Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ДНК-топоизомераза I печени крыс: маркер канцерогенеза и зонд на аутоиммунные заболевания

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ДНК-топоизомераза I печени крыс: маркер канцерогенеза и зонд на аутоиммунные заболевания"



РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИЧЕСКОЙ И КЕЙШКСКОЙ химки

На правах рукописи

I

КИРСАНОВ* Ирина Дпитриевна

ДНК—Т0П0И?0МЕРАЗА I ПЕЧЕНИ КРЫС: МАРКЕР КАНЦЕРОГЕНЕЗА И ЗОНД НА АУТОИММУННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ,

'Г

Специальность: бИохипкя - 03.00.04

Автореферат диссертации на соискание учеггой стьпекн кандидата биологических наук

Коспва. 1993 г.

\

Робота выполнена в

Институте биологической и медицинской

химии РАКН I

Научный руководитель:

член-корреспондент РАМН, доктор биологических наук, профессор И.И,Вотрин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Хирзон С.С.

доктор Биологических наук Прозоровский З.Н.

Ведущая организация:

Институт медицинской генетики РА№

ся Пс'^Ж 1993 г. в

Задал а состоится _____________

кз заседании Специализированного совета £.001.10.01 при Институте биологической и медицинской хикни РАМН по адресу; Москва, 119832, Погодинская ул.. 10

С диссертацией иогено ознакомиться в библиотеке Института биологической и медицинской химии РА11Н

Автореферат разослан «

1993 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета

кандидат биологических наук ¿

Ларионова Т.Н.

--------------------------------------ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА-РАБОТЫ------------------- ---------

Актуальность работы. Основной проблемой современной «глицины является диагностика и леченне неопластических заболеваний человека.

Известно, что молекулярной основой опухолевой трансформации

является механизм непостоянства генома, ¿оказано, что траис.тока-цки генетического материала в результате гомологичной и негомологичной рекомбинации приводят к активации клеточных онкогенов и неопластичсехоЯ трансформации клеток. Вазкейшки этапом генетической рекомбинации является сочетанная реакция разрыва-воссоединения ДНК с участием <>еряентов. способны* разрезать ДКК. Одними из феркевтов. способных гидролиэов&ть фосфодиэ$ирну>э связь с ее последует®«!! легированиям является топоизомеразы клеточных ядер.

ДНКтопоизош?рязы относятся к группе пояадезоксинукяготидил-Трансфграз СКв-5.99.1. 3.3. ДНК-топоизомеразы Г типа характеризуется способностью разрезать и легировать одну из пеггей 2-ух цепочечной ДНК. ДНК—тогоиэомераэы IX типа катализируют реакцию разрезг-кия—воссоединения 2-ух цепей ДНК. Продуктов действия обеих типов ферментов на кольцевые колгкулы ДНК являются топологические и:а.о-нэры Скзокеры полрпгнкяз этих молекул: узлы, полукатенакы, кате-наны и т.д. Фермент обнаружен во всех таксонях эукариот.

В настоящее время существуют несколько «одела." реконби нации ДНК. предусматризгюсих участие ДНК-топоизочераз в зтон процессе. Известно, что ДНК-топоизоме?ази участзуат в основнпх генетических процессах - репоибинации и репарации. Информация о топоизо— неразах достаточно полка - они изолированы из кнопи; эукиристи— чес-.их источников, изучены их свойства, определена их аминокислотная последовательность и клон!!роеа1»м геньх иг ряда органнзмоз. Однако, несмотря яа относительно /угонку» история исследования топоизопераз и многочисленные литературное данныа,. представления о роли этих ферментов' в функции геьаяа в норне и яря пато.когичес— ких состояниях Р значительной степени повсрхностнч. Полностью утсутс х вулт данные о изменении активности топон:»онеразы I типа в процессе рзззития канцерогенеза. Изучение же !.олекуляр::их чеха-низнов участия топоизомораз при опухо^^вой трансформации необходимо для разработки принципиально нэвых способов диагностики и коррекции генетических нарушений, приводящих к опухолевому

перерождению тканей.

Таких образом исследование изкенения активности ДНК-топоизо-мераз при различных типах опухолевой трансформации является одной из актуальных задач Биологической и медицинской химии.

Цель и задачи исследования. Основной цель» работы являлось исследование важнейшего фермента функционирования генома - ДНК-топоизоиеразы I типа в норме и при опухолевой трансформации клеток, а такая вознозлости использования полученных данных с целью создания теста для диагностики неоплазий. В качестве основных объектов исследования использованы печень крыс, фибробласты крыс и клетки яичников китайского хомячка.

В соответствии с цель» исследования были поставлены следу»- ~ , ■не задачи:

- получить препарат ядерной ДНК-гопоиэокерэзы I типа из ялеточиых ядер печени крыс, свободный от зндонуклеазиой активности и стандартизованный по изоэлектрической точке;

- определить изменение активности ДНК-топоизонеразы I типа в клеточных ядрах гепатон при опухолевой трансформации в процессе химически индуцированного диэтилнитрозамином канцерогенеза, регенерации и онтогенеза у крьс;

- исследовать изменение активности ДНК-топоизонеразы I типа в культурах фибробластов крыс, находящихся на стадиях последовательной опухолевой трансформации;

- использовать очинённый препарат ДНК-топоизонеразы I с цель» разработки теста для диагностики системной склеродермии в группе диффузных заболеваний соединительной ткани.

Научная новизна. Впервые исследовано изменение активности то-поизомеразы I типа на различных стадиях опухолевой трансформации.

Основным результатом диссертационной работы явилось доказательство участия топоизонеразы I типа в процессе опухолевой, трансформации клзтск. основанное на обнаруженном нами снижении активности топоизонеразы I типа при инкортализации и трансформации клеток в нескольких испытанных моделях, а также иа выявленной нами увеличении актизиости при обратной трансформации, индуцированной дибутирилцякло-АИФ.

Определена активность топоизонеразы I типа в клеточных ядрах нормальной печени. химически индуцированных гепатои, регенерирую-

«чей и энбриональной печени. Обнаружено снижением активности топо-----------

кзомеразы I типа как в опухолевых клетках в зависимости от степени дифферехцировси, так и в нормальных клетках печени в зависимости от стадии регенерации.

Получены косвенные данные, указывающие на роль фосфорилирова-кия я регуляции активности топоизоиер*зы I типа р процессе химического канцерогенеза.

В эмбриональных фибробластах крыс снижение активности топо-изомеразьг I типа совпадало со ста/г»ей имиортялизаоии платок и прояэжегяо сниг^гтьс-я при первой трангфепцни огастгеяок ras-

Разработана схена выделения топоизокеразы I типа из ядер печени крыс, погсоллощзя получить препарат фермента, стандартизованный по изозлек-гричесхгай тичке и близкий с элелтрофоретичес-коЯ гзнсгениости. '

Практическая новизна. Показано, что топсизояераза I выступает паркером иянорталчзации и первичной трансформации с образование« вы:оксдиу)фервкчироваикых клеток.

Вьявлека корреляция между массой опухолевой ткани и активность»* тсггаизоиераэи I типа в окружающей гепатолу ткани, что указывает на во-яохность использования данного подхода для оценки активности тоггоизояеразы Г типа в биопсийноя материале при раке печени человека.

Определение активности топокгонеразы I типа целесообразно проводить для диагностики опухолевых заболеваний чрлосепа в комплексе различных диагностических тестос с цель» гобып~ккк точности постановки диагноза.

Разработанный кетод количественного определения активности тояоизочеразы I типа в гикрокоя'чэствзж исследуемых тканей был использован для исследования изменения активности топоиэоиеразы X на поделях,канцерогенеза.

Предложен тест для диагностики систеяной склеродермии среди других системных заболеваний соединительной тхани. который прошел испытания в клинической практике С в НИК разнатологии PfKO.

Апробация работы состоялась 24 нарта 1993 года на яехлабора-торной научной конференции ЙБМХ РАМН.

Материалы диссертации докладывались иа V Всесоюзной биохимическом съезде СКиев. 198ÉO , Всесоюзной симпозиуме по биохимии

сельскохозяйственных зивотных СТашкент, 19863, Совещании по молекулярным неха::изагп канцерогенеза СПуцино, 19673, IX Всесоюзном симпозиуме "Структура и функция клеточного ядра" С Черноголова, 19873, Международной конференции по склеродермии и схлеродермия-подобним заболеваниям СВаршава, 19913. IV Всесоюзном съезде ревматологов СМинск, 19913.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы» методической части и результатов собственных исследований. Работа изложена на 144 страницах текста, содержит 20 рисунков и 20 таблиц. Список литературы вклачает 239 источника.

По материалам диссертации опубликованы 12 работ, в.тон числе 2 в зарубегяых журналах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клетки фибробластов крыс культивировали в СО^-инхубаторе на среда КЕМ с добавлением 5У Детальной сыворотки и 1 мкг/Ил гента-мицин^ до стадии понослоя. С поверхности стекла клетки снимали шпателе» Сез использования трипсина. СНО-клетки выратавали. в среде р-12 с доСаолеяиея 10Х феталыюй сыворотки "С1Ьсо" при 10Х СО^.

Индукцию гепатом у крыс дизтилнитрозамином проводили пр методу ЭыегЬ [19803. Гистологический анализ препаратов был проведен К.А.Поповой СНИИ канцерогенеза ВОНЦ РАМНЭ. Гистологические диагнозы ставились э соответствия с работой Гелъпгтейн и соавт. [ 19843-Для индукции регенерации у крыс удаляли 2^3 печени.

Все препаративные процедуры, кроне оговоренных особо проводили при 4°С. Клеточные якра печени крыс получали, из белых нелинейных крьс-саицов"весом 180-200 г. Печень быстро извлекали и помещали в охлажденный иа льду буфер, содержащий 50 нМ трис-БС1, рН 7,9, 0,25 М сахарозу. 10 мГ1 СаС12> 3 нМ 2-меркаяозтаиола, 1 иН РНЭУ С буфер АЗ. Печень гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновын пестиком. Гомогенат Фильтровали через 4 слоя марли и центрифугировали при 1500 е. Осадок ядер суспендировали в буфере А. добавляли при постоянном перемешивании 4 объема буфера Б. отличающегося от буфера А тея, что концентрация сахарозы в нем составляла 2 М- При этом-конечная концентрация сахарозы в суспензии ядер равнялась 1,65 М. На буфер Б наслаивали 3 объема получен-

ной суспензии ядер и центрифугировали при 70 ООО g в течение 90 пкк. Осадок клеточных ядер ресусиендировади р буфере А и пропивали центрифугированием при 1000 g в течение 5 ник. Выход клеточных ядер из ICO г печени составлял по ДИК примерно 100 чг. При измерении ДНК клеточных их суспендировали в вохе. затем добавляли ЗДТА до 20 нМ и SDS до 1 5: и измеряли оптическое поглощение при 260 им.

Клеточные ядра С-ибробластов и CH0—к.кеток получали теп se методой. в одно пыде.-екие брали от Z до 200 нлн клетог. Рьгход ядер ядер по ДНК составлял около 10 икг из 1 нлн клеток клеток.

Для получения зкетргкта клеточные ядра лпзкровали с помощью ЗДТА до Ю нМ и экстрагировали I М НаС1. Нуклеиновые кислоты из экстракта осаждали добавление» ПЗГ-6000 до 65Í. йри этон достигалось также освобождение от значительной части пкггонов, которые а присутствии I М НаС1 не диссоциируют от ДКК. Для подавления лротеол'эа испо.гьзовали фенилнетилсульфонилфторнл и бисульфит кзлчя.

Выл».пенне ДНК плазкиды pBR322 и рРС19 проводили по методу, описанному з руководств» ^нкатиса [1&85].

Элэктроуорез £НК приводили в горизонтальных блоках О, ВУ. ага-розного гглг разпергки 14 х 18 х С,4 cr. в буфере, содержащем 40 я(1 трис—ацетат, рК 7, е. 2 мМ ЭДТА, 0,5 ккг^ял броямда этидия при напряжении 7 Е/сн д.танч геля в течение 1 ч. Объем пр-обы составлял Н5 мкл. По окончании электрофореза ос.велеккьк.- ультрафиолетом С254 н»0 гели фотографировали через оракаевкГ: светофильтр. Электрофорез кольцевой ДНК проводите по той гр схеме, но окрлишание этидий брони дом осуществляли после окончания электрофореза. Негаткзы сканировали в денситометре "Хроноскак-200" СЛкгж:3. Кодичест-еэнное определение ДНК в геле прозодили в линейном диапазоне за-висиности количества ДНР з полосе от ее оптической плотности на негативе.

Измерэнго активности топоизоиерлзп I т:;пз зронодили я пробе обменом ?С г.кт.. содерхаией 1 мкг плазмидной ЯНК рВН322, 10 нМ трис-HCU ГН 7,9, ffO нИ КС1, 1Ь0 мН КаС1. 0.1 híí ЭДТА. ЬО «кг/нл БСА, ядерный экстракт, разведенный в ТЕ-буфере; 10 нМ трис-HCl, 0,1 нМ ЭДТА. Пробы инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Реакцию останавливали добавлением 2,5 мкл спеси 0,1 К ЭДТА, ÍX SDS. и 2.5

мхл протеиназы К С500 мкг/нлЭ. Инкубацию продолжали еще 30 нии при 37°С.

Единицей активности топоизоперазы I типа считали количество Фермента. необходимое для релаксации 1 икг ДНК за 1 ч при 37 °С. Расчет активности проводили на уровне 50К релаксации сверхспира-лнзоваиной плазимды.

фосфопротеиикииазную реакцию проводил в пробах того se объема и состава, что и при определении активности тспоизонеразы I типа. В качествs источника фосфата использовали X нН АТФ, содержащий 103 сри Cy"®P Э-АТ6. Пробы инкубировали при 37°С. Реакции останавливали добавлением во ккл ко мМ трис—НС1, рН 7,9* IX SDS, 100 Mil НаС1, 10 кН ЭДТА. Избыток негидролиговаиксй АГв отделяли гель-фильтрацией через сефадекс G-50 в колонках 0,5x4 си. Эффективность отделения составляла 99,7Jí. Сциктиляционный счет вели по Череикову с эффективность» счета 41SC.

Фосфатазную активность определяли по способности гидролизо-вать АТФ в пробах того зве объема и состава, что и при определении топоизомераз. В качестве источника фосфатов использовали ненечен-кый АТФ. Продукты гидролиза иуклеотида разделяли тонкослойной хроматографией иа пластинах "Silufol 0V2S4". В качестае подвитой фазы использовала смесь диоксан:вода:аммиак 6:4:1.

Протеиназиую активность определяли по методу Lin et al.[19691 используя Н, N -дипетилказечи в качестве субстрата. Концентрацию белка определяли no Sedcark [1977].

Обратную трансформацию клеток СНОК^ дибутирилцикло-АМФ проводили по метод}'. Asball [1984].

При определении ингибировання топоизомеразы I сывороткой крови последнюю добавляли в стандартную инкубационную смесь в

количестве 0,25-0,4 нкл. Электрофорез белков проводили по Laemali

[1970].

Определение достоверности различий между группами данных проводили с использованием критерия Стьюдента в соответствии с руководством Бронштейна [1986]. Для данных использовали мини-

компьютер "aewlett-Packard" НР67 Спакет статистических программ^.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ-------------------------

1. Выделение топоизо-леразы I типа из клеточных адер печеяи крис.

Эктракцию ядер проэодилн 1 М NaCl. которая по даиньа*. Shaepoux [1976] позволяет наиболее полно экстрагировать ядерные топок-оке-раэы. В ходе выделения иягибировали протеолиз тспоизокеразы I введением во все буферы 1 кМ PMSF и 10 мМ бисульфита калия.

При разработке схемы выделения были использованы ионосбиен-ник: - фосфоцеллюлоза; молекулярное сито - юеперл; аффинные сорбенты - голубая сефароза и гепарин—сефароза. На этапах фракционирования субстратом для определения активности топоизокераз служили кольцевые плазкидаые ДНК. В качестве яетода определения активности топоизонерезы 1 типа использовали электрофорез в геле дгарозы.

Для получения высокоочиоенного препарата топокзокеразы 1 была использована схема, вклзчаюлия Л этапа хроиатограЛии и изо-электрофокусирование Срис.13.

Клеточные ядра, выделенные из 1 кг печени крыс, с/спендирсза-ли в буфэре А до концентрации 0,5 иг ДВК/мл. и лизировали при постоянном перемешивании добавление» по каплям равного об-ьена буфера В, содержащего 10 нМ трис-HCl, рН 7.S. 50 нМ ЭСТА, 2 М NaCl, 5 иМ 2-неркаптозтвнола, 20 мМ KHS03> 1 нМ FfCvF- Лизат перемешивали еще 30 мик. ДНК осаждали добавлением i/З объема 18JC ПЗГ-fcOGO с после-дуюяим центрифугированием при 10 ООО g в течения 20 мни. Для кок-центрирования белок иэ надосадочной вмдг.ости высаливали добавлением на магнитной мешалке 30 мин после полного растворения соли. Осадок белка собирали центрифугированием при 20 С00 g в течении 20 мин, растворяли в 50 нл буфера Г: 20 иМ Ыа-фосфат, рК 6,0, 5 Hit 2—меркаптозтанола, 0,1: нМ ЗДТА. 1кИ PMSF. 10* глицерина и диализовали в течении ночи против • того же буфера.

Колонку фосфоцеллюлоэк "Sigma" 5 х 6 см уравновешивали буфером Г. Экстракт э объеме 50 нл накосили на колоагу со скоростью 3 МЛ/Т1ИН. Промывание и элюиразание зели со скоростью в нл/пнк. При хроматографировамки использовали ступенчатый градиент концентрации NaCl 0-1,5 f!. Активность топоизопераэы 1 типа выявлялась во фракциях О.е-1 М NaCl. Белок объединенных фракций 0,7-1 М концентрировали высаливанием 80?: сульфата аммония н диализовали про-

тив буфера Д: 10 нМ трис-HCl. рН 7,7. 0.1 яМ ЭДТА. S иИ 2-неркап-тозтанола, 10Я глицерина.

Колонку! для изоэлектрофокусирования объемом Ю0 мл с Ш ам-Фолинами рЯ 7-11 и градиентом глицерина О-ЬОУ. пронормировали э течение 6 часов при напряжении 1200 V. В прсбу добсвдяли глицерин со ЗОХ и препарат фермента в обмене 7 нл вносили в - зону рН 8,5. Изоэлектрофокусироваине вели в точение 18 часов при 1200 V 10 НА на холоду. Фракции объемом 2 нл собирали, определяли рН и а^тизность топоазокеразн 1.

Колонку голубой сефгрозы "Pharmacia" 1.4 х 1 сн уразноввгм-вали буфером Д. Препарат в объег.е в пл вносили со скорость» 0.S ил/Нии. Нанесение повторяли пятикратно. Колонку промывали 15 нл исходного буфера н элоировали ступенчатый градиентом НаС1: 0.1, 0.2. 0,3. O.f. и 1,5 И. Объем каждой ступени состаля 7 ил. Для последуюмгй очистки фракции /реализовали противв буфера Д.

Колонку гепарин-сефарозы "Phanaacio" 0.4 х 1 см уравновешивали буфером Д. Дзализоаанный препарат топоизомеразы вносили в объеме 7 мл со скорость» 0,2 клхмин. Колонку промывали 10 мл исходного буфера. Белок злвировали тремя ступенями - 0,2, 0.6 и 1.5 К НаС! в буфере Д объемом по 1.5 нл.

Хроиатографки через тойоперл проводили в колонке размером 2,5 х 35 см. уравиоветсвали буфером, содержащим 10 мМ трис-ВС1. рН 7,7, 0,2 М НаС1. 5 мН 2-меркаптоэтанола, 10 нИ KHS0s, 0,1 мМ ЭДТА. 105с глицерина. Объем препарата, наносиного на колонку составлял 3 мл. скорость элюции - 1 нл/кнн.

Конечный препарат топоизомеразы I днализо&али против буфера Е: Ю ни трис-НСЬ. рН 7.7. 0.1 иМ ЭДТА. 0.5 нМ ДТТ. 50Х глицерина н хранили до 6-ти месяцев без потери активности. Результаты счистки приведены в табл.1. Как видно из табл.1, очистка топоизомеразы 1 составила 1000 раз. Выход топоизомеразы I составил 0.5%.

По данным электрофореза в SDS-ПААГ полученный нами- препарат топоизомеразы 1 содержал одну полосу.

В полученном препарате топоизомеразы не обнаружено: эндонук-леазной. РНК-азной и АТФ-азной активности.

ЯДЕРНЫЙ ЭКСТРАКТ

ФОСООЦЕЛЛЮЛОЗЛ 0.7-1.0 М

ГОЛУБАЯ СЕФАРОЗА 0,4-1,5 М

ИЭО рХ 9.7

ГЕПАРИН-СЕФАРОЗА 0.2-0.6 М

ТОЙЕПЕРЛ Ш50?

Рис.1. Схема' выделения ДНК-топоизонеразы I типа из клеточных ядер печени крыс.

У

Таблица 1 . Очястка ДНК -топоизонеразы 1 из клеточных ядер печени крыс

Стадия выделения .Белок, яг Удельная активность ,10 ед. /Иг Очистка Выход, X

экстракт 2200 0,7 - 100

фосфоцеллюлоза 9в 7 10 44,5

ИЭС 4 33 47 8,6

голубая сефароза 0.4 210 300 6,5

гепарин-сефароза 0,032 400 570 0,9

Тоуорваг1-ННвОР 0.010 650 1000 0.5

2. Активность топоизонеразы I в норяальиых и трансформированных клетках.

С цель» реаения основной задачи иссследования - определения уровня активности топоизонеразы 1 на различных клеточных моделях опухолевой трансформации - ианк был разработан нккронетод экстракции ядер и определения активности топоизонеразы X типа, показывавший возможность определения активности в неочищенных экстрактах. Метод позволяет определять "активность в 3-25 якг ядер по ДНК.

Данные по измерению топоизонеразной активности в экстрактах клеточных ядер вормальной печени. химически индуцированных гепа-тон, регенериру й й и эмбриональной печени представлены в табл.2.

В экстрактах ядер гепатон. индуцированных диэтилнитрозаминон, активность топоизонеразы I типа была значительно снижена по сравнению с нормой, ври этом наиболее резкое снижение имело место между контролен и ВДГ Стабл.25. В ткани печени, окрухапцей опухоль, активность топоизонеразы X типа значительно превышала ее активность в нормальной печени крыс и в опухолях. Обретает на себя внимание то. что активность топоизонеразы 1 в ткани печени, окружав- . пей опухоль, коррелировала с массой опухолевой ткани Стабл. 33.. Сходство топоюояеразного профиля регенерирующей печени и гепатон позволяет предположить, что снижение активности топоизонеразы I типа связано с пролиферируюсз«м состоянием ткани. Снижение актив-сти топоизонеразы X не является признаком фенотипа низкодифферен-цированных клеток, поскольку в печени эмбрионов обнаружено лишь незначительное уменьшение активности фермента.

Табл.2. Удельная активность топоизонеразы I в экстрактах ядер гепатои, ткани окружающей опухоль, регенерирующей и Фетальной печени крыс.

Все числа приведены в значении М ± я.

Ткани • п Активность

топоиэонеразы I 10гед. /пг белка

Контроль

10

1С0+11

Гематомы ВДГ УДГ НДГ

Ткань, окрузаюцая опухоль

4

18

4

10*1 2?±1

650±350

Регенерирующая печень после гепатаэктоиии через:

12 ч 18 ч 24 ч 30

Печень новорожденных детальная печень

4 <С±3

4 10±1

4 3.4+1

4 25±1

4 85±5

28 79±3

Табл.3. Корреляция негду активностью топоизонеразы 1 а экстрактах ядер из ткани печени окружающей опухоли крысы и массой опухолевой ткани

Касса опухолевой ткани, г Активность топоизонеразы I, 10аед/мг

0 40+10

0.01 2501-30

0.02 420+140

0.1 1020+20

0.5 1500+60

Сравнение релакснрухаей активности топоизонеразы 1 в нормальной и опухолевой тканях печени крыс показало, что АТЛ икгибирует активность топоизонеразы 1 только в экстрактах из гепатоп. В экстрактах из тканей; окружающих опухоль наблюдали увеличение релак-сируюдей активности в присутствии А ТФ. связанное с действием топоизонеразы II.

С цельэ получения дополнительной информации о причинах обнаруженного нами сакаеяия активности топоизонеразы I на нодэли химического канцерогенеза, а также наблюдаемого нами ингибировакия активности топоизонеразы I АТФ, нами было проведено сравнительное исследование активности протеинкииаэ а экстрактах гепатон. тканей окружающих гепатону и нормальной печени. Как видно из табл.4, экстракты из гепатон характеризуются более высокой протеиикиназной активностью по сравнению с нормальной печенью. при этом экстракты из окружающей ткани занимали по этому параметру промежуточное по-

с •

лохение. На основании этих данных нами было сделано предположение, что ингибированве активности топоизонеразы 1 в эктрактах гепатон посредством АТ4. связано с фосфорклированием фермента протеинкика-зани.

Для определения фосфорилирования топоизонеразы была использована возможность реактивации фермента, предварительно ингибиро-ванного фосфоршнрованиен. обработкой щелочной фосфатазой. Как видно из рис.2. с увеличением содержания фосфатазы в инкубационной пробе имело место восстановление активности фермента.

Табл. 4. Протеиикиназная активность в 3-х экстрактах клеточных ядер нормальной, опухолевой и окружающей опухоль тканях печени крыс.

Объект Скорость связывания неорганического

фосфата, мкм Фн/нин

Норна 1.12+0.16

Округатазая опухоль 9.77+3.45

ткань

Гепатоны 15.17+2,12

Рис.2. Активность топоизомеразы I при обработке щелочной фосфатазой.

По оси абсцисс - единицы фосфатазы в пробе , по оси ординат - % сс-ДНК от суммарной ДНК.

1Ь

Аналогичные изненения были выявлены в клетках находящихся на последовательных стадиях трансформации. В работе использовали модельную систему клеток крысиных фибробластов, полученную ранее Тополь и соавт. [1986^ которая включала в себя первичные фибро-бласты крыс, иппорталнзоварные ранней областью аденовируса обезьян £А? СИПТ-!}, те же клетки претерпевшие дополнительные морфологические изненения после однократной трансакции онкогеном ЕЛ-гав С|5ЕР-1БЛ. и, наконец, после полной трансформации при повторной трансфекцик этик же онкогенон СКЕР-2ЫЭ. Для трансфекции использовали плазпиду рЕОгав. Особенностью модельной системы, используемой для этих экспериментов являлось то. что она содержала дополнительную стадию помимо инмортализации на пути к трансформации.-Эксперименты показали; что активность топоиэонеразы I монотонно снижалась в ряду КЭФ-гВетч-ШППЕ»? С табл. 53. Иннортализация альтернативными способами - онкогеном туе. большим Т-антигеном вируса полиомы так же сопровождалась уменьшением активности топоизомеразы I типа.

В клеточной модели, включавшей в себя первичные клатки яичников китайского хонячка С рСВСО. те же клетки иннортализованные ви-вирусон БУ-40 С ЯУСВС» и те же клетки трансформированные онкогенон у-зег С СН010. также продемонстрировано снижение активности топоизомеразы I С табл. 6Э.

Показано, что при обратной трансформации СВОК1 дибутирилцик-ло-АМФ вместе с восстановлениен морфологии фибробластов, а также нормальных ядерных и специфических мембранных структур имело место увеличение активности топоизомеразы 1 Стабл.73.

При хроническом лимфолейкозе крупного рогатого скота нами установлено увеличение активности топоизомеразы I в клеточных ядрах лимфоцитов периферической крови телят. Как видно из ^табл.В, активность топоизокераэы 1 в лимфоцитах периферической крови при хроническом лилфо^ейкозг значительно.превышала активность топоизомеразы I в корне. Известно, что хроНатин лимфоцитов периферической крови при хроническом лимфолейкозе - конденсирован. а хроматин клеток опухолей печени - деконденсироваи. Такин образом полученные нами результаты вполне согласуются с данными о степени конденсации хроматина. .

Табл.5. Изменение удельной активности топоизонеразы 1,

в экстрактах клеточных ядер фибробластов крысы на стадиях канцерогенеза, в X от КЗ«

Клетки Удельная активность

топоизонеразы 1

КЭФ 100

КЕУ-1 41.В

25.5

ШХ-23.3 7.3

Табл. 6. Изменение удельной активности топоизонеразы 1

в экстрактах клеточных ядер нормальных и трансформированных клеток яичников китайского хомячка, . а У. от рСНО

Клетки Удельная активность топоизонеразы 1

рСВО 100

БУСВО 38.7

саок 22. Ь 1

1 1

Табл.7. Изменение удельной активности топоизомеразы 1 в экстрактах клеточных ядер трансформированных и обратнотрансфорнированных клеток яичников

китайского хомячка.

Клетки Удельная активность

топоизомеразы 1. хЮ2 едии белка

снсж | 120+10 .. • .

етснок1 | 250+14 1

Клетки п Активность топоизомеразы 1,

х10* еду-иг

Лимфоциты доноров 6 120+13

Лимфоциты при хро-

ническом лимфолейкозе 6 450+50

Таблица 8. Удальная активность топокзомграэы 1 типа в экстрактах клеточных ядер лимфоцитов периферической крови в норне и при хроническом лимфолейкозе.

Такая образом, на основании полученных нами данных о измене------------------

чик уровня активности топоизомеразь: 1 в нескольких испытанные нлки моделях опухолевой трансформации мы предполагаем, что топоиэонера-за 1 ногзгт являться биохимическим маркером неопяасткческой трансформации клеток.

3. Исследовакиь сывороток больных системными заболеваниями соедаиительной • тиани на активность тог.оизонеразы 1 типа.

Чсследэвзли ингибирующуя активность 207 сьвороток 6сль.»ых различными системными заболеваниями» соединительной ткани, а так-же 35 здоровых доноров. Результаты исследования приведены в табл. 9. Кнгибироваяие активности топоиэолеразы 1 сисоротками больных системной склеродермией кзблидалх в 72 случаях из 90-ста. В случае . :'спользозЕ:)ап сывороток больных резиатолднь» артрнтон, систеиной красной ролчангой. болезнь» Пагрене. псориатпчесс:т артритом, очаговой склеродермией я у здоровых доноров инг»£крование активности топоязоперазы I типа не набл»да.аось.

Кроме того. 50 больных ССД были дополнительно тестированы ка наличка 2нти-Зс1-70-антител :!нкуно*>еркентнЬ|Я методом С "RLISA"} параллельно с предложении.! нами методой. Анти-ЬсХ-УО-антитела обнаружены у 15 СЗО^О из 50 больных, а ингибирование топонзо-неразкой реакции у 33 СЬЬ>0 кз 50 больн-^х ССД. Сопоставление результате:) двух нетодов между собой показало, что результаты сопоставимы в Í0X сывороток.

Клиническая характеристика больных системной склеродермией с положительной и отрицательной топоизомеразной реакцией представлена в табл. Ю. Под положительной топоизомеразной реакцией подразумевается ингибирование топоизомеразной реакции сывороткой больного ССД; под отрицательной топоизомеразной реакцией - отсутствие ингибирования топоизомеразной реакции. Ras: видно из табл.10, ингибирование наблюдали в В7Х случаев у больных с диффузной формой ССД и в 755: случаев у больных с лнмитировакной формой ССД. Не обнаружено различий з результатах в зависимости от продо лжите льности. стадии и активности заболевания. Пациенты с положительной топоиэо- ■ неразной реакцией имели большую распространенность поражения кожи и более выраженные периферические нарушения. Различие в частоте поражения внутренних органов между двумя группами было несущественным.

1S

Табл. 9. Икгибирование топоизонеразной реакции в присутствии сывороток больных системными заболеваниями соединительной ткани

Клинический . Количество Количество

диагноз обследованных сывороток

сывороток ингибкрушцих

больных актизность топоизомеразы 1

Системная

склеродермия 90 72

Синдром Рейно 35 4

Ревматоидный

артрит 24 0

Систепная

красная

Еолчанка 22 0

Дер матомиозит 7 0

Псориатический артрит • 12 0

Очаговая склеродер-

мия В 0

Болезнь

Пегрена .4 . 0

Здоровые

доноры 35 0

Табл. 1 и. Клиническая характеристика больных ССД. имеюлкх поло-еттельную н отрицательную топоизонерэзную реакцию

Признак Топоизонеразная реакция

Положительная п='/Х Отрицательная п=1В Р

Средний возраст, годы 44,4+1,7 40,3*2.8 ад

Средняя продолжитель яоеть болезни, годи 9,3+1.3 7,7+1.9 ид

Средний кожный счет 21,3+1,8 14.3+2.0 0.05

Диффузный тип 26 с 36га 4 сггхэ нд

Лимитированный тип 46 С645СЗ 15 СВ350 нд

Дигитальные рубцы 55 С765СЗ 7 С3850 0.05

Телеангиэктазия 49 с бе» в С44X3 0,05

Остеоякз 36 с 50 ■/.•> 3 С17ИЗ 0,05

Кальциноз 22 С 315:3 1 С6» 0,05

Пораяениэ пкгзавода 55 С 76» 15 СЗЗКЗ нд

Поражение легких 43 С 60» 12 С 65X3 нд

Поражение сердце. 46 С6450 7 С ¿050 0.05

Примечание, нд - различия недостоверны.

ВЫВОДЫ

1. Разработан нетод выделения топоиэонеразы 1 типа из клеточных ядер печени крыс яо состояния электрофоретической гоиог-еняоети позволяющий освободиться от изофорн топоизоперазы 1 с низкой язо-точкой и экдонуклеазиой активности.

1'. С цель* оценки изменения активности топоиэонеразы 1 типа в иикроколичествах трансформированной ткани разработан высокочувствительный иикрометод количественного определения активности топоизоперазы 1 типа, позволяющий обнаружить активность в 3-20 пкг ядер

по ДНК.

2. Показано увеличение активности топоиэоиеразы i типа в лимфоцитах периферической крови телят при хроническом лимфолейкозе, что позволяет рекомендовать метод диагностики хронического ликфо-лейкоза крупного рогатого скота на основе определения активности топоизэмеразы 1 типа в клеточных ядрах лимфоцитов э качестве дополнительного диагностического тоста при комплексном обследовании с целью гыявлення групп, риска заболэваинК хроническим липфолей-козон и рационального планирования выбраковки животных.

4. Обнаружено резкое снижение активности толоизомеразы 1 в клеточных ядрах ггпатои крыс, иклуцкрованных диэтиянитрозгмином, на стадии опухолеобразоваияя■ при прогрессии опухоли имело место незначительное дальнейшее снижение активности*фермента. Аналогичные изменения наблюдались в регеиерирукжей печени

крыс, но отсутствовали в. печени эмбрионов и новорожденных крыс.

5. Продевонстрированно значительное повышение активности топоиэоиеразы I типа /в клеточных ядрах ткаки печени,' окружающей гепатоиу, по сраггенмю с нормальной и опухолевой тканью печени крыс, при этом выявлена корреляция кееду ьирахекностью опухолевого поражения и активностью топоизомеразы 1: типа в окружающей гепатоиу ткани; что уг.аз-иает на возможность использования данного подхода для исследования изменения активности топоизомерагы 1 типа в биппсийнок материале при раке печени человека. ^.

6. Выяв.геио нкгибкрование активности топоиэоперазы 1 АТФ в экстрактах геиятон и показана возможность того, что причиной снижения' активности является фзсфорилирозание фермента.

7. В эмбриональных фквроб-пйстах крыс снижение активности топсизонеразы 1 совпадало со стадией книортализации клеток и продолжало, незначительно снижаться при первой трансфекции онкогеном Ыгав- Вккорталкэгция альтернативными способами - онкогена» туе, бо.хывин 7-антигеном зкруса подломы также сопровождалась падением активности топоизомераэи 1 типа, что позволяет нам сделать предположение. что еккжякие активности топоизонеразы X может являться маркером имнортализации С незлокачественной трансформации клетокЭ.

«

3. Предложен способ дифференциальной диагностики систеянсй склеродермии среди системных заболеваний соединительной ткани.

основанный на использовании полученногопрепарата топоизомеразы 1. В работе показана вознозность использования предложенного способа для прогкозирсзания течения синдрома Рейно.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Соколов H.H.. вотрин И. И., Фицкер я. Б., Кирсанова И. Д. Рестркхционные эняонуклеазы Bacillus aniioleguefaciens //Тезисы III Всесоязной конференции "Методы получения и анализа биохиви-ческих pciKTKBOs". Олайно.-1979.-с.23

2. Соколов H.H.. Вотрин И. И.. Фицнер A.B., Кирсанова И. Д. Нозый метод выделения рестрикцконных эндонуклогз с использованием органических раетсорятелей /"^Вопросы мед. химии. 1930. -И. -с. 128-132

3. Баснакьян А. Г., Блпякова Л. П. , Бутовч Л. Г. , Кирсанова И. Д. . Зотрин И.И. Способ выделения хромосомной и плазкидиой ДНК из гран-положительных кокков /VAbt. свидетельство (41152367 от 15.07.1925

4. Баснакьян А. Г., Кирсанова И. Д., Бубнов Н.В. . Вотрин И, И. Топоизомэраза 1 хроматина печени крь~: применение для изучения блг.теуиалькых плазк-ля /"-"Тезисы V Всес.биох.съезда, Киев.-1926.-• -т. 2. —с. 255.

5. Кирсанова И. Д.. Бэсиахьян А .Г., Ч/пмрика И.З. , Газдарои А. К. .Еотрик И. И. ДНХ-топоизонераза лимфоцитов крови телят 2 норме и при лэйкозе /'/Тезисы Есес.снмп.по биохимии сельскохоз. xvBOTHt«. Ташкент. -1986. -с. 746.

6. Баскакьян А. Г., Кирсанова И. Д. . Ботрин И. И.. Чупырика И. В., Газдаров А.К. Определение активности ДНК-топоязомераз и ДНК-зндо-вуклваз в микроколичествах клеточных ядер Сметодические рекомендации} /Л5ИЭВ, ВАСХНИЛ.-1969

7. Баснакьян А. Г.. Бубнов Н.В. , Кирсанова И. Д. . Вотрин И. И. Активность ядерных экдонуклеаз и топоизонераз в печени крыс и опухолях, индуцированных диэтилинтрозамином s/Эксп.онкология. -1989 -Т.Н. N2.-с. 15-19.

8. Баснакьян А. Г., Тополь 3. Л. , Кирсанова И. Д.. Вотрин К. И.. Киселев О. Л. Активность топоизонерази 1 и зндонуклеаз в клетка*, трансфнвдрованных онкогеном ras s/Уаяек.биология. -1989. —т. 23.

N3. -с. 750-759.

9. Basnafcian А. <5- . Boubnov N. V. , Kirsanov» I.D. , Votrin I.I.

Nuclear topoisomorase and DNase activities in rat diethylnitros-aiaine induced hepatoma, in regenerating and fetal liver//Biochemistry International.-1991. -v.24 ,N6- -p. 429-43710.

10. Scherbacov A.3.■ Remenson E.I., Kirsanova I.L. , Basnakian A.G. , Gaseevs H.G. Inliibition of activity of topoisomerase I by зегп cf patients with systemic sclerodermia: new method of determination and clinical correlations /vThe Int.Conf .on sclerodermia and scleroderttia-lifce diseases, Poland, Pwieradow-Zdroj.-19.91.

-p. 70

11. Кирсанова И. Д. , Роменсон Э.И. , йербакса А. Б., Баснакьяк А.Г., Гусева Н.Г. Ингибироьаиие активности топоизоперазы I типа каяи больных системной склеродернией ✓,<Гвзисм IV Всес. съезда рев-катологов, Минск.-1991.-с.В0-Е1.

12. Щербаков А. Б. , Кирсанова' И. Д. , Ремексон Э. К. . Гусева Н.Г. Клиническая значимость выявления ингибироваиия толоиэонеразм I сыворотками 'больных системной склеродермией /'/Терапевт, архив.--1992.-т.64, Н5.-с.73-76.

ОСНОВНЫЕ ПРИНЯТЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

СНО-клеткк - клетки яичников китайского хомячка

RT-клеткк - обратнстрзнсформирзванные клетки

PtJSF - феннлкетилсульфонилф-!-орид

ПЭГ - полизтклекглиголь

SDS - дэдецилсульфат натрия

ССД — системная склеродермия

ВДГ - высоко дифференцированные гепатом»

УДГ - умьрепно .дифференцированные гепатомы.

НДГ __ - низко дифференцировании? гепгтомк .