Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Специфическая профилактика диктиокаулеза, фасциолеза и эхинококкоза сельскохозяйственных животных

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора ветеринарных наук, Курочкина, Каринэ Гегамовна, Москва

.i i : е з к д и у м i i я »'г-сш:

I шм IV

■ С i ■■ П

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕЛЬМИНТОЛОГИИ имени К.И.СКРЯБИНА

на правах рукописи

КУРОЧКИНА Каринэ Гегамовна УДК 619:578.097.3:616.995.1

СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА ДИКТИОКАУЛЕЗА, МСВДОЛЕЗА И ЭХИН0К0КК03А СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ

ЖИВОТНЫХ

Специальность 03.00.19 - Паразитология, гельминтология

Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

Научный консультант

доктор ветеринарных наук,

О

профессор Э.Х.ДАУГАЛИЕВА

Москва - 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ .............................................. 4

А. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ................................... 10

1. Клеточные и гуморальные механизмы иммунитета

при гельминтозах ................................ 10

2. Пути коррекции иммунной системы ................. 21

3. Теоретическое обоснование иммунопрофилактики гельминтозов сельскохозяйственных животных ...... 24

Б. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ..................... 36

1. Материалы и методы.............................. 36

2. Результаты исследований ......................... 39

2.1. Клеточные и гуморальные факторы иммунитета

при гельминтозах .............................. 39

2.1.1. Динамика иммунного ответа при диктиокаулезе

овец........................................ 40

2.1.2. Динамика иммунного ответа при фасциолезе

овец ........................................ 53

2.1.3. Динамика иммунного ответа при эхинококкозе

овец........................................ 62

2.2. Активация иммунокомпетентных клеток и влияние

на антителогенез иммуногенов различной природы. 69

2.2.1. Иммуностимулирующие и протективные свойства препаратов германия ьх -5 и ьх 13........ 70

2.2.2. Иммуностимулирующие и протективные свойства аквафтема (Н), аквафтема (НГ) и аквалипола .. 75

2.2.3. Иммуностимулирующие свойства проксона - 20 ... 85

2.2.4. Влияние препарата полисепт на иммунный статус

2.2.5. Определение иммуностимулирующих и протективных свойств полиоксидония, градекса и вегетана .. 101

2.2.6. Дротективные и иммуногенные свойства препаратов различных серий, синтезированных на основе специфического антигена и полиэлектролитов

при диктиокаулезе ........................... 105

2.2.7. Иммуногенные и протективные свойства препаратов Н-поливак при диктиокаулезе ................. 115

2.2.8. Протективные и иммуногенные свойства специфических препаратов при фасциолезе ..... 125

2.2.9. Протективные и иммуногенные свойства препаратов Н-поливак при эхинококкозе овец............. 144

2.2.10. Иммунопрофилактика эхинококкоза собак ...... 152

и приживаемость гельминтов

ОБОБЩЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ .

ВЫВОДЫ .................

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ......

ПРИЛОЖЕНИЕ .............

156 182 185 187 220

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Иммунный ответ является сложным многокомпонентным процессом, включающим цепь молекулярных и клеточных событий., которые разворачиваются в определенной последовательности (Р.В.Петров., 1987).

Использование современных методов исследований в иммунологии позволило рассмотреть некоторые вопросы иммунитета с новых позиций., обратить внимание на процессы иммунологической перестройки, происходящей при гельминтозах.

К ним относятся в первую очередь: функционирование Т~,В систем иммунитета., активация макрофагов., усиление цитотокси-ческой активности клеток-киллеров, реакции гиперчувствительности замедленного типа и т.д.

Впервые при гельминтозах последовательность включения ?-и В-лимфоцитов в иммунный ответ установлена E.Soulsbv, P.Khoury (1974). В литературе имеется значительное количество работ, подтверждающих способность гельминтов подавлять иммунные реакции хозяина на антигены, выделяемые ими (И.Ю.Черняховская с соавт. , 1971: О.Г.Полетаева., 1975, 1978, 1983, 1984: Е.С.Лейкина, 1976, 1978, 1981; А,С.Бессонов, Р.А.Пень-кова, 1984; Э.Х.Даугалиева с соавт., 1989, 1990, 1991; A.Jebreas, 1976; G.Faubert, 1977; G.Phillips, E.Fox, 1984; M.Green et. al., 1985).

Одним из важнейших механизмов возникновения иммунологической недостаточности является нарушение регуляторных про-

цессов в иммунной системе, связанных с хелперной, супрессор-ной и киллерной функциями Т-лимфоцитов.

К настоящему времени установлены механизмы, лежащие в основе иммунологической супрессии. К ним относятся, в первую очередь, нарушения функции макрофагов, в связи с чем они не способны полноценно представлять антигены. Большую роль в возникновении иммунологической недостаточности играют различные факторы паразитарной природы A.Dasgupta et al. (1978) установили, что депрессия Т-клеток при фшшриатозах связана с циркуляцией растворимых антигенов, иммунных комплексов и лим-фоцитотоксинов.

Однако, при гельминтозах до сих пор не установлены сроки нммуносупрессии и ее длительность при различных дозах и кратности заражения. Поэтому стимуляция иммуного ответа полимерными веществами - одно из наиболее интенсивно развивающихся направлений современной иммунологии. Начало его относится к первой половине 70-х годов, когда были обнаружены: активация продукции антител синтетическими полинуклеотидами (R.Cone, 1979) или полиакриловой кислотой (Т.Diamantstein etal., 1973), а также стимулирующее влияние синтетических карбоцеп-ных полиэлектролитов на кроветворение и иммунопоэз (Р.Б.Петров с соавт., 1974, 1975).

Было изучено влияние водорастворимых полиионов на отдельные звения иммунопоэза in vivo: миграцию стволовых кроветворных клеток и лимфоцитов Т- и В-субклассов, пролиферацию и дифференцировку каждого типа клеток, кооперативное взаимодействие этих клеток в ходе соревнования и реагирования

(Р.М.Хаитов., 1976, 1977: Р.В.Петров, Р.М.Хаитов. 1976).

На основании полученных данных был сформулирован принципиально новый подход к поиску и отбору модуляторов иммунитета по их влиянию на конкретные звенья иммунного ответа. Был предложен подход к созданию иммуногенов путем структурного объединения антигена и полимера-иммуностимулятора (Р.В.Петров, К.А.Кабанов, Р.М.Хаитов, 1981).

Конструкция оптимальных вакцин заключается в замене антигенов паразита, индуцирующих супрессию и аутоиммунитет, на иммуногенные компоненты, способные влиять на развитие полноценного иммунитета. Разработка таких вакцин может пойти успешно только в том случае, когда будут решены задачи преодоления механизмов защиты паразита от действия иммунной системы хозяина, чему и посвящена наша работа.

Цель работы. Основной целью диссертационной работы явилось изучение механизмов иммунитета при различных типах миграции паразитов и определение роли иммунодефицитов при гель-минтозах и пути их коррекции.

Задачи для экспериментального исследования: - изучить в динамике развития болезни механизм клеточного и гуморального ответа на клеточном и субклеточном уровнях при диктиокаулезе, зхинококкозе и фасциолезе:

- дать оценку количественной и качественной характеристик Т- и В-систем иммунитета и их субпопуляций при изучаемых гельминтозах;

- охарактеризовать роль иммунодефицитов в проявлении гельминтозов;

- изучить возможность применения целого ряда препаратов иммуномодулирующего действия при гельминтозах;

- использовать полученные сведения для создания вакцин нового поколения и их апробировать.

Научная новизна. Впервые расшифрован механизм иммунитета при экспериментальном дикитокаулезе, фасциолезе и эхинококке-зе овец на клеточном и субклеточном уровне. Накоплены принципиально новые сведения об иммунодефицитных состояниях животных после заражения гельминтами.

Впервые определены иммуностимулирующие свойства препаратов германия (ХЬ - 5, ХЬ - 13), полисепта., эмиотима., микроци-та, аквафтема (Н) и СНГ), акваяипола (ЕГ), проксона-20.

Установлено, что иммуностимуляторы полимерной природы -полиоксидоний, градекс, вегетан повышают иммунный .статус при гельминтозах и профилактируют •клиническое проявление этих заболеваний в течение 2,5 - 3-х месяцев.

Предложена вакцина Н-поливак нового поколения для профилактики эхинококкоза, фасциолеза и диктиокаулеза. Препараты Н-поливак обладают иммуногенными и протективными свойствами.

Практическая значимость. Основные положения результатов проведенных исследований отражены в следующих нормативно-технических документах:

1. "Наставление по применению полиоксидония для профилактики и лечения больных с/х животных". Утверждены ГУВ РФ от 01.10.91, N044-3, г.Москва.

2. "Методические рекомендации по изучению механизмов иммунитета при гельминтозах и определению иммуногенных свойств

препаратов". Утверждены Отделением ветеринарии ВАСХНИЛ, М.5 1990.

3. "Методические рекомендации по профилактике желудочно-кишечных стронгилятозов овец". Утверждены Отделением ветеринарии ВАСХНИЛ, М., '1990.

4. Авторское свидетельство на "Способ профилактики и лечения стронгилоидоза поросят" N0159867 от 8 июня 1990 г.

5. Авторское свидетельство на "Средство для профилактики желудочно-кишечных стронгилятозов животных" N01734256 от 15 января 1992 г.

6. Авторское свидетельство на "Средство для профилакти-кижелудочно-кишечных стронгилятозов животных" N01734266 от 15 января 1992 г.

7. Авторское свидетельство на "Средство для профилактики желудочно-кишечных стронгилятозов животных" N01734267 от 15 января 1992 г.

8. Авторское свидетельство на "Способ получения вакцины для профилактики гелъминтозов животных" N1751892 А1 от 13 октября 1992 г.

9. Патент "Способ получения вакцины для профилактики гельминтозов животных" N1838914 от 13 октября 1992 г.

10."Методические рекомендации по профилактике желудочно-кишечных стронгилятозов овец". Утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН. М. 1995 г,

11.Временное наставление по применению вакцины Н-поливак в ветеринарии при гельминтозах. Утверждены Департаментом ветеринарии 06.08.96. N13-4-2/728.

Основные положения, выносимые на защиту. Оценка Т- и В-систем иммунитета при ряде гельминтозов на клеточном и субклеточном уровне в динамике развития болезни.

Состояние иммунодефицита и пути его коррекции при гель-минтозах.

Препараты., обладающие иммуностимулирующими и протектив-ными свойствами при гельминтозах.

йонъюгированные вакцины по схеме антиген-спейсер-иммуностимулятор, обладающие иммуногенными и протективными свойствами при диктиокаулезе, фасциолезе и эхинококкозе овец.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на ежегодных годовых отчетах ВИГИС 1986-1995 гг., на конференциях в Нижнем Новгороде (1992, 1995), в Санкт-Петербурге (1994), в Караганде (1993), в Москве (1992, 1993). на координационных совещаниях в ВИГИСе (1993, 1994), на заседании общества гельминтологов РАН (1997).

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в печатных работах, изданных у нас и за рубежом.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов и практических предложений. Она изложена на 22Q страницах машинописного текста, которые дополнены 64 таблицами, 19 рисунками. Список литературы включает 147* отечественных и 155 зарубежных источников.Диссертация дополнена приложением.

- 10 -А. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Клеточные и гуморальные механизмы иммунитета при гельминтозах

Иммунный ответ является сложным многокомпонентным процессом, включающим цепь молекулярных и клеточных событий, которые разворачиваются в определенной последовательности (Р.В.Петров, 1987).

Механизм иммунитета при гельминтозах впервые в нашей стране расшифровали Р.С.Шульц (1950; 1958) и Н.П.Шихобалова (1950) в своих монографических работах. Значительный вклад в изучение механизма иммунитета принадлежит В.С.Ершову (1966-1985) и Е.С.Лейкиной (1972-1984).

Использование новых методов исследований в иммунологии, позволило рассмотреть некоторые вопросы иммунитета с новых позиций, обратить внимание на процессы иммунологической перестройки, происходящей при гельминтозах. К ним относятся в первую очередь: функционирование Т-и В-систем иммунитета, активация макрофагов, усиление цитотоксической активности, реакции гиперчувствительности замедленного типа и т.д.

По данным Р.В.Петрова (1976) функцию обеспечения иммуно-компетентности лимфоидных клеток и регуляции функции В-системы выполняет Т-система. Т-лимфоциты участвуют в реакциях клеточного иммунитета. В-лимфоциты, трансформируясь в плазматические клетки, синтезирующие антитела, обуславливают гуморальный иммунный ответ. Иммунокомпетентые клетки находятся в

- 11 -

определенном кооперативном взаимодействии.

Впервые при гельминтозах последовательность включения Ти В-лимфоцитов в иммунный ответ установлена Е.Soulsby, P.Khoury (1974).

Изучая иммунный ответ при аскаридозе, авторы наблюдали через 1 день после заражения возрастание количества Т-, а через 2 дня - В-лимфоцитов.

K.Karmanska с соавт. (1978, 1981) при экспериментальном трихоцефалезе отмечали повышение Т-лимфоцитов в первые дни после заражения животных.

D.Wakelin, M.Wilson (1979) сообщают об участии клеточного и гуморального иммунного ответов Т- и В-лимфоцитов в индукции иммунного ответа против Trichinella spiralis.

С.Jonstori et al. (1981) отмечали увеличение количества Т-, В-лимфоцитов при экспериментальном аскаридозе.

О.Г.Полетаева (1978, 1983), L.Boroskova et. al. (1982), M.Benkova et al. (1984), М.В.Якубовский (1988), И.А.Гаджиева (1986), И.С.Каныгина (1989) констатировали увеличение количества как Т-, так и В-лимфоцитов при экспериментальном аскаридозе свиней, ниппостронгилезе мышей и диктиокаулезе овец.

Однако, по данным V.Pashuk et al. (1980), К.Genta et al. (1983), Г.К.Раисова с соавт. (1985), В.С.Васильева и др. (1985) при трихинеллезе установлено снижение активности факторов клеточного иммунитета.

По данным Г.Н.Дьяченко (1989) при трихинеллезе иммунный ответ имеет трехфазный характер, включающий два подъема активации и период супрессии. По данным автора стимулирующее воз-

действие гельминта на органы иммунной системы приходится на раннюю кишечную (1-3 сутки) и раннюю мышечную стадии (21-35 сутки). Период супрессии приходится на период массовой миграции личинок трихинелл и заселения ими мышечной ткани (10-21 дни инвазии). Наличие двух стадий в иммунном ответе хозяина по данным Г.Н.Дьяченко происходит за счет перенапряжения иммунной и кровеносной систем и направлено на элиминацию гельминта., ограничение лярвопродукции и поступления ее в мышцы, нейтрализацию продуктов распада тканей хозяина. В этом процессе участвуют как центральные, так и периферические органы лимфоидной ткани. При этом четко выражена фазноеть иммунного ответа, определяющая местные и генерализованные реакции.

В литературе имеется значительное количество работ, подтверждающих способность гельминтов подавлять иммунные реакции хозяина на антигены, выделяемые ими (И.Ю.Черняховская с соавт., 1971; О.Г.Полетаева, 1975, 1978, 1983, 1984: Е.С.Лей-кина, 1976, 1978, 1981; А.С.Бессонов, Р.А.Пенькова, 1984; Э.Х.Даугалиева, 1986, 1990, 1991; A.Jebreas, 1976; G.Faubert, 1977; G.Phillips, E.Fox, 1984; M.Green et al., 1985 и другие) .

Проявление клеточного и гуморального иммунитета зависит от вида гельминта, дозы и кратности заражения, стадия развития инвазионного процесса. Нарушения в системе иммунитета коррелируют со степенью тяжести течения инвазии и связаны с супрессивным действием возбудителя на Т-систему иммунитета (Н.И.Тумольская с соавт. 1983; А.И.Збарекий, Н.И.Тумольская, 1983; Н.И.Тумольская, 1988; 0.Barriga, 1984 и др.). Это при-

водит к нарушению клеточного звена и его регуляторного влияния, что обуславливает неконтролируемый иммунный ответ.

В настоящее время установлено, что реакции, вызывающие разрушение патогенных агентов, относятся к зффекторным механизмам иммунитета - это цитотоксические (антителозависимые) Т-лимйфоциты, разрушающие покрытые антителами клетки-мишени (специфические) и клетки "неспецифические" (ЕКК - натуральные киллеры).

Для цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ.) характерна исключительная иммунологическая специфичность.

У естественных натуральных киллеров иммунологическая специфичность отсутствует, они убивают клетки вне зависимости от их органного, генетического и видового происхождения (R.Herberman, 1980).

Среди эффекторных механизмов иммунитета при гельминтозах все большее значение приобретает цитотоксическое действие клеток-киллеров ("убийц"), вызывающие гибель паразита-мишени (Е.С.Лейкина, 1983).

По данным I.Niederkorn et al. (1983) у мышей, зараженных Tr. pseudospirails происходит увеличение цитотокеической активности нормальных киллеров по отношению к опухолевым клеткам линии YAC -1 в легких.

В работе R.Keller et. al. (1971) описывается роль ЕКК при ниппостронгилезе крыс. Авторы установили, что у зараженных животных в течение первых нескольких дней замедляется рост опухоли, а затем после миграции восстанавливается.

И.С.Каныгина (1989), С.И.Пономарь (1990) наблюдали уве-

личение индекса цитотоксичности ЕКК в 2 раза в первые дни после заражения животных яйцами гельминтов и снижение их активности к концу исследований.

К настоящему времени установили, что механизмы, лежащие в основе иммунологической супрессии изучены далеко не полностью. По всей вероятности, в процессе ее формирования принимает участие целый комплекс факторов. К ним относятся в первую очередь нарушение функции макрофагов, в связи с чем они не способны полноценно представлять антигены. Большую роль в возникновении иммунологической недостаточност�