Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дрожжевая долихилпирофосфатаза: солюбилизация и свойства

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Дрожжевая долихилпирофосфатаза: солюбилизация и свойства"

Г, 5 31

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи УДК 577.127.4:577.152.3

АД НАЛ МУХАММЕД ХАМУИ

ДРОЖЖЕВАЯ ДОЛИХИЛПИРОФОСФАТАЗА: СОЛЮБИЛИЗАЦИЯ И СВОЙСТВА

(специальность 03.00.04 - биохимия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 1992 г.

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН. Научные руководители: доктор биологических наук, чл.-корр. РАН И.С.Кулаев кандидат биологических наук Ю.А.Шабалин

Официальные оппоненты: доктор биологических наук И.Б.Наумова

кандидат биологических наук А.Б.Циоменко

Ведущее учреждение: Институт органической химии им.Н.Д.Зелинского РАН

Защита диссертации состоится 1992 г. в час.. ^¿?мин.

на заседании Специализированного совета Д 002.69.01 при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, г.Пущино, Московской области, 142292.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Автореферат разослан "«¿У"/^1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор биологических наук

В.М.Вагабов

, . Актуальность проблемы. Изучение структурной организации и биосинтеза тликозилированных белков является в настоящее время одной из актуальных проблем современной биохимии. Гликозилированные белки - гликопротеины -" • являются важными субъектами метаболизма живой клетки. Гликопротеины обеспечивают процессы взаимодействия микроорганизмов и их хозяев, клеточно-" клеточных узнаваний, взаимодействия гормонов с рецепторами, функционируют как ферменты, как структурные компоненты клеточных стенок, к гликопротеинам относится большая часть секретируемых клеткой белков, также белков плазмы крови.

В тематике исследований гликопротеинов особое место занимает проблема изучения собственно процесса биосинтеза этих соединений. Построение молекул гликопротеинов является многостадийным, тонко организованным процессом с участием мембраносвязанных ферментов и липидных переносчиков. При биосинтезе гликопротеинов ключевую роль играют липидные переносчики моно- и олигосахаридов, функцию которых в клетках эукариот выполняют фосфорные эфирьг долихолов. Долихилмонофосфат является исходной формой липидного переносчика и при N-гликозилировании белков служит своеобразным стапелем для сборки внутреннего "кора" гликопротеинов, при этом между олигосахаридом "кора" и долихолом образуется пирофосфатная связь. После переноса синтезированного олигосахаридного блока на молекулу белка освобождается долихилпирофосфат, который необходимо превратить в исходный долихилмонофосфат, чтобы переносчик мог вернуться в цикл реакций биосинтеза гликопротеинов. Эту важную функцию регенерации липидного переносчика выполняет специальный фермент - долихилпирофосфатаза. В связи с ключевой ролью долихилпирофосфатазы в системе биосинтеза гликопротеинов исследование свойств этого фермента заслуживало внимания и было актуально.

Состояние вопроса. К моменту начала работы фермент долихилпирофосфатаза был обнаружен в клетках животных тканей, были описаны некоторые характеристики данной биохимической реакции (Kato et al., 1980; Wedgwood, Strominger, 1980; Adair, Cafmeyer, 1989). Специального исследования дрожжевой долихилпирофосфатазы не проводилось, но было отмечено, что активность данного фермента присутствует и в клетках дрожжей (Наумов и др., 1985).

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы являлось исследование свойств и характеристик долихилпирофосфатазы дрожжей, солюбилизация из мембран и определение внутриклеточной локализации данного фермента в дрожжевой клетке. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- исследовать и оценить состав дрожжевых долихолов, являющихся неотъемлемой частью липидных переносчиков биосинтеза гликопротеинов;

- оценить эффективность препаративных методов выделения и очистки долихолов из биологического материала;

- осуществить химический синтез препаративных количеств долихилпирофосфата, в том числе меченых радиоактивными изотопами фосфора;

- разработать способ «мобилизации долихилпирофосфатазы из мембран дрожжей;

- определить физико-химические свойства солюбшшзированного фермента;

- установить внутриклеточную локализацию долихилпирофосфатазы.

Научная новизна. Впервые из мембран дрожжей солюбилизирован фермент

долихилпирофосфатаза и определены основные характеристики данной реакции гидролиза терминального фосфата долихилпирофосфата. В процессе выделения мембран из бесклеточного экстракта и солюбилизации из мембран долихилпирофосфатазы достигнута 50-кратная очистка фермента без потери его активности. В работе установлено, что дрожжевая долихилпирофосфатаза преимущественно связана с везикулами микросомальной фракции, а также локализована в вакуолях. Определен состав дрожжевых долихолов, и установлено, что основным компонентом смеси является долихол с длиной цепи в 16 изопреновых единиц.

Практическая значимость. Способ солюбилизации долихилпироосфатазы из мембран может найти практическое применение при выделении других мембранных ферментов. Полученные данные по характеристике фермента, который регенерирует липидный переносчик, позволят лучше понять, механизм регуляции биосинтеза гликопротеинов у дрожжей. Методические подходы и приемы, использованные для препаративного выделения долихолов, их анализа и химического фосфорилирования, могут быть применены в практике работы со структурно близкими соединениями.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на V Международной конференции по химии и биотехнологии биологически активных природных соединений (Болгария, Варна, 1989); на 15-м Международном специализированном симпозиуме по дрожжам (Латвия, Рига, 1991).

Публикации. По теме диссертации имеется три публикация.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов и изложение результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитированной литературы, включающего ссылки, из них /д работ отечественных авторов и/^ зарубежных авторов.

Работа изложена на 6 страницах машинописного текста, содержит /О таблицы, рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили дрожжи Яасскаготуса сагЬЬегкети ИБФМ У-366, культуру хранили на косяках с сусло-агаром. Дрожжи выращивали в среде 2

с 2% глюкозы, 1% пептона и 0,5% дрожжевого экстракта при 29°С в колбах объемом 750 мл с 200 мл среды.

Протопласты из дрожжевых клеток получали с помощью препарата "улиточный фермент" (лнофилизированный желудочный сок виноградной улитки) по стандартной методике, используя сорбитол в качестве осмостабилизатора.

Субклеточные мембранные фракции получали из лизата протопластов. Дрожжевые вакуоли выделяли флотацией в градиенте фиколла (Wiemken, 1975), везикулярные фракции получали из лизата протопластов после удаления из него вакуолей, применяя комбинацию методов дифференциального центрифугирования, флотации в градиенте фиколла, седиментации В(Градиенте верографина.

Суммарную мембранную фракцию получали методом дифференциального центрифугирования из разрушенных осмотическим шоком протопластов в виде осадка 70000xg.

Солюбилизацию долихилпнрофосфатазы проводили из суммарной мембранной фракции с помощью тритона Х-100. К суспензии мембран в 0,05 М трис-HCl буфере рН 7,5, 0,006 М MgCl2, 0,018 М NaCl добавляли раствор тритона Х-100 из расчета равных весовых долей белка мембран и детергента. Фермент солюбилизировали при 2°С в течение 30 мин. К солюбилизату добавляли 2 объема буфера-стабилизатора (45% глицерин, 0,05 М трис-HCl буфер рН 7,5, 0,01% 2-меркаптоэтанол) и центрифугировали 1 час при 105000xg. Супернатант (солюбилизированные белки) хранили при -10°С.

Выделение долихолов из дрожжей проводили тремя способами: 1) спирто-щелочной гидролиз сухих дрожжей с последующей экстракцией гидролизата гексаном; 2) экстракция сухих дрожжей смесью хлороформ:метанол (С:М = 3:2), спирто-щелочной гидролиз экстракта с последующим извлечением неомыляемой фракции липидов гексаном; 3) разрушение клеток механическим способом, получение лиофилизированной суммарной мембранной фракции, обработка ее аналогично второму способу.

Выделение долихолов из печени свиньи проводили по методу (Burgos et al., 1963).

Долихилмонофосфат получали химическим фосфорилированием долихола с помощью хлорокиси фосфора методом Данилова и Хойнацкого (Danilov, Chojnacki, 1981).

Долихилпирофосфат получали традиционным способом (Cramer, Bohm, 1959)« используя трихлорацетонитрил в качестве конденсирующего агента.

Радиоактивный [р,Р32]долихилпирофосфат получали по методике Шибаева с сотр. (Шибаев и др., 1979, Шабалин и др., 1985), активируя синтетический долихилмонофосфат имидазолом и затем вводя его в реакцию с радиоактивной солью (три-н-октиламмоний) фосфата.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) долихолов

3

проводилась с использованием оборудования производства LKB (Швеция) (насос LKB 2150, УФ-детектор LKB 2151, интегратор LKB 2221) и Laboratornie Pristroje (ЧСФР) (насос НРР 4001, рефрактометр RIDK 101, интегратор CI 100). Обращеннофазовую хромагогрфию проводили на колонке Partisil ODS-3 4,6x250 мм (система изопропанол:метанол 1:1), для нормальнофазовой ВЭЖХ использовали колонку Separon SIX-CN 3,3x300 мм (система 0,05% изопропанол в гексане).

Эксклюзионную препаративную хроматографию долихолов проводили на колонке (3,5x75 см) с сефадексом LH-20, элюируя вещества смесью хлороформ:метанол (С:М = 1:1).

Фосфаты долихола выделяли с помощью ионообменной хроматографии на колонке (1,5x20 см) с DEAE-целлюлозой в ацетатной форме.

Тонкослойную хроматографию долихолов и их фосфатов проводили на пластинках с силикагелем (Merck, Германия), используя системы растворителей: 1) бензол:эталацетат (95:5); 2) хлороформ:метанол: вода (60:25:4); 3) хлороформ:метанол:аммиак:вода (65:35:4:4).

Определение активности долихилпирофосфатазы проводили с использованием [ß ,РЗЭ] долихилпирофосфата в качестве субстрата. Реакционная смесь объемом 100 мкл содержала: [ ß,P3}] Dol-PP (20000-90000 имп/мин); 0,1% тритон Х-100; 5 тМ ЭДТА-Na; 50 тМ трис-HCl буфер pH 8,0; ферментный препарат (4-Ю мкг белка). После инкубации реакцию останавливали добавлением 500 мкл смеси хлороформ:метанол (С:М = 3:2) и измеряли радиоактивность верхней фазы.

Активность фосфогадролаз измеряли стандартными методами, используя в качестве субстрата 4-нитрофенилфосфат.

Активности' oi.-маннозидазы и маннан-синтетазы определяли по методике (Behrens, Cabib, 1968).

Количество фосфора в пробах измеряли методом Хесс и Дерр (Hess, Derr, 1975).

Количество белка в пробах определяли методом Лоури в присутствии 1%

SDS.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1 Выделение и анализ состава дрожжевых долихолов

Для подбора оптимальных условий выделения долихолов из дрожжевых клеток были проверены три различных способа экстракции неомыляемой липидной фракции, содержащей долихолы. Наиболее эффективным следует признать метод, который* обычно используют для выделения долихолов из животных тканей, включающий спярто-щелочной гидролиз биомассы на первой стадии (таблица 1, способ 1). Очевидно, что одним из факторов, оказывающих влияние на степень 4 .

Таблица 4.

Распределение активности долихилпирофосфатазы при солюбилизации из мембран дрожжей.

Количество белка Активность, х103

Фракция фракции, мг имп/мин на 1 мг белка

Лизат протопластов 1728,0 3,6

Супернатант, 3000 g 1565,1 2,8

Супернатант, 70000 g 1480,6 0,07

Осадок, 70000 е 59,6 78,7

Солюбилизированный

ферментный препарат* 32,9 152,0

Осадок, 105000 я 26,4 88,0

* Отношение белок:детергент = 0,5

солюбилизирующего детергента. Как видно из результатов, представленных в таблице 5, оптимальным условием для солюбилизации исследуемого фермента является равенство весовых долей мембранных белков и тритона Х-100. При сравнении удельных активностей фермента, солюбилизироваяного в оптимальных условиях, и лизата протопластов можно сделать вывод, что данная операция

Таблица 5. Определение оптимального отношения белок:детергент при солюбилизации долихилпирофосфатазы.

Отношение Количество Активность, х103

Фракция белок белка имп/мин на 1 мг

детергент фракции,мг белка

Солюб илизат 56,0 112,0

Супернатант, 105000 g 0,5 32,0 136,0

Осадок, 105000 g 23,0 78,5

Солюбилизат 61,0 100,8

Супернатант, 105000 g ьо 34,8 202.9

Осадок, 105000 е 26,0 51,4

Солюбилизат 58,0 83,3

Супернатант, 105000 g 2,0 26,7 112,5

Осадок, 105000 g 30,2 63,5

привада к более, чем 50-кратной очистке долихилпирофосфатазы без потери суммарной активности. Солюбилизированный ферментный препарат сохранял свою активность в течение месяца при -10°С в стабилизирующем буфере с глицерином. Б конце срока хранения активность препарата снижалась на 5-10'%.

5. Влияние катионов двухвалентных металлов, 2-меркаптоэтанола, ЭДТА и фосфатов на активность долихилпирофосфатазы

В таблице 6 приведены данные по определению влияния некоторых добавок на активность солюбилизярованной долихилпирофосфатазы. Наиболее эффективным активатором является ЭДТА, увеличивающий скорость реакции более, чем в 3 раза. Этот же эффект отмечен для всех исследованных к настоящему времени долихилпирофосфатаз эукариот. Все катионы двухвалентных металлов в той или иной Степени ингибировали реакцию. Если катионы магния лишь слегка снижали активность, а никель - на 50%, то остальные металлы полностью останавливали реакцию. . Ингибирующее действие катионов двухвалентных металлов возможно связано с образованием неактивного комплекса этих металлов с долихилпирофосфатом. Ортофосфат сильно тормозил реакцию, а пирофосфат практически не оказывал влияния на активность долихилпирофосфатазы, также как и 2-меркаптоэтанол.

Таблица 6. Влияние добавок на активность солюбилизироваиной долихилпирофосфатазы.

Добавки Концентрация, мМ Активность, х103 имп/мин на 1 мг белка

Без добавок - 26,9

ЭДТА 5 85,5

2-меркаптоэтанол 10 28,0

Ортофосфат 5 7,7

Пирофосфат 5 22,9

5 24,9

8г2 + 5 1,3

5 16,6

Мп2 + 5 0

Ваг + 5 0

Са2 + 5 0

Со2* 5 0

Рис.З. рН-зависимость

долихилпирофосфатазной

реакции.

имп/миня10"3

5 г

9 10 12

рН

имп/лин*1С"3 6

0,2 0,4

Тритон Х-100, °/в

Рис.4. Влиянйе концентрации детергента на активность долихилпирофосфатазы.

0,6

11

6. Зависимость активности долихилпирофосфатазы от рН

рН-оптимум действия фермента находится в слабощелочной области с максимумом активности при рН 8,0 (рис.3). Известная долихилпирофосфатаза из печени крысы наибольшую активность проявляла при рН 6,9-7,5, долихилпирофосфатаза из мозга теленка и лимфоцитов человека имели оптимум рН в области 8,0.

7. Влияние концентрации детергента на активность долихилпирофосфатазы.

При определении активности долихилпирофосфатазы обязательно присутствие в реакционной смеси детергента, который необходим для растворения гидрофобного субстрата. На рис.4 приведена кривая влияния концентрации детергента на активность долихилпирофосфатазы. Оптимальной концентрацией тритона Х-100 для долихилпирофосфа тазы является 0,1%. Активность долихилпирофосфатазы в клетках тканей животных также максимальна при 0,1% тритона Х-100.

& Зависимость активности долихилпирофосфатазной реакции от количества белка солюбилизированного препарата

Скорость гидролиза долихилпирофосфата монотонно возрастала с увеличением количества белка в интервале 0-8 мкг (рис.5). В данном случае с солюбилизировакным ферментом не наблюдалась та зависимость скорости

имп/«инк10"3

6 г

5

к

2

3

X

Рис.5. Зависимость активности долихилпирофосфатазы от белка солюбилизированного препарата. 12

2 и 6 в 10 12 Белок, мк»

гидролиза от количества белка, которая была обнаружена при исследовании микросомальной фракции из печени крыс. При увеличении концентрации белка микросомальной фракции происходило сначала повышение активности гидролиза долихилпирофосфата, а затем довольно резкое ее снижение (Belocopitow, Bosco-boinik, 1982). Авторы объясняли этот эффект присутствием в мембранах ингибирующего фактора - фосфатидной кислоты. При солюбилизации, по-видимому, этот ингибитор не переходит в раствор и поэтому в нашем случае не оказывал влияния на активность долихилпирофосфатазы.

9. .Термостабильность солюбилизированной долихилпирофосфатазы.

Полученный солюбилизированный препарат долихилпирофосфатазы оказался достаточно термостабильным. Прогрев его в течение 5 мин при 60°С приводил к потере 50% активности (рис.6).

имп/(лин*10"3

Sr

Темперотура, °С

Рис.6. Кривая термостабильности солюбилизированной долихилпирофосфатазы.

Таким образом, представленные результаты свидетельствуют о том, что у дрожжей, также как и в клетках тканей животных, имеется мембраносвязанная долихилпирофосфатаза, которая сравнительно легко солюбилизируется из мембран

13

с помощью тритона Х-100. В силу своих свойств, а именно, высокой активности и стабильности солюбилизированного препарата этот мембранный фермент может быть в дальнейшем получен в высокоочищенном виде.

ВЫВОДЫ

1. Впервые из мембран дрожжей солюбилизирован фермент долихилпи-рофосфатаза, катализирующий отщепление терминальной, фосфатной группы долихилпирофосфата; солюбилзация долихилпирофосфатазы привела к 50-кратному увеличению удельной активности фермента относительно бесклеточного экстракта без потери общей активности.

2. Определены некоторые физико-химические характеристики солюбилизи-рованной долихилпирофосфатазы:

а) рН-оптимум реакции равен 8,0;

б) катионы двухвалентных металлов ингибируют долихилпирофосфатазу, а ЭДТА стимулирует активность фермента более, чем в 3 раза;

в) оптимальная концентрация тритона Х-100 при определении активности долихилпирофосфатазы равна 0,1 %;

г) Km реакции 0,7 мкМ.

3. Долихилпирофосфатаза локализована преимущественно в трех мембранных фракциях: микросомах, "легких мембранах" и вакуолях.

4. Наиболее эффективным методом препаративного выделения долихолов из дрожжевых клеток является спирто-щелочной гидролиз биомассы с последующей экстракцией неомыляемой липидной фракции гексаном, выход долихалов составлял 92 мг/кг дрожжей.

5. Определен гомологичный состав долихолов дрожжей Sacch.carlsbergensis и установлено, что основным компонентом смеси является долихол-80.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Шабалин Ю.А.., Хамуи А., Бухтияров Ю.Е., Кулаев И.С. Внутриклеточное распределение и солюбилизация дрожжевой долихилпирофосфатазы // Биохимия, Том 56, вып. 11, с. 2032 - 2041, 1991.

2. Bukhtiyarov Yu.E., Hamui A., Shabalin Yu.A., Kulaev I.S. Prenyltransfrase reaction catalyzed by the Sacch.carlsberrgensis membrane preparation // Proceedigs of V-th Internatinal confernce on chemistry and biotechnology, Varna, v.4, p.324-328, 1989.

3. Shabalin Yu., Hamui A., Bukhtiyarov Yu., Kulaev I. Solubilization and characterization dolichyl pyrophosphate phosphatase from yeast // Abstracts, 15-th Intern.Special.Symp.on yeast, Riga, p. 122, 1991.