Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Два направления транскрипции в области генов 25-29 базальной пластинки бактериофага Т4

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Два направления транскрипции в области генов 25-29 базальной пластинки бактериофага Т4"

ЛИТОВСКАЯ РЕСПУБЛИКА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

На правах рукописи

КЛАУСА ВИТАУТАС ИОНО

ДВА НАПРАВЛЕНИЯ ТРАНСКРИПЦИИ В ОБЛАСТИ ГЕНОВ 25-29 БАЗАЛЬНОЙ ПЛАСТИНКИ БАКТЕРИОФАГА Т4

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на ооискание ученой степени кандидата биологических наук

ВИЛЬНЮС - 1992

Работа выполнена в Лаборатории генной инженерии Институт!

биохимии

Научный руководитель - кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Р.Г. НИВИНСКАС

Официальные оппоненты - доктор биологических наук, профессор

член-корреспондент Литовской Ш A.A. ЯСАИТИС

- кандидат биологических наук, старший научный сотрудник К.В. САСНАУСКАС

Ведущая организация - Кафедра биохимии Естественного

факультета Вильнюсского Университета

Заздата диссертации состоится Р. ишя 1992 г. в часов а заседании специализированного совета К 011.05.01 в Институт« биохимии, 2600 Вильнюс, ул. Мокслининку, 12. С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке Институт! биохимии.

Автореферат разослан мая 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

"В.®. 30ВИТЕ-БРАЖЕНЕН1

- 1 -В 53 E Д И И 15 В

Актуальность TSi.aj. 3 ранних работах, ироведошшх и лаборатории Хесина (Хес>ш л др.. 1952, 1963), било исказаш наличие ранних а. поздних фэгоспвцйфЕтских мйЭС в клетках, зарагданшх Т-чэтпш фагом. В дальнейшей било установлено, что транксригщия поздних гэкоз происходит a г-шгш фзговой ДШС пс направлению часовой стрелки на гонотшюской карта фага, а транскрипция ранних гзаов ~ с 1-яити ДНК по коправление против часовой стрелка (Guiia et al., -19Т1). Следует отмотать, что метода тотальной конкурентной габридазовди, на которых базировалось традиционное представление о полярности поздней транскрипции, но позволяла обнаружь транифшгш поздних генов, итпдарованныэ с поздних промоторов на l-нити дик.

Большинство поздних генов бактериофага Т4 локализовано в области меяду ганаш 2 и 54 на генотичэской карте (Stood. Revel, 19Т6). в то se время недавние исследования показала, что в интервале мезду генами 24 и 25 локализован целый ряд раишп генов, а именно гены hoc, Mi, dar, отз1? н uvaY (Hosig, 1983). В работах, проведенных с использованием клонированного EcoR[-фраге.еита фаговой ДНК, содержащего область генов uv3\?--29, а именно гены uvs'tT, uvsY, 25, 26, 51, 27 , 28 и 29, показано, что мРНК, выделенная на поздних стадиях инфекционного ^ш/й, гибридизируется но только с r-нитью, но- ц с 1-нитыо днк этого фрагмента (Young et al., 1980; Зогрзф н др., 1985). При этом существовало мнение, что поздние гены с 25-ого по 29-ий транскрибируются с r-нити ДНК. Однако в действительности лишь для генов с 51-го по 29-й гекетичесюми методами бнла показана их котранскршция но направлению гон 51 ген 29, т. е., как и в случае других поздних генов, по направлению часовой стрелки на генетической карте фага (Stahl et al., 19Т0). В отноиенш зе направления транскрипции генов 25 к 26 данные отсутствовала,

Гены с 25 по 29 составляют кластер поздних генов, многофункциональные продукты которых участвуют в образован®! базальной пластинки бактериофага Т4 - наименее изученной в функциональном и морфогекзтическом отношении субструктурн вириояа (Wood, Bevel, 1976; Berget, King, 1983). Поэтску коучэ-шхе организации генетической и-пйрмащж я жссцрзссгя генов-адиругаах белки базальной пластишк, является актуальной для

понимания процесса самосборки этого весьма сложного структурного компонента фаговой частицы.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение направлений транскрипции в области генов 25-29 базаль-ной пластинки бактериофага Т4. Задачи исследования:

1) определить направление транскрипции поздних генов 25, 26, 51, 27, 28 и 29 фага 14;

2) определить, продукты экспрессии клонированных генов и изучить стабильность синтезируемых белков;

3) определить последовательность расположения амбер-мута-ций S105, NG1H и Н131 в гене 26 фага Т4.

Научная новизна работы. Впервые показано, что гены 25 и 26, в отличие от генов 51, 27, 28 и 29, транскрибируются по направлению против часовой стрелки на генетической карте фаг~ Т4, -т. о. с 1-нита ДНК. Полученные нами результаты, наряду с данными о направлении транскрипции поздних генов в других областях фагового генома (Kutter et al., 1990), показывают, что направление транскрипции но может быть абсолютным критерием классификации генов бактериофага Т4 на ранние и поздние.

При изучении экспрессии клонированных генов из этой области генома показано, что продуктом гена 26 является белок с мол. массой 24-25 кДа, а продуктом гена 51 - белок с мол. массой около 30 кДа. Тагам образом, уточнены мол. массы продуктов гопов 26 и 51 фага Т4, которые ранее были идентифицированы как белки с мол. массами 40-41 кДа и 16,5 кДа, соответственно (Koalofl, Lute, 1984). Показано, что среди индуцируемых фаго-сшоцифических белков в данной системе, продукт гена 29, вероятный кандидат на роль регулятора, определяндего длину хвостового отростка при сборке фаговой частицы (Ishlmoto et al., 1988), является нестабильным к полностью деградирует при, инкубации клеток.

В результате проведенного рекомбинационного анализа области гена 26 была определена последовательность расположения амбер-мутацай в этом гене: (ген 51 )-anSl05-amKG1U-aroN13l-(ген 25).

Практическое значение» работы. Работа выполнена в рамках научно—тоХНЙЧ8ской программа 0.74.05 (йгаико-химичвская биология) ш текэ Института биохимии "Изучить механизма активации и

- з -

направленной экспрессии генома" (Я Госрегистрации 01 87 0049912).

Настоящая работа является частью фундаментальных исследований функционирования генома бактериофага Т4. Материал диссертационной работы используется при чтении лекций по молекулярной генетике для студентов V курса химического факультета вильнюсского университета.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на научной конференции Общества генетиков и селекционеров Литвы (Каунас, 1985); на международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989); и на Эвергринской международной конференции по бактериофагу Т4 (Олимпия, США, 1991).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 статьи и тезисы 5 докладов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуздения, выводов. Диссертация изложена на //^' страницах машинописного текста, включая список литературы из<?57 наименований, 5 таблиц и 24 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И'МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования - область поздних генов 26-29 базаль-ной пластинки бактериофага Т4.

Материалы. Штамм Eahertchla colt В40 (ви^) слушл в качестве перлиссивного хозяина для амбер-мутантов фага. Непер-миссивным хозяином был штамм Е. coll В . В работе использован штамм Е. coli М5248 (bio2T5 CI85T Olli* делеция Ш) n итамм Е. coll JC4588/A,+ (P~endA recA56 gal hls322 thi), содержащий плазмиду pSCC31 -B12. Штаммы.получены от t.41. Black (Цэдицкнская школа Мэрилендского университета, США).

Бактериофаг T4D дикого типа и его амбер-мутента S52, HG91 И N67 (Г6Н 25), S105, NG114 И N131 (ген 26), S29 И NG462 (Г9Н 51), N120, NG35 V S92 (ген 27), А452 (ГОН 28), Вб и S3 (гэн 29), N85 И NG42 (ген 48) и В21 (ген 54) получены от Я.В. ?ood (Колорадский университет, США). Амбер-мутанты S105x5 и KG114x1 по гену 26 получены нами путем скрещивания мутантов ainsi 05 а атИ'3114 с фзгом Т4 дикого типа.

шазмида pSCC31-Bl2 являзтся производной шюзмйде pSCG31 (Cheng, Kodrich, 1983). Плазшда pSCC31 (ApR, ECoHI, r+ m") дошлой и 5152 Пль содержи Р^-промотор Фага По направлена» транскрипция от Pj -промотора находится ген энцонуклеазы EcoRI, содераднй единичные сайта действия рестриктаз HirvSlII и Bglll. Рбком0ян811Т1Шв плазмяда рНЬТ05 и рПЬТСГГ содержат BgZII-фрагмент длиной £ 5,2 т.п.н. ДНЯ фага 74 с геначга 25-29, клонированный в векторной плазмвде pSC031 (Швшскас, 1988).

Котодн. ведзлокио шюзшдаой ДНК, рестрикцию, датирование, электрофораз в агарозном голо проводила по общоизвэскш што-дшсаы (Xaniatis et al., 1902; Sambroo:* et al., 1S39), Трансформация. ДНК плозмяд в кломш нташа Е. colt Ы5248, позволяющего проводить контролируемую Pj-npcisoiopoja теркощдуццровашув

РКС1){»СС!ТЙ ЧуКОрОДЯ!.!Х ГОКОВ ХШШЗЩ1» ИрОЕЭДвЯЗ С Пр'ЩоЫЗШЮ^.

хлористого кальция (L'aaia'cls et al., 1932).

Гежтлческоэ Едэктнаашфованиэ клонировашак фрагазнтов да лрошдан ызтодоа спасовал маркора в спот-т&стах (Matteon et al., 1977), используя аибор-мутан'гы фзгв Т4.

Ошга по опродэлонню 8§®ек?ивноо2Е висовс ембэр-кугантоз на бшлериалыгах Exaissai с рошяйаакшкЕЗ плазщдяа: проЕоди-да в стандартных условиях (Soustad, 1S5S). Скрзпщьашо акбэр-к/т&нтов проводили но «отодаэ (Steinberg, Edgar, 1S52).

Электрсфороипескоэ разделение белков проводила в 12£-м тш^акрпллмадаом голо в щзасутсмк: 0,1% SDS в Сударкой системе Яашта (LasiHsll, 1970).

К'зчушзаюш кроликов для получекая полЕ&попальннх ентптел к сутюрпродуцированноггу продукту гона 25 фага Т4, внделанаа антисчворожи из кровн хагеоатазю, шоднохтгчеокузз рэакщш Д№ЙНО«1 раДБЬЯЬВОЙ ДлЩуЗВЕ и 1Ш?ЕСбЛОИНЕГ ПрОБОДПЛП по "блдепрттнк кегодккам (Остериан, 1933; Sasi&roofc et al.. 1969).

ШШ'ИШ Ш Ж ОЕОЛУШНМЕ

1.Оирздел9вво:ивщ©ал0ЕШ| гракскрхпцак клошровашшх гояов Фага Т4в опытах по шшвмоэт&щш in vivo

При гошяровзмш Vglil-Фрагазш'о да. фага Т4 о гонада 35-?.9 в шда<й!дэ psCC31 с содерша&й Р^-прошч'ор фзга л, в швзй л-йЮрлюрии шля получегш две рохсмйишлиыо гошйядй рНГ,705 к ршг:7 (Ш!шэ;скас, JSPD). В ошт по сппсшж- трюрр к саог-

гостах установлено, что шшаровавпна ¡дЬагсэнт фаговой да содерж гона 26, 23, 51, 27, 20, 29 и часть гзка 43 (таблица).

Для сшродэлшптя орлзнтгцш йраггзнта флгсзой ДНК о оостагэ пяазздд рШ.705 и рШ07 (рас. I) Ca проезда рэстрзктазтаЗ анализ с аспольаовашэа рэстрякяаая ntnûШ. Устаковзгвпо, что з случеэ плаэмзди рПЬ7С5 Сфашэн? jarosoü ЯШ нэходася в благоприятной орээгоацщ для ■грщсдфшщет поздая. гопсз (нзнболээ близко к PjHxpcMOTopy расгге-яоюн ген 25, нгпо'олзэ оадшшо -гон 29 фзга Т4) п в не(Шгопршгаоа - з шжядэ pRL707. орзеп-тация годов в плэклздаз бала нодтЕорэдека щп суйушзрзоши фрагтпт. Пояучеш субяяош pHV20 п pfi'MO (рго. 1). ß cmœa по сшсэняэ паркера в иют-тэсгга ионаэгш, что идагыцда рШО, полученная пря субклонирозэлаа pïïLTOT, оощшт оаздаеиаЗ Ярагашг фаговой ДШС с говоа 25, а плазжда pïîV20, полученная пра субклогароаапы pKLTOS, содор'ззт vccr« гспа 29 п roua to (таблица ).

Таблица

Спасение маркера з спот-тестах

Бактериофаг Т4 Штамм с рекомбинантной плаэмидой

PRL705

Ген Мутант или pHVSO pRV20

¡¡mm

23 amS52 +

amXGÛt + + —

am.N'G" + + -

2G amS 105X5 + _ _

amXGlliXl + — —

am.\131 + - -

51 ainS29 + - _

ami\G462 + - -

27 amX120 + _ _

amXG35 + — -

amS92 + - -

28 amA452 + - -

25' итВб + _ _

amS3 + - -1-

4S arm\85 . + _ +

amNG42 - - -

54 _ -

amH21 - - -

Уае. 1 • Структура к родословная рекомбинштаых. плазазд.

Для определения направления транскрипции индивиду алышх генов фага Т4 в дашгсй работе был использован подход, осковак-ячй на том, что транскрипция, тврмощцуцировшная с Р^-прокото-ра, происходит только в одном направлении и приводит к синтезу белка лишь в случае благоприятной ориентации соответствующего юна. Об дашшаш количества Сема судили по уровшэ коъшлемен-тецвм в отношении амбер-муталтов фага Т4.

В экспериментах по комплементации. 1п vtvo были использованы следуйте амбар-мутанты: аяВ25 (ген 25), аай105х5 (ген 26), юпЗ.?9 'ген 51), ИЙИ20 (ген 27), ашА452 (ген 28) и апйЗ (ген 29), Из данных, приведенных на рис. 2, видно, что перенос бгкторйзлънйх клеток с плазмидаш рНЪ705 и рН1.707 с 30 °С на 42 ~С и дальнейшая инкубация при 42 °С до фаговой инфекции различно влияют па урожай амбвр-мутант-ов по изучаемы?* генам клонированного фрошенто. При этом перенос клеток с плазмидой рНЬТОТ ва °С приводит к значительному увеличении выхода амбер-мутантов по генам 25 и 26 к к уменьшении выхода кутвнтов по генам Г>1, 27, 28, 29 к почти по влияет на выход фагя дикого

T4D

25" 26" 51" 27" 29" 2В"

1Р1МЙ чниуьдиии «»uro« п,и 42'C, чин

Рис. 2. Зависимость урожая фага Т4 дикого тша и его акбер мутантов по генам 25, 26, 51, 27, 28 и 29 в метках Е. coli К5248 с плазмидами pRL705„ и рШОТ от продолжительности инкубации клеток при 42 С перед зарайением0Фагом. Бактеряиовиюащя-вались в среде LB с аштхиллином при 30 С до титра 2 10 клеток /мл, затем переносились на 42 С для термо!шдущфов8жгя транскрипции с Рт -промотора фага К. После инкубации при 42 "О в течение 0, 5, ю, 20 и 30 мин клетки переносили на 30 С и заражали амбер-мутантом или se фагом Т4 дикого типа с множественностью заражения 5. Размножение фага при 30 иС проводили в течение 120 мш,.добавляли хлороформ и вдсеввли на газон клеток Ж. coli В40 (sur) для определения выхода Фага.

типа. В случае se клеток с пласгадсЗ pRL705 наблюдается стпэгтэ выхода амбер-мутантов по генам 25, 26, 29 и даге фага дикого тша; в то ке время ежсод амбер-гяутантов по гонем 51, 27 и 28 сначала возрастает и лишь потом снижается.

По характеру зависимости доли рвкомбинантов в урожае фа га от температурного переноса (рас. 3) изученные гены разделялись

. : I__

о ^о зо с зо о го

О —рЯ-7С7

зо о ю зо о ао о-ю зо

ВРЕЫН И ИХ У й Л11И И КЛЕТОК ПРИ 42"с, ИЙН

Рдс. 3. ¡Зависимость образования рзкокбшсзтов пта рабшогашк ехСвр-щяатоа фага Т4 да генам 25, 26, 51, 27 , 28 к 29 в клат-— ?г,шд8ШоШЬ705 и т>НЬ707 от продожжга&носзи пикубацнз зп 42 0 до фаговой р газЗэкцик. РэкскОешшн сш+

ках с пяадада

!У1Э'Х01; пр:

шявлякк на газов

2. 0014 Вь (ви

па да • груши: гаш 25-26 и гохш 51-27-28-29. Так, в случае генов 25-г-б доля рэодзйшаэтсв сяаааэяся с цродолкешэы пшсуОещш клеток с лпажадос. рйЬ707 и пракгЕчшш: ш изменяется в случае 1у:эток с дказшщоа рЗЬТОЗ. В отпошта зд еыбзр-{гутантов по гевш 51-27-28-29 нббвдеэ?ся цротавополозная здзяшюсть, т. е. дсш рш&бнзантов в урогао ©зга снжаегся в случае кяоток с плазкадой рНЬТСб I: почте не ббмзеяотся в клетках, с плазавдрВ рга.707. Постоянная взлищша процента ржомбвнаахов в урокаэ фага, вядао, увашвеох на то,- что цро-шсс рококбгтацян яздяагсв суезсиюшек для образована! ©згов, о скшзнне доли рекокбЕнаптогз сшдотол&отвует о нвобяшжмшнос-тк рашайшшда для созровшаг (¡-егонее. частей

Такш образом, тержэкуцщированЕв транскрипции с Р1-ггро:'отора в случае шгазшдо рйЬТОб, содержащей фрагмент фаговой ДНК в ориентации, благоприятной для транскрипции поздних геноз Т4, приводит к увеличению выхода амбер-,мутантов по генам 51, 27 и 28, причем это увеличение сопровождается значительным сюикением доли рекомбинантов. Противополоамя ориентация (фрагмента фаговой ДНК в плазэде рНЬ707 оказалась благоприятной для экспрессии генов 25 и 26, и, следовательно, эта геш транскрибируются по направлешпэ против часовой стрелки на генетической карте фзга Т4. Следует окотить, что в случае гона 29 шблздаэтся скаяэние Енхода фага в клетках, несущих обо плезнвдц - рШ05 к рШОТ; однако только в клетках с плэз?,щдой рЯ1705 наблэдаэтея значительное снижение доли рекомбинантов, аналогичное с генами 51-27-28 (рас. 3). Следовательно, ген 23 следует отнести к группе генов 51-27-28.

Итак, результаты опытов по комплементаций 1п vivo убедительно указывают на то, что геш 25 и 26, в противоположность гена!.; 51, 27, 28 и 29, транскрибируются по направлзшгя протки часовой стралки на генетической карте фага Т4, т. е. с 1-нитп ДНК. Дополнителыюе подтверждение наличия двух направлений тралскршпзш в области гонов 25-23 получено наш при изучения про/слотов экспрессии упомянутых гонов в клетках с рекомби-нантшш плазмздакц рШУГ05 и рШШ.

2. Продукта экспрессии клонированных генов 25-29 баэальной пластинка бактериофага Т4

Наличке сильного Рь-промотора Фага к в состава рекомби--наптних плазшд рВ1705 и рм.707 позволяет предоолошть высокий уровень -термоиядуцируемого синтеза фагоспецц$кческих белков и, следовательно, возможность идонтийжацки продуктов скспрессвн фзговкзе генов на <5)оно белков бактериальных клеток.

фЕГсснвщ^Тгибсктю бэлки в клетках с идазкидей рН1705. Пра кндущфовйгпта транскрипции с Р1 -промотора плазмида рНЬ705, в которой фрагмент фаговой ДНК находится в благоприятной ориен-тецая для транскрипции поздних генов фага, в клетках доляен происходить термоиндуцкруемай синтез продуктов генов 29, 28, 27 н 51. Продукты этих генов, за исключением продукта гена 51, обнаруживаются в мечоных лизэтах бактериальнш клеток, содержащих вншеупомянутую плазмиду (рис. 4а).

I 2 3

О»*

VT

Igg» «ftW MgBM*

0е

1 2 3

пг29

пг 27

Käi? «035;

— —

_ «»»iss®'

Т" i

«S9 «—!«„

Sf I

пг28

т-

( чвд»««»»

■'S— пг26

1 2 3

„. ES3 «31 •SS SS ш «и» «з»

«er«. «ом. «ж»

ю» wa

gp» —V -«и*

чг. w «ö

92.5 — 69.0

-46.0 -30.0

-14.3

б

Рио. 4. Электрофоретическое разделение продуктов экспрессии генов фага Т4 в клетках Е. coli М5248, содерка;цих нлазшду pRL705 (а) и плазмвду pRL7ü7 (б); контроль (в) - клетки Е. colt Ы5248 без плазмида (справа указан^ мол. масса, белков-маркеров, кДа)

rto rrvntj TTTV-iönтгт.1тя п rrr\iir\m^in Т—ГТТ_'4Л1 е**т*илт.т*г»пл»7> /Лтппг»

Мечение белков проводили с помощь» L-CU- 01 аминокислот Eham): 1 - бактериальные клетки выращивали при 30 С и м

(Аглег-метили в

индуцирования транскрипции при Б мин синтезируемые белки метили в течение 1 мин, а затем, с целью опведеления их стабильности, добавляли казаминовые кислоты и продолжали инкубацию клеток 30 каш при 42 °С. Стрелками показаны продукты генов (пг) фага Т4, индуцируемые с рекомби-нантных плазмид.

Продукт гена 29. Известно,, что ¡..ол. масса продукта гена 29 фага Т4 равна 77 кДа (Моэ15, 1983). Как видно из представленных на рио. 4 электрофореграмм, повышение температуры в случае клеток с плазмидой рНЪ705 (а) приводит к появлению бежа с мол. массой

76-7? кДа. Меченко при 42 °С с послодувдей инкубацией в течение 30 мин показало, что синтезируемый белок гена 29 является нестабильным и полностью деградирует при дальнейшей инкубации клеток (рис. 4а, дорожка 3). Зто, очевидно, не позволило обнаружить продукта гена 29 среда других индуцируемых фагоспецифм-чесгак белков при электрофоротическом разделении их после 60 мин термоиндуцирования немеченых бактериальных культур с последущей дезинтеграцией ультразвуком (см, рис. 5). Возможно, для стабильности белка гена 29 требуется взаимодействие с продуктами других генов фага ТД.

Продукт гена 28. Продуктом гена 28 фага 74 является белок с мол. массой 24-25 кДа №оз1в, 1983). Из электрофореграмм, приведенных на рис. 4а я ряс. 5, видно, что з клетках с роком-бзшантной плазмидой рНЬ705, содержащей фрагмент фаговой ДНК в ориентации, благоприятной для транскрипции гена 28, синтезируется фагоспэцифический белок с мол. массой 23-24 кДа. Показано, что продукт гена 28 является стабильным, так как не•деградирует с продолжением инкубация бактериальных клеток в течение 30 шш (рис. 4а, дорокка 3).

Продукт гона 27. Ген 27 фага Т4 кодирует белок с мол. массой 44 кДа (Воуа ег а1., 1930). 11а злектрофореграмме меченых клеток с плазмидой рй!705 (рис. 4а.) белковая полоса предполагаемого продукта гена 27 (43-44 кДа) совпадает с таковой моченого бактериального белка (см. рис. 4а и 4в). йдантийщаровать продукт этого гена позволяет относительное увеличение соответствующей полоса после термоиндукщш в клетках с плазмидой рН1705 и отсутствие такового увеличения как в случае клеток с плазмидой рКЬ707 (рис. 46), так и в случае бактериальных клеток без плазмид (рмс. 4в), Для более четкого выявления продукта гена 27 было проведено термоиндуцировзше синтеза продуктов клонированных генов в течение 60 мил с последущей дезинтеграцией бактериальных ¡слеток ультразвуком. В осадочной фракции лизатоп меток с плазмидой рРЬТС5 обнаруживается значительное количество продукта гена 27 (рис. 5, дорогка 4). Как видно кз электро-форэграмм, приведенных но рис. 4а (дорожи 2, 3) и на рио. Б (дороззш 4), продукт гена 27 фага Т4 является стабильным в

ДРШЮЙ ПИСТЭМЗ ЭКСПр^СПШ.

1 2 3 4 5 s

пг27—>

— 34.0 67.0

— 43.0

—30.0

— 20.1

Рас. 5. Элвктрсфоретвческое разделение фагоснецифаческих белков» обнаруживаемых в осадочной фракции лнзатов, после дезинтеграция клеток ультразвуком: 1 - лизат клеток с плазмидой pHL707, выращенных при 30 2 - лизат клеток с плазмидой рНЬ705, Еыращенных при 30 0: 3 - лизат клеток с плазмидой pKLTOT после их переноса в 42 0 на 60 ьин; 4 - лизат клеток о иявзмвдоЛ pHL705 после их переноса в 42 на 60 мин; 5 - контроль, лизат клэток Е. colt м5248 без плазмид после их переноса в 42 С на 60 мин; 6 - белки-маркеры (справа указана их мол. масса, кДа). ПААГ окравшвали кумассн ярко-голубш G-250.

Про дуну гена 51. Продук? гона 51 фага Т4 первоначально был вдэнткфацирован как Оэлок 16,5 кДа (Kozloff, Lute, 1934). Однако, при опрэдслонла первичной структуры этого гена бнло показано, что гон 51 кодирует голжюптдц с ьюл. массой 23,3 кДа (Scarlato et al., tS89). При электраЗорэтичэскок разделении иэченнх белков в клетках с рекомбшантной- плазьадсЗ рНЬТОб (рис. 4а), в которой фрагмэнт фаговой ДНК находятся в благоприятной ориентация для вксцрэссии гена 51, нрэдполагаэшго бежа гена 51 величиной около 30 кДа обнаружить нэ удалось. В случае вэ анализа (Jагоспецкфкчоских Сэдков в бактериальных тетках с

плаз?,шлей pF¡L705, инкубированных 60 ?яго при 42 °0 и дезинтегри-■ ронанкых ультразвуком (рис. 5), наблюдается полоса 30 кДа, которая отсутствует в случае плззмиды pRI707 и меток без плаз-киды. При gтом, малая интенсивность окрашивания отой белковой полосн в геле, видимо,отрезает низкий уровень синтеза продукта гена 51. Тагам образом, наблюдаемый наш продукт гена 51 как солок с кол. массой 30 кДэ подтверждает вышеупомянутые дошше по секвснировашш этого гена к, в то ке время, противоречит первонччальнш ' данным о мол. массе продукта этого гена (Kozloír, Lute, 1984).

.&ягоспецкфичзские белки в клетках с плазмидой PRL70T. В соответствий с установленным в опытах по кошлементаци in vivo направлением транскрипции, в клетках с плакадой рНЬ707 додазн наблюдаться тзрмоиндуцироваякыа синтез продуктов генов 25 и 26. Продукт гэна 25. Ген 25 фага Т4 кодирует белок с мол. кассой б 15 кДа íGmlcU et al., 1938). Белок с такой мол. массой индуцируется в клэтаах с плазмидой pRL707 (рис. 46), однако он обнаруживается п з клетках с плазмидой рИ.705 (рис. 4а) н ¿ase в клетках без плазмнда (рис. 4в). Следовательно, мол. масса белка . гена 25 совпадает с кол. массой одного из белков теплового шока Е. col i (Keidbarût et al., 1984) a его идентификация в данной системе является затруднительной. Для обнаружения предполагаемого белка гэна 25 в клетках с плазмидой pRL7Q7 наш был проЕЭ-ден 2к-дуЕОХ2зжческнй анализ лизатов бактерий. Для наработка гашклокалькых антител к продукту гена 25 использовали белок, суперпродущрованвый в клетках с рэкошйшантной плазквдоЯ рГО5-31 (Вайикунайтв, ШвЕнскас, • 19SO). Как видво из рис. G (1), в лшзате клеток рНЬ707 действительно обнаруживается антигены» роагируадкз с ангп-лгйб сывороткой. Б лезетах аз, подученных ез клеток с плазмидой рШ05 после 60 mm инкубации при 42 °с, такая реакция ез наблюдается (рис. 6 (2)). Проведенный в посдедстшш анализ электрофорэтическа разделенных бежев этих лкзетов с яомещыз Енмукоблоттинга однозначно показал, что в клетках с плазмидой рйЬ707 появляется белс-к с мол. массой около 15 кДа, резгйрукцЯ! с полиюювальнниа антителами к .продукту гена 25. К теку se, он одел 'одинаковую эдехтрофоретпческуо под5-?::шость как и продукт гена 26, обнаруживаем в параллельных опятах.с белками интакпмх вприоноз фзга Т4 дикого типа.

«-Э-ПГ25

Рис. 6. Обнаружение продукта гена 25 фага Т4 в лизатах клеток, содернадих плазмиду рШ07, методом двойной радиальной иммуно-диффузии: 1 - лизат клеток с плазмидой pRLTOT после инкубации при 42 °С в течение 60 мин; 2,3- такие se лизаты клеток Е. coll М5248 с плазмидой pRLT05 и без плазмид, соответственно.

Продукт гена 26. В меченых клетках с плазмидой pKLTO? (рис. 46) наблюдаемый единственный фагоспеикфический белок с мол. массой 24-25 кДв, видимо, является продуктом гена 26 фага Т4. Как видно из рис. 46 (дорожка 3), синтезируемый белок гена 26 стабилен и не деградирует с продолжением инкубации клеток. При электрофоре тизе ском разделении белков из осадочной фракции дезинтегрированных ультразвуком клеток с плазмидой pRLTOT, инкубированных в течение 60 мин при 42 °С, также обнаруживается яркая полоса белка с мол. массой 24-25 кДа (см. рис. 5). Следует отметить, что наблюдаемая величина мол. массы белка гена 26 существенно отличается от таковой белка -40-41 кДа, идентифицированного в составе базальной пластинки фага Т4 как продукт гена 26 (Kozlolf, Zorzopulos, 1981; KozlofI, lute, 1984). Однако, определенная нами при картировании амбер-мутаций гена 26 частота рекомбинации между этими мутациями и ближайшими генетическими маркерами соседних генов 25 и 51 предполагает образование продукта гена 26 как белка с мол. массой не более 25 кДа. И наконец, секвенирование гена 26, проведенное в нашей лаборатории, показало, что ген кодирует белок с мол. массой 24 КДа (HivtriBkas et al., 1990), что подтверждает данные, представленные в настоящей работа.

В результате рекомбинационного анализа области генов 25-51 была определена такая последовательность расположения амбер-мутаций в гене 26: (ген 51)-amS105-amNG114-amN131 -(ген 25).

- 15 -ВЫВОДЫ

1. Гены 26 и 25 базальта пластинки бактериофага Т4, в противоположность генам 51, 27, 28 и 29 того-же кластера поздних генов, транскрибируются по направлению против часовой стрелки на генетической карте фага, т. е. с 1-нити ДНК.

2. Уточнены мол. массы продуктов генов 26 и 51 фага Т4. Тан, продуктом гена 26 является белок с мол. массой 24-25 кДа, а продукт гена 51 - белок с мол. массой около 30 кДа.

3. Продукт гена 29 фага Т4, индуцируемый в клетках с плазмидой pRL705, является нестабильным и полностью деградирует при дальнейшей инкубации клеток.

4. Амбер-мутации гена 26 локализованы в различных сайтах в слэдуюцай последовательности: (ген 51)-amS105-amNG114-amN131~ (ген 25).

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Нивинскас Р., Клауса в., Шалнене В., Шакалене О. Изучение трансмиссии амбер-мутантов бактериофага Т4. Сообщение II. Термочувствительность размножения амбер-мутантов по гену 26 б клетках Eahertchta colt В и отсутствие таковой в случае гена зя // Генетика. - 1983. - Т. 19. а 7. - С. 1075-1080.

2. Клауса В., Нивинскас Р. Генетическая карта гена 26 бактериофага Т4 // Теоретические и практические вопросы генетики и селекции микроорганизмов, растений и животных: Тез. конф. Вильнюс, 1985. - С. 149-150.

3. Клауса В., Нивинскас Р. Экспрессия генов базальной пластинки фага Т4, клонированных в плазмиде pSCC31 // Генетика и селекция в ускорении научно-технического прогресса: Тез. конф. - Каунас, 1986. - С. 115-117.

4. Клауса В.Я., Нивинскас Р.Г. Определение направления транскрипции некоторых генов базальной пластинки бактериофага Т4 // V съезд Всесоюзного общества генетиков я селекционеров им» Н.И. Вавилова: Тез. докл. - Москва, 1987. - Т. 5. -

С. 42-43.

5. Клауса В.П., Нивинскас Р.Г. Определение направления транскрипции генов бактериофага Т4 при термоиндуюфовэнии транскрипции с Pj-промотора рекомбинантных плазмид: два на-

правления в области генов 25-29 // Генетика. - 1983. - Т. 24. ß 1. - С. 42-52.

6. Klausa V.J., Hlvlnskfis R.II. Expression of clonsd. bacteriophage T4 baseplate genes under phage \ promoter regulation // Uolesular Organization of Biological Structures / Abstracts of international Symposium. - Koacow, 1989. Book I. - P. 85.

Т. Клауса В.И., 1Швинскас Р.Г. Продукты экспрессии клони-клонировашшх генов 29, 28 , 27 , 51 и 26 базальшй кязсшеси бактериофага Т4 // Генетика. - 1990. - Т. 26. » 2. - C.359-3S2.

8. Hlvinakaa R., VaisKunalte R., Dagyte R., Klausa V. Cloning, sequence and overexpresslon of bacteriophage T4 baseplate genas 51, 26 ana 25 // Abstracts or Evergreen intarna-tional Bacteriophage T4 Meeting. - Olyurpia, ",'A, Auguat 1-6, 1991. - P. 49. '

9. Hivinsltaa В., Valslamaite R., Dagyte R., RaucLoiiUiiene A., Klausa V. Cloning, sequence, and overexpresslon ol bacteriophage T4 gene 51 // Virology. - 1992. - V. 188.

ЛИТОВСКАЯ РЕСПУБЛИКА ИНСТИТУТ ШОХИДН1И КЛАУСА ВИТАУТАС ЙОНО

ДВА НАПРАВЛЕНИЯ ТРАНСКРИПЦИИ В ОБЛАСТИ ГЕНОВ ,25-^0 БАЗАЛЬНОЙ ПЛАСТИНКИ БАКТЕРИОФАГА Т4 '

БУМАГА ТИПОГРАФСКАЯ 00x84 1/17.Т11РЛЖ ЮС ЭКЗ. ЗАКАЗ 30-1. УСЛ.ИСЧ.Л.1.00. ОТПЕЧАТАНО РОТАПРИНТОМ В ИНСТИТУТЕ ИНФОРМАЦИИ ЛИТВЫ.2000.13ИЛЬШ<10,Т010Р10 27.