Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Эколого-биохимическая характеристика микроорганизмов, участвующих в круговороте азота в щелочных гидротермах Прибайкалья
ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Эколого-биохимическая характеристика микроорганизмов, участвующих в круговороте азота в щелочных гидротермах Прибайкалья"

На правах рукописи

ШАГЖИНА АЙВИ ПЕТРОВНА

ЭКОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ, УЧАСТВУЮЩИХ В КРУГОВОРОТЕ АЗОТА В ЩЕЛОЧНЫХ ГИДРОТЕРМАХ ПРИБАЙКАЛЬЯ

03 00 1 б - экология 03 00 07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Улан-Удэ 2007

003058109

Работа выполнена в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Баир Бадмабазарович Намсараев

Научный консультант:

доктор биологических наук Яков Ефимович Дунаевский

Официальные доктор биологических наук, профессор

оппоненты: Александр Иванович Саралов

кандидат биологических наук, доцент Любовь Батомункуевна Буянтуева

Ведущее учреждение. Лимнологический институт СО РАН

Защита диссертации состоится «16» мая 2007 г В 900 часов на заседании диссертационного совета Д 212 022 03 в Бурятском государственном университете по адресу 670000, г. Улан-Удэ ул Смолина, 24а, конференц-зал Факс (3012)211593, e-mail d21202203@mail ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Бурятского государственного университета

Автореферат разослан « 13 » апреля 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук / >/ Шорноева Н А

/У'-.Г"'"

Актуальность темы: Азот является одним из важнейших биофильных элементов, во многом определяющим характер и направление микробиологических процессов в различных экосистемах Избыток или недостаток азотсодержащих соединений отражается на общей продуктивности водоемов В настоящее время накоплен большой материал, освещающий круговорот азота в таких водных экосистемах как моря, океаны и озера (Кузнецов и др, 1989, Goering, Parker, 1972, Birch, Spindakis, 1981, Knowles, 1982, Kuenen et al, 1988, Zehr et al, 1998, Саралов, 1991, Zumpf, 1992, Koops, 2001, Lis, 2006 и т д )

В гораздо меньшей степени изучены особенности цикла азота в экосистемах, характеризуемых как экстремальные В пределах Байкальской рифтовой зоны широко распространены слабоминерализованные источники, газирующие азотом с высокими значениями температуры (до 75°С) и pH (до 10) В щелочных термальных источниках проведено много исследований, посвященных азотфиксирующим циано бактериям В то же время роль алкалотермофильных азотфиксирующих, нитрифицирующих и денитрифицирующих бактерий в биогеохимическом цикле азота изучена недостаточно

Цель исследования - изучение бактериальных процессов цикла азота в гидротермах Прибайкалья, выделение и описание алкалотермофильных бактерий, участвующих в этих процессах В задачи исследования входило:

1 Изучение физико-химических параметров исследуемых щелочных термальных источников Прибайкалья

2 Исследование сезонной динамики азотсодержащих соединений в илах

3 Определение интенсивности бактериальных процессов цикла азота

4 Изучение внеклеточной протеолитической активности в нативных образцах

5 Определение численности азотфиксирующих, аммонифицирующих, нитрифицирующих, денитрифицирующих бактерий по сезонам

6 Выделение чистых культур бактерий цикла азота и изучение их физиолого-биохимических свойств и определение функциональной активности

Научная новизна работы: Впервые проведена комплексная оценка интенсивности микробного цикла азота в щелочных гидротермах Впервые изучено пространственно-временное распространение бактерий, участвующих в процессах трансформации азота в щелочных термальных источниках Прибайкалья Определено вертикальное распределение бактерий круговорота азота, содержание органических веществ и внеклеточная протеолитическая активность микроорганизмов в илах гидротерм Выделены накопительные и чистые культуры азотфиксаторов, аммонификаторов, нитрификаторов и денитрификаторов, способные

расти в щелочных условиях среды (рН 8,0-9,0) при высоких температурах (>45°С) Описана алкалотермофильная нитритокисляющая Мигояргга яр с оптимумом роста при температуре 48°С и рН 8,7 Практическая значимость: Количественная оценка функциональной активности микроорганизмов круговорота азота может быть использована для определения экологического состояния водных экосистем Выделенные культуры представляют интерес для биотехнологии как активные продуценты протеаз, устойчивых к высоким значениям температуры и рН Материалы, представленные в диссертации, могут быть использованы при чтении курса лекций по предмету "Микробиология", "Биохимия", "Экология"

Апробация работы Резутьтаты работы были представлены на научно-практической конференции «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование» (Иркутск, 2004), 8-ой Путинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2004), Южносибирской научной конференции студентов и молодых ученых «Экология Южной Сибири» (Хакасия, 2004, 2005), Международной конференции "Экосистемы Монголии и приграничных регионов сопредельных стран природные ресурсы, биоразнообразие и экологические перспективы', Улан-Батор (Монголия) 2005, V межрегионаи ной научной конференции молодых ученых «Научный и инновационный потенциал Байкальского региона», (Улан-Удэ, 2006), Мотодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» ИНМИ (Москва, 2005, 2006), Всероссийской конференции с международным участием «Биоразнообразие экосистем Внутренней Азии» (Улан-Удэ, 2006) Публикации По теме диссертации, включая тезисы, опубликовано 14 работ

Объем работы Диссертация включает 9 глав и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов исследования и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложения Работа изложена наХ^страницах машинописного текста, содержит^¿таблицы и иллюстрирована^рисунками и фотографиями

Благодарности Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д б н , проф Б Б Намсараеву, к б н Т Г Банзаракцаевой и сотрудникам Лаборатории микробиологии ИОЭБ СО РАН, к б н ЕВ Лебедевой и сотрудникам Лаборатории хемолитотрофных микроорганизмов ИНМИ РАН, д б н Я Е Дунаевскому, д б н , проф А Л Степанову

Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ 05-04-97215р_байкал_а, Президиума РАН «Происхождение и эволюция биосферы», МО РФ № РНП 2 1 1 НОЦ «Байкал», Президиума СО РАН №24

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1 1 Объекты исследования

Объектами явились 10 термальных щелочных гидротерм Байкальского региона Горячинск, Алла, Гарга, Кучигер, Уро, Сея, Умхей, Котечьниковский, Змеиный, Хакусы В газовом составе воды источников содержится до 98-99% молекулярного азота (Борисенко, Замана, 1978)

Объектами более детального рассмотрения процессов круговорота азота явились гидротермы Алла, Кучигер и Горячинск Источник Алла и Кучигер находятся в Баргузинской долине (Северное Прибайкалье) Источник Горячинск расположен на юго-восточном побережье озера Байкал, где станция Г1 - излив источника, единственное место, которое характеризуется обильными обрастаниями циано-бактериальных матов Далее по ручыо, до станции ГЗ сохраняются физико-химические параметры источника, после начинается постепенное снижение температуры, pH и изменение других химических показателей Станция Г4 -проточный пруд Станция Г5 расположена в месте смешения естественной воды источника со сточными водами прошедшими очистную обработку Далее ручей протекает через залесенную местность и втекает в озеро Байкал - станция Г-6 1 2 Методы исследования Гидрохимический анализ воды был выполнен по общепринятым методикам Температуру измеряли сенсорным электротермометром Prima (Португалия), pH определяли потенциометрически при помощи портативного рН-метра (рНер2, Португалия) Для определения окислительно-восстановительного потенциала использовали портативный измеритель redox-потенциала ORP (Португалия) Минерализацию воды определяли при помощи портативного тестер-кондуктометра TDS-4 (Сингапур)

Кислород в воде источника определяли методом Винклера (Резников и др, 1970) Концентрацию сульфида определяли колориметрически с пара-фенилендиамином на полевом спектрофотометре ПФЭК-П-2 (Truper, Schlegel, 1964) Содержания карбонатов и гидрокарбонатов определяли титрованием (Резников и др , 1970) Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорд (Dawson et al, 1986), содержание органического вещества - по методу Тюрина в модификации Никитина (Аринушкина, 1970) Концентрацию общего азота определяли по Къельдалю и минеральных форм азота - колориметрически (Аринушкина, 1970)

Пробы грунтов, микробных матов и растительных остатков для микробиологического исследования отбирали в стерильную посуду Общую численность микроорганизмов в илах определяли путем подсчета бактерий на мембранных ультрафильтрах (Романенко, Кузнецов, 1974) с диаметром пор 0,23 мкм (фирма Сынпор)

Численность азотфиксирующих, аммонифицирующих, денитрифицирующих и нитрифицирующих бактерий в образцах ила определяли путем посева на элективные питательные среды с учетом температуры и pH in situ методом десятикратных разведений Значения pH среды доводили карбонатно-гидрокарбонатным буфером Биохимические свойства бактерий, удельную скорость роста, численность бактерий определяли общепринятыми методами (Методы , 1984) Молекулярно-генетические анализы выделенных штаммов проводили на коммерческих условиях Транслированные аминокислотные

последоватетьности сравнивали 'С последовательностями из Gen Bank, используя программы NCBI BLAST (http//vvwvv nebí nlm nih gov/Blast)

Определение внеклеточной протеазной активности в экстрактах природных образцов на основе фосфатного буфера (рН 7) и в культуральной жидкости проводили по методу Эрлангрра с соавт (Erlanger et al, 1961), используя 5 мМ синтетические субстраты М-бензоил-Ь-аргинил-п-нитроанилид (БАПА), карбобензокси-аланил-аланил-лейцил-п-нитроанилид (КААЛП), пироглутамил-аланил-аланит-лейцил-п-нитроанилдд (ГААЛП) а также с помощью тринитрофенилирования, испочьзуя 1%-ный белковый субстрат желатин (рН 8) Инкубировали в течение 1, 12 и 24 часов при температуре 37°С, с последующим спектрофотометрическим определением активности при 410 нм За единицу ферментативной активности принимали количество фермента в исследуемом образце, которое расщепляет 1 нмоль продукта в указанных условиях инкубации за 1 минуту Для выяснения природы функциональных групп активного центра штаммов к раствору фермента добавляли раствор соответствующего ингибитора, инкубировали 40 минут при температуре 37°С, затем добавляли раствор субстрата и определяли активность, как указано выше В работе использовались ингибиторы металлопротеаз- эгилендиаминтетраацетат Na (ЭДТА), циетеиновых протеаз -иодацетамид (ИАА) и сериновых протеаз - фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ) Для опредетения оптимума рН активности исследуемых протеиназ по отношению к синтетическим с>бстратам были использованы цитрат-фосфатные, фосфатные гидрокарбонатные буферы (Dawson et al, 1986) в диапазоне рН 2-11 Температурный оптимум ферментов определяли, измеряя их активность после 5-минутной инкубации при температурах от 20-80°С

Скорости деструкции бетка и целлюлозы были измерены аппликационным методом (Мишустин, Пегрова, 1987)

Интенсивности процессов дыхания, азотфиксации, нитрификации и денитрификации измерены газохрамотографически (Методы , 2002) Анализ газов (С2Н4, N20 и С02) проводите на газовых хроматографах Chrom-41 и М-3700/4 (Россия) Общее время инкубации составляло 1-2 часа при определении эмиссии С02, и 12-48 часов при определении эмиссии N20 Определение активности денитрификации и азотфиксации проводили в присутствии ацетилена, который вводили во внутренний объем изолятора (10% от объема камеры) Потенциальную (субстрат-индуцированную) активность дыхания и фиксации молекулярного азота, интенсивность эмиссии закиси азота определяли после обогащения образцов донных осадков соответствующими субстратами (Методы ,1991)

Опредечение интенсивности бактериальных процессов и химических показателей в образцах плов проводили в нескольких повторностях Статистическая обработка данных выполнена стандартными методами по Плохинскому H А (1969), Ашмарину И П , Воробьеву А А (1962)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.1 Физико-химическая характеристика исследуемых термальных источников Прибайкалья

Для исследования были отобраны пробы воды, илов, микробных матов и растительных остатков из гидротерм Горячинск, Алла, Гарга, Кучигер, Уро, Сея, Умхей, Котельниковский, Змеиный, Хакусы Температура воды

на выходах термальных источников варьировала в широких пределах (45,5 - 7б,2°С) Наиболее высокотемпературными были источники Уро (69,9°С), Котельниковский (71,0 °С), Гарга (72,5 °С), Алла (76,2 °С) Воды имели щелочную реакцию, значение рН варьировало от 7,6 до 9,9 Температура и рН в термальных водах снижалась по мере удаления от излива

Максимальные концентрации сероводорода были зафиксированы в источниках Кучигер (23 мг/л) и Умхей (33 мг/л) В гидротермах отмечены низкие значения окислительно-восстановительного потенциала (до +103 Мв) Концентрация сероводорода по ручью уменьшалась, концентрация кислорода и значения ЕЬ увеличивались

Содержание гидрокарбонатов в воде исследуемых проб варьировало от 66,0 до 167,7 мг/л Для источников характерна низкая минерализация, которая была в пределах от 0,15 до 0,6 мг/л

Источник Кучигер, расположенный в болотистой местности, содержал до 19,2% органического углерода Наименьшее количество органического углерода 0,3 - 0,4% определено в источнике Алла, выходы которого приурочены к каменистой местности Количество белка в исследуемых пробах составляло от 0,36 (ист Алла) до 0,83 мг/мл (ист Гарга) В целом концентрация органического вещества в матах и растительных остатках была выше, чем в илах

Общее количество азота в илах источников варьировало от 0,09 до 2,77 % Максимальное количество аммонийного азота равное 2,34 мг/100г определено в источнике Кучигер, минимальное - 0,51 мг/100г в источнике Горячинск Содержание нитритного и нитратного азота в некоторых пробах илов было ниже предела чувствительности прибора Максимальные концентрации нитритного и нитратного азота были определены в источнике Кучигер и достигали 1,3 мг/100г

2 2 Сезонные изменения условий среды в источнике Горячинск Максимальная температура воды (51,5 °С) источника на изливе (ст Г1) зафиксирована зимой В летнее время температура снижается до 47 — 48,5 °С Вниз по ручью наблюдается постепенное уменьшение температуры воды Летом температура воды на станциях Г5 и Г6 составляет 25 и 18,7 °С, соответственно Значения температуры воды на станциях Г4, Г5 и Г6 следовали изменениям температуры воздуха Максимальное значение рН равное 9,0 отмечено на станции Г1 и в течение года ее величина держится приблизительно на одном уровне Далее по течению отмечено постепенное понижение величины рН до 7,2 и 6,7 (ст Г6)

Концентрация кислорода в термальном источнике Горячинск увеличивается по ручью и в среднем составляет 1,1 - 4,2 мг/л В летний период времени на изливе источника отмечено увеличение содержания растворенного кислорода в воде Максимальное содержание сероводорода в источнике отмечено осенью на станции ГЗ в количестве

■ — - концет-рэция кислсрада •-концентрация серсеэдорсяа

1,22-1,33 мг/л {рис,]). По концентрации гидрокарбонатов и карбонатов в источнике было отмечено, что а точках максимума гидрокарбонатов наблюдается минимум карбонатов и наоборот. В течение

года максимальное количество карбонатов было обнаружено в конце зимы, максимальное количество гидр о карбонатов - летом.

Определение динамики

подвижных форм азота в плах выявило разное их содержание по сезонам (рис. 2). Максимальное содержание аммонийного азота в ил ах источника Горячинск было определено летом, минимальное - весной, В то же время весной отмечено увеличение нитратного азота почти вдвое по сравнению с осенними показателями. Наименьшее количество нитритного азота было определено летом.

а)

стаицииП гз Г4 Г6 ГВ

Fiftff.í .Концентрации О? u Нj.S'по источнике Горяч-имт:*

Рис. 2. Сезонная динамика подвижных форм азота. а) аммонийный, б) нитратный, вj нитратный в итх источника Горячинск.

Время отбора проб: III - 6 марта, V ^25 мая, VIII - 27 августа, XI - 2 ноября

Соотношение Сорг,Жпбщ в илах варьировало в пределах от 8 до И в течение года. На станциях ГЦ Г4, Гб соотношение С0рг./Ы0бЩ с октября по май держалось на одном уровне в пределах 10-12, и только в летнее время отмечено небольшое снижение на фоне повышенного содержания в источнике аммонийного азота.

Концентрации кислорода, карбонатов, гидрокарбонатов, подвижных форм азота в источнике подвержены внутригодовой динамике. При этом основные факторы среды, такие как температура, рН и минерализация, остаются относительно постоянными.

3.1. Численность функциональных групп бактерий круговорота

азота в гидротермах Бурятии Но всех исследуемых пробах была определена численность азотфиксаторов, аммонификаторов (протеолитиков), тарификаторов и денитрификаторрв. Ключевую роль в биологическом круговороте азота

играют микроорганизмы, фиксирующие молекулярный азот

Численность азотфиксирукнцих бактерий колебалась от 2,0 *102 до 5,5*107кл/мл Максимальная численность азотфиксаторов наблюдалась в пробах источников Горячинск, Алла, Котельниковский Многократный анализ показал, что при количестве аммония до 1,0 мг/100г ила корреляции содержания аммония с численностью азотфиксаторов не обнаружено, а при повышенном содержании аммония (>1,0 мг/100г) наблюдается обратная зависимость (гср — -0,71) Поэтому невысокая численность азотфиксаторов в источниках Кучигер и Сея, вероятнее всего, связана с повышенным содержанием аммония В то же время именно в этих источниках была определена наиболее высокая численность бактерий, участвующих в минерализации белков - аммонификаторов. Численность аммонифицирующих бактерий в изученных гидротермах составляет от 1,3x103 до 7,0x108 кл/мл и коррелирует с содержанием аммония (гср = 0,65) Наибольшее количество аммонификаторов было выявлено в матах и растительных остатках Количество нитрификаторов I и II фазы в илах источников Горячинск, Алла и Гарга достигало аммонийокисляющих бактерий - 1,3 х10б кл/мл, нитритокисляющих бактерий - 4,7х105 кл/мл Обнаружены корреляции численностей нитрификаторов I и II фазы с содержанием аммония (гср = 0,43) и нитратов (гсР = 0,64), соответственно Наибольшее количество бактерий -денитрификаторов (6,3x105 кл/мл) наблюдалось в илах источников Кучигер, Сея и Змеиный Минимальное количество (1,7х Ю1 кл/мл) было зафиксировано в пробах источников Алла и Горячинск Следует отметить, что была установлена линейная зависимость между численностью денитрификаторов с нитратами (гср = 0,63), с нитритами (гср= 0,51) и аммонием (гср= 0,49) Корреляционной связи численности бактерий цикла азота с температурой, рН и минерализацией в исследуемых источниках не установлено

В источнике Горячинск было изучено вертикальное распределение бактерий по глубине грунта На станции Г4 максимальная численность бактерий цикла азота определена в поверхностном слое ила (до 2 см) и в придонной воде На стациях Г1 и Г6 максимальное количество азотфиксаторов и денитрификаторов находится в слое 2-5 см, аммонификаторов - в слое 2-10 см Нитрифицирующие бактерии были обнаружены только на поверхности (до 2 см), в слое 2-5 см их численность не превышала 0,5x101 кл/мл На глубине 20-30 см выявлено значительное уменьшение численности азотфиксаторов, аммонификаторов и денитрификаторов Отмечена прямая зависимость (гср = 0,87) между количеством белоксодержащих соединений с численностью аммонификаторов, характерная для всех изученных слоев ила

3.2. Сезонная численность бактерий в источнике Горячинск

Наименьшая общая численность микроорганизмов (ОЧМ) отмечена в ноябре - 1,3'ж10<' кл /мл, наибольшая - и мае (8,1 х Ю8 кл /мл). Наибольшее количество азотфиксаторов 4,3х Ю" кл /мл обнаружено в феврале, наименьшее (1!3*10~ кл /мл) - й августе, что определяется количеством аммонийного азота в илах. Максимальная численность аммонификаторов была отмечена весной, минимальная - летом и осенью. Численность деиитрификаторов варьировала от 6,0 х 101 до 4,7 х 105 кл/мл, нитрификаторов от 3,0* 10 до 1,3* 10й кл/мл (рис. 3). Повышение количества бактерий в феврале, происходит из-за накопления за зимний период легкоусвояемых источников углерода и энергии.

Уменьшение количества

азотфиксаторов летом и осенью определяется увеличением

аммонийного азота в этот период. Летнее снижение концентрации нитратов и нитритов в илах при низком содержании

нитритокисляющих и

денитрифицирующих бактерий обусловлено использованием

легкоуейояемых форм азота цианобактериалы!ым сообществом, активно развивающимся в это время. Изменение структуры микробного сообщества в гидротерме связано с сезонными колебаниями физико-химических параметров среды и содержанием минеральных форм азота, которые накапливаются за счет поступления из прибрежной зоны и функционирования биоты.

Детальное изучение зависимости физико-химических условий и численности бактерий в источнике Горячинск позволило установить, что численности азотфиксаторов (г^" - 0,36), аэробных а м м они фи каторо в (Гср-- 0,44) и нитрификаторов (гср= - 0,61) отрицательно коррелируют с концентрацией сероводорода. Корреляция содержания сероводорода с чиеленноетЯми де нитрификаторов и анаэробных аммонификаторов отсутствует. Содержание кислорода положительно коррелирует с численностью нитрификаторов (гср= 0,73), отрицательно - с численностью деиитрификаторов (гс? - 0,34); с численностью азотфиксаторов и аммонификаторов корреляции не обнаружено.

Таким образом, в источниках основными факторами, влияющими на численность бактерий круговорота азота, являются: содержание минеральных форм азота, качественный и количественный состав органических веществ, содержание сероводорода и кислорода в придонной воде.

месяц ш V УШ XI

р Азотфикслторы □ Аммокнфикаторь; О Р1цтркфг<|сэг01>ы 1 фазы а Нитрнфнкаторы II фазь

Э Дкнитрнфикяторы □ ОЧМ

Рис. 3. С х' зон/шя динамика числе) тост и групп бактерии л4 и:шх источника Горячинск

4.1. Эмиссия С02 в илах источников Прибайкалья

Значения динамики дыхания варьировали в пределах от 0,07 мкг С-С02/ г в час до 0.96 мкг С-СО/г в час. Максимальные значения наблюдались в местах с повышенным содержанием органических веществ. Высокие значения биологической активности илов выявлены в источнике Кучигер, величина скорости эмиссии СО, составила 0,96 мкг С-С02/г ч и 0,73 мкг С-С02/ г ч соответственно (рис.4). Высокая эмиссия диоксида углерода подтверждается высокими величинами скорости минерализации илов в источнике Кучигер, скорость деструкции белоксодержаших соединений достигала 2,43% в сутки, целлюлозы - 1,2 % в сутки. Самый низкий показатель дыхания обнаружен в пробах источника Алла (Ал 9/4) и Горячинск. Корреляция интенсивности дыхания илов с содержанием С01,г в илах источников составило г:р- 0,82.

Исследование динамики дыхания за период осень - весна в илах источника Горячинск показало, что величина потока диоксида углерода изменялась от 0.073 до 0,281 мкг С-СОг/г ч в ноябре и от 0,276 до 0,629 мкг С-С02.'г ч в марте. Показатели потенциальной интенсивности дыхания в исследованных образцах ила на 1-2 порядка выше актуальных.

Т"С: 32 32 43 34 Я 23 25 1Й |>н : 9.9 9,6 9,9 9,9 9,0 8.5 7,6 5.1 6.7

0.6

1

04

п

2 О.З

* 0.0

Ап Ал АГ| На К1 Г-1 Г-3 ГЛ Г-5 Г-Я аз ей ач й20 ш

У'нс. -1 Азотфиксщия # гидротер^шх Л л :<1

'('. ¿Н.'СР и Горячинск.

4.2. Денитрифицирующая и а ]Ш фиксирующая активность в илах источников Прибайкалья

Значения азотфиксируюшей активности и минеральных источниках варьировали от 0,002 нг Ы2/г ч до 0,499 нг №,/г ч (рис.4). Относительно высокие значения выявлены в гидротерме Горячинск (Г-4, Г-6). Здссь азотфиксация была равна 0,499 нг М2/г ч и 0,447 нг Ы^/г ч. Наиболее низкие значения были установлены в илах источников Алла (Ал 9/3) и Кучигер (Ки 8-20).

Оценка процесса

денитрификации в илах

минеральных источников показала, что активность была в пределах 0,024 -0,661 нг ^О/г ч. Максимальное выделение закиси азота выявлено в термальном источнике Алла на станции Ал 9/4 (0,661 мкг Ы30/ г ч). Наиболее низкие показатели денитрифицирующей активности установлены в илах термального источника Горячинск. Активность денитрификации в этом источнике не превышала 0,035 нг 1Ч20/ г ч (рис.5).

: о.о: : 0.00

Ал Ал Ал ((и Кц Г * Г-3 I : Г-6 4-г а-З 9(4 8-20

/' . • с % Денитрификация е гидромермих •яКучигер и Горячинск. Примечание- значения -температуры и рН осенью и весной на станциях источников см. на оно. 4.

Сезонная динамика процессов азотфиксации, нитрификации и денитрификации в ил ах

ТС рн

0.6 2 0.6 "г* 0.4 ? 0.2 ■ г о

станции п

весна: Т °С 31.5 рН 9.1

44,1 8,5

М

7.4

II,6,? 7.; 6,7

осечь

«м

43.3

8,5

\гг

7,4

1'ис.б. Сезонная динамика

а$атфиксирук»цеи активности а илах

источника Горячинск. Результаты межсезонных исследований процесса азотфиксации в ил ах показали увеличение нитрогеназной активности весной до 0,584 нг Ы2/г ч (рис. 6). Значения скорости азотфиксации коррелируют с сезонной динамикой численности азотфиксирующих

бактерий. Весной численность диазотрофов достигала максимума - 10 млн кл/мл. На станциях, где были определены максимальные величины азотфиксирующей активности, величина соотношения С/Ы варьировала в пределах 10-12, что является благоприятным условием для процесса азотфиксации. Эти результаты согласуются с данными исследований в других биотопах (Саралов и др., 1982, Новиков и др., 2004). Таким образом, наиболее важными регулирующими факторами активности азотфиксации в различных экосистемах является обеспеченность усвояемым азотом и качественный состав органического вещества.

Изучение нитрифицирующей активности бактерий в илах выявило ее низкую скорость, которая варьировала в пределах от 0,3 до 1,5 нг !Ч037 г в сутки - осенью и 1,1-2,4 нг Ы037 г в сутки - весной (рис, 7), Численность нитрифицирующих бактерий по ручью составила: осенью от весной -

увеличилась на порядок.

Определение активности

денитрификации в разные сезоны, также как и активности процесса нитрификации, не выявило существенных межсезонных различий (рис. 8). В осенних образцах илов активность денитрификации была ниже предела чувствительности прибора. Отсутствие

денитрифицирующей активности микроорганизмов в илах источника Горячинск, объясняется низкой нитрифицирующей активностью и, как следствие, низким содержанием нитратов. Незначительное увеличение скорости денитрификации в

0.15

; о.ю * о.оо

станции Г1

Л

ГЗ

Г4

Г5 ГБ

}'ис. 7 . С.аюшшя динамика ншприфицирущей активности а илах ист. Горяч ичск но ручыо. Примечая не значения температуры и рН осенью н весной на станциях см . на рис, 6,

источника 1,7*103 до 5,0*104кл./мл,

а осень о весна

.. й] г

7_ 0,3

— 02

0 1 0.1

1 о - - сз станции ГТ ГЗ Г4

Рис. Н, Смзиииоя динамика ¡^нитрифицирующей активности к шах 11С1Г1 Горлчинск ПрИМ£Ч№И£ : .11С : .1Ч температур!.' и рН осенью и веской на

Стаиниях СМ. [1ИС. б.

Г5 ге

весенних образцах илов коррелирует с численностью денитрификаторов Денитрифицирующей активности бактерий в весенний период способствуют более благоприятные физико-химические условия источника, в частности, увеличение нитратов почти в 2 раза и снижение содержания растворенного кислорода в воде

Потенциальная активность процессов азотфиксации и денитрификации в образцах ила после обогащения глюкозой увеличилась в 3-20 раз В этих условиях наибольшая активность азотфиксации (0,23 мкг N2 /г ч) и денитрификации (0,39 мкг N20/r ч) была зафиксирована при температуре 51,5 °С и значении рН 9,0 (ст Г1), хотя актуальная азотфиксирующая активность бактерий в илах на станции Г 1 была низкой Вероятно, это связано с активной нитрогеназной деятельностью цианобактерий (Anabaena variabilis, Calotrix termahs, Gloeocapsa punctata, Gl minnta), обнаруженных на той же станции, и подавление ими бактериальной азотфиксируюшей активности

На станции Г 3 выявлена низкая активность процессов цикла азота Это связано с токсичным воздействием сероводорода (1,33 мг/мл) и, как следствие, ингибированием процессов

Таким образом, в щелочной гидротерме Горячинск нитрогеназная активность может проявляться в широком диапазоне температур от 22 до 51°С и значениях рН от 7,6 до 9,0 Основными факторами, определяющими интенсивность биологических процессов круговорота азота в исследуемой гидротерме, являются наличие органического вещества, минеральных форм азота, концентрация сероводорода и кислородный режим

5 Внеклеточная протеолитическая активность в нативных образцах термальных источников Прибайкалья

Образцы микробных матов, растительных остатков и илов были отобраны из точек отбора в гидротермах, которые характеризовались различными значениями температур 18,7 - 69,0°С (табл 1) Содержание белка в образцах варьировало от 0,42 до 0,83мг/мл

Таблица 1 Типы проб, места отбора и температура

Источник № Точки отбора и температура отбора (°С)

1 2 3 \ 5 6

Гор-к 1 ч м - 49 0 in - 49 0 ил-45 0 ил - 22 7 ил - 25 0 ил - 18 7

Котел ь-П 2 м м - 65 1 м и - 48 0 ил - 48 0 ит-45,5 ит-39 0 ит -32 0

Сухая 3 м м - 43,5 ич - 43,5 - - - -

Змеиный 4 м м - 45 5 ил - 45 5 - - - -

Хак\сы 5 м ч - 460 in - 46 0 - - - -

Гарп 6 м м - 66 4 ро -57,4 ил - 49 8 ил - 42,0 м м - 42,0 ил - 33 5

Сея 7 ип-498 ч м - 46 5 ил - 46,5 м ч - 34,0 ил-31,4 ил-31,0

Уро 8 ч м - 69 0 ил - 64,0 м ч - 52 1 м м - 44 2 ил - 44,2 ит-33 8

А.па 9 ч м - 65 2 ил - 60 0 мм -49 0 ил - 49,0 р о - 24,0 р о - 23,5

Кучигер 10 ил - 47 2 ч ч - 45,9 р о - 43,0 м м -41,0 ил-41 0

Учхен □ ¡Т I ро.-45:1 ! м м - 41." [ ил-4!,7 | ия-39ХГ

1

Рис.9 Протеолитическая активность по БАПА

8

Гор-к .- Горячннск, Котсль-й - Котельниковский. м.м - микробный мат; р.о. - растительные остатки, «-я - пробы не отобраны

Скорость бак териального разложения белоксодержащих соединений р исследуемых источниках составила от 1,25 до 2,43%, максимальные скорости деструкции отмечены в источниках Кучигер (2,43%) и Умхей (2,14%).

Максимальная внеклеточная протеолитическая активность по субстрату БАПА (рис. 9) зафиксирована в ил ах источника Котельниковский (1.65 - 2,29 ед.) и циано-бактериальных матах источника Гарта (1,93 - 2,27 ед.). Для источника Алла характерно увеличение продукции три не иноподобньЩ протсаз при повышении температуры. Максимальная активность (1,43 ед.) отмечена при температуре 65,2°С. В образцах источников Змеиный, Хакусы, Кучигер и Умхей значения протеазной активности по КАПА составили от 0,48 до 1,07 ед. Образцы источников Сея, Горячинск, Уро характеризовались низкими

значениями активности. Исключение составляли микробные магы, где активность была в 6-7 раз выше, чем в илах. Относительно постоянные физико-химические условия, качественный и количественный состав органических веществ в шгано-бакгериальных матах способствует активному развитию в них различных бактерий - деструкторов.

Максимальные значения

протеазной активности по субстрату КАЛЛП (рис. 10) в источниках Уро, Гарга, Сея и Змеиный были выявлены в образцах микробных матов. Активность образцов ниано-бактериальных матов превышает активность илов в 3 - 5 раз. В источниках Сея и Змеиный активность по данному субстрату проявилась - 1,46 ед. (точка 2) и 1,31 (точка 1),

Рис. ю Прдтеолитуческая активность

Рис. 11 Протеолитическая активность по ГААЛП

только в микрооных магах соответственно. Источники Хакусы, Алла и Умхей характеризовались

Рис 12 Протеолимическая активность

пп жепятину

средними значениями активности - от 0,19 до 0,9 ед, Наименьшей активностью по субстрату КЛЛЛП обладли образцы из источников Котельниковский (0.07 - 0,19), Горячинск (0,154 - 0,29) и Кучигер (0,15 -0,30).

Наибольшие активности по ГААЛГ1 (рис, 11) обнаружены в циано-бактериальных матах источников Сея (2,36 ед.) и Алла (2,18 ед.). Также высокую активность по этому субстрату проявляют термальные источники Гарга (0,20 - 1,56 ед.) и Горячинск (0,14 - 0,75 ед.). В источнике Горячинск субтнлизиноподобная активность возрастает с повышением температуры. Протеазная активность по субстрату ГААЛП исследуемых образцов из источников Котельниковский, Змеиный, Хакусы, Уро, Кучигер и Умхей либо отсутствовала, либо характеризовалась низкими значениями.

Наиболее высокая общая внеклеточная протеолитическая

| ™ й активность (рис. 12), определенная

1 ™ Д.« методом тр инитро фен е лирования,

ю-гМ^^ тШЛ*Я1у выявлена в источнике Кучигер - от

4,54 до 9,09 ед. в илах и 30,30 - 35,15 ед, в циано - бактериальных матах. Активное разложение желатина было отмечено в образцах источников Умхей (4,55 - 27,42 ед.) и Уро (7,15 - 26,03 ед.). Пробы из источника Алла характеризовались незначительной активностью по желатину (1,30 - 6,06 ед.).

Исследованные по слоям илы показали высокую ферментативную активность (рис. 13). На станции Г6 на глубине 25-30см, при минимальном количестве бактерий также наблюдалась

высокая протеазная активность. Результаты данных исследований показывают, что в деструкции белоксодержащих соединений в исследуемых илах в основном участвуют сериновые нротеазы субтилизинОподобного типа. Определение корреляции в илах показало прямую зависимость протеолитической активности от содержания органических веществ г(1,= 0,91.

Полученные результат позволяют заключить, что микробное сообщество щелочных термальных источников обладает широким

станция Г 6

стаи+вд ГА

а-»™

• &ЛГА1КААГПОГААЛП ОМепяп»

Рис. 13, Вертикальное распределение протеолитической активности е илах ист, Горячинск.

спектром внеклеточных протеаз и характеризуется высокой

вариабельностью в распределении протеазной активности по субстратам Выявлено, что на протеазную активность оказывают существенное влияние тип субстрата, физико-химические условия источников и их специфическое микробное сообщество Наибольшие значения протеазной активности в нативных образцах характерны для микробных матов Проведенные исследования показали высокую степень участия внеклеточных ферментатов в деструкции органического вещества в термальных источниках

6 Микроорганизмы цикла азота щелочных термальных источников

Прибайкалья

Азотфиксирующие бактерии. Для оценки нитрогеназной активности бактерий было отобрано 8 наиболее активно растущих изолята штаммы АТ2 и АТЗ с диапазоном роста от 30 до 55°С (оптимум 45-50°С) и pH от 6,5 до 10,0 (оптимум pH 8,7-9,2) и 6 штаммов (AI, А2, A3, A4, А5, А6) с ростом в пределах от 15 до 40°С (оптимумы 25 - 35°С) и pH от 5,0 до 9,2 (оптимумы 7,1 - 8,2) Полученные изоляты используют широкий ряд Сахаров По морфо-биохимическим признакам азотфиксирующие изоляты были отнесены к представителям родов Pseudomonas, Bacillus, Clostridium

Интенсивность фиксации молекулярного азота выделенных штаммов составляла от 0,017 до 1,81 нм N2/107iui ч (рис 14) Максимальное количество фиксированного азота было зарегистрировано у штаммов А5 (1,81 нм 1Ч2/107кл ч) и АТ2 (1,26 нм 1Ч2/107кл ч) По морфо-биохимическим признакам штамм А5 (источник Алла) был отнесен к представителю рода Clostridium

Штамм АТ2, выделенный из щелочного термального источника Горячинск (Г 1), при росте на твердой среде образует колонии 0,2-1,5 мм в диаметре, белого цвета Клетки — грамположительные, спорообразующие, подвижные прямые палочки 0,3-0,5х 1,1-2,5 мкм Факультативный анаэроб При анаэробном росте сбраживает глюкозу, рамнозу, ксилозу и дульцит Умеренный термотолерантный алкалофил Рост в пределах SO-SS1^ с оптимумом 45 °С и в области pH 6,5-10 с оптимумом pH 8,7 На основании данных частичного секвенирования генов 16S рРНК исследуемый штамм АТ2 показал сходство 99,5% с Anoxybacillus pushchinoensis (рис 16)

Денитрифицирующие бактерии. В накопительных культурах полученных на среде Гильтая при различных значениях температуры и pH, в основном присутствовали палочки и только при инкубации культур при 50 °С и pH 9,0 - 9,3 в среде были обнаружены еще очень мелкие

оУ0

Рас ¡4 Иитро^еназиая at птыюсть гитаммоа

клетки - предположительно археи, которых не удалось выделить в отдельную культуру. Рост денитрификаторов регистрировался с активным образованием газов.

Для дальнейших исследований были отобраны штаммы DM и DAT. Изолят DAT выделенный из источника Алла, был отнесен к умеренным алкалотермофилам. Культура развивается в пределах 30 - 55°С с оптимумом 45иС и в области рН 6.0 - 9,2 с оптимумом 9,0. Штамм DM (Горячинск, станция Г4) показал активный рост в пределах от 15 до 4 О "С с оптимумом 25°С и при рН среды от 6,0 до 8,2 с оптимумом 7,5.

Штаммы обладали высокой

денитрифицирующей активностью: DAT -2,28 нм N-N20 ПО1 кл ч и DM - 1,68 нм N-N30 /10 кл ч (рис. 15). Выделенные штаммы денитрификаторов были проверены на способность фиксировать молекулярный азот. Незначительная нитрогеназная активность равная 0,03 нм Ni/IOkji ч была обнаружена у термотолерантного ал кал оф ильного штамма DAT (рис.16). Грам положите льны й, спорообрачующий штамм DAT, представленный палочками 0,3-0.8 х 1,5-3,5 мкм, из широкого ряда используемых им углеводов активнее развивается на манните. Результаты Анализа сиквенса 16S рРНК (500 пар нуклеотидов) показали, что штамм принадлежит к роду Bacillus. Коэффициент сходства составил 99,7% с Я. licheniformis (рис. 16)

I

и

[- Anoxybacilhis sp (АМ402982) 78 I АпохуЬасШщpushckiHoerisi? (АВ234214) М.'at 2

яя ' Anoxybacilhis bogroviensis (AM409I84) 'M.i и I

son DAI

Bacillus licheniformis (AU275356)

Escherichia coli

(

I

Рис. 16. Филогенетическое дерево бацилл, показывающее положение штаммов AT 2, ПАТ. П I в системе порядка термофильных Bacillus. В качестве «внешней группы» использована нуклеотидная последовательность гена I6S рРНК Я coli.

Аммонифицирующие бактерии. Из накопительных культур было выделено 4 штамма (ПI, П2, ПЗ, Г14) с пор о образующих аэробных гетеротрофных бактерий. Клетки имели форму крупных прямых палочек. На твердых средах образовывали колонии - от 1 до 4 мм желтого или

_

■ ■

D М О At

Put 15. Денитрифицирующая ак-тимтапь штамион DM it ПЛТ

бежевого цвета Все штаммы являются термофилами с диапазоном роста 35 - 70°С с оптимумами 45-65°С и рН 6,0 - 10,2 с оптимумами 8,0-8,5

Проведенные исследования показали, что все культуры обладают высокой внеклеточной протеолитической активностью По субстрату БАПА максимальная активность через 12 часов инкубирования проб, равная 1,71 ед/мг, обнаружена в культуре ПЗ На субстрате КААЛП активность практически отсутствовала, кроме культуры П1 (1,32 ед/мг) Максимальная активность на субстрате ГААЛП для субтилизиноподобных протеаз была зафиксирована в культуре П2, равная 3,76 ед/мг Все выделенные культуры показали высокую активность по желатину от 2,46 до 2,61 ед/мг Внеклеточная протеолитическая активность 24-часовых культур была в 2-3 раза выше 12-часовых

Штамм П1 показал самый высокий оптимум температуры (60°С), рН (8,5) и явился активным продуцентом внеклеточных протеаз На основании данных неполного секвенирования генов 16Б рРНК штамм П 1 имеет сходство 99,3% с представителями рода бацилл АпохуЪасйкт ршИсЫпоетм и ЛпохуЬааНих Ьо^гохчети (рис 16)

Анализ субстратной специфичности и ингибиторный анализ показали, что фермент секретируемый штаммом П 1 активен по отношению к нитроанилидным субстратам трипсиноподобных протеаз Фермент имеет оптимум рН 10,5 и стабилен в интервале рН от 6 до 11 (рис 17 а) Температурный оптимум протеазы около 65°С (рис 176)

г 3 I

I 21

I 1 ____....

< о - ♦ - * рН

а) О 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 5)

Рис 17 Динамика активности внеклеточной сериновой протеазы, секретируемой штаммом П1 а) при различных значениях рН б) при различных значениях температуры

Штамм П 1 является активным продуцентом внеклеточных щелочных протеолитических ферментов, относящихся к классу сериновых протеаз, которые активно секретируются при высоких температурах, что позволяет отнести их к алкалотермофильному виду

Аммонийокисляющие и нитритокисляющие бактерии (I фаза нитрификации) Первоначально, амонийокисляющие

алкалотермофильные бактерии, выросшие при температуре 48 °С и рН 8,5, показали активный рост, но при дальнейших пересевах культура была утеряна В ходе эксперимента отмечалось сильное подкисление среды Максимальная скорость окисления аммония накопительной культурой определенна на 5 сутки в количестве 70,84 мМ ЫН4+/сутки На 6 сутки следов аммония в среде не обнаружено В накопительной культуре присутствовало 2 разных вида бактерий, активно окисляющих аммоний

Электронное микроекопирование бактерий не позволило определить их принадлежность к какому-либо роду известных на сегодняшний день аммонийокисляющпх бактерий,

(II фат нитрификации) Накопительная культура

алкалотермофильных нитритокисляющих бактерий показала стабильный рост в лабораторных условиях. Результат жизнедеятельности нитритокисляющих бактерий не оказывал влияния на значение рН в среде, он был постоянен И составлял в ходе всего эксперимента 8,5. Динамика

роста накопительной культуры при различных значениях рН обозначилась в области от 6,5 до 9,8, В накопительной культуре присутствовало, по крайней мере, 2 вида нитритокисляющих бактерий с Йптимумамй рН 7,1 и 9,1. Определение динамики роста при различных значениях температур, выявил рост культуры пределах от 36 до 60 "С. Максимальное окисление нитритов было определено на 3-й сутки при температуре 48 "С (0,92 мМ М027сутки) и при температуре 53 °С (0.61 мМ Ы02"/сутки).

Описан изоляг, активно окисляющий нитриты с образованием нитратов при алкал отерм офильных условиях среды. Температурный диапазон роста культуры отмечен от 36 до 55ПС с оптимумом 48иС. Максимальная скорость потребления нитритов при 48°С отмечена на 3 суткп в количестве 37,85 мМ N0/. При определении оптимума рН было установлено, что культура окисляет нитриты в диапазоне рН среды от 6 до 9,7 с оптимумом 8,7. Максимальная скорость окисления была отмечена на 3 сутки в количестве 0,41 мМ N0/ (рис.18). На 4 сутки следов Нитритов в среде не обнаружено Присутствие нитратов в среде проверяли качественной реакцией. Микроекопирование тотальных клеток и ультратонких срезов нитритокисляющею штамма показало, что выделенная грамположительная культура является представителем рода щ/Иго$р1Щ (рис. ! 9). Из полученных данных мы заключили, что выделенная

' Количество о*и с пен ноге МС£ при разныхТ, С

——+--Количеств□ окисленного ЫСЕ |трн разных рН

6.0 6,5 7,1 7.5 8.1 6.7 а,1 8.3 Э.8

Рис 18 \itrospira ¡р. Скоромь Окисления нитритов наЗ -и сутки при различных значениях температуры и рй,

0 У

0,25мжя пп Рис. 19. Ультраструктура ,\'Иго.чр1га хр пи -увеличенное периплазм этическое пространство, В ПС - внеклеточная полимерная субстанций

культура Nitrospira sp относится' к новому алкалотермофильному виду хемолитотрофных нитритокисляющих бактерий

ВЫВОДЫ

1 В исследованных щелочных гидротермах Прибайкалья азотфиксаторов, аммонификаторов, тарификаторов и денитрификаторов составляет от 1,7 xlO1 до 7,0х 10s кл/мл Основным регулирующим фактором сезонного изменения численности бактерий круговорота азота является содержание минеральных форм азота, качественный и количественный состав органического вещества, а также содержание сероводорода и кислорода в воде и илах

2 Значительные скорости азотфиксации в илах источника Горячинск, равные 0,16 и 0,58 нг N2 /г ч, определены весной при температурах 50,5 и 12,2°С, pH 9,0 и 7,4, соответственно В илах источника Горячинск отмечены низкие скорости нитрификации и денитрификации, активность которых незначительно возрастает весной Эмиссия С02 в илах источника определяется содержанием органического вещества, коэффициент корреляции составляет Гср= 0,82

3 Высокая протеолитическая активность в нативных образцах и культурах свидетельствует о высокой скорости деструкции органического вещества при значительном участии аммонификаторов, независимо от температуры и pH

4 Среди выделенных чистых культур бактерий азотфиксаторов, аммонификаторов и денитрификаторов доминировали представители родов Bacillus, способные развиваться при 30 - 70°С и pH 6-10 Азотфиксирующие изоляты обладали высокой нитрогеназной активностью - от 0,226 до 2,461 нм N2/107 кл ч Активность денитрификаторов достигала 2,89 нм N- N20 /107 кл ч Внеклеточная протеолитическая активность аммонификаторов составляла 1,54 - 3,76 ед /мг

5 Выделены и описаны алкалотермофильные бактерии цикла азота денитрифицирующий штамм DAT (1,34 нм N- N20 /107 кл ч) близкородственный к В licheniformis, обладающий также и нитрогеназной активностью 0,226 N2/107 кл ч, аммонифицирующий штамм П1 представитель рода Anoxybacillus - активный продуцент внеклеточных сериновых протеаз трипсиноподобного типа с оптимумом активности фермента при 65°С и pH 10,5, нитритокисляющий штамм Nitrospira sp, с максимальной скоростью окисления нитритов при 48 °С и pH 8,7

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1 Шагжина А П Внеклеточная протеазная активность в щеточных гидротермах Баргузинской долины/ А П Шагжина Е В Лаврентьева Б Б Базаржапов// Биология - наука XXI века 8-я Путинская школа - конференция молодых ученых -Пущино 2004 - С 164

2 Шагжина А П Протеазная активность в источнике Гарга (Бурятия)/ А П Шагжина, Е В Лавреньтьева, Б Б Базаржапов// Международная научно-практическая конференция в НГУ сборник тезисов - Новосибирск, 2004 - С 84

3 Шагжина АП Протеазная активность в минеральном источнике Кучигер (Северо-Восточное Прибайкалье)'Е В Лаврентьева АП Шагжина// Экотогия Южной Сибири Южносибирская научная конференция студентов и моподых ученых - Абакан, 2004 - С 125

4 Шагжина А П Протеазная активность в щелочных гидротермах Прибайкалья/ А П Шагжина, Е В Лавреньтьева, Б Б Базаржапов// Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование материалы Межрегиональной научно-практической конференции — Иркутск, 2004 - С 185

5 Шагжина А П Ферментативная активность микроскопических грибов в щелочных гидротермах Северною Прибайкатья/ ЕВ Лавреньтьева, Б Б Базаржапов, АП Шагжина, Б Б Намсараев// Биология микроорганизмов и их на>чно-практическое использование материалы Межрегионатьной научно-практической конференции — Иркутск, 2004 - С 154-156

6 Шагжина А П Внеклеточная протеазная активность в щелочных гидротермах Баргузинской дотины/А П Шагжина, Е И Лаврентьева Б Б Базаржапов, Б Б Намсараев// Вестник БГУ Серия 1 Биология Вып 8 - Улан-Удэ, 2005 - С 42-50

7 Шагжина АП Разнообразие микроорганизмов круговорота азота в гидротермах Монголии и Забайкалья/ А П Шагжина, Т Г Банзаракцаева // Ecosystems of Mongolia and frontier areas of ad|acent countnes natural resources biodiversity and ecological prospect International eonfeience - Ulaanbaatar, 2005 -P 124-126

8 Шагжина А П Разнообразие азотфиксаторов термального источника Горячинск (Бурятия)/ А П Шагжина, Д Д БалдановаУ/ Актуальные аспекты современной микробиологии Молодежная школа-конферепция ИНМИ - М, 2005 - С 66

9 Шагжина А П Биохимическая активность источника Уро/ А П Шагжина, L И Лаврентьева// Научный и инновационный потенциал Байкальскою региона V межрегиональная научная конференция молодых ученых - Улан-Удэ, 2005 -С 64

10 Шагжина А П Протеазная активность микроскопических грибов в щелочных гидротермах Северного Прибайкалья/ Е В Лаврентьева А П Шагжина, Б Б Намсараев// Вестник БГУ Серия 1 Биология Вып 9 - Улан-Удэ 2006 - С 97-103

11 Шагжина А П Микробиологические исстсдовапия бактерий участвующих в круговороте азота/Д М Прохоров, А П Шагжина//Экология Южной Сибири Южносибирская научная конференция студентов и молодых ученых -Абакан, 2005 - С 118

12 Шагжина АП Процессы азотфиксации и денитрификации в щелочном термальном источнике Горячинск/ Т Г Банзаракцаева, А П Шагжина, А Л Степанов, Д Д Бархутова// Вестник БГУ Серия 2 Биология Вып 9 - Улан-Удэ, 2006 -С 57-62

13 Шагжина АП Процессы азотфиксации и денитрификации в щеточном источнике Горячинск/ Т Г Банзаракцаева, А П Шагжина, А JI Степанов// Биоразнообразие экосистем Внутренней Азии тезисы Всероссийской конференции с международным участием Т 1 - Улан-Удэ, 2006 - С 25

14 Шагжина АП Биологическая активность в щелочном гидротерме Горячинск (восточное побережье озера Байкал)/ А П Шагжина, Г Г Банзаракцаева// Актуальные аспекты современной микробиологии Молодежная школа-конференция ИНМИ - М , 2006 - С 34

Подписано в печать 11 04 2007 г Формат 60x841/16 Тираж 100 экз Уел печ л 1 28 Заказ № 2056 Издатетьство Бурятского государственного университета 670000 г Улан-Удэ, ул Смолина, 24 а

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шагжина, Айви Петровна

введение. обзор литературы

Глава 1. Шел очные термальные источники.

1.1. Азотные термы.

1.2. Азотные щелочные гидротермы Байкальской рифтовой зоны.

Глава 2. Микробное сообщество щелочных термальных источников.

Глава 3. Влияние абиотических факторов на микроорганизмы, функционирующие в щелочных термальных источниках.

3.1. Адаптация и причины устойчивости микроорганизмов к высоким температурам.

3.2. Адаптация и причины устойчивости микроорганизмов к экстремальным значениям рН.

Глава 4. Биологический круговорот азота в экосистемах.

4. 1. Азотфиксирующие микроорганизмы.

4. 2. Аммонифицирующие микроорганизмы.

4. 3. Нитрифицирующие микроорганизмы.

4. 3.1. Аммонийокисляющие бактерии.

4.3.2. Нитритокисляющие бактерии.

4. 4. Денитрифицирующие микроорганизмы. экспериментальная часть

Глава 5. Объекты и методы исследования.

5.1. Объекты исследования.

5.2. Методы полевых исследований.

5.3. Методы лабораторных исследований.

5.3.1. Методы культивирования и изучения роста бактерий в зависимости от физико-химических факторов.

5.3.2. Методы идентификации бактерий.

5.4. Методы определения скорости микробных процессов.

5.4.1. Метод определения денитрифицирующей и азотфиксирующей активностей чистых культур бактерий.

5.5. Методы определения протеолитической активности. результаты исследования и их обсуждение

Глава 6. Физико-химическая и микробиологическая характеристика источников.

6.1. Физико-химическая характеристика исследуемых термальных источников Прибайкалья.

6.1.2. Физико-химическая характеристика источника Горячинск по сезонам.

6.2. Численность функциональных групп бактерий круговорота азота в гидротермах Бурятии.

6. 2. 1. Общее микробное число и численность функциональных групп бактерий круговорота азота в источнике Горячинск по сезонам.

Глава 7. Скорости процессов цикла азота в донных осадках источников

Прибайкалья.

7.1. Биологическая активность микроорганизмов в донных осадках термальных источников Прибайкалья.

7.2. Азотфиксирующая активность микроорганизмов в донных осадках термальных источников Прибайкалья

7.3. Денитрифицирующая активность микроорганизмов в донных осадках термальных источников Прибайкалья.

7.4. Протеолитическая активность в нативных образцах термальных источников Прибайкалья.

Глава 8. Сезонная динамика процессов цикла азота в донных осадках источника Горячинск.

8.1. Сезонная динамика эмиссии СОг.

8.2. Сезонная динамика скорости азотфиксации.

8.3. Сезонная динамика скорости нитрификации.

8.4. Сезонная динамика скорости денитрификации.

Глава 9. Бактерии участвующие в круговороте азота в щелочных гидротермах

Прибайкалья.

9.1. Азотфиксирующие бактерии.

9.2. Денитрифицирующие бактерии.

9.3. Аммонифицирующие бактерии.

9.4. Аммонийокисляющие и нитритокисляющие бактерии.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Эколого-биохимическая характеристика микроорганизмов, участвующих в круговороте азота в щелочных гидротермах Прибайкалья"

Актуальность темы. Азот является одним из важнейших биофильных элементов, во многом определяющий характер и направление микробиологических процессов в различных экосистемах. Избыток или недостаток азотсодержащих соединений отражается на общей продуктивности водоемов. В настоящее время накоплен большой материал, освещающий круговорот азота в таких водных экосистемах как моря, океаны и озера (Кузнецов и др., 1985; Goering, Parker, 1972; Birch, Spiridakis, 1981; Knowles, 1982; Kuenen, Robertson, 1988; Zehr et al., 1998; Саралов, 1991;Zumpf, 1992; Koops, 2001; Lis, 2006).

В гораздо меньшей степени изучены особенности цикла азота в экосистемах, характеризуемых как экстремальные. В пределах Байкальской рифтовой зоны широко распространены слабоминерализованные источники, газирующие азотом с высокими значениями температуры (до 75°С) и рН (до 10). В щелочных термальных источниках проведено много исследований, посвященных азотфиксирующим цианобактериям. В то же время роль алкалотермофильных азотфиксирующих, нитрифицирующих и денитрифицирующих бактерий в биогеохимическом цикле азота изучена недостаточно.

Цель исследования - изучение бактериальных процессов цикла азота в гидротермах Прибайкалья, выделение и описание алкалотермофильных бактерий, участвующих в этих процессах. Задачи исследования:

1. Изучение физико-химических параметров исследуемых щелочных термальных источников Прибайкалья.

2. Исследование сезонной динамики азотсодержащих соединений в илах.

3. Определение интенсивности бактериальных процессов цикла азота.

4. Изучение внеклеточной протеолитической активности в нативных образцах.

5. Определение численности азотфиксирующих, аммонифицирующих, нитрифицирующих, денитрифицирующих бактерий по сезонам.

6. Выделение чистых культур бактерий цикла азота и изучение их физиолого-биохимических свойств и определение функциональной активности.

Научная новизна работы. Впервые проведена комплексная оценка интенсивности микробного цикла азота в щелочных гидротермах. Впервые изучено пространственно-временное распространение бактерий, участвующих в процессах трансформации азота в щелочных термальных источниках Прибайкалья. Определено вертикальное распределение бактерий круговорота азота, содержание органических веществ и внеклеточная протеолитическая активность микроорганизмов в илах гидротерм. Выделены накопительные и чистые культуры азотфиксаторов, аммонификаторов, нитрификаторов и денитрификаторов, способные расти в щелочных условиях среды (рН 8,0-9,0) при высоких температурах (>45°С). Описана алкалотермофильная нитритокисляющая Nitrospira sp. с оптимумом роста при температуре 48°С и рН 8,7.

Практическая значимость. Количественная оценка функциональной активности микроорганизмов круговорота азота может быть использована для определения экологического состояния водных экосистем. Выделенные культуры представляют интерес для биотехнологии как активные продуценты протеаз, устойчивых к высоким значениям температуры и рН. Материалы, представленные в диссертации, могут быть использованы при чтении курса лекций по предмету "Микробиология", "Биохимия", "Экология".

Защищаемые положения. • Распространение бактерий, участвующих в цикле азота в щелочных термальных источниках Байкальского региона определяется химическим составом воды, содержанием органического вещества и минеральных форм азота. В то же время такие факторы, как высокие температура и рН, не оказывают ингибирующего влияния на жизнедеятельность бактерий.

• Наибольшие значения протеазной активности в нативных образцах характерны для микробных матов и растительных остатков.

• В илах и микробных матах щелочных термальных источников среди культивируемых азотфиксирующих, аммонифицирующих, денитрифицирующих бактерий доминируют представители рода Bacillus. Среди нитрификаторов I и II фазы - представители родов Nitrosomonas и Nitrospira.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на научно-практической конференции «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование» (Иркутск, 2004); 8-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2004); Южносибирской научной конференции студентов и молодых ученых «Экология Южной Сибири» (Хакасия, 2004, 2005); Международной конференции "Экосистемы Монголии и приграничных регионов сопредельных стран: природные ресурсы, биоразнообразие и экологические перспективы", Улан-Батор (Монголия) 2005; V межрегиональной научной конференции молодых ученых «Научный и инновационный потенциал Байкальского региона», (Улан-Удэ, 2006); Молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» ИНМИ (Москва, 2005, 2006); Всероссийской конференции с международным участием «Биоразнообразие экосистем Внутренней Азии» (Улан-Удэ, 2006).

Публикации. По теме диссертации, включая тезисы, опубликовано 14 работ.

Объем работы. Диссертация включает 9 глав и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов исследования и их обсуждения, выводов, списка литературы (80отечественных и 111 зарубежных источников) и приложения. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 22 таблицы и иллюстрирована 29 рисунками и фотографиями.

Заключение Диссертация по теме "Экология", Шагжина, Айви Петровна

выводы

1. В исследованных щелочных гидротермах Прибайкалья численность азотфиксаторов, аммонификаторов, нитрификаторов и денитрификаторов

1 8 составляет от 1,7 х10 до 7,0x10 кл/мл. Основным регулирующим фактором сезонного изменения численности бактерий круговорота азота является содержание минеральных форм азота, качественный и количественный состав органического вещества, а также содержание сероводорода и кислорода в воде и илах.

2. Значительные скорости азотфиксации в илах источника Горячинск, равные 0,16 и 0,58 нг N2 /г ч, определены весной при температурах 50,5 и 12,2°С, рН 9,0 и 7,4, соответственно. В илах источника Горячинск отмечены низкие скорости нитрификации и денитрификации, активность которых незначительно возрастает весной. Эмиссия С02 в илах источника определяется содержанием органического вещества, коэффициент корреляции составляет гср= 0,82.

3. Во всех исследованных гидротермах с различными значениями температуры и рН среды показана высокая протеолитическая активность нативных образцов и выделенных культур аммонификаторов, которая свидетельствует об активном участии микробного сообщества в деструкции белоксодержащих соединений.

4. Среди выделенных чистых культур бактерий азотфиксаторов, аммонификаторов и денитрификаторов доминировали представители родов Bacillus, способные развиваться при 30 - 70°С и рН 6-10. Азотфиксирующие изоляты обладали высокой нитрогеназной активностью - от 0,226 до 2,461 нг N2/107 кл ч. Активность денитрификаторов достигала 2,89 нг N-N20 /107 кл ч. Внеклеточная протеолитическая активность аммонификаторов составляла 1,54 - 3,76 ед./мг.

5. Выделены и описаны алкалотермофильные бактерии цикла азота: денитрифицирующий штамм DAT (1,34 нг N-N20/107 кл ч) близкородственный к В. licheniformis, обладающий также и нитрогеназной активностью 0,226 нг N2/IO7 кл ч; аммонифицирующий штамм П1 представитель рода Anoxybacillus - активный продуцент внеклеточных сериновых протеаз трипсиноподобного типа с оптимумом активности фермента при 65°С и рН 10,5; нитритокисляющий штамм Nitrospira sp., с максимальной скоростью окисления нитритов при 48 °С и рН 8,7.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В щелочных термальных источниках Прибайкалья были изучены распределение и активность микроорганизмов, принимающих участие в круговороте азота.

Ключевую роль в биологическом круговороте азота играют азотфиксаторы. Максимальное количество азотфиксирующих бактерий, до 10 млн кл/мл, было определенно в гидротермах Горячинск, Алла, Котельниковский. Минимальное - в источниках Кучигер и Сея (100 кл/мл). В то же время именно в этих источниках была определена наиболее высокая численность аммонификаторов до 100 млн. кл/мл. Среди бактерий, участвующих в процессе окисления восстановленных соединений азота до нитритов и нитратов, наибольшие значения численности аммониокисляющих и нитритокисляющих бактерий определенны в источнике Горячинск - 1 млн кл/мл. Денитрификация - это последнее звено в цикле азота, в котором связанный азот возвращается в атмосферу в виде N2. Численность денитрификаторов в исследуемых источниках варьировала от 100 кл/мл (ист. Горячинск, Хакусы) до ЮОтыс. кл/мл (ист. Кучигер).

Среди культивируемых видов азотфиксирующих, аммонифицирующих, денитрифицирующих бактерий из проб илов и микробных матов щелочных термальных источников доминировали представители рода Bacillus. Среди нитрификаторов I и II фазы присутствовали в основном представители родов Nitrosomonas и Nitrospira. Все выделенные культуры проявляли алкалотермофильные свойства.

В исследуемых источниках наблюдалось сезонное изменение содержания соединений азота, которое оказывало влияние на численность микроорганизмов основных физиологических групп цикла азота. В марте увеличение количества нитратов на фоне низкого содержания аммония сопровождалось увеличением численности всех исследованных функциональных групп бактерий цикла азота. В ноябре при уменьшении количества нитратов и повышении содержания аммония в источниках отмечено снижение численности азотфиксирующих, нитрифицирующих и денитрифицирующих микроорганизмов. Изучение динамики численности аммонифицирующих бактерий установило возрастание их количества в августе. Ведущую роль в процессе аммонификации играют внеклеточные протеолитические ферменты, которые осуществляют гидролиз ряда пептидных связей в молекулах белков. Общая протеазная активность в нативных образцах исследованных источниках достигала 65,2 ед. (Кучигер). Наибольшие значения протазной активности характерны для микробных матов. По полученным данным выявлено, что в деструкции белоксодержащих соединений исследуемых проб основную роль играют протеиназы субтилизинподобного типа.

Скорость бактериального разложения белоксодержащих соединений в исследуемых источниках составила 1,25 - 2,43%, максимальные скорости деструкции отмечены в источниках Кучигер (2,43%) и Умхей (2,14%).

Биологическая активность в источниках, определяемая по величине эмиссии С02, была выше в местах с повышенным содержанием органических веществ. Высокие значения биологической активности илов выявлены в источнике Кучигер, расположенный в болотистой местности, величина скорости эмиссии С02 составила 0,96 мкг С-С02/г ч. Весной значения интенсивности дыхания илов в источнике Горячинск были выше, чем в осенне-зимний период.

Максимальная азотфиксирующая активность выявлена в гидротерме Горячинск - 0,499 нг N2/r ч. Высокие величины азотфиксирующей активности зафиксированы на станциях источников, где величина соотношения C/N варьировала в пределах 10-12. Наименьшая азотфиксирующая активность отмечена в илах источников Алла и

Кучигер.

Оценка процесса денитрификации в минеральных источниках показала, что наиболее интенсивнее процесс выделения закиси азота протекает в илах источника Алла - 0,661 нг N20/r ч. Наиболее низкие показатели денитрифицирующей активности установлены в илах термального источника Горячинск. Активность денитрификации в этом источнике не превышала 0,035 нгЫ20/гч. Низкая денитрифицирующая активность микроорганизмов в илах источника Горячинск связана с невысоким содержанием нитратов (0,012 - 0,032 N02Mr/100r ила) в илах, вследствие низкой нитрифицирующей активности (0,012 - 0,1 нг N037 г ч) бактерий.

Следует отметить, что скорости бактериальных процессов цикла азота в гидротермах снижаются при повышении содержания сероводорода в воде.

Сравнение весенне-осенней динамики интенсивности процессов цикла азота в илах источника Горячинск показало повышение активности в весенний период времени, которые коррелируют с сезонной динамикой численности бактерий.

Таким образом, структура и функциональная активность микроорганизмов, участвующих в круговороте азота в щелочных термальных источниках Байкальского региона, определяется химическим составом воды, содержанием органического вещества и минеральных форм азота.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шагжина, Айви Петровна, Улан-Удэ

1. Аринушкина Е.В. Руководство по химическому анализу почв / Е.В. Аринушкина // М.: Изд-во МГУ. 1979. - С. 487.

2. Ашмарин И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев // Л.: Гос. изд-во мед. Литературы. 1962. - С Л 75.

3. Бабьева И. П. Биология почв / И. П. Бабьева, Г. М. Зенова // М.: изд-во МГУ. 1989. - С.170-185.

4. Бакунина Н. А. Микробиология / Н. А. Бакунина, Э.Л. Краева // М. -1976.-С.54-76.

5. Барабанов Л.Н. Азотные термы СССР / Л.Н. Барабанов, В.Н. Дислер // М: Геоминвод ЦНИИ КиФ. 1968. - С. 120.

6. Басков Е.А. Гидротермы Земли / Е.А.Басков, С.Н. Суриков //Л.: Недра.-1989.-С.245.

7. Брянская А.В. Цианобактерии гидротерм Бурятии //А.В .Брянская, Б.Б. Намсараев // Иркутск: СИФИБР СО РАН. 2000. - С.17-18.

8. Брянская А.Б. Биогеохимические процессы в альгобактериальных матах щелочного термального Уринского источника / А.Б. Брянская, З.Б. Намсараев, О.М. Калашникова, Д.Д. Бархутова, Б.Б. Намсараев, В.М. Горленко // Микробиология. 2006. - Т.75. - С.702-712.

9. Бонч-Осмоловская Е.А. Термофильные микроорганизмы в морских гидротермальных системах. С. 131-140 / Е.А. Бонч-Осмоловская // В кн. Биология гидротермальных систем. Под ред. А.В. Гебрук, К.Н.

10. Несис, А.П. Кузнецов, A.M. Сагалевич. М: КМК Press. 2002. - С.543.

11. Борисенко И.М. Минеральные воды Бурятской АССР / И.М. Борисенко, JI.B. Замана // Улан-Удэ: Бурятское книжное изд-во. 1978. -С. 162.

12. Виноградский С. Н. Изучение нитрифицирующих микроорганизмов / С. Н. Виноградский // Микробиология почвы. М: Изд-во АН СССР. -1952.-С. 179-193.

13. Гальченко В.Ф. Микроорганизмы в гидротермальных сообществах / В.Ф. Гальченко // В кн. Биология гидротермальных систем. Под ред. А.В. Гебрук, К.Н. Несис, А.П. Кузнецов, A.M. Сагалевич. М: КМК Press. 2002.-С.113-130.

14. Гебрук А.В. Гидротермальный биотоп и гидротермальная фауна: общее положение / А.В. Гебрук, С.В. Галкин // В кн. Биология гидротермальных систем. М: КМК Press. 2002. - С. 13-24.

15. Герхардт, Ф. (под ред.). Методы общей бактериологии. В 3 т. М.: Мир.- 1983.-С. 344.

16. Головачева Р.С. Термофильные нитрифицирующие бактерии горячих источников / Р.С. Головачева // Микробиология. 1976. - Т.45. Вып.2. - С.377-379.

17. Голубев В.А. Тепловые и химические характеристики гидротермальных систем Байкальской рифтовой зоны / В.А. Голубев // Сов. геология. 1982.-№10.-С. 100-108.

18. Горленко В.М. Влияние температуры на распространение фототрофных бактерий в термальных источниках / В.М. Горленко, Е.И.

19. Компанцева, Н.Н. Пучкова // Микробиология. 1985. Т. 54. - №5. - С. 848-853.

20. Гусев М. В. Микробиология / М. В. Гусев, JI. А. Минеева // М: изд-во МГУ. 1992. - С.409-414

21. Добровольская Т. Г. Методы выделения и идентификации почвенных бактерий / Т. Г. Добровольская, И. Н. Скворцова, JI. В. Лысак // М.: изд-во МГУ. 1989. - С. 74.

22. Досон Р. (под ред.) Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Эллиот, У. Элиот, К. Джонс // М.: Мир. 1991. - С.544.

23. Дунаевский Я. Е. Внеклеточные протеиназы мицелиальных грибов как возможные маркеры фитопатогенеза/ Я. Е. Дунаевский, Т. Н. Грубань, Г. А. Белякова, М. А. Белозерский // 2006. Т. 75. - № 6. -С.747-751.

24. Емцев В. Т. Микробиология / В. Т. Емцев, Е. Н. Мишустина // М.: Колос.-1993.-С.383.

25. Тэнси М. Жизнь микроорганизмов при высоких температурах: экологические аспекты / М. Тэнси, Т. Брок // Жизнь микробов в экстремальных условиях. Под ред. Д.Кашнера: Пер. с англ. М.: Мир. -1981.-С.521.

26. Заварзин Г.А. Биоразнообразие как часть биосферно-геосферной системы возникновения порядка из хаоса / Г.А. Заварзин // Методология биологии: новые идеи (синергетика, семиотика, коэволюция). Отв. Ред. О.Е. Баксанский. М.: Эдиториал УРСС. 2001.

27. Заварзин Г.А. Введение в природоведческую микробиологию / Г.А. Заварзин, Н.Н. Колотилова // М.: Книжный дом "Университет".- 2001. -С.256.

28. Звягинцева Д. Г. (под ред.) Методы почвенной микробиологии и биохимии / Д. Г. Звягинцева // М.: изд-во МГУ. -1991. С.303.

29. Ильина Т.К. Химизм денитрификации у спороносных почвенныхбактерий / Т.К. Ильина, Р.Н. Ходакова // Микробиология. 1976. - Т.45. - С.602-606.

30. Калачева Г.С. Состав жирных кислот Spirulina platensis в зависимости от возраста и минерального питания культуры / Г.С. Калачева, Н.Н. Сущик // Физиология растений. 1994. - Т.41. - С.275-282.

31. Кардиналовская Р. И. Биологическая фиксация молекулярного азота атмосферы и ее значение в земледелии / Р. И. Кардиналовская // Киев,-1983.-С.43.

32. Кашнер Д. (под ред.) Жизнь микробов в экстремальных условиях / Д. Кашнер // М.: Изд-во Мир, 1981. С.520.

33. Квасников Е.И. Физиология термотолерантных микроорганизмов / Е.И. Квасников, ДМ. Исакова // М.: 1978. С.67.

34. Ковалев Н.Г. Торф, торфяные почвы, удобрения / Н.Г. Ковалев, A.M. Поздняков, Д.А. Мусекаев, JI.A. Позднякова // М.: Изд-во ВНИИМЗ. -1998.-С.240.

35. Компанцева Е.И. Фототрофные сообщества в некоторых термальных источниках озера Байкал / Е.И. Компанцева, В.М. Горленко // Микробиология. 1988. - Т. 57. - №5. - С. 841-846.

36. Корнеева Г.А. Внеклеточная протеазная активность в компонентах криосферы / Г.А. Корнеева, Н.А. Буданцева, Ю.Н. Чижова // Изв. РАН. Сер. Биол.- 2004. № 5. - С. 625-633.

37. Корнеева Г.А. Изучение ферментативного гидролиза казеина в морской воде / Г.А. Корнеева, С.В. Карченко, Е.А. Романкевич // Известия РАН. Серия биологическая. 1990. - № 6. - С. 821-829.

38. Костина Н. В., Степанов А.Л., Умаров М.М. Изучение комплекса микроорганизмов, восстанавливающих закиси азота в почвах /Н.В. Костина, А. Л. Степанов, М.М. Умаров // Почвоведенье-1993. № 12. -С. 72.

39. Крайнов С.Р. Основы геохимии подземных вод / С.Р. Крайнов, В.М. Швец // М.: Недра. 1980 - С. 285.

40. Кузнецов С.И. Микрофлора озер и ее геохимическая деятельность/ С.И. Кузнецов //Л.: Наука. 1970. - С. 546.

41. Кузнецов С.И. Методы изучения водных микроорганизмов / С.И. Кузнецов, Г.А. Дубинина // М. 1989. - С.285.

42. Кузнецов С.И. Микробиологическое изучение внутренних водоемов / С.И. Кузнецов, В.И. Романенко // Л.: Изд-во АН СССР. -1963.-С.129.

43. Кузнецов С.И. Микробиологичсекие процессы круговорота углерода и азота в озерах / С.И. Кузнецов, А.И. Саралов, Т.Н. Назина // М. 1985. - С.212.

44. Логинова Л.Г. Анаэробные термофильные бактерии / Л.Г. Логинова//М.: 1982.-С. 99-101.

45. Ломоносов И.С. Геохимия и формирование современных гидротерм Байкальской рифтовой зоны / И.С. Ломоносов // Новосибирск: Наука. -1974.-С. 166.

46. Ломоносов И.С. Минеральные воды Прибайкалья / И.С. Ломоносов, Ю.И. Кустов, Е.В. Пиннекер // Иркутск: Вост.-Сиб. Кн. Изд. 1977.1. С. 269.

47. Ломоносов И.С. Термальные воды Прибайкалья / И.С. Ломоносов, Е.В. Пиннекер // Природа. 1980. - № 3. - С. 78-85.

48. Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия промышленных сточных вод / Ю.Ю. Лурье // М.: Химия. 1984. - С. 325.

49. Львов Н. П. Молибден в ассимиляции азота у растений и микроорганизмов / Н. П. Львов // 43-е Баховское чтение. М: Наука. -1989.- С. 87.

50. Мишустин Е.Н. Микробиология / Е.Н. Мишустин, В.Т. Емцев // Изд. 2. М. 1978.-С.350.

51. Мишустин Е.Н. Биологическая фиксация атмосферного азота / Е.Н. Мишустин, В.К. Шильникова // М.: Наука. 1968. - С. 325.

52. Намсараев З.Б. Микробные сообщества щелочных гидротерм / З.Б. Намсараев, В.М. Горленко, Б.Б. Намсараев, Д.Д. Бархутова // Новосибирск. Изд-во СО РАН. 2006. - С. 109.

53. Новиков В. В. Сезонная динамика эмиссии СО2, СО2, СН4И N2O из торфяных почв поймы р. Яжрома / В. В. Новиков, А. Л. Степанов, А. И. Поздняков, Е. В. Лебедева // Почвоведение. 2004. - №7. - С. 867-874.

54. Носова Л.М. Определение протеолитической активности дерново-подзолистой и дерновой почв методом фотобумажной автографии / Л.М. Носова, Ю.Т. Гельцер // В кн.: Микроорганизмы как компоненты биогеоценоза. М.: Наука. - 1984. - С. 153-156.

55. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уильямса. М.: Мир. 1997- С. 800.

56. Перельман А.И. Геохимия элементов в зоне гипергенеза / А.И. Перельман // М.: Недра. 1972. - С.288.

57. Перельман А.И. Геохимия природных вод / А.И. Перельман // М.: Наука.-1982.-С. 193.

58. Плохинский Н.А. Биометрия / Н.А. Плохинский // Новосибирск. -1961.

59. Пиннекер Е.В. Геохимия подземных минеральных вод Монгольской Народной Республики / Е.В. Пиннекер // Новосибирск: Наука. 1980.-С. 437.

60. Посохов Е.В. Общая гидрогеохимия / Е.В. Посохов // JL: Недра. -1975.-С. 208.

61. Резников А.А. Методы анализа природных вод / А.А. Резников, Е.П. Муликовская, И.Ю. Соколов // 3-е изд. М.: Недра. 1970. - С.152.

62. Романенко В.И. Экология микроорганизмов пресных водоемов / В.И. Романенко, С.И. Кузнецов // Лабораторное руководство. М. 1974. -С.194.

63. Романов В. И. Физиология растений / В.И. Романов, В. Л.Кретович, Н. Г. Федулова, А. В. Королев //1976. Т. 23. - С. 617 - 619.

64. Саралов А.И. Микробиологические процессы цикла азота в озерах / А.И. Саралов // Автореферат дис. д-ра Биол. наук. М.: ИНМИ АН СССР. -1991.-С. 44.

65. Саралов А.И. Фиксация молекулярного азота и активность микрофлоры в грунтах некоторых озер Эстонской ССР и Рыбинского водохранилища / А.И. Саралов, А.Н. Дзюбан и И.Н. Крылова // Микробиология. 1980. - Т.49. - С.813 -819.

66. Соломин Г.А. Щелочные составляющие природных и сточных щелочных вод, геохимические процессы их нейтрализации кислыми и околонейтральными подземными водами / Г.А. Соломин, С.Р. Крайнов // Геохимия. 1998. - №2. - С. 183-201.

67. Сорокин Д.Ю. Гетеротрофная нитрификация бактерий, принадлежащих к роду Alcaligenes / Д.Ю. Сорокин // Микробиология. -1989. Т.58. - С.9-14.

68. Сорокин Д. Ю. Окисление нитритов гетеротрофными бактериями / Д.Ю. Сорокин // Микробиология. 1990.-Т.59. - Вып.6. - С.962 - 967.

69. Степанов A.JI. Методы газовой храмотографии в почвенной микробиологии / A.JI. Степанов, JI.B. Лысак // М. Изд-во Макс Пресс. -2002. С. 86.

70. Сущик Н.Н. Влияние температуры на состав внеклеточных жирных кислот культур зеленой и синезеленой водорослей / Н.Н. Сущик, М.И. Гладышев, Г.С. Калачева // Докл. АН. 1999. -№ 4. - С.567-570.

71. Теппер Е.З. Практикум по микробиологии / Е.З. Теппер, В.К. Шильникова, Г.И. Переверзева // М.: Агропромиздат. 1987. - С.165-166.

72. Харди Р. Проблемы фиксации азота / Р. Харди, Ф. Боттомли, Р. Берис // М.: Мир. 1982. - С. 13, 19-22.

73. Храпцова Г.И. Термофильные бактерии горячих источников Бурятии / Г.И. Храпцова, И.А. Цаплина, Л.М. Серегина, Л.Г. Логинова // Микробиология. 1984. -Т.53. - Вып. 1. -С. 137-141.

74. Чурикова В. В. Основы микробиологии и вирусологии: Учеб. пособие для биол. спец. ун-тов / В. В. Чурикова, Д. П. Викторов // Воронеж: изд-во Воронеж, ун-та. 1989. - С. 271.

75. Шлегель Г. Общая микробиология / Г. Шлегель//М.: Мир.-1987.

76. Adams M.W.W. Enzymes and proteins from organisms that grow near and above 100 °C / M.W.W. Adams // Annu. Rev. Microbiol. 1994. -V.47. - P. 627-658.

77. Amoiy A. Characterization of the sacQ genes from Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis / A. Amoiy, F. Kunst, E. Aubert, A. Klier,

78. G. Rapoport // Bacteriol. 1987. - V. 169. -P.324 -333.

79. Anitori R. P. Radontolerant Microbes from Paralana Thermal Spring, South Australia / R. P. Anitori, C.Trott, D. J. Saul, L. Tuiafitu, P. L. Bergquist, M. R. Walter // Abst. Astrobiol. Macquarie University, Sydney. -2001. -P.352-361.

80. Bergersen F. J Formation and function of bacteroids / F. J. Bergersen // In The Biology of Nitrogen Fixation (ed. A. Quispel) Amsterdam. 1974. -P. 473-498.

81. Bergersen F. J. The presence of N2-fixing bacteria in the intestines of man and animals / F. J. Bergersen, EH. Hipsley // J Gen Microbiol. 1970 -V. 260.-P. 61-65.

82. Birch P.B. Nitrogen and phosphorus recycling in lake Sammamish a temperate mesotrophic lake / P.B. Birch, D.E. Spyridaris // Hydrobiologia. -1981. V.80. -P.129-138.

83. Bock E. Nitrification / E. Bock, Eberhard et al. // Washington: Oxford. 1986. -P.37 -45.

84. Bock E. Oxidation of inorganic nitrogen compouds as an energy source In Schleifer and stackbrandt (Editors), The Procariotes, 2nd ed./ E. Bock, M.Wagner // Online, Springer-Verlag N.Y. 2001. - P. 137 - 145.

85. Booth I. R. Alkali cation transport systems in prokaryotes / I.R. Booth, R.M. Douglas, G.P. Fergusson, A.W. Lamb, G.J. Ritchie, In: Bakker E.P. (ed.) //Boca. Raton. Fla. CRC Press. 1993. - P.291-308.

86. Bordeleau L.M. Nodulation and nitrogen fixation in extreme environments / L.M. Bordeleau, D. Prevost.// Plant and Soil. 1994. - V.l61. -P.115-125.

87. Brock T.D. The road to Yellowstone / T.D. Brock // Annu. Rev. Microbiol. 1995.- V.49. - P. 1-28.

88. Brock T.D. Micro-organisms adapted to high temperatures / T.D. Brock // Nature. -1967. -V. 214. -P.882-885.

89. Brock T.D. Relationship between standing crop and primary productivity along a hot spring thermal gradient / T.D. Brock // Ecology. -1967. V.48. - P.566-571.

90. Castenholz R.W. Thermophilic blue-green algae and the thermal environment / R.W. Castenholz // Bacteriol. Rewiews. -1969. V.33. - P. 476-504.

91. Castenholz R.W., Pierson B.K. Ecology of thermophilic anoxygenic phototrophs / R.W. Castenholz // In Blankenship, Madigan, Bauer (eds.). Anoxygenic photosynthetic bacteria: Kluwer Academic publishers. N. -1995. —P.87-103.

92. DeBlois S. Thermophilic anaerobe with high xylanolytic activity / S. DeBlois, J. Wiegel// Ann. Meet. Am. Soc. Microbiol. Dallas.- 1991.- P.0-46.

93. DeBlois S. Cellulolytic vestiges of the xylanase activity in a new strictly xylanolytic thermophile Clostridium sp. / S. DeBlois, J. Wiegel// Biotechnol. Lett. 1995. - V.17. -P.89-94.

94. Duckworth A.W. Phylogenetic diversity of soda lake alkaliphiles /A.W. Duckworth, W.D. Grant, B.E. Jones, R. van Steenbergen // FEMS Microbiol. Ecol. 1996. - V.19. - P. 181 -191.

95. Ehrich. S. A new obligately chemolithoautotrophic, nitrite-oxidizing bacterium. Nitrospira moscoviensis sp. / S. Ehrich., D. Behrens, E . Lebedeva, W. Ludwig, E. Bock. // Arch. Microbiol. 1995. - V.164. -P.16-23.

96. Erlanger B.F. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin / B.F. Erlanger, N. Kokowsky, W. Cohen // Arch. Biochem. Biophis. 1961. - V.95. -P.271-278.

97. Fani R. Molecular Evolution Of Nitrogen Fixation: The Evolutionary History Of nifD, nifK, nifE, and nifN genes / R. Fani, R. Gallo, P. Lio // J Mol Evol. 2000. - V.51. - P. 1 -11.

98. Fani R. Evolution of the structure and chromosomal distribution of histidine biosynthetic genes / R. Fani, E. Mori, E. Tamburini, A. Lazcano // Origins of Life and Evolution of Biosphere. 1998. - V.28. - P.555-570.

99. Frunzke K. 3-rd Europ. Bioenerg. Conf / K. Frunzke, W. G. Zumft // Hanover. 1984. - V. 3. - P.202.

100. Fujiwara N. Utilization of a thermostable alkaline protease from an alkalophilic thermophilic for the recovery from used X-ray film / N. Fujiwara, K. Yamamoto, A. Masui // Ferment. Bioeng. 1991. - V.72. - P.306-308.

101. Calldwell D.E. Thermothrix thioparus gen. et sp. nov., a facultatively anaerobic facultative chemolithotroph living at neutral pH and high temperature / D.E. Calldwell, S.J. Calldwell, J.P. Laycock // J. Microbiol. -1976. -V.22 -P.1509-1517.

102. Galtier N. A nonhyperthermophilic common ancestor to extant life forms / N. Galtier, N. Tourasse, M. Gouy // Science. 1999. - V.283. -P.220-221.

103. Glazebrook J. A Rhizobium meliloti homolog of the Escherichia coli peptide-antibiotic transport protein SbmA is essential for bacteroid development / J. Glazebrook, A. Ichige, G.C. Walker // Genes Dev. 1993 -V. 7. -P.1485-1497.

104. Goering J.J. Nitrogen fixation by epiphvtes on sea grasses / J.J. Goering, P.L. Parker // Limnol. and Oceanogr. 1972. - V. 17. - P.320- 323.

105. Gokce N. Thermophilic Bacillus sp. that shows the denitrification phenotype of Pseudomonas aeruginosa / N. Gokce, T.C. Hollocher, D.A. Bazylinski, H.W. Jannasch. // Appl. Environ. Microbial. 1989. - V.55. -P.1023-1025.

106. Golterman H. L. Influence of FeS on denitrification in shallow waters / H. L. Golterman // Vern. Int. Ver. Angew. Limnol. -1991. V. 24. - P.3025 -3028.

107. Granhall U. Nitrogen fixation in a sub-arctic mire / U. Granhall, H. Selander//Oikos.- 1973.-V.24,- P.8-15.

108. Grant W.D. The alkaline saline environment / W.D. Grant, B.J. Tindall // In: Halophilic Bacteria (Rodriguez, Valera F., Ed.) CRC Press. USA. 1986. -P.31-67.

109. Habeeb T.S. Determination of free amino groups in protein by trinitrobenzenesulphonic acid / T.S. Habeeb // Analyt. Biochem. 1966. -V.14. -P.328-336.

110. Hamadi A.F. Calcium ions, oxygen and acetylene reduction ( nitrogen fixation) in the unicellular cyanobacterium Gleocapsa sp / A.F. Hamadi, J.R. Gallon // J. Gen. Microbiol. 1981. - V. 125. - P. 391-398.

111. Hankinson S. An acidophilic and a neutrophilic Nitrobacter strain isolated from the numerically predominant nitrit-oxidizing population of an acid forest soil / S. Hankinson, E.L. Schmidt // Appl. Environ. Microbiol. -1988. V.54. -P.1536-1540.

112. Hard F.U. Molecular chaperones in protein folding: the art of avoiding sticky situations / F.U. Hartl, R. Hlodan, T. Langer// Trends Biochem. Sci. -1994. V. 19. - P.20-25.

113. Hawumba J.K. Thermophilic Protease-Producing Geobacillus from Buranga hot springs in Western Uganda / J.K. Hawumba, J.Theron, V. S. Brozel. // Current Microbiol. -V.45.-2002. -P.144-150.

114. Head I.M. The phylogeny of autotrophic ammonia-oxidizing bacteria as determined by analysis of 16S ribosomal RNA gene sequences / I.M. Head, W.D. Hiorns, T.M. Embley, A.J. McCarthy, J.R. Saunders // J. Gen. Microbiol. 1993. - V.139. - P.1147-1153.

115. Hollocher Т. C. Thermophilic denitrifying bacteria: A survey of hot springs in Southwestern Iceland / Т. C. Hollocher, J. K. Kristjansson // FEMS Microbiology Ecology. 1992. - P. 113-119.

116. Hollocher, Т. C. Thermophilic denitrifying bacteria: A survey of hot springs in Southwestern Iceland / T.C. Hollocher, J. K. Kristjansson //FEMS Microbiology Ecology. 1992. - V.101. -P.l 13-119.

117. Joye, S.B. Sulfide inhibition of nitrification influences nitrogen regeneration in sediments / S.B. Joye, J.T. Hollibaugh. // Science. 1995. -V.270.-P.623-625.

118. Karpati E. Interaction of Azospirilium lipoferum with Wheat Germ Agglutinin Stimulates Nitrogen Fixation/ E. Karpati, P. Kiss, T. Ponyi, I. Fendrik, M. de Zamaroczy, L. Orosz. // J. of Bacteriology. 1999. - V.181. -P.3949-3955.

119. Krienltz L. Contribution of hot spring cyanobacteria to the mysterious deaths of Lesser Flamingos at Lake Bogoria, Kenya / L. Krienltz, A. Ballot, K. Kotut et al. // FEMS Microbiol. Ecol. 2003. - Vol. 43. - P. 141-148.

120. Knowles R. Denitrification / R. Knowles // Microbiol. Revs. 1982. -V. 46.-P. 43-70.

121. Konneke M. Isolation of an autotrophic ammonia-oxidizing marine archaeon / M. Konneke, A.E. Bernhard, J.R. De la Torre, C.B. Wolker, J.B. Waterbry, D.A. Stahl //Nature. 2005. - V. 437/22. - P. 543-546.

122. Kevbrin V. V. A novel thermophilic facultative aerobic bacterium with a broad pH optimum from the Geyser valley, Kamchatka / V.V. Kevbrin, K. Zengler, A M. Lysenko, J. Wiegel // Extremophiles.-2005.-V.9.-P. 391-398.

123. Koops H-P. Distribution and ecophysiology of the nitrifying bacteria emphasizing cultured species / H-P. Koops, A. Pommerening-Roser // FEMS Microbiology Ecology. -2001.- V.37. P. 1-9.

124. Kuenen J.G. Ecology of nitrification and gentrification / J.G. Kuenen, L.A. Robertson // The Nitrogen and Sulfur Sycles Ed. J.A. Cole, S. 1988. -P.2918 - 2926.

125. Masui A. Stabilization and Rational Design of Serine Protease AprM under Highly Alkaline and High-Temperature Conditions / A. Masui, N. Fujiwara, T. Imanaka // Appl. Envir. Microbiol. 1994. - V. 60. - P.3579-3584.

126. Matsubara T. Modulation by Copper of the product of nitrite respiration in Pseudomonas perfectomarinus / T. Matsubara, Frunzke, W. Zumft // J. Bacterid. -1982. V.149. -P.816.

127. Mulder A. Anaerobic ammonia-oxidation discovered in a denitrifying fluidized-bed reactor / A. Mulder, A.A. Van de Graaf, L.A. Robertson, J.G. Kuenen // FEMS Microbiol. Ecol. -1995. -V.16. -P.177-183.

128. Olson J.B. N2-fixing microbial consortia associated with the ice cover of Lake Bonney, Antarctica / J.B. Olson, T.F. Steppe, R.W. Litaker, H.W. Paerl // Microb. Ecol. -1998. V.36. -P.231-238.

129. Padan E. Molecular physiology of NaVH* antiporters key transporters in circulation of Na+ and If1" in cells / E. Padan, S. Schuldiner // Biochim. Biophys. Acta. 1994. - V.l 185. - P.129-151.

130. Payne W. J. The status of nitric oxide and nitrous oxide as intermediates in denitrifications denitrification, nitrification and atmospheric nitrous oxide / W. J. Payne // John Wiley & Sons Ltd. New York.-l 981P.85-103.

131. Payne W. J. Separate nitrite, nitric oxide and nitrous oxide reducing fractions from Pseudomonas perfectomarinus / W. J. Payne, P. S. Riley, J.R. Cox // J. Bacterid. 1971. - V. 108. - P.356.

132. Phillips D.A. Plant physioljgy / D. A. Phillips // Lancaster. 1974. - V. 53. -P.67-72.

133. Pond J.L. Long-chain diols: a new class of membrane lipids from a thermophilic bacterium / J.L. Pond, T.A. Langworthy, G. Holzer // Science. -1986. V.231. -P.1134-1136.

134. Postgate J.R. The fundamentals of Nitrogen Fixation / J.R. Postgate // Cambridge University Press. London. 1982.

135. Reynolds J. The use of lead citrate of high pH as electron opaque in electron microscopy//J. Cell. Biol. 1963.-V.17.-№1.-P.208-218.

136. Robertson L.A. Heterotrophic nitrification in Thiosphaera pantotropha -oxygen uptake and enzyme studies / L.A. Robertson, J.G. Kuenen // J. Gen. Microbiol. 1988. - V.134. - P.857-863.

137. Ryter A. Etude an microscope electronique des plasmes contenant acide deoxyribonucleique des nucleodes des bacteries en croissances active / A. Ryter, E. Kellenberger // Z. Naturforsch. 1958. - V. 13b. - P.597-605.

138. Shaw L. J. Nitrosospira spp. can produce nitrous oxide via a nitrifier denitrification pathway /L. J. Shaw, G. W. Nicol, Z. Smith, J. Fear, J. I. Prosser, E.M. Baggs //Environmental Microbiology.-2006.-V.8.-P.214-222.

139. Slonczewski J.L. pH-regulated genes and survival at extreme pH / J.L. Slonczewski, J.W. Foster // In: Neidhardt F. C, CurtissR., Ingraham J. L., LinE.C.C, LowK.B., MagasanikB., ReznikoffW., Riley M., Schaechter M.,

140. Umbarger H. E. (eds.) Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology .2nd edn.Washington;DC:ASM Press.-1996.-P.1382-1399.

141. Sorokin D.Y. Isolation and characterization of a novel facultatively alkaliphilic Nitrobacter species, N. Alcalicus sp. nov. / D.Y. Sorokin, G. Muyzer, T. Brinkhoff, J.G. Kuenen, M.S.M. Jetten //Arch. Microbiol. -1998. V. 170. - P.345-352.

142. Spieck E. Nitrifying bacteria / E. Spieck, E. Bock // 2nd edn In: Bergey's Manual of Systematic bacteriology: Proteobacteria (Staley J.T., Boone D.R., Brenner D.J., De Vos P., Garrity G.M., Goodfellow M., Krieg N.R., Rainay

143. F.A., Schleyfer K.H.)// NY: Springer-Verlag. 2005a. - V.2. - Part A. -P.137-140.

144. Spieck E. The lithoautotrophic Nitrite-Oxidizing bacteria / E. Spieck, E. Bock // 2nd edn In: Bergey's Manual of Systematic bacteriology: Proteobacteria (Staley J.T., Boone D.R., Brenner D.J., De Vos P., Garrity

145. G.M., Goodfellow M., Krieg N.R., Rainay F.A., Schleyfer K.H.)// NY: Springer-Verlag. 2005b. -V.2. - Part A. - P. 149-153.

146. Stouthamer A.H. Dissimilatory reduction of oxidized nitrogen compounds / A.H. Stouthamer // In: F. J. B. Zehnder (ed). Biology of anaerobic microorganisms. John Wiley & Sons Ltd. NY. 1988. - P.245.

147. Strous M. Missing lithotroph identified as new planctomycete / M. Strous, J.A. Fuerst, E.H.M. Kramer, S. Logemann, G. Muyzer, K.T. Van de

148. Pas-Schoonen, R. Webb, J.G. Kuenen, M.S.M. Jetten // Nature (Lond.) -1999. V.400. - P.446-449.

149. Takai K. Spatial distribution of marine crenarchaeota group I in the vicinity of deep-sea hydrothermal systems / K. Takai, H. Oida, Y. Suzuki, H. Hirayama, S. Nakagawa, T. Nunoura et al. // Appl. Environ. Microbiol. -2004. V.70. - P.2404-2413.

150. Umarov M.M. Biotic sources of nitrous oxide in the context of the global budget of nitrous oxide / M.M. Umarov // Soils and the greenhouse effect. John Wiley & Sons Ltd. Chichester. 1990. - P.263.

151. Umarov M.M. Microbiol formation and consumption of N20 in soil / M.M. Umarov, A. L. Stepanov // Abstracts. 2-nd session. 11-th International Symposium on Environmental Biogeochemistry// Salamanca. 1993.

152. Verkhovtseva N. V. Bacilli of the deep subterranean biosphere/ N. V. Verkhovtseva, N. V. Shekhovtsova, I. A. Ryzhikova, T. A. Rodionova, G. V. Kondakova // 9th international conference on bacilli. Lausanne (Switzerland). - 1997. - P. 176.

153. Verkhovtseva N.V. Nitrogen fixation in the deep layers of the subsurface biosphere / N.V. Verkhovtseva, G.V. Kondakova // Ed. C.

154. Elmerich et al. Biological Nitrogen Fixation for the 21st Century Dordrecht, Boston, London: Kluver Academic Publishers. - 1998. - V.31. - P.536.

155. Volkl P. Pyrobaculum aerophilum sp. nov., a novel nitrate-reducing hyperthermophilic archaeum / P. Volkl, R. Huber, E. Drobner, R. Rachel, S. Burggraf, A. Trincone, К. O. Stetter // Appl Environ Microbiol. 1993. -V.59.-P.2918-2926.

156. Watson S.W. Taxonomic considaration of the family Nitrobacteraceae Buchanan. Request for opinions // Int. J. Syst. Bacterid. 1971. V.21. P.254-270.

157. Watson. S.W. Nitrifying bacteria / S.W. Watson, E. Bock, H. Harms, H.-P. Koops, A.B. Hooper. // In: Sergey's Manual of Systematic Bacteriology (Staley. J.T., Bryant. M.P. Pfennig. N. and Holt. J.G. Eds) 1th Ed. 1989. -V.3. -P.1808-1834.

158. Wickstrom C.E. Discovery and evidence of nitrogen fixation by thermophilic heterotrophs in hot springs / C.E. Wickstrom // Curr Microbiol. 1984. V. 10. - P.275-80.

159. Wiegel J. Anaerobic alkalithermophiles, a novel group of extremophiles / J. Wiegel // Extremophiles. 1998. - V.2. - P.257-267.

160. Young J.P. Phylogenetic classification of nitrogen fixing organisms / J.P. Young // In Biological Nitrogen Fixation. Stacey, G., Burris, R.H., and Evans, H.J. (eds.). NY USA: Chapman & Hall. -1992. P.43-86.

161. Yutani K. Effect of a single amino acid substitution on stability of conformation of a protein / K. Yutani, K. Ogasawara, Y. Sugino, A. Matsushiro // Nature. 1986. - V.267. - P.274-275.

162. Zablotowicz R. M., Focht D. M. Denitrification and anaerobic nitrate dependent acetylene reduct in Cowpea rhizobium / R.M. Zablotowicz, D.M. Focht // J. General Microbiol. 1979. -№11.- P.445.

163. Zahran H.H. Rhizobium legume symbiosis and nitrogen fixation under severe conditions and in an arid climate/ H.H. Zahran // Microbiol Mol Biol Rev. - 1999. - V.63. - P.968-989.

164. Zehr J. Diversity of heterotrophic nitrogen-fixation genes in a marine cyanobacterial mat / J. P. Zehr, S. Zani // Appl. Environ. Microbiol. 1995. -V.6. - P.2527-2532.

165. Zehr J.P. New nitrogenfixing microorganisms detected in oligotrophic oceans by amplification of nitrogenase (ni/H) genes / J.P. Zehr, M.T. Mellon, S. Zani // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V.64. - P.3444-3450.

166. Zeng Y.B. Biogeochemistry of hot spring environments. Lipid compositions of Yellowstone (Wyoming, U.S.A.) cyanobacterial and Chloroflexus mats / Y.B. Zeng, D.M. Ward, S. Brassell, G. Eglinton // Chem. Geol. 1992. - V. 95. - P.327-345.

167. Zeng Y.B. Biogeochemistry of hot spring environments. Apolar and polar lipids in the biologically active layers of a cyanobacterial mat / Y.B. Zeng, D.M. Ward, S. Brassell, G. Eglinton // Chem. Geol. 1992. - V. 95. -P.347-360.

168. Источник Алла Т 76,2°С, рН 9,91. Источник Кучигер1. Источник Уро1. Г 69,9°С, pi I 8,61. Источник Гарга1. Источник Сея