Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эффекты дельта-сон индуцирующего пептида при гипоксии мозга

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Эффекты дельта-сон индуцирующего пептида при гипоксии мозга"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РФ ПО ДЕЛАЛ! НАУКИ И ВЫСШЕЙ ШКОЛЫ

РОСТОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Специализированный совет К 063.52.09 по биологическим наукам

ЭФФЕКТЫ ДЕЛЬТА-СОН ИНДУЦИРУЮЩЕГО ПЕПТИДА ПРИ ГИПОКСИЯ МОЗГА

На правах рукописи

МАЦИОНИС Александр

03.00.13 — Физиология человека и животных

14,00.17 — Нормальная физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ростов-па-Дону 1992

Работа выполнена на "кафедре"'физиологии человека и животных Ростовского государственного университета.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: доктор биологических наук

профессор КУРАЕВ Г. А.

доктор биологических наук профессор МЕНДЖЕРИЦ-КИИ А. М.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: академик Российской

АЕН, доктор медицинских наук, профессор АВТАН-ДИЛОВ Г. Г.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

доктор медицинских наук профессор ВИЛКОВ Г. А.

— Научно-исследовательский институт морфологии человека РАМН.

Защита состоится 24 декабря 1992 года

в /}(/ часов на заседании специализированного совета К 063.52.09 по биологическим наукам в Ростовском университете (344711, г. Ростов-на-Дону, ул. Большая Садовая, 105, РГУ, биолого-почвенный факультет, ауд. 304).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РГУ (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148).

Автореферат разослан 19 ноября 1992 года.

Ученый секретарь специализированного совета \л л/? доктор биологических наук /у/^1 В. Н. КИРОЙ.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследовании.

Данные последнего времени свидетельствуют, что взаимодействия между нервными клетками не ограничиваются лшаитичсскими связями и что огромную роль в этом нгра-от процессы регуляции и ауторегуляции на пре- и постси-[аптическом уровнях. В зтой связи отмечается повышении интерес к изучению эффектов регуляторных пептидов, «>торын связан с перспективой их практического использо-зания в ыеднцпне для коррекции функциональных сдвигов i центральной нервной системе при действии экстремальных факторов среды и некоторых патологических состоя-шй. Отличительной особенностью этих соединений является их способность регулировать сразу несколько функций )рганизма одновременно. В результате многочисленных исследовании эффектов и механизмов действия регуляторных юптидов была сформулирована концепция о регуляторном 1СПТПДН0М континиуме (И. П. Ашмарнн, 1986; И. П. Ашма-лш, М. А. Каменская, 1988). Биологические эффекты этих jemecTB уникальны: они влияют на память, обучение, ио-¡еденне, эмоциональный статус организма, путем измене-шя функционального состояния различных иейромедна-срных систем на рецепторпом н метаболическом уровне.

Дельта-сон индуцирующий пептид (ДСИП), который п тстоящее время относят к группе регуляторных нейропеп--идов, был выделен в 1964 г. в лаборатории Монье и Шонен->ергера как фактор гуморальной передачи сна (Monnier :! al., 1963). При введении этого нанопептида в электрокор-чгкограмме реципиента регистрируется появление дельта-шлновой активности, характерной для медленноволновой 1>азы сна, однако поведенческий сон при этом отсутствует. Зальнейшпе исследования позволили выявить целый спектр психофармакологических свойств у ДСИПа, среди которых штнстрессориые, хронобнологические и ряд других (Graf, \aslin, 1988; Graf Kaslin, 1989).

По современным представлениям ДСИП относится к ти-шчным нейромодуляторам, то есть к пептидам, реализующим свое действие через классические нейромедиаторные системы. Одним из интереснейших эффектов ДСИП являет-:я его способность к пролонгированному действию, по-види-

мому, опосредованному через адренсргическне механизмы. Введенный однократно в дозе 120 ыг/кг, пептид обнаруживает свои эффекты через одни, трое, семь суток (Т. И.Бон-даренко и солвт., 1986; А. М. Менджерпцкий и соавт., 1990; Г. А. Курае; и соавт., 1991). Имеются данные о его действии на адрснертичсскую и серотолпнершческую системы (Е. Л. Доведова, 1989; О г .1 Г, К;1>1ш, 1989). Исследования, проведенные к нлшей лаборатории,показали модуляцию пептидом активности системы ГАМК — основной тормозной системы ИНС (А. М. Мендлсерицкпй и соавт., 1987, 1991, 1992).

Изменения, происходящие в пейромедпаторных системах под влиянием ДСИП, доллены сопровождаться соответствующими нзмег зниями ультраструктуры синаптического аппарата. Однако наблгсдемый модуляторный эффект пептида находится в пределах физиологической нормы, вероятно, в связи с этим проведенный нами ранее визуальный анализ не дал конкретных доказательств альтерации структуры синапсов под влиянием ДСИП (Г. А. Кураев и соавт. 1991).

Наиболее эффективно модулирующие свойства ДСИП р^хллЕукь'ся на фоне стрессорных состояний. Наблюдается повышение устойчивости организма к разнообразным видам стресса — емоцпоналыго-бслсвому, холодовому, гипокинетическому, пммобнлизацпошюму (Е. В. Коплик и соавт., 1982; Е. 10. Крупенннкова п соавт., 1986; Ф. 3. Меер сон, 1986; А. М. Мендлсерицкпй с соавт., 1992).

В нашей работе в качестве экспериментального воздействия выбрана гппокснческая гипоксия, что обусловлено в первую очередь актуальностью зтой проблемы для клинической медицины. Необходимо отметить, что вряд ли есть друюс столь уннверсальное, тщательно исученное и нуждающееся в дальнейшем глубоком исследовании пэтологическоз состояние, как гипоксия мозга. Возможность использования адаптогениых свойств ДСИП для повышения устойчивости ткани мозга к кислородному голоданию представляется весьма перспективной с позиций таких областей практической медицины, как невропатология, анестезиология, нейрохирургия, реаниматология.

Цель н задачи исследования.

В этой связи в настоящей работе была поставлена цель — с помощью комплекса морфологических и биохимических методов изучить механизмы модулирующего действия ДСИГ1 на синалтнческнй аппарат неокортекса в норме и в условиях гнпоксической гипоксии.

Конкретными задачами работы являлись:

1. Исследование ультраструктуры III—V слоев сенсомо-ториой коры головною мозга крыс черев 4 часа после вну-трибрюшинного введения 120 мг/кг массы ДСИП и морфоме-трическая оценка ультраструктуры аксосоматнческих и ак-сошипиковых синапсов.

2. Изучение системы ГАМК — глутаматдекарооксилаза (ГДК) — глутаминовая кислота через 1 час и 4 часа после введения 120 мг/кг массы ДСИП крысам.

3. Изучение активности К + , Na <-—АТРазы и Cün н—t-—• АТРазы через 4 часа после введения 120 мг кг- массы ДСИП крысам в коре больших полушарий".

4. Исследование ультраструктуры III—V слоев сснсомо-юрной коры головного мозга крыс в условиях гипоксичес-кей гипоксии (0,029 МПа, 9000 м н. у. м., 3 часа) и при гипоксии на фойе предварительного введения ДСИП в дозе 120 мг/кг массы с морфометрическои оценкой ультраструктуры аксосоматнческих и аксошипиковыч синапсов.

5. Изучение системы ГАМК — глутаматдекарооксилаза (ГДК) —глутаминовая кислота в условиях гнпоксической гипоксии и при гипоксии на фоне введения 120 мг кг массы ДСИП крысам.

6. Игученис активности Nat—АТРазы п Са+ + — АТРазы при гнпоксической гипоксии и при гипоксии на фоне введения 120 мг/кг массы ДСИП крысам в митохон-дрнэльнои и синаптической фракциях коры больших полушарий.

Научная новизна работы.

В результате проведенных исследований впервые установлено, что модулирующее действие ДСИП на центральную нервную систему сопрсвоясдается изменениями ультраструктуры тормозных и возбуждающих спнаптических контактов. Впервые проведена не только качественная, но и количественная оценка выявленных ультраструктурных из-

менений аксосоматических синапсов в ответ на введение ДСИП.

Нами впервые показано, что ДСИП является модулятором спнаптической трансмиссии, поскольку в норме его действие зависит от функциональной принадлежности си-наптического контакта: пептид повышает эффективность тормозных аксосоматических синапсов, способствует их дополнительной знергизации, в возбуждающих синапсах происходит накопление общих синаптическпх везикул, однако эффективность спнаптической передачи, судя по количеству активных синаптических везикул и сужению спнаптической щели, падает. Количественная оценка синаптпческого покрытия пирамидных нейронов глубоких слоев коры показала увеличение этого параметра в ответ на введение ДСИП. Показано, что одновременно с изменениями ультраструктуры синапсов снижается активность Са + +—, К + , К'а + — АТРаз. Результаты морфометрического исследования синапсов коррелируют с полученными данными, свидетельствующими о накоплении в коре тормозного ненромедиатора ЦНС — ГАМК и падении уровня возбуждающего нейроме-диатора — глутаминовой кислоты через 4 часа после введения ДСИП.

Показано, что предварительное введение ДСИП нормализует большинство исследованных параметров тормозных и возбуждающих синаптических контактов коры, способствует развитию на электронномикроскопическом уровне адаптивных изменений в нервных и глиальных клетках, микроциркуляторном русле и нейропиле при гипокспчес-кой гипоксии.

Показано, что введение ДСИП за 1 час до помещения животных в барокамеру приводит в результате к снижению активности как Са + 4-, так и К+, К'а + +—АТРаз, в то время как сама гипоксия активирует К+, №а +—АТРазу и незначительно снижает активность Са+ + —АТРазы.

Установлено, что предварительное введение ДСИП способствует снижению уровня тормозного медиатора ЦНС — ГАМК, количество которого при гипоксии повышается более, чем в два раза и нормализует содержание возбуждающего нейромедиатора — глутаминовой кислоты, что свидетельствует о поддержании баланса между тормозным и возбуждающим нейромедиатором в условиях гипоксии при введении ДСИП.

Сопоставление результатов изучения влияния ДСИП иа развитие метаболических и ультраструктурных гнпоксиче-ских повреждений мозга позволяет заключить, что введение пептида мобилизует механизмы, обеспечивающие сохранение «нормального» физиологического уровня синап-тнческой регуляции в условиях экстремальных воздействий.

Основные п о л о ж е н и я, вынос и лт ы е на я а-щит у;

1. ДСИП является модулятором синаптической передачи, так как изменяет наиболее существенные параметры ультраструктуры двух функционально различных типов еинаггшческнх контактов коры — его действие способствует сшикеншо активности аксошигтковых синапсов и активирует аксосоматические синапсы, что свидетельствует о развитии торможения в ЦНС.

2. Введение ДСИП уменьшает активность N а, К + — и Сл-М АТРаз в мозге, что приводит к стабилизации ионных трансмембранных токов и, следовательно, к стабилизации функционального состояния пре- и постспнаптнческих структур мозга.

3. Ультраструктурная активация и увеличение числа, активных аксосоматпческих спнаптических структур при введении ДСИП коррелирует во времени с увеличением содержания тормозного нейромедиатора ГАМК.

4. Предварительное введение ДСИП регулирует развитие метаболических сдвигов в системе тормозного нейромедиа-тора ГАМК, препятствует активации N а -г-, К+ и Са+ь АТРаз, а также предотвращает некоторые лопрелсдения ультраструктуры, определяя адаптивный характер изменений в мозге при гипоксии.

Теоретическая и практическая значимость работы,

В работе получены данные, свидетельствующие о модулирующем эффекте ДСИП на функциональное состояние различных типов синапсов сенсомоторной коры. Причем ото модулирующее действие в условиях гипоксии имеет адаптивный характер. Адаптивная перестройка спнаптических структур, обусловленная введением ДСИП, сопровождается изменением активности транспортных АТРаз, опре-

деляющих интенсивность ионных потоков в синаптическпх образованиях, и функционального состояния тормозной системы мозга, поддерживая адаптивный характер баланса ГАМК/глутаминовая кислота в мозге.

Полученные в работе данные имеют практическое значение в связи с актуальностью проблемы гипоксии и ишемии мозга для клинической медицины. Современные специализированные области клинической медицины — невропатология, нейрохирургия, анестезиология, реаниматология и другие — нуждаются в глубоком исследовании структурных и молекулярных основ повреждения центральной нервной системы при кислородном голодании.

Ресультаты настоящего исследования указывают на перспективность использования ДСИП в клинической медицинской практике в качестве препарата, способствующего повышению адаптивных возможностей ЦНС в условиях гипоксии, тем более, что по ряду показателей ДСИП уже рекомендован Фармкомитетом Минздрава России в качестве лекарственного препарата.

Апробация работы.

Материалы диссертации докладывались на Рабочем совещании по нейропептидам (Ростов-на-Дону, 1991 г.) на X Международной конференции по неирокибернетнке (Ростов-на-Дону, 1992 г.), на заседании Российского общества патологоанатомов (Москва, 1992 г.).

Публикация результатов исследования.

По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Объем работы.

Диссертация изложена на 17? страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания постановки экспериментов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения и выводов.

Работа содержит 14 таблиц и 39 рисунков, в списке литературы приведено 257 источников, из них 112 иностранных авторов.

ПОСТАНОВКА ЭКСПЕРИМЕНТА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводили на самцах белых крыс массой 130 — 150 г. В экспериментах использовано 117 лсивотиых.

Проведены следующие серии экспериментов:

1. Внутрибрюшшшое введение ДСИП крысам в дозе 12 мг/кг массы, растворенного в физиологическом растворе, интервал времени — -1 часа. Контрольным животным лну-трпбрюшинно вводился физиологический раствор.

2. Действие гипоксической гипоксии при 0,029 МПа в течение 3 часов. Контролем служили животные, находившиеся в гипоксической камере в условиях нормоксин.

3. Действие гипоксической гипоксии при 0,029 МПа в течение 3 часов на фоне предварительного внутрпбрюшин-ного введения ДСИП. Пептид вводился за 1 час до помещения животных в гипоксическую камеру. Контролем служили животные первой серии, находившиеся в гипоксической камере в условиях нормоксин.

Гипоксическую гипоксию вызывали в барокамере проточного типа. Опыты проводили при атмосферном давлении в барокамере 0,029 МПа. Животные находились в барокамере в условиях свободного поведения. Крыс дскапитиро-вали через 4 часа после внутрибрюпшнной инъекции ДСИП, или через 3 часа после помещения животных в гипоксическую камеру.

Материал для электронной микроскопии получали тотчас после декапитации животного. Кусочки из коры головного мозга обрабатывали по общепринятой методике (Н. Т. Рапхлнн, 1977). Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме УМТП-6, контрастировали на сетках цитратом свинца п просматривали в электронном микроскопе ПЭМ-100.

Морфометрпческий анализ элсктроннограмм синапсов проводили на автоматизированном анализаторе изображения «ИБАС» («Оптон», Германия) с использованием разработанных программ и имеющегося программного обеспечения. На негативах, снятых при увеличении 15 000, производили детальное мсрфомстрическое изучение структуры аксо-соматнческих и аксошшшковых синапсов. Измерялись следующие структуры: иресинаптичоское окончание, синаптп-

ческие везикулы, активная зона, синаптическая щель, митохондрии. В акеошипиковых синапсах кроме того измерялся постсинапс (шшшк).

Оценка пре- и пссгсинаптическпх окончаний и митохондрий проводилась по следующим базовым параметрам: площадь, периметр, максимальный диаметр, минимальный диаметр, фактор формы. Для митохондрий вычислялось количество ерганелл в каждом пресинаптнческом окончании. Спнаптическне везикулы оценивались по следующим базовым параметрам: их общее количество в пресинаптнческом аксонном окончании, количество везикул вблизи активной зоны. Вычислялись следующие производные параметры: общая плотность еннаптнчеекпх везикул на 1 квадратный микрон пресинапса, число активных везикул на 1 микрон длины активной зоны, плотность митохондрий на 1 квадратный микрон площади пресинапса. Для активной зоны измерялась ее длина. Для синаптнческой щели измерялась се ширина в 10 случайно выбранных местах и давалось среднее значение.

Определение содержания ГЛМК и глутаминовой кислоты в мозге проводилось методом высоковольтного электрофореза на бумаге в К;а-ацетатном буфере (¿¡зкеи е! а1, 1961). Об активности ГДК судили по накоплению продукта реакции— ГАМК (5с1юи8с1ое ,1981).

Активность К + , Са ++АТРаз определяли в мито-

хоидриальноп и синаптической фракциях гомогената коры больших полушарий юловного мозга крыс, полученных методом дифференциального центрифугирования в градиенте плотности сахарозы (Ро^чз, 1981). Активность ферментов определяли по приросту неорганического фосфора при инкубации препарата в течение 15 минут в соответствующей среде. Активность +—зависимой К'а+, К+ АТРазы рассчитывали по разности между ебщей и Мц+т—АТРаз-ной активностью. Активность ферментов выражали в мкМ неорганического фосфора на 1 мг белка за 1 час.

Статпстичская обработка проводилась с использованием прикладного пакета статанализа к «ИБАС»у, производные параметры обрабатывались независимо. Оценка достоверности различий меисду средними величинами во всех сериях экспериментов проведена с использованием критерия Стью-дента, при этом достоверными считались различия с вероятностью не хуже 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Морфофутсциоиалыплй анализ сенсомоторной тгори мозга крыс при введении ДСИГ1

Электронномшсроскоппческий анализ сенсомоторной коры мозга крыс, проведенный спустя 4 часа после внутри-брюшинного введения ДСИГ1, показал, что в ядрах нейронов появляются инвагинации, наружный листок кариолеммы приобретает петлистый контур, к нему фиксируются цепочки рибосом, наблюдается конденсация ядерного хроматина. Перестройка ядерного аппарата нейронов соответствует его активации, что является предпосылкой усиления пластического обмена клеток (И. Б. Збарский, 1975; Г. Д. Туманишвили, П. В. Челидзе, 1983).

Об этом же свидетельствуют изменения в гладком и шероховатом зндоплазматичсском ретикулуме. Введение пептида приводит к значительной пролиферации всех его компонентов. Указанные сдвиги реактивного характера свидетельствуют об изменении метаболизма и транспорта белков через 4 часа после введения ДСИП. Митохондрии нервных клеток практически не изменены, не наблюдается активации лизосомального аппарата. Ультраструктура астро- и олигодендроцитов, а также капилляров соответствует норме.

Таким образом, ДСИП при впутрибрюшинном введении вызывает активацию ядерного и белоксинтесирующего аппарата нейронов и не оказывает повреждающего действия на ультраструктуру сенсомоторной коры. Наши результаты соответствуют полученным ранее при исследовании ультраструктуры сенсомоторной коры через 3 и 24 часа после вну-трибрюшинного введения ДСИП (Г. А. Кураев и соавт., 1991).

Злектронномикроскопическое исследование аксосомати-ческнх синапсов на пирамидных нейронах слоев Ш—У сенсомоторной коры через 4 часа после введения ДСИП позволило выявить в пресинаптичсских терминалях многочисленные мелкие фермы митохондрий с конденсированным матрпксом и плотно упакованными кристами.

Кроме того, необходимо отметить появление аксосомати-ческих синапсов с двумя активными зонами контакта с пласмалсммой пирамидного нейрона, образование цепочек ид сипаптических везикул. Изменяется ультраструктура

слшаптической щели — в ней четко визуализируются элек-тронноплотные тяжн, ориентированные от про- к постси-иаптической мембране.

В аксошипиковых синапсах наблюдается незначительная пролиферация мембран шппикового аппарата, вакуолизация отдельных его цистерн. Как правило, шипиковый аппарат располагается вблизи от активной зоны. Синаптическая щель в аксошипиковых синапсах хорошо выражена и заполнена злектронноплогным веществом. Количество синап-тических везикул и митохондрий в аксонных окончаниях при визуальном анализе выглядит неизменным.

Количественный морфометрический анализ базовых и производных параметров аксосоматических синапсов (табл. 1) показал, что при введении ДСИГ1 происходит расширение сннаптнческой щели на 7% (р<0,001), уменьшается площадь пресинаптическпх аксонных терминален, увеличивается плотность прееинаптических митохондрий на 50%. Анализ гистрограммы распределения митохондрий по площадям позволяет утверждать, что при введении ДСИП ин-тактным животным в аксонах аксосоматических синапсов образуется пул мелких, «юных» форм митохондрий. Кроме того, через 4 часа после введения ДС1'Ш в аксосоматических синапсах имеется тенденция к увеличению плотности синап-тическнх везикул. Длина активной зоны этого типа синапсов остается неизменной, однако анализ гистограммы по-своляет заключить, что распределение синапсов в соответствие с длиной активной ноны существенно меняется: большая их часть после введения пептида, судя по степени дисперсности, имеет среднюю длину активной зоны. Анализ спнаптического покрытия нейронов (отношение длины ней-ролеммы к длине расположенных на ней активных зон аксосоматических синапсов) позволил выявить тенденцию к увеличению этого показателя.

Морфометрический анализ аксошипиковых синапсов через 4 часа после введения ДСИП (табл. 2) показал, что в этом тьпе контактов под влиянием пептида происходит сужение синаптической щели на 9"» по сравнению е контролем. По-видимому, различная реакция аксошипиковых и аксосоматических синапсов на введение ДСИП связана с их различней функциональной специализацией. По современным представлениям аксошипшсовые синапсы являются возбуждающими, а акеосоматические — тормозными. Анл-

Табл.1.

МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ЛКСОСОДГЛТИЧЕСКПХ СИНАПСОВ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ДСИ11 И ГИПОКСИИ

- П.чр.-пкмр | ----- ЛСПП ; Гипоксия

1 |()рмп '! ч.-ю.ч | Г.;п:;КСНЯ ЛСПП

1. Oi1ni.cc ЧИСЛО 1-19 133 1-10 111

ешкшеов

2 Ширина спнпнгиче- 22,87 24,55":|й 25,79- 22,40

скоп me.ni (им) + 0.20 г 0,25 ±0,-17 + 0,20

5. П.чопииь иксом 0,58 0.50 ■ 0,52 0,17 ■

окончания (ки, мкм) + 0,02 _ 0,1)2 0,02 -ь0,С2

.1 Осщсе кол-но 59,0 5(1,:) 19,0"' ■17,5

нечпкул .1-2,9 - 2.9 2,3 -2. 1

И ОКОПЧ.'КПШ

5 Оощии и.'кгшш'и, 1 18,8 127,7 101,1 1 12.9

('»и. немжул ! 5,7 ' 5,.» ' 1.8 1 5,1

(ки мкм)

о Ко '¡ее 1 по 8,5 8.0 7.8 8.5

; 1 к 1 и и п 1>Г \ сип 1.0, .5 ; 0,5 1 0,:1 ■ 0,5

нечпкул

1 Число лкиник 8,5 8.0 7. К >' ; , с )

ичткул/м км ±0,8 0.» ± 0.:'!

ллпны ;п,! .чипы

8 Л.'шип актином о.з,^ 0,55 0,32й 0,3-1*

юны (мкм) ■ 0,01 ; 0,01 - ;-0,01 + 0.01

5) 1 !.'Ю1 нос гь 1.2 1.8"' ! ,9:

МПТОХОПДрПП + 0,1 -! 0. 1 ±0,2 ±0,2

(кп мкм)

1(1 Количеств) 0,77 0.90 0,Ь<) 0,82

митохондрии г1-0,06 +0 07 -.1-0,00

в окончлппп

(ки мкм)

Примечание: — р < 0,05 — р<0,01 — р + 0,001

Табл. 2.

МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ЛКСОСОИТИПИКОВЫХ СИНАПСОВ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ДСИГГ и ГИПОКСИИ

Параметр Норм,'!

ДС11П

4 часа

i 1шокс11я -

дсип

1. Оощсе чт\ю 150 еинапсон

2. Ширина спившие- 2G,If> CKoii шелн (им) Ч-Д.')1

3 Площадь ;ikciiii 0,31

окончания (кн. мкм) ±0,01

■1 Площадь шшшка 0.31:

(кн. мкм) ^0,01

Г). Число активных 9,81

ьезпкул на мкм. ±0,42 ак'нмш. чоны

О Общее колнчомло 48,27

нечикул ± 1,8 II окончашш

7. Оош,ая плотность 146,11

гни. пезикул ±-4,90

(кн. .мкм)

8. Длина активной 0,40 зоны (мкм) ^0,01

9. Плотность мнтохо I- 1,48 дрпй (К!!, мкм) ±0,17

10 Площадь поетениап- 0,01 1

тнческого унлотпе- ±0,0005 пня (кг, мкм)

150 150 150

24,05"' ±0,28 28.39' ±0,32 25,22 ±0^20

0,31 ±0,01 0,38s'' " ±0,02 0,30 ±0,01

0,28' '' ±0.01 0.30' ±0,01 0,3! ±0,01

9,01 ±0,42 8,48" ±0,28 12,6""'" ±0,48

5:'.4.i 48,99 52,51'"* ±2,1

179,78' (ИМ 136,23 ±3,82 lt;8,20's';' -■5,0(1

0,40 ±0,01 0,46-' ±0.02 0,42 ±0,01

1,57 ±0,18 1,15 ±0,13 1,04 ±0,17

0.012 ±0,0005 0.017' ' ' ±0,0009 0,095 ±0,0006

Примечание: * — р<0,05 ■''' - р<0,01 _ р<0,001

Изнененне активности ЛТР-аз нитохондриалыюй фракции коря йолынях полуилрий поз га крис пги иполршш ДСИН

¡1 д0;'!стг!!!;1 п'ноксин (i! / 1с контролю)

юох «о 00 40

го о --ЙО 40 60 ЙО 1C0Z

На •. К ♦ АТРлзл

[777\

лсип 1 час

деки ' час

12?3

///

///

/// ----

/// * И к

/// i у а

/// 1 « ш

/// * и а

/// I 1 1

/// » * V

/ !/ КИЙ

Са>< А'П'лзл

•гипоксия

ЕЛ

гнпоцспл

• лсшг

Рис. 2.

юох ао со чо 20 О — 20 '!() t.O 00 ЮОХ

Изменение активности "ТР-аз сннлптической фракции коры больпих полупария." нозга крыс при пвеяепии ЛСИП 1Í ЛОКСТПИИ ГИПОКСИИ 'I) '/■ к контролю)

(//] гипоксия к.1 t/K ► АТР.лза

//

fl

Слi< АТРазл I / /

гипоксия » ДСИII

Гас. .i. Солггчлнио ГАИК >: глутлмата. активность ГДК яри спрдсчши ЛСИП и r.sficTi.'iiH гипоксии н коре болылик полушарии мозга крыс (r¡ г к контролю)

103Z !Ю G0 '10 20 О -20 '10 60 Í10 100Z

Содержание ГАИК

активность

* ш

г ai

// 1 1

// 1 «

/ / « *

//

Содержание глутамлта

и; г п-\ ' ':, иг; А

- ПС ЯП 'I часа

LZZJ

гипоксии

и

гипоксия • ЛСИП

1 о Í и

лиз некоторых производных параметров аксошипиковых синапсов выявил неизменность таких параметров, как пло-шадь аксонного окончания, плотность пресинаптичаских митохсндрий, длина активной зоны. Площадь шипиков, которые, как известно, являются более пластичной частью ак-сошипиксвого синапса, под влиянием пептида уменьшается на 18«. Кроме того, в аксонных окончаниях увеличивается как количество (на 9"», р<0,01), так и общая плотность (на 23'', р<0,001) спнаптических везикул. Однако количество активных синаитических везикул при этом остается неизменным.

Таким обраЕм, электронномикроскопическое исследование двух типов синаитических контактов глубоких слоев сонсомоторнсй коры через 4 часа после внутрибрюшинного введения ДСИП позволило выявить признаки активации тормозных аксссоматических синапсов, о чем свидетельствует ультраструктура митохондрий, синаптической щели, расположение спнаптических везикул. Наши результаты соответствуют полученным ранее при электронномикроско-ппческом исследовании сенсомоторной коры крыс через 24 часа после введения той же дозы ДСИП (Г. А. Кураев и со-авт., 1991). Изменения ультраструктуры аксошипиковых синапсов при нашем режиме эксперимента заключаются в пролиферации шипикового аппарата, уменьшении площади шиппка, увеличении плотности спнаптических везикул. Однако в целом информативность аксошипиковых возбуждающих синапсов под влиянием ДСИП снижается судя по уменьшению ширины синаптической щели и неизменному количеству активных везикул на единицу длины активной зоны.

Очевидно, что одним из самых существенных компонентов системы поддержания функционального состояния синапсов является активность транспортных Г\!а+,К+ и Са-Н-—АТРаз.

В этой связи нами проведено исследование активности последних в сенсомоторной коре больших полушарий мозга крыс при гипоксии и введении ДСИП. Полученные результаты показывают, что через 4 часа после введения ДСИП (рис.1) в митохондриальной фракции неокортекса активность N £1+, К + —АТРазы снижается на 62% (р< 0,001), а Са + +АТРазы на 25*" (р<0,01), что может свидетельствовать об определенной стабилизации иотенциалозависнмьтл процессов в синапсах.

Выявленная активация яксосомятических синапсов, которые относятся ко II типу по Грэго (1965), то есть, к тормозным, обусловила необходимость исследования основной тормозной системы мозга — системы ГАМК.

Установлено, что через 1 час после внутрибрюшинного введения 120 мг/кг массы ДСИП содержание ГАМК в коре крыс остается неизменным. Накопление этой аминокислоты начинается в более поздние сроки и через 4 часа отмечены уже статистически достоверные отличия. Уровень ГАМК у животных этой группы составлял 2,75^0,05 мкМ/г •гкапн, что на 33% (р< 0,05) выше контрольных величин (рис. 3). Паши данные согласуются с результатами, полученными при исследовании пролонгированного действия ДСИП на содержание ГАМК (А .М. Менджерицкий и соавт., 1990).

Параллельно с увеличением содерясания ГАМК происходит незначительное уменьшение количества глутамино-вой кислоты, из которой при участии ГДК синтезируется спнаитосомальная часть ГАМК (К. С. Раевский, В. П. Георгиев, 198G; Sze, 1978). Через час после введения пептид i уровень глутамннсвой кислоты так же как и ГАМК соответствует контрольным величинам и составляет 7,54±0,19 мкМ/г ткани, а спустя 4 часа снижается на 10'" по сравнению с контролем (р<0,05). Очевидно, выявленное нами увеличение количества ГАМК связано с другими источниками и другими путями синтеза, что подтверждается также результатами исследования активности ГДК, которая через четыре часа после введения ДСИП также уменьшается на 24% (р<0,05). Известно, что, помимо нейромедиаторной функции, которая приурочена к синапсам, образованным ГАМК-ергическими нейронами, ГАМК активно включается в энергетический метаболизм (Scliousboe, 1981).

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют, что внутрибрюшшшое введение ДСИП крысам индуцирует развитие в ГАМК-ергической системе мозга изменений, соответствующих активации тормозных процессов. В течение, четырех часов происходит постепенное повышение уровня ГАМК — тормозного нейромедиатора,, и некоторое снижение содержания возбуждающего нейромедиатора глу-таминовой кислоты. Судя по активности ГДК эти изменения реализуются другими, не глутаматдокарбоксилазными путями синтеза ГАМК, или же связаны с уменьшением использования тормозного медиатора.

Морфофункциональный анализ сенсомоторнои коры мозга крыс при гипоксии и введении ДСИП

При электронномнкроскопнческом исследовании сенсомоторнои коры крыс, перенесших 3-часовую гипоксию (8.000 м н. у. м.. 0,029 МПа), установлено, что в наибольшей степени повреждаются нервные клетки с темной цитоплазмой. Количество таких темных нейронов при гипоксии значительно увеличивается. Наблюдается резкое расширение цистерн эндонлазмагического ретикулума, пролиферация пластинчатого комплекса, повышение осмиофилии ядер, исчезновение ядрышек, значительно повреждаются митохондрии нейронов. Кроме того, увеличивается количество первичных и вторичных лнзссом (аутофагосом), липнд-ных капель, появляются миелиноподобные структуры, что свидетельствует об активации ПОЛ и протеолитических процессов в клетках. Наши результаты соответствуют литературным данным, по классификации В. А. Шахламова (1983), исследуемую нами стадию гипоксии следует отнести к стадии обратимых изменений.

Введение ДСИП за 1 час до помещения животных в гч-псксическую камеру приводит к снижению электронной плотности цитоплазмы большой части пирамидных нейронов. Признаки деструктивных изменений выражены в меньшей степени. Следует отметить изменение межнейроналъ-ных и нейро-глиальных взаимоотношений — нервные и гли-альные клетки нередко контактируют значительными по протяженности участками плазмалемм, в этих местах образуются субповерхностпые цистерны и поры.

Аксосоматические синапсы выглядят более сохранными, в отдельных аксонных окончаниях наблюдается адгезия синаптических везикул в центральной части аксоплазмы или у активной зоны, формирование цепочек из синаптических везикул.

В аксошипиковых синапсах по сравнению и с гипоксией и с нормой отмечается дробление активной зоны контакта. По мнению некоторых авторов, подобный феномен соответствует активации синаптической передачи (В. П. Бабмин-дра, Т. А. Брагина, 1989). Кроме того, следует отметить, что визуально по сравнению с гипоксией происходит значительное изменение формы лостсинаптической части контакта: шейка шипика вытягивается и в нее переходит шипиковый аппарат.

./1

ir

M

uff f !¡ JJjl

á¡ÉL.

Л

m гч

л

i-X

Г'

i

ш

iku

U.

■t.

ïlïùà

___

! ! ;" ■■.

ill!IN ,

I'm-. 4, Гпскл'ра.-л.чн распределения аксошнпнкопых синапсов 'в i4,o'¡ nercT.'üiii с площадями постспнаптпческих уплотненна при введении ДСШГ н деиавпи гипоксии. Спилу вверх: контроль, ДСИП 4 часа, гипоксия, гипоксия на фоне ведения ДСИП.

Таким образом, электрснномикроекопический анализ показал, что предварительное внутрибрюшинное введениз ДСИП еншкает степень повреждения в глубоких слоях коры головного мозга при действии гипоксии.

Морфометрический анализ ультраструктуры аксосома-тичзскх синапсов при гипоксии (табл. 1) показал, что сп-наптнческая щель в тормозных синапсах увеличивается на 13' • (р<0,003). Предварительное введение ДСИП предотвращает изменение ширины синаптической июли, и отот показатель остается на уровне контрольных значений. Эффект введения ДСИП за час до гипоксического воздействия проявляется в уменьшении площади пресинаптических аксон-ных терминален, даже более значительном, чем при введении интактным животным (на 20' •■). Крме того, снижается общее количество везикул в окончании, длина активной зоны несколько нормализуется под влиянием пептида, плотность митохондрий в обеих сериях экспериментов увеличена, по-видимему, за счет реактивного набухания.

Исследосание аксошшшковых синапсов (табл. 2), показало, что этот тип синапсов реагирует на гипокеические условия так же, как агссосоматические — расширением синаптической щели (на 9'1, р<0,001), предварительное введение ДСИП нормализует зтет параметр. Площадь аксоч-ного скончания при гипоксии значительно увеличивается, а шцпика — уменьшается, причем, предварительное введение ДСИП нормализует оба параметра. Кроме того, действие пептида приводит к существенному, даже по сравнению с контролем, увеличению плотности как общих, так и активных спнаптических везикул, причем, плотность актив-пых везикул при гипоксии без ДСИП достоверно снижена.

Величина постсинаитического уплотнения б ассиметрич-ных спнаптических контактах является весьма показательным параметром, поскольку подвержена изменениям при различных патологических процессах. В наших экспериментах гипоксия увеличивает площадь иостсинаптического уплотнения на 37%, предварительное введение ДСИП приводит к нормализации этого параметра. Однако исследование гистограммы фактора формы иостсннаитпческго уплотнения (pire. 4) позволяет заключить, что уплотненность или нерегулярность структур псстсинаптичезкого уплотнения в некоторой степени сохраняется и при сочетанием действие ДСИП и гипоксии.

Таким образом, визуальное и морфометрнческое исследование ультраструктуры аксссоматпческих и аксошипико-вьгх синапсов показало, что ДСИП оказывает различное действие на эти типы контактов в норме. При гипоксии предварительное введение ДСИП в целом нормализует ультраструктуру сепсомсториои коры и большинство исследованных параметров аксссоматпческих и акссшнпиковых синапсов, что молсет свидетельствовать о защитном действии пептида.

Развитие гипоксии приводит к неоднозначным изменениям активности исследованных АТРаз в мптохондрналь-ной и сичаптической фракциях (рис. 1, 2). Активность \!а -1-, 1С:-АТР-аны в исследовагшом режиме гипоксии незначительно изменяется, как в суммарной митохондриальной фракнии, так и во фракции синаптосом (активность повышена па 18"» в митохондриальной и на 17'" в синаптичес-кой, р<0,01). Р> то лее время снижение активности Са - + — АТРазы к сннаптической фракции на 35 ' ■ (р<0,01). сопровождается значительным, (на 115"", р<0,001) увеличением активности Са+ - — АТРазы в митохондриальной фракции. По нашим данным, активность Са+ +—АТРазы в спнаптнческсй фракции в 6 раз выше, чем в мнтохондри-альнсн. При гипоксии, по нашим данным, угнетается активность синаптическон С а+4-—АТРазы, на фоне увеличения в 2 раза суммарной активности этого фермента, то есть ингнбируется кальциевый ток спнаптических мембран.

Введение ДСИП за час до помещения крыс в гнпокепче-ску.ю камеру позволило выявить определенную специфичность реализации эффектов ДСИП на уровне транспортных АТРаз. Так, уровень активности N34 , К+ АТРазы в мито-хендриальной фракции соответствует контрольному уровню, в то время как во фракции синапсов выявляется снижение се активности на 70% (р<0,01). Динамика изменения активности Са-М-—АТРазы в митохондриальной и сннаптической фракциях прямо противоположны друг другу: увеличение активности на 66"» (р<0,01) в митохондриальной, и снижение на 48% (р<0,01) в сннаптической фракции. Следовательно, как гипоксия, так и гипоксия на фоне предварительного введения ДСИП стимулирует повышение активности Сл+г—АТРазы, определяемой в митохондриальной фракции и ее снижение во фракции синаптосом.

Анализируя влияние предварительного введения ДСИП на состояние системы ГАМК — глутаматдекарбоксилаза —

глутаминовая кислота при гипоксии по данным рис. 3, в первую очередь следует отметить тенденцию к нормализации всех трех показателей. Введение ДСИП препятствует резкому увеличению уровня ГАМК, характерному для 3-часового гипоксического воздействия. Количество аминокислоты у этой группы животных было на 41'" ниже (р<0,05), чем у крыс, которым предварительно до помещения в барокамеру не вводился ДСИП, и всего лишь на 31"» выше, чем у контрольных (р<0,05). Содержание ГАМК в этой серии статистически достоверно не отличается от уровня нейромедиатора в мозге у животных через 4 часа после введения ДСИП.

Таким образом, действие ДСИП при гипоксии направлено на поддержание количества ГАМК на уровне, характерном для интактных животных с введением ДСИП. Такая умеренная активация ГАМК-ергической системы должна предотвращать истощение ее компенсаторных возможностей при более длительных повреждающих воздействиях. Судя по данным рис. 3, подобный уровень ГАМК обеспечивается не за счет активности ГДК. Последний показатель практически не отличается от такового у животных предыдущей серии, которым перед гипокснческим воздействием не вводили ДСИП. Глутаматдекарбоксилазная активность в этой серии экспериментов равна 1,07 мкМ ГАМК/г ткани за 20 минут, что на 42% ниже, чем контрольные показатели активности фермента.

Интересно, что предварительное введение ДСИП, как видно из данных рис. 3, полностью предотвращает падение на 46' и уровня глутаминовой кислоты, вызываемое гипоксией. Содержание глутамата в мозге у крыс этой серии равно 7,08 мкМ/г ткани, что превышает показатели, полученные для интактных животных через 4 часа после введения ДСИП и статистически достоверно не отличается от контрольных значений.

ЗАКЛЮЧЕН И Е

Рассматривая механизмы биологического действия ДСИП, следует прежде всего учитывать отсутствие к нему рецепторов, что определяет модулирующий характер эффектов этого пептида. По современным представлениям, ДСИП относится к нейромодуляторам и реализует свое дей-

ствие через классические нейромеднаторпые системы. В настоящей работе получены данные, свидетельствующие о модификации ультраструктуры двух функционально различных типов синапсов сенсомоторной коры под влиянием ДСИП, причем эффект пептида определяется функциональной принадлежностью синапса. Полученные нами данные относительно ультраструктурных сдвигов в аксосоматиче-ских и аксошипшсовых синапсах, по-видимому, отражают вовлечение различных нейромедиаторных систем в реализацию модулирующего действия ДСИП. Влияние ДСИП на ультра структуру и функциональное состояние синапсов может, по нашим данным, осуществляться на уровне изменения активности К!а + , К + , Са++АТРаз, определяющих транспорт ионов через синаптическпе мембраны. Исследование системы ГАМК — глута^атдекарбоксилаза — глутами-ноьая кислста при введении ДСИП подтвердило полученные ранее результаты о модулирующем влиянии пептида на эту нейремедиаторную систему (А. М. Менджерицкий и соавт., 1990). Необходимо отмстить, что полученные при морфометрическом исследовании данные об активации тормозных аксосоматических синапсов (II тип по Грэю) и подавление эффективности возбуждающих аксошиппковых синапсов (1 тип по Грэю), хорошо согласуются с накоплением в структурах коры ГАМК и падением уровня глутамата в те же сроки после введения ДСИП.

В условиях гипоксии в сенсомоторной коре развиваются ультраструктурные повреждения аксосоматических н аксошиппковых синапсов, что характерно для данного патологического состояния (Н. А. Боголепов, 1979). По $ашнм данным, этот процесс сопровождается изменением активности изученных АТРаз как в митохондриальной, так и в си-наптичсской фракции. Повреждение мембранных структур при гипоксии в первую очередь определяется активацией в них системы перекисного окисления липидов, что и приводит к нарушениям активности транспортных АТРаз. Известно, что введение ДСИП предотвращает накопление конечных продуктов переокисления — малонового диальдеги-да и регулирует активность супероксиддиссмутазы (А. М. Менджерицкий и соавт., 1991), что может являться одним из механизмов адаптивного действия ДСИП при гипоксии.

Следовательно, в условиях гипоксии индуцированное пептидом состояние преадаптации реализуется на ультра-етруктурном и метаболическом уровне нормализацией большинства исследованных нами параметров, характеризующих сннашическиэ структуры, и созданием оптимального баланса в системе ГАМК—ГДК—ГК.

ВЫВОДЫ:

1. Дельта-сон индуцирующий пептид является модулятором синаптической передачи. Введение его в дозе 120 мг/кг массы повышает эффективность работы тормозных аксосоматических синапсов и снижает эффективность работы возбуждающих акссшипиковых синапсов.

2. Введение ДСИП через 4 часа приводит к снижению активности К+, Ка+ (на 62%) и Са+ +—АТРаз (на 25%).

3. Введение ДСИП через 4 часа активирует основную тормозную систему моз1а, что проявляется в увеличении содержания ГАМК на 33% и снижении содержания глута-миновой кислоты на 10%.

4. Введение ДСИП, предшествующее помещению животных в гипоксическую среду (0,29 МПа, 3 часа), предотвращает развитие ультраструктурных изменений синаптичес-кнх структур, характерных для гипоксической гипоксии.

о. Сниженный уровень активности К.+ , Ка+АТРазы (70%) и Са + +АТРазы (48%) в синаптической фракции коры больших полушарий сохраняется при помещении животных в гипоксическую камеру после предварительного введения ДСИП, в то время как развитие гипоксической гипоксии сопровождается активацией К+, Ь'а+АТРазы (17%) и незначительным снижением активности Са+ + АТРазы.

6. Предварительное введение ДСИП предотвращает развитие изменений в соотношении ГАМКч лутампновая кислота, характерных для гипоксической гипоксии.

7. Модуляция синаптической передачи, которая индуцируется введением ДСИП в условиях гипоксии, носит адаптивный характер, о чем свидетельствует нормализация большинства исследованных параметров ультраструктуры н метаболизма.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мацнонис А. Э., Повилаитнте П. Е., Кураев Г. А. Особенности реакции синапсов сенсомоторной коры на введение дельта-сон индуцирующего пептида. // Сб. Проблемы нейрокнбернетикп. — Рсстов-ня-Дону, 1992. С. 300—302.

2. Мацнонис А. Э., Повнлайтпте П. Э., Ускова Н. И. Влияние дельт а-сон индуцирующего пептида на ультраструктуру синапсов нсокортекса при гипоксии. —■ // Сб. Проблемы нейрокибернетики. — Ростов-на-Дону. 1992. С. 302—303.

3. Мснджерицкпй А. М., Михалева И. И., Мацнонис А. Э., Повиллйтнте П. Э. Дельта-сон индуцирующий пептид кок модулятор ультраструктуры синапсов. — //Архив апат. гнетол. эмбрнол. — 1992. 11. С. 9—11.

■1. .Mcnd^erisky Д. .W., .Matsioms А. Е„ Povilaitite Р. Е., Л\ог-foinctnc rcseaeh of a.\ij-s<jm ;i 1 i г synapses of ral brain cerebral cortex under DSIP administration, //in the book «Delta-sleep indiicin«' peptide». — Rostov-Don. — 1992. ?, 17.

5. Kuraev (1. Д., A\atsionis A. E., Poxilaitite P. E. The influence of DSIP upon the a.xo-somatic synapses cerebral cortex under lixpoxia. //in (lie book «Delta-sleep indiiciiiy peptide». — Rostov-Don. — 1992. F, 11.