЖ (I). самка ПШ и самец КШ (II), самка КШ и самец ПШ (III), самка КШ и самец БЖ (IV). Все особи гетероспецифичных пар первой группы (I) продемонстрировали НП. В четырёх парах из пяти наблюдали нерест. В контроле без стимуляции Т нерест не наблюдали.

На 28 день инкубации икры появились гибридные личинки первой группы (I). Они имели длину тела 6.0-6.5мм. Большой желточный мешок. Личинки совершали беспорядочные движения, передвигаясь по дну аквариума за счёт хвостового стебля. Тело у них было длинное и прогонистое. Рот хорошо развит. Перикардиальная полость хорошо развита, у личинок

в бинокуляре наблюдали пульсацию сердца и движение лимфы. Глаза ик тенсивно чёрного цвета. Через 10 дней по вылуплении у личинок полнс стью рассосался желточный мешок и личинки стали подниматься к поверх ности воды. У гибридных личинок был большой желточный мешок, как БЖ. Тело длинное и прогонистое, как у ПШ (рис. 5).

Во второй группе (II) гетероспецифичных пар все особи демонстри ровали НП. В трёх парах из пяти наблюдали нерест. В контрольных аква риумах без подачи Т межвидового нереста не наблюдали. Развитие икр! гибридной формы до выклева личинок продолжалось 29 дней.

Выклюнувшиеся личинки имели длину 6.8-7.0 мм, большой желточ ный мешок, выдвинутый кпереди под голову с крупной жировой каплей На желточном мешке хорошо развиты звёздчатые меланофоры. Глаза ик тенсивно чёрного цвета. Перемещались личинки по дну аквариума, совер шая хаотичные движения за счёт хвостового стебля. Перикардиальная пс лость хорошо развита. У личинок видна пульсация сердца. Глаза большие расположены очень близко к ротовой щели. Света личинки не избегали. "! восьмидневной личинки желточный мешок почти рассосался. Личинки пе ремещались в поверхностных слоях. У гибридных личинок тело длинное прогонистое, как у ПШ. Большой желточный мешок, выдвинутый кперед; под голову с большой жировой каплей и хорошо развитые звёздчатые ме ланофоры, как у КШ (рис. 5).

Синтетическое . производное Т - тестостерон-пропионат также вызы вал межвидовой нерест в первых двух группах (I и II).

■ а

Рис.5 Личинки бычков-подкаменщиков: а) песчаная широколобка Paracottus kessleri, б) бычок-желтокрылка Cot tocomephorus grewingki, в) каменная широколобка Paracottus kneri, г) гиб ридная форма Paracottus kessleri х Cottocomephorus grewingki, д) гибридна: форма Paracottus kessleri х Paracottus kneri.

В двух последних группах (III и IV) самцы после подачи стимула на-шнали демонстрировать НП, но .межвидового нереста не наблюдали. Обнаружено, что используемая концентрация Т (1x10 М) для самок КШ бы-ia слишком высокой и оказывала тормозящее действие. Мы считаем, что зидоспецифичность ПФС изученных видов может определяться также кон-дентрацией Т.

Таким образом, в результате проведённых исследований удалось экс-1ериментально подтвердить нашу гипотезу об участии феромонов в гибридизации видов рыб, и, как следствие, мы получили жизнеспособные гибридные личинки между самкой ПШ и самцом БЖ (Paracottus kessleri Dyb. х Cottocomephorus grewingki Dyb.) и между самкой ПШ и самцом КШ (Рага-:ottus kessleri Dyb. х Paracottus kneri Dyb.). В литературе также имеются данные подтверждающие нашу гипотезу. Так, в 1907 году Берг описывает ;воеобразные экземпляры особей рода Paracottus. По общему облику они тождественны типичному Paracottus kessleri Dyb., а по счётным признакам )т него значительно отличаются и близки к Paracottus kneri Dyb..

В своей работе Талиев (1955) сообщает, что в разные годы в различ-дых местах Байкала вылавливали гибридные формы бычков-подкаменщи-сов. Описывая гибридные формы Талиев отводит им главу и условно считает их гибридной формой КШ и ПШ.

По данным Янссена (J.Janssen) частоты звуковых сигнальь самцов "ГШ и КШ в период нереста перекрываются. Однако в контрольных экспериментах без стимуляции Т или тестостерон пропионатом гибридизации не иблюдали, что доказывает доминирующую роль ПФС.

Таким образом эколого-биохимические взаимодействия самка—» са-лец играют очень важную роль в экологии размножения байкальских быч-сов-подкаменщиков. Полученные нами данные расширяют наши знания об жологии размножения рыб, а выделенные компоненты ПФС могут найти драктическое применение в промышленном рыбоводстве и селекционной фактике рыб.

ВЫВОДЫ

1. Разработана схема выделения половых феромонов самок рыб, жлючающая экстракцию, тонкослойную и жидкостную хроматографии.

Впервые выделены и идентифицированы компоненты половой феро-гональной системы самок рыб на примере бычка-желтокрылки. Установ-[ено, что половая феромональная система самки бычка-желтокрылки 1ключает два компонента. Методами масс-спектрометрии и абсорбционной пектроскопии они идентифицированы как 17а- гидроксипрогестерон

и тестостерон. Это позволило расшифровать репродуктивную феромона льную систему вида Cottocomephorus grewingki Dyb..

2. Изучено функционирование половой феромональной системы сам ки бычка-желтокрылки. Показано, что 17а-гидроксипрогестерон являет« праймер-компонентом и вызывает гипертрофию мочевого пузыря и спер миацию у самца. Выявлено, что тестостерон является релизер-компоненто\ и выполняет функции афродизиака, т.е. вызывает половое возбуждение * нерестовое поведение у самцов.

3. Идентифицирован один компонент половой феромональной сис темы самок песчаной и каменной широколобок. Установлено, что он такж( является тестостероном, функционирует как релизер-компонент и выполня ет функции афродизиака.

4. Впервые показано, что тестостерон является бисексуальным феро моном бычков-подкаменщиков (Cottoidei).

5. Впервые экспериментально доказано, что половые феромоны участвуют в гибридизации рыб и, возможно, в видообразовании. С использова нием тестостерона, компонента половой феромональной системы само! бычков-подкаменщиков, получены жизнеспособные межвидовые гибриды:

а) самка песчаной широколобки х самец бычка-желтокрылки Paracottus kessleri Dyb. х Cottocomephorus grewingki Dyb.

б) самка песчаной широколобки х самец каменной широколобки Paracottus kessleri Dyb. х Paracottus kneri Dyb.

6. Видоспецифичность половых феромональных систем бычков подкаменщиков может быть обусловлена концентрацией тестостерона.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Валеев P.E., Валеева Н.И., Остроумов В.А. Изучение половых фе ромонов самки желтокрылого бычка // Тез. докл. пятой конф. мол.учёных, Иркутск, 1987.-ч. 2.-С. 106.

2. ВалеевР.Б., Дмитриева Т.М., Остроумов В.А., Кацель П.Л., Валее ва Н.И. Эколого-биохимические взаимодействия между самцом и самкоЁ бычка-желтокрылки в период размножения // Тез.докл. межд.конф. по эко логии Сибири "СИБЭКО-93", Иркутск, 1993. - ч.1. - С. 80 -81.

3. Валеева Н.И. О феромонально-индуцированной гибридизации бы чка-желтокрылки и песчаной широколобки // Актуальные проблемы био логии: Тез.докл.конф.,посвящ. 75-ле-тию ИГУ, Иркутск, 1994. - С.38.

4. Валеева Н.И., Дмитриева Т.М. Изучение феромонально-активно! фракции смыва с икры самки бычка-желтокрылки // Актуальные пробле мы биологии: Тез.докл. конф., посвящ.75-летию ИГУ, Иркутск, 1994. - С 39.

5. Валеева Н.И. Химические сигналы самок бычков-подкаменщиков в репродуктивный период // Проблемы экологии: Материалы межд. конф., Новосибирск: Наука. Т.2. - 1995. - С. 143 - 144.

6. Валеева Н.И. Использование полового феромона для получения гибридов байкальских бычков-подкаменщиков // Вторая межд. Верещагинская байкальская конф., Иркутск, 1995. - С.32.

7. Валеева Н.И. Новая экотехнология для селекционной практики рыб // Мат. межд. конф." Экотехнология", Иркутск, 1996. - С.13.

8. Способ получения гибридов рыб // Валеева Н.И., Валеев Р.Б., Дмитриева Т.М. Положительное решение о выдаче патента от 26 июля 1996 г. по заявке N 93028928/13/029655/ от 08.06.93г.