Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эффекторные и регуляторные механизмы иммунитета при фасциолезе и пути их коррекции

ВАК РФ 03.00.20, Гельминтология

Автореферат диссертации по теме "Эффекторные и регуляторные механизмы иммунитета при фасциолезе и пути их коррекции"

¡и - л 9 3

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СМЬСКОШШСТВШШХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛВДОВАТтСКИЙ Ш1СТИТУТ ташингоюшн имени ахадешжа К.И. СКРЯБИНА

эффекторные и рег/ляторные механизмы ИММУНИТЕТА при фасциолезе и юти и коррекции

Специальность 03.00.20 - гелшинтология

автореферат

. диссертации на соиоканнв ушной огаиони кандидата ветврвнарннх наук

На правах рукописи

ВАТНИКОВ Юрий Анатольевич

Ыоеива « 1992

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте гельминтологии имени академика К.И. Скрябина (ВЙГИС).

Научный руководитель - доктор ветеринарных наук,

профессор Э.Х. Даугалиева

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор Н.В. Демидов доктор медицинских наук, профессор Р.И. Атауллаханов

Ведущая организация - Московская ветеринарная академия имени академика К.И. Скрябина

Защита диссертации состоится ^^ 199^ г.

Д-020.04.'I при Всероссийском научно-исследовательском институте гельминтологии имени академика К.И. Скрябина. Адрес: 117259, Москва, В. Черемушкинская, 28

С диссертацией можно Ознакомиться в библиотеке ВИГИС.

в ¿"«у часов на заседании специализированного совета

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного сов кандидат биологических

Вертинская

Актуальность проблемы. Фасциолез является одним из наиболее распространенных гелъшштозов сельскохозяйственных зшвотшх, наносящих значительный ущерб животноводству (Н.В. Демидов, 1963, 1965, 1979; H.A. Бабящдас, 1969; O.A. Кублицкене, 1962, 1963, 1971; Т.П. Ввселова, 1964, 1966, 198?; A.M. Сазанов, 1976 и др.).

Нередко многократные (6-7-8) дегельминтизации но дают положительного эффекта (В.В. Горохов, 1983).

На наш взгляд, одним из ключевых моментов в решении пробле ыы профилактики и борьбы с фасдиолезом может быть расшифровка механизма иммунитета с использованием новых методологических подходов. Познание закономерностей формирования иммунитета (Э.Х. Ддугалиева с соавт., 1991) уже сейчас позволяет сделать вывод о том, что иммобилизация защитных систем любого организма дает возможность в одном случае снизить кратность применения химико-фармацевтических средств, в другом - повысить их терапевтическое действие. Один из способов достижения этой дели -использование иммуномодуляторов, способствующих повышению иммунобиологической реактивности организма и, как следствие, снижению патогенного воздействия паразита на организм хозяина. В связи с этим.необходим поиск средств и методов иммунорегуляции организма на основе расшифровки клеточных механизмов взаимодействия в иммунной системе и создания рациональных методов им-мунокоррегирумцей терапии.

В настоящее время разрабатываются новые подходы к соащишв вакцин, основанные на принципе фенотюшческой коррекции (Р.П.Пот ров и др., 1983, 1985).

Работа выполнялась по государственной тематике Й гос. регистрации 81059328.

Цель работы - изучить роль эффекторких и регуллторных механизмов иммунитета на спонтанно и экспериментально знрозкшшх фасциолазйм животных и изыскать способы к'.с коррекции.

Задачи исследований:

- изучить динамику Т- и В-аистеи иммунитета у яш.л ¡:j:u спонтаг "ом и экспериментальном заражении г-шп-лгяарлдаи ¡..... ,

ВВЕДЕНИЕ

ч

- исследовать и охарактеризовать изменения Т-клеточной системы иммунитета на субпопуллционном уровне;

- изучить динамические изменения макрофагальнсй активности и специфического иммунного ответа;

- охарактеризовать основные закономерности клеточных и гуморальных механизмов иммунитета у животных, экспериментально и спонтанно зараженных адолескариями фасциол;

- изыскать средства и разработать методы фенотшшческой коррекции, выявить действие конъюгированных препаратов на различных этапах инвазии.

Научная новизна. Впервые при фасциолэзе в эксперименте и на спонтанно зараженных животных изучен иммунный статус. Установлено, что заражение ягнят адолескариями фасциол вызывает им-ыуносупрессию, сопровождающуюся изменениями в динамике Г- В-лимфоцитов и макрофагов. Установлена коррелятивная связь отдельных показателей иммунной системы хозяина. Впервые изысканы конъюгированные препараты, повышающие иммунный статус животных и обладающие протективннми.свойствами.

Практическая ценность раЗотц, Материалы работы вошли в:

1. "Методические рекомендации по изучению механизма иммунитета 11рп гельминтозах и определение иммуногенных свойств препаратов", утвержденные Отделением ветеринарной медицины БАСХНИЛ от 5.09.90 г.

2. "Методические рекомендации по применению иммуностимуляторов для профилактики гельмингозов и повышения резистентности животных", утвержденные ВШНИЛ 28.08.90 г.

Положения, выносимые да защиту:

1. Развитие эффекторных и регуляторных механизмов в иммунном ответе при фасциолезе овец;

2. Оценка Т- и В-сисгем иммунитета при спонтанном и экспериментальном фасциолезе;

3. Иммунокоррегиругацее действие комплексов антиген-полиэлектролит;

4. Протективное действие комплексов АГ-полиэлектролиг при спонтанном и экспериментальном фасциолезе овец.

Дпсобация результатов. Материалы диссертации доложены:

I. На конференции молодых ученых и специалистов (Москва, ВИГИС, 1990);

£

2. На конференции ВОГ "Метода профилактики и борьбы с три-«одозвми -человека и жиботншс", (г.Сумы, 9-II октября 1991 г.);

3. На заседаниях Ученого совета ВИГИС (Москва, ï990-1991 эды).

Публикации. По теме диссертации опубликованы*три статьи.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на^ границах машинописного текста. Состоит из введения, обзора итературы, собственных исследований, вюшчающих раздел "Ма-ериалн и методы"; разделов экспериментальных данных и обсуждения; заключения; общих выводов; списка литературы, включаадего '¿2/ отечественных и «^¿¿«'зарубежных источников. Работа иллюст-«рована Jlf таблицами и/¿¿""рисунками.

СОБСТВЕННЫЕ ИССВДОВАШ1Я I. Материалы и методы

Настоящая работа выполнена в I9B9-I992 гг. Эксперименталь-гая часть проведена в лаборатории иммунологии и генетики ВГО1С, ta экспериментальной базе Курнлово и Красногвардейском районе Зелгородской области. Производственные испытания препаратов про-зедекы в Турумовском районе Дагестана совместно с зав. кафедрой .таразитологии а вет.-сан. экспертизы Дагестанского СХИ профессором A.M. Атаевым и в Уреньском районе Нижегородской области совместно со старшим научным сотрудником НШ Нечерноземной зоны г. Н-Новгорода Горчаковым В.В.

В основу работы положены 6 опытов, проведанных на овцах пород финский ландрас, прекрс и грозненская, в количество \1ь голов.

Перед постановкой опытов животных подвергали гельминтологическому обследованию методом последовательных смывов. В работе использовали препараты, изготовленные сотрудниками B1UMG совместно с Институтом иммунологии Министерства здравоохранения России.

Введение конъюгированних препаратов проводили двукратно с интервалом в 21 день, внутримышечно во внутреннею поверхности бедра. Для заражения использовали культуру адолескарие-^ .... i .. ala he;:>itLci любезно продосгавленную нам с.u.c. 1U31 11.3. Горчаковым 1J. В.

sf

Для иммунологических исследований использовали гепарияизи роЬанную кровь и сыворотку.

Выделение лимфоцитов крови в градиенте плотности, впослед ствии используемых в иммунологических тестах, выполняли по А. Волга (1968).

Определение количества Т—лимфоцитов (Е—РОК) проводили в реакции спонтанного розеткообразования о эритроцитами кролика по методу M.Jondal (1972).

Т-упрессоры и хеллеры (ТФЧ; ТФР-РОК) определяли по методу S.Lifflatibui et al.(1978), идентификация В-клеток (ЕАС-РОК) проводили по методу H.S.Mendea et al. (1973), фагоцитарную активность макрофагов (НСТ-тест) - по методу a.segal 0984).

Полученную сыворотку использовали в реакции имиуноферменг-ного анализа (elisa, по методу H.Frimei, G.Holaheidt

(1987). В качестве антигена использовали цельную белковую фракцию в концентрации 3 мг/мл, предоставленную нам сотрудником нашей лаборатории Пивораровым Н.Г. Результат учитывали на фотомет ре при длине волны 492 нм.

Статистическая обработка данных проведена по методу Стъю-дента.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1. Иммунный статус ягнят при экспериментальном фасциолезе

В опыт были взяты 10,ягнят 4-4,5-месячного возраста} животных разбили на две rpyftfiu по принципу аналогов: животных 1-ой группы заразили адолескариями фасциол в дозе 100 экз. на голову, 2-ая служила незаражвкным контролем.

Динамика Т-лимвомтов. Достоверная разница в общем количестве Т-лимфоцитов отмечена нами на 5-й день после заражения. С 10-го дня наблюдали снижение общего количества Т- лимфоцитов-у подопытных ягнят. На 15-И день после .-заражения продолжалось снижение E-F0K в 1-ой группе ягнят до 1191,6 ± 33,6 кл/мкл. С 30-го дня констатировали тенденцию к увеличению общего количества Т~ лимфоцитов в опытной группе, на 45-й день количество Е-РОК достигло 1853,6 ¿-158,5 кл/мкл. Количество Т-клеток у ягнят 1-оЙ группы продолжало накапливаться и достигло уровня 2027,4 t 91,4 E-FOK/мкл, при показаниях контроля 1522,6 - 44,8 F-ИЖ/мкл. К концу наблюдений (75-й .день) щхмкчпяво резкое па-

эние Т-клеточной популяции до уровня 1127,6 ± 129,2 кл/мкл, го было ниже контроля в 1,3 раза.

Динамика Т-хелперов. Фоновые значения Т-хеллеро» были в ределах 815,7 ± 55,2 - 766,6 ± 60,4 ГФР-РОК/мкл (1-ая и 2-ая руган, соответственно). На 5-й и 10-й дни после заражения ко-ичество Т-хелперов в крови ягнят 1-ой группы снизилось до уров-я 269,4 ± 85,0 кл/мкл против 312,2 ± 31,5 кл/мкл в контроле, вкоторою стабилизацию клеточных популяций в крови ягнят обеих рули отметили на 15-ый день, но уже к 30-му дню исследований оличество Т-хелперов в крови ягнят опытной группы вновь уменьшись с 745,9 ± 65,4 кл/мкл до уровня 321,3 ± 59 кл/мкл. В дльнейшем не выявлено каких-либо изменений в динамике Т-хелпо-юр и только к 75-му дню в«крови зараженных ягнят наметилось накопление клона Т-хелперов и числовые значения их приблизились : показателям контроля (702,9 ± 121,0 ТФР-РОК/мкл).

Динамика Т-супрессоров. Изменение супрессорной активности '-лимфоцитов отметюш уже на 5-8 день после заражения. Коли-1ество ТФЧ-РОК с 545,2 - 84,3 кл/мкл поднялось до уровня 1455,2-65,5 ТФЧ-РОК/мкл. На 10-Й день количество Т-супрессоров снилось, но было достоверно выше, чем у контрольных животных. Тозднее у ягнят 1-ой группы абсолютное количество ЮТ-РОК уве-иичилось до 1.014,7 - 46,5 ГФЧ-РОК/мкл и продолжало расти вплоть но 60-го дня опыта и их количество составило 1460,7 - 75,1 кл/мкл, при показаниях контроля 681,5 - 57,6 ТФЧ-РОК/мкл. К моменту окончания опыта у зараженных ягнят резко изменилось количество Г-лиы-фоцитов и числовые значения снизились до 646,3 - 33,7 ТФЧ-РОК/ыкл, что достоверно отличалось от чистого контроля - 874,9 - 77,4

Динамика фагоцитарной активности макрофагов. Через 5 дней после заражения количество макрофагов составило 135,8 - 14,8 кл/мкл в 1-ой группе и 92,6 - 3,2 - во 2-ой. На 10-й дань наблюдений отмечено увеличение количества макрофагов в зараженной группе животных до 212,4 ± 17,6 кл/мкл, что было на 50* выао, в контроле. Абсолютное количество макрофагов достоверно сннаи-лось на 15-й день до 95,5 * 1,3 кл-мхл. Затем ах количество у ягнят 1-ой группы постепенно повышалось а на 45-й день ¿»ига составило 221,6 ± 16,7 кл/мкл, что достоверно отличаиось о? контрольной группы, гАО показатель НСТ-геста находись кч oî-метке 145,6 ¿11,5 кл/мкл (р< 0,01).

»

К 60-му дню отмечали вновь снижение макрофагов у ягнят 1-оЙ группы до 113,2 ¿1,7 кл/мкл, а к 75-му дню количество НСТ-гюлсжителъных клеток снизилось до 78,1 - 17,8 кл/мкл. У контрольных ягнят количество макрофагов было в пределах 156,9 ± 24,0 кл/мкл.

Динамика В-лимЬоцитов. После заражения ягнят культурой адолескариев, количество B-клеток в крови опытной группы составило 1258,1 ± 45,1 ЕАС-РОК/мкл, чг'о в 1,9 раза превышало показатель контроля. Затем произошло резкое снижение количества В-лимфоцитов и на 10-й 'день опыта числовые значения составили 815,8 ¿19,9 .кл/мкл в контроле и 713,4 ~ 20,3 кл/мкл в зараженной группе. Снижение уровня B-лимфоцитов в крови ягнят 1-ой группы выявили на 30-й и 45-й дни и достоверность различий мезду двумя группами составила Р ^ 0,01. К 60-му дню показатель активности В-лимфоцитов в 1-ой группе не отличался от такового в контроле, их значения колебались в пределах 647,0 ± 13,5 - 962,5 ± 51,3 ЕАС-РОК/мкл, соответственно. На 75-й день эксперимента наблюдали повышение абсолютного количества ЕАС-РОК в группе зараженных ягнят до 733,7 - 63,'6 ,кл/мкл, при показаниях чистого контроля 1067 -92,3 ЕАС-РОК/мкл.

Динагчка специфического иммунного ответа. Фоновые значения количества антител в начале эксперимента находились в пределах 0,032 ± 0,002 - 0,027 - 0,002дЕ. После заражения ягнят на 5-10-й дни наблюдалось резкое увеличение количества антител, а к 15-му дню их количество снизилось. Затем титр антител вновь увеличился до 0,017 ~ 0,003л Е. Повышение титра антител продолжалось до 45-го дня опыта и составило 0,184 - 0,01 л Б, при показаниях контрольной группы - 0,033 - О.ООЗДЕ. На 60-й день произошло снижение специфических антител в 1,3 раза, однако их уровень был выше на '¿'1,3%, по сравнен™ с незаражен-ным контролем. В дальнейшем титр антител продолжал снижаться и к 75-му дню достиг уровня 0,148 ~ 0,13 Д Е. Показатель специфических AT у подопытных ягнят к концу опыта составлял 0,042 -± 0,007 - 0,029 ± 0,002 ¿i Б.' • •

Результаты гельминтологического вскрытия. После убоя у зараженных животных обнаружили от 36 до 61 &кз. фасциол (в среднем 51.3 - 7,6 экз.). В контроле фасциол не находили.

Таким образом, заражение животных адолескарияма фасциол 1зквает снижение иммунного статуса, в связи с чем мы провели эрию экспериментов по коррекции иммунного ответа.

2.2. Коррекция иммунного ответа при, спонтанном фасциолезе

Под опыт било взято 70 ягнят текущего года рождения, кото-ых разделили на 7 групп по 10 голов в каждой по принципу ¡итогов: ягнята 1-ой группы получили - СЩ1 АГФ; 2-ой - АГФ; -ей - АГФ + Гр; 4-ой АГФ » ПО; 5-ой - Н-поливак; 6-ой - Гр 1 АГФ + Гр; 7-ая группа жиьотннх служила контролем.

Перед введением препаратов у животных определяли иммуно-иологическую реактивность и гельминтологический статус.

Динамика Т-лимЬоцитов. До введения препаратов количество '-лимфоцитов находилось в пределах 641,2 - 48,0 - 690,8 - 26,7 л/мкл.

Через день после первого введения препаратов (15-Й день юсле начала опыта) произошло увеличение абсолютного числа ¡-ГОК в опытных группах по сравнению с контролем (881,9 £ 25,6 5-РОК/шш) за исключением животных 1-ой и 5-сй групп. Наибаяь-1ее количество Т-лимфоцитов выявляли у ягнят 2-ой группы -- 1058,2 ± 2,3 Е-РОК/мкл.

На 36-й день исследований (первый день после повторной шмунизации) отмечали достоверное увеличение Т-лим{)0Щ1Т0в в эпытных группах но сравнения с -неиммунизированной контрольной группой животных. Наивысшее значение Т-лимфоцитов (1311,5 i -99,5 Е-РОК/мкл) обнаружили в крови ягнят 5-ой группы.

После иммунизации ягнят вывели на пастбище, где они находились в течение 5 месяцев.

Через месяц после второго введения препаратов (60--П день) количество Е-РОК в 5-ой группе достигло 1629,1 1 28,0 нл/ыкл, что значительно отличалось от других опытных групп животных.

На 90-Й день наблюдений у ягнят 4-ой и 6-ой групп коли-' чество Т-лимфоцитов достоверно увеличилось и составило 1569,1* ± 64,0 и 1656,2 ± 202,1 Е-РОК/мкл, соответственно. В 5-- 4 группе количество Т-лимфоцитов снизилось до 1269,3 1 9?,3 В-РОИ/и к.*. и но отличалось от контрольной группы. В остальных I оуыпи количество Т-лим{юцнтов так же статистически не отли 1&яы& ос и.;

/О

казателей контроля.

В ходе дальнейших исследований (120-й день наблюдений) выявлено повышение абсолютного количества Т-клеток в крови всех опытных и- контрольных ягнят до 1859,7 ± 104,0 и 2399,3 ± 152,3 Е-РОК/шсл, соответственно. Наибольшее количество Т-лимфоцитов в этот момент зарегистрировано в З-вй группе, где достоверный по отношению к контролю результат составил 2295,5 ^ 44,2 Е-РОК/шсл.

В следующий день опыта общее количество Г-лимфоцитов увеличилось у ягнят 1-ой, 2-ой, 5-ой и 6-ой групп. При этом их значения колебались в пределах 2036,2 ± 88,6 и 2194,0 ± 128,1 ' Е-РОК/мкл.

К последнему дню (180-му) исследований наметилось снижение Е-РОК во всех опытных группах. Более высоким, абсолютное содержание Т-клеток было в 3-ей группе - 1858,8 ± 8,9 кл/мкл. Показатели Т-лимфоцитов в остальных группах статистически не отличались от контрольной группы (1580,6 - 38,0 Е-РОК/мкл).

Динамика Т-хелпетов. Анализ данных о количестве ТФР-РОК до введения препаратов выявил недостоверные различия у животных всех групп и составил 347,4 ± 55,7 и 477,5 ± 39,7 ТФР-. -РОК/мкл. с 15-го дня наблюдений отмечена тенденция к увеличению хел~ерной активности вплоть до 36-го дня (2-ой день после повторного введения препаратов). Абсолютное количество ТФР--РОК у подопытных ягнят достоверно отличалось от количества ТФР-РОК контрольной группы и было в пределах 1043,4 ± 35,7 и 853,4 - 44,6 кл/мкл при показаниях контроля 480,2 ± 46,5 кл/мкл.

Самые высокие показ а!бли хелперной активности отмечены в

3-ей ± 780,5 - 73,5 кл/мкл и 5-ой - 745,8 ± 32,6 ТФР-РОК/мкл группах. В 7-ой (контрольной) группе снижение ТФР-РОК носило более выраженный характер (193,8 ~ 15,1 кл/мкл).

На 120-й день исследований количество Т-хелперов в 3-ей и 5-ой группах достоверно отличалось от контроля и составля-. ло, соответственно, 771,1 ± 94,1 и 685,4 ± 96,7 ТФР-РОК/мкл.

На 150-й день опыта установлено достоверное увеличение хелперов во всех группах жийотных. Наибольшее количество Т--хелперов установили 1044,4 - 4125,8 ТФР-РОК кл/мкл у ягнят

4-ой группы.

К 180-му дню опыта зарегистрировано достоверное отличие показателей всех опытных групп относительно контроля - 251,9 ^ - 92,1 ТФР-РОК/мкл. . '

и

Динамика Т-супрессоров. Достоверной снижение числа супрес-оров наблюдали после второго введения препаратов у ягнят 2-ой 6-ой опытных групп (их значения составляли соответственно 2,2 ± 38,1 кл/мкл и 120,7 ± 4,1 ТФЧ-РОК/мкл).

Через месяц после повторного введения препаратов и до 90-ю (ня наметилась тенденция к увеличению Т-супрессоров у ягнят все*, юдопытных групп.

Пик увеличения Т-супрессоров приходился на 120-ый день эксперимента и составил 1306,3 ± 187,6 - 2033,6 ± 257,6 ТФЧ--РОК/мкл.

К 150-му дню изучения количество Т-супрессоров снижалось з 4-ой и 5-ой группах до 603,1 ± 63,7 кл/мкл и 615,7 ± 36,4 ГФЧ-РОК/мкл. Далее отмечалось падение Т-супрессоров в большинстве опытных груш: -в 1-ой группе - до 963,7 ¿96,5 кл/мкл, в 3—ей - до 984,1 - 48,1 кл/мкл, в 5-ой - до 660,1 i 64,2 кл/мкл а в 6-ой группе - до 650,5 ¿98,6 ТФЧ-РОК/мкл. Однако у ягнят контрольной группы мы в эти дни констатировали увеличение ТФЧ--РОК до 1328,6. ± 11,4 кл/мкл.

Динамика (фагоцитарной активности макрофагов. В первый день исследований количество макрофагов было в пределах 41,9 ¿ 7,1 -- 67,7 - 15,9 кл/мкл, на второй день - 45,1 ± 10,0 - 89,2 ¿ ¿15,8 кл/мкл У животных всех подопытных-групп. На 36 день произошло увеличение общего количества НСТ-положительных меток, в крови ягнят 3-еЛ группы - 208,4 - 56,2, 5-ай группы- 194,8 - 22,1 кл/мкл. Количество макрофагов в контроле при этом составило 56,1 - 7,7 кл/мкл. На 60-е сутки отмечена тенденция снижения активности макрофагов в опытных группах. На 90-й день наблюдали увеличение количества макрофагов во 2-ой, 3-ей и 5-ой группах и снижение их в 1-ой, 4-ой и 6-ой группах.

К 120-му дню исследований в крови опытных ягнят увеличилось количество НСТ-положигелышх клеток. Во всех иммунизированных группах показатели достоверно отличались от контроля г-137,7 ~ 31,2 кл/мкл, за исключением 2-оЙ и 6-ой групп.

В конце опита (180-Й день) отмечено увеличение НСТт!1пло-жмтельных клеток в контрольной группе до 240,6 - 37,3 к.Г/икл. Количес-во макрофагов у ягнят иммунизированных групп школилось на уровне контрольной группы.

(Л

Лшамика В~лимфоцитов. При изученивдинамики В-лимфоцитоз через сутки после введения препарата отмечали достоверное ув< личение количества B-лимфоцитов в 6-ой группе до 813,8 ± 23,i ЕАС-РОК/мкл. На 36-й день опыта произошло увеличение абсолютного числа В-клеток во воех группах, за исключением 4-ой и 6-ой групп, показатели которых не отличались от контроля. В крови животных контрольной группы количество ЕАС-РОК составил 540,3 - 83,8 кл/мхл. Наибольшее кбЗшчество В-лжмфоцитов установили в 1-ой, 2-ой, 3-ей и 5-ой группах.

К 60-му дню исследований самые высокие показатели были у ягнят 4-ой группы - 1189,0 ±35,8 кл/мкли 5-ой - 1117,1 ± 75,; ЕАС-РОК/мкл. Наименьшее количество В-лишфоцитов находили во 2-ой группе - 776,0 ± 55,5 ЕАС-РОК/мкл. При исследовании кров) к 90-му дню отмечали достоверную разницу мевду 7-ой - 555,0 ±

- 141,8 ЕАС-РОК/мкл и иммунизированными группами. Количество лимфоцитов во 2-ой группе, увеличилось до 1105,7 ± 5,5 в 6-ой -

- 1208,5 - 193,4 ЕАС-РОК/мкл. В остальных опытных группах животных произошло некоторое снижение количества В-клеток.

На 120-й день отмечачи повышение ЕАС-РОК в 5-ой 'группе. Уровень лимфоцитов в крови ягнят этой группы составил 1449,7 -

- 138,1 "л/мкл. Количество В-клеток в других группах было на достаточно высоком уровне, но не отличалось от контроля -

- 1004,5 ±97,7 ЕАС-РОК/мкл.

150-й и 180-й дни наблюдений не выявили достоверно значимых изменений в динамике В-лимфоцитов.

Динамита спешкфическьго иммунного ответа. В начале опыта титры антител в реакции не отличались друг от друга и находились в пределах 0,230 ± 0,116 - 0,398 ± 0,008 Л Е.

На 36-й день исследований отмечены различия в титрах антител,у ягнят 1-ой группы они составили 0,510 - 0,0009; во 2-ой - 0,857 - 0,042 и 5-ой - 0,569 ±0,038 Д Е, при показаниях в контроле 0,387 ± 0,0334 Е.

60-й и 90-й дни исследований отмечены активацией специфических антител у животных 2-ой, 3-ей, 4-ой и 5-ой групп, пока-* эатеди контроля при этом составили 0,630 - 0,026&Е.

На 120-й день коэффициент экстинкции во всех группах был в пределах 0,757 * 0,049 - 0,964 ± 0.087ДЕ, что не отличалось

от показаний в контроле. К 150-му дно отмечено некоторое спи*« ние экстшшии в контрольной группе и увеличение в 1-ой, 5-ой « 6-ой грушах. Последний день опыта (180-й день) выявил достоверные отличия в 1-ой - 0,0964 ± 0,05, З-ей - 0,979 ± 0,040, 5-ой - 1,235 ± 0,122 и 6-ой - 0,945 ± 0.038ЛЕ группах по отношению к контрольной группе животных.

Результаты гельминтологического вскрытия. При убое подопытных и контрольных животных установлена следующая интенсэф-фективность: в 1-ой группе - 79.9%, во 2-ой - 34,3%, в З-ей -47,4%, в 4-ой - 77%, в 5-ой - 69,5£, в 6-ой - 71,1%, животин?, контрольной группы были заражены все.

Таким образом, у ягнят 5-ой группы (препарат Н-поливак) получены обнадеживающие результаты. Поэтому дальнейшую работу мы проводили только с препаратом Н-поливак.

2.3. Динамика иммунного ответа при фасциолезе в условиях спонтанного- заражения с введением дополнительной культуры

адолескариев т. hepática.

Для опыта было взято 30 голов ягнят текущего года рождении, свободных от гельминтов. Ягнят подбирали по принципу аналогов. Животных разделили на две группы: 1-ой группе животных в количестве 20-ти голов вводили внутримышечно препарат Н-поливак в дозе 3 мг на голову с интервалом 21 день. 2-ая группа ягнят из 10 голов составляла контроль. Через две недели после повторного введения препарата ягнят обеих групп заразили культурой адолескариев hepática по 15 экз. на животное. После этого животных вывели на пастбище.

Динамика Фагоцитарной активности макрофагов. Первый пик макрофагальной активности приходился на 2-й день после повторного введения препарата и составил 115,8 - 9,56 кл/мкл, что в 1,6 раза больше, чем в контроле. Следующее ловншепяе количества макрофагов было выявлено на третий день после заражения. Абсолютное количество НСТ-ялегок в опытной группе составило 170,2 ± 10,2 кл/мкл, в группе контроля - 118,8 - 12,0 кл/мкл. На 35-й лент, наблюдений количество «акр^фзггп в обеих группах животных увеличилось, но при этом сг-тги-пячеоки значимых количественных изменения не обнаружено. В посл<»5утпо

ft

uiiui'tt наметилась тенденция к снижению количества макрофагов, хо-■1» в 1-ой группе юс было больше, чем в контроле.

Динамика специфического иммунного ответа. В первые два дня исследований не было достоверной разницы в титре антител мевду опытными и контрольными группами животных. Небольшое, но достоверное увеличение экстинкции обнаружили на второй день после повторной иммунизации. В опытной группе животных Л Е достиг 0,068 i 0,002, при показателях-контроля 0,046 i 0,003 Е.

В последующие дни отмечено два пика активности антител в 1-ой группе, на 3-й и 64-й дни после заражения. ДЕ в зти дни составил 0,208 ~ 0,006 и 0,251 i 0,01 соответственно. Контрольные показатели были в пределах 0,196 - 0,002 и 0Д61 ± 0,02 ДЕ. На ЭЗ-й день исследований титр антител был несколько ниже по отношению к предыдущим показателям и составил 0,214 - 0,005 в опыте и 0,149 £ 0,002ДЕ в контроле.

Результаты тельминтологиче&кого вскрытия выявили достоверное отличие между опытной (1-ой) группой (Н-поливак) и 2-ой контрольной. В первой группе животных обнаружено в среднем 13,9 - 0,7 экз. гельминтов, а у животных контрольной группы -- 21,2 екэ.

2.4. Иммунный ответ при введении коныогированного препарата Н-поливак (серия I и 3) при экспериментальном фасциолезе

С этой целью 20 ягнят разделили на четыре группы по следующей схеме: 1-ая группа (5 ягнят) - вводили препарат Н-поли-вак-3 в дозе 3 мг на голову двукратно с интервалом 21 день; вторая группа - аналогично вводили ягнятам препарат Н-поливак-1 в дозе 5 мг/гол.; третья группа - контрольная (зараженная) препарат не получала; четвертая группа - чистый контроль.

Заражение животных адолескариями р. hcpatica по 100 экз. иа кивотное проводили через 14 дней после повторной иммунизации.

Динамика Т-лим^оцитов. При исследовании динамики общего количества Т-лимфоцитов отмечали общее увеличение Е-РОК на следующий день после введения препарата.

На 15-й день после 1-ого введения Н-полив„а установили падение общего количества Т-лголфоцитов до 920,4 - 50,2 кл/мкл у ягнят 2-ой группы. В остальных группах достоверных различий

те обнаружено.

На 3-й день после повторного введения препарата отмочено резкое увеличение количества Т-лимфогагаов в подопытных гранях тавотных: 1778,4 ± 62,5 (1-я группа) и 1845,3 - 35,3 (2-я группа), что достоверно отличалось от обеих контрольных i-pymr.

На 10-й день после повторного введения Н-поливак дрсизогп-ло достоверное снижение Т-лямфоцитов по отношению к контролю (1346,8 - 54,7) и обе подопытные группа достигли уртня треть г Г (контрольной зараженной) группы животных - 1161,0 - 73,9 В--РОК/мкл.

Через 5 дней после заражения наблюдали увеличение Е-РОК во всех группах получавших адолескарии. На 10-й день после заражения констатировали повышение количества Т-лим$оцитов до

1919.5 ± 150,6 кл/мкл в 1-ой группе и 2107,8 ± 83,5 кл/мкл во 2-ой группе. Одновременно установили снижение Е-РОК в 3-ей (контрольной зараженной) группе животных - 1283,9,- 32,0 кл/мсл, при атом в группе чистого контроля «Зыло II6I - 8,32 Е-РОК/мкл.

При дальнейшем исследовании.динамики Е-РОК выявили увели-чипш количества Т-лкмфоцитов в 3-ей группе к 45-му дню -

1853.6 ± 158,5 кл/мкл, к 60-му дню - 2027,4 - 91,4 кл/мкл, а к 75-му дню произошо резкое снижение количества Т-лимфотитов в крови ягнят этой группы до уровня 1127,7 i 120,2, что было достоверно ниже контроля - 1577,6 - 79,0 кл/мкл. К концу опыта количество Т-лимфоцктов у ягнят первой группы также было низким и статистически не отличалось от данных, полученных у животных 3-ей группы. У ягнят 2-ой группы их количество находилось на уровне контрольной (незаряженной) группы животных.'

Динамика Т-хелперов. Анализируя полученные данные, следует отметить достоверное увеличение количества Т-хелперов у ягнят 1-ой и 2-ой групп на 3-й день после повторного введения Н-поливак. IIa IO-й день после повторного введения препарата и 5-й день после заражения произошло падение уровня ТФР-РОК у подопытных ягнят по сравнении с контролем и достоверный подъем на 10 и 30-й дни послй заражения у ягнят этих же групп. При исследовании крови ягнят 3-ей группы отметили стойкое сттж<?нпо ТФР-РОК по отношению к нвэараженному контролю до 75 дни исследований .

Динамика Т-супреасотюв. При рассмотрении функционал! ной активности теофилинчувствительности клеток нами отмечено снижение ТФЧ-РОК. пс сравнению с контролем в момент первого введения препарата. Увеличение Т-супрессоров выявлено на 5-й день после заражения во всех группах животных получавших инвазионную культуру. Наибольшее количество ТФЧ-РОК наблюдали в 3-ей группе, абсолютное число их составило 1455,2 £ 65,5 кл/мкл. У ягнят 1-ой группы отметили 1335,8 - 83,6 кл/мкл, во второй 1041,9 - 64,3 кл/мкл при показаниях в контроле - 569,7 ~ 40,1 ТФЧ-РОК/мкл. У ягнят 1-ой и 2-ой групп не обнаружили достоверных отличий от контроля вплоть до 75-го дня исследований, где абсолютное количество ТФЧ-РОК в 1-ой группе упало до 486,9 £ 45,4 кл/мкл, что было достоверно ниже контроля. Количество ТФЧ-РОК в крови ягнят 3-ей группы на всем протяжении опыта было достоверно выше контроля и двух подопытных групп до окончания опита,

„ Динамика фагоцитарной активности макрофагов. На 5-й и Ш-й дни после заражения отмечен подъем НСТ-положителышх клеток. Абсолютное количество в 1-ой группе составило 292,9 -± 30,0; во 2-ой 251,8 ± 28,0 и 3-еЙ - 212,4 ± 17,6 кл/мкл. Количество НСТ- положительных клеток в контроле составило 141,6 ± 3,2 кл/мкл.

На 15-й день отмечено снижение НСТ-положителышх клеток. Если количество макрофагов в двух первых группах животных снизилось до уровни контроля (157,7 £ 22,7 кл/мкл), то в третьей группе произошло более выраженное падение до 95,8 - 1,3 кл/мкл. В последующие дни наблюдали подъем макрофагов,за исключением 3-ей группы животных. Количество макрофагов в 3-ей группе, начиная с 30-го дня,резко увеличилось к 45-60-му дням опыта, после чего снизилось относительно чистого контроля до 78,1 ~ 17,9 кл/мкл к последнему дню исследований.

Динамика В-лимфоцитов. Достоверное увеличение ЕАС-РОК в 1-ой и 2-ой группах - 678,8 ± 79,8 к 519,6 £ 42,7 кл/мкл произошло на 3-Й день после введения Н-ноливак.

Следующий, более мощный подъем активно :и В-клеток отмечен в момент повторного введения препарата у ягнят 1-ой и 2-ой групп, абсолютное значение которых составило 1243,1 £ 63,7 кл/мкл и 1153,5 ~ 83,8 кл/мкл,соответственно, при показаниях

п

контроля 611,9 ± 53,1 кл/мкл. На 5-й день после заражения у ягнят 1-ой, 2-ой и 3-ей групп произошло резко выраженное'увеличение количества В-лимфоцитов.

Наибольшее количество B-лимфоцитов в 1-ой группе ягнят составило 1840,8 ± 65,7 ЕАС-РОК/мкл, что отличало ео достоверностью как по отношению к незараженному контролю, так и к зараженному. Достоверно значимое отличие было во 2-ой и 3-ей группах. При этом показания контроля соответствовали 633,7 ± ¿40,6 кл/мкл. На 10-й день после заражения абсолютное количество В-клеток у ягнят 1-ой и 2-ой групп было достоверно выше, чем в контроле. Количество В-лимфоцитов в 3-ей группе ягнят резко снизилось и было значительно ниже контроля.

К 45-му дню наблюдений снова отметили увеличение ЕАС-РОК у ягнят первых двух групп, которое продолжалось до конца эксперимента. Количество B-лимфоцитов в 3-ей группе, начиная с.30-го дня и до конца эксперимента занимало самое низкое графическое положение относительно других групп и чистого контроля.

Динамика специфического иммунного ответа. Впервые достоверное отличие в титрах антител опытных и контрольных групп отмечено на 3-й и 10-й дни после повторного введения Н-полявак.

На 5-й день после заражения наметился подъем специфичес-хсй активности антител во всех первых трех группах. Титр антител составил 0,110 ± 0,007; 0,104 ± 0,007; 0,061 ± 0,002, соответственно, при показаниях контроля - 0,06 ± 0,002 Е.

В контроле.титр антител на-протяжении всего опыта находился в пределах 0,020 ± 0,001 - 0,042 ± 0,007 Л В. Втрех опытных группах отмечено увеличение специфических антител, прием наивыс-лй пик активности в третьей группе приходился на 45-Й день и достоверно отличался как от контрольной, так и от 1-ой и 2-ой групп. Титр антител в этой группе составил 0,184 - 0,001. В последующие дни опыта он снизился до 0,148 ± 0.013ДЕ к 75~му дню наблюдений.

Пяк активности антител приходился на 60-е сутки опыта и составил в 1-ой группа 0,241 ± 0,002ЛЕ и во 2-ой группа -0,226 ± 0,'006, что достоверно отличалось от двух контрольных групп.

' Исследования показали: в печени ягнят 1-ой группы было пайлеяо 28,0 ±3,4 экз. фасциол, П-ой группы - 32,4 ± 1,3 окп.,

№

л 3-ей - 61,3 - 7,6 экз. Чистый контроль убою не подвергался.

2.5. Производственные испытания вакцины Н-поливак

Работу проводили в колхозе "Минеевский" Уреньского района Новгородской области. Под опытом 5 находилось 68 ягнят 3-4-х месячного возраста. Перед началом эксперимента животных разбили на две группы: животным 1-ой группы (53 ягненка) ввели вакцину Н-поливак в дозе 3 мг на голову дважды с интервалом в 21 день, животные 2-ой группы (15 ягнят) служили контролем,

В течение опыта за животными вели наблюдение и через 245 дней был проведен убой..При гельминтологическом вскрытии из 43-х вакцинированных ягкят ^асциолы обнаружили у 38-ми в количестве II—17 экз., у 5-ти животных, фасциол не находили. Из II вскрытых ягнят контрольной группы,фасциолы найдены у всех ягнят в количестве 26-37 экз. Таким образом ИИ-составнла в подопытной группе - 11,76 - 0',7 экз., в контрольной 32,4 - 1,0 экз., ИЭ -составила 63,7%.

Опыт 6 был проведен на 220 ягнятах 4-5-ти месячного возраста' в колхозе "Путь рыбака" Турумовского района Дагестана. Животных предварительно взвешивали и бирковали, затем сформирова-*ли двб группы по принципу аналогов. Ягнятам 1-ой группы в количестве 170 голов ввели препарат Н-поливак в дозе 5 мг на животное, 2ая группа (50 голов) служила контролем. За животными вели наблюдение, периодически проводя гельминтоовоскопию. Через 360 дней животных подвергли убою на Махачкалинском мясокомбинате. ИЭ-составила 71%, ЭЭ - 63$.

0ЕСУ1ДЕЖЕ РЕЗУЛЬТАТОВ . Стадийность гельминтозного процесса и качественное изменение антигенной структуры паразита способствуют развитию у хозяина эффекторных и регуляторных механизмов иммунитета.

Нами экспериментально установлено супрессорное воздействие гояшинта на хозяина в 5-10-й дни после заражения адолескариями с1, huputica и последующая супрессия в период нахождения фасциол ' & паренхиме печени хозяина на 30-60-й дни. Вы' -ленное преобладание супрессорной активности Т-системы уже на ранней стадии инвазионного процесса позволило нам сделать вывод о специфических особенностях форадювания иммунного ответа при фасциолезе.

1<9

Результаты наших исследований говорят о том, что наиболее интенсивный иммунный ответ развивается в процессе миграции фас~ одол в места их локализации. Период адаптации паразита к условиям существования в организме хозяина, сопровождающееся травматическими изменениями в органах и тканях, которые носят вариабельный по силе воздействия характер - от небольших очаговых воспалений до диффузно-гнойного процесса с расплавлением пораженных тканей И.С. Сагоян (1958), Н.В. Демидов (1963,1965), О.А. Кублицкене (1971) оЬ а1. (1972), Е.^.Латоип еЪ 11.

(1987) и др. Убедительно также и утверждение Э.Х. Даугалиевой (1991) о регуляторной функции Т-супрессоров. Принимая во внимание данный факт, мы можем с уверенностью говорить о присутствии этого начала в нашем эксперименте, что нашло подтверждение в установленных нами, динамических изменениях в системе Т-В-А клеток и специфическом антительном ответе. Выявлен переменный характер хелперных влияний. Такая тенденция сохранялась как при экспериментальном, так и при спонтанном заражении ягкят. При этом установлено стойкое снижение Г-хелперов в крови зараженных, невакцинярованных животных.

В результате экспериментального заражения овец фасциолезом выявлена коррелятивная зависимость клеточных реакций от биологии возбудителя. Отмечено увеличение количества В-клеток и макрофагов в первые дни после заражения и В-супрессия в последующие дни эксперимента. Однако, мы не можем говорить о дисфункции В-клеточного звена, т.к. показатели его активности, по .сравнению с незараженным контролем, постоянно менялись, что можно отнести к аутоконтролв со стороны В-йшфоцитов.

Появление сывороточных антител выявлено наш на 5-й день после заражения. Причиной такого ответа, по нашему мнению, явилась бурная миграция фасциол. Антительная активность в первые дни после заражения вызвана, вероятно, накоплением пристеночного зр Е, а если учесть теорию первичного иммунного ответа, не исключена наработка и ±х М. Начиная с 30-го дня после заражения антительный отпет усиливался вплоть до окончания опыта (75 день); что согласуется с данными Клименко В. (1971) и по его мнению связано с полисахарвдной природой антигена.

Б опытах, проведенных с применением конъюгированннх пршп рптоз на спонтанно зарачо-чинх ягнятах, нами выявлено:

1. Изменение соотношения теофиллинрезистентных клеток к •1 еофшишнчувствит е ль ним;

2. Выраженная супрессия Т-клеточного звена лимфоцитов и наибольший их подъем в период с 90 по 120 дни исследований (по всей вероятности в этот момент произошло заражение);

3. Переменный характер хелперннх влияний - увеличение уровня их активности в начале опыта, снижение в период с 36 по 120 дни и следувдий более поздний подъем ТФР-РОК на 150 -180 дни эксперимента;

4. Активация В-лимфоцитов во второй половине опыта с 60т 90-го дня вплоть до окончания эксперимента.

Введение конъюгатов значительно стимулировало иммуногенез. Проводя двукратную иммунизацию, мы искали возможность усилить иммунологическую память, на что ориентирует Н.Е. Сивук (1985), отмечая способность синтетических полнэлектролитов потенцииро-вать индукцию иммунологической, памяти к природным антигенам при их сочетанном использовании,

В опытах по выявлению коррелирующей способности конъюгатов полиэлектролит - антиген нами выявлены их иммуногенные свойства. Установлена коррелятивная связь между моноцитарным и мак-рофагалъным звеньями иммунитета, а также увеличение количества специфических антител как при экспериментальном, так и спонтанном заражении животных.

Проведенные наш исследования позволили установить .закономерность в развитии иммунного ответа у животных, которым вводили синтетический полиэлектролит. Активация всех систем иммунной защиты на -3-й день после введения препаратов,, усиление клеточной продукции вгвриод заражения на 5-й и 10-й дни, включившийся регуляторлый ауто-механизм позволили скорректировать взаимодействие на уровне Т-В-А лимфоцитов в более поздние сроки развития заболевания.

Целесообразно подчеркнуть, что протективное действие конъюгировашшх препаратов приводило к снижению приживаемости гельминтов. Наилучший эффект достигнут в опыте по спонтанному заражению у ягнят 5-ой группы, которым вводили '!-поливак в до-se 5 иг ка животное. При экспериментальном заражении бояее выраженный эффект отмечен в первой группе, получившей Н-поливак-3 в дозе 3 w.

а/

Проведенные нами исследования по изучению взаимодействия иммунокомпетентных клеток при спонтанном и экспериментальном фаспиолезе позволили установить кооперативные взаимоотношения мокду гетерогенной системой клеток, несущих генетическую детерминированную направленность, что в конечном счете, возможно представить как совокупность единого целого.

ВНВДЩ

1. Экспериментальное заражение овец алолескариями фасдиол сопровождается стимуляцией эффакторних и регуляторных механизмов иммунитета, динамическим изменением Т- и В-популяций, снижением индексов иммунорегуляции, активацией моноцлтарно-макро-фагального звена и специфических антител.

2. Период миграции фасциол сопровождается усиленным образованием Т-супрессоров с 545,2 - 84,3 кл/мкл до уровня 1490,

£ 179,4 кл/мкл л угнетение Т-хелперов в 2,15 раза.

3. Экспериментальное заражение животных фасцйолезом вызывает снижение B-лимфоцитов с 1258,1 - 45,1 кл/мкл до 647 £ 13,5 кл/докл в период миграции паразитов. Макрофагалъная активность отмечена на 10-й (212,4 ± 17,6 кл/мкл) и 45-й дни наблюдений (221,6 ± 16,7 кл/мкл).

4. Двукратное введение коныогироЕанной вакцины Н-поливак

в дозах 3 и 5 мг вызывает активацию Т-лимфоцитов (1845,3 £ 35,Я кл/мкл) на 10-й, В-лимфоцитов (1840,8 £ 66,3 кл/мкл) на 5-й и макрофагов - до 292,9 - 30,0 кл/мкл на 10-й дни после заражения. Количество специфических антител увеличивается на 60-е сутки до 0,241 ± 0,002 Е.

5 При спонтанном заражении ягнят фасцйолезом на фоне введения конъюгированных препаратов увеличивается количество Т-В-лимфсиитов и макрофагов с преобладанием Т-супрессоров на 90 и 120-й дни наблюдений. Индекс иммунорегуляции снижается до 0,1 - 0,08 на 120-й день.

Количество B-лимфоцитов и макрофагов во всех группах животных увеличивается с. 60-го по 90-й дни по отношению к контролю, снижается к 180-му дню.

6. Конъютвроианный препарат серии Н-лоливак в дозе 3 и 5 мг, ввезенный дважды с интервалом в 21 день, обладает иммуно-генннми и протективными свойствами.

0.Х

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Материалы работы вошли в:

1. "Методические рекомендации по применении иммуностимуляторов для профилактики гельминтозов и повышение резистентности животных", одобренные рабочей комиссией "Паразитология и профилактика инвазионных болезней животных" и утвер&денныа ВАСХШЛ 28 августа 1990 г.

2. "Методические рекомендации по изучению механизма иммунитета -при гельминтозах и определению иммуногашых свойств препаратов", одобренные Ученым советом ВИГИС 30 марта 1990 г. и утвержденные ВАСХНИЛ 5 сентября 1990 г.

< СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ватников Ю.А. Метод двойного розеткообразования на примере периферической крови овец // Бюллетень ВИГИС. - 1990. - вцп. 54. - С.71. .

2. Ватников Ю.А. Иммунопрофилактика фасцволеза овец // Тезисы докладов Всесоюзной научной конференции "Методы профилактика и борьбы с трематодозами человека и животных", г. Су-ми, - М. - 1991. - С. 21.

3. Ватников Ю.А. Иммуносупрессия при фасциолезе овец // Тезисы докладов Всесоюзной научной конференции "Методы профилактики и борьбы с трематодозами человеку и животных", г. Су мн, - М. - 1991. - С. 22.