Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ДНК-специфичные лиганды на основе димеров Хёхста 33258

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "ДНК-специфичные лиганды на основе димеров Хёхста 33258"

ии

Громыко Александр Викторович

На правах рукописи

/ . 7

ДНК-СПЕЦИФИЧНЫЕ ЛИГАНДЫ НА ОСНОВЕ ДИМЕРОВ ХЁХСТА 33258

03.00.03 - Молекулярная биология 02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2009

003467018

Диссертация выполнена в Лаборатории ДНК-белковых взаимодействий Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Научные руководители: кандидат химических наук

Жузе Алексей Львович

кандидат физико-математических наук Стрельцов Сергей Анатольевич

Официальные оппоненти: доктор химических наук,

Формановский Андрей Альфредович

кандидат химических наук Козлов Максим Викторович

Ведущая организация: ГУ НИИ по изысканию новых

антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН

Защита диссертации состоится «/У» ÜAV^C^tt- 2009 г. в на заседании Дис-

сертационного совета Д 002.235.01 при Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова, д. 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан «

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

А.М. Крицын

Синеок сокращений:

ХТ - Хёхст 3325 В; бис-ХТ(п) - бис-Хёхст 33258, где п - общее число метиленовых групп и атомов кислорода в линкере; бис-ХТ^Ме) - бис-Хёхст 33258, содержащий Ы-метильную группу в центре 7-членного линкера; ДББИ(п) - димериый бисбензимидазол, где п - общее число метиленовых групп и атомов кислорода в линкере; ДНК - двухцепочечная В-форма ДНК, её концентрация приводится в парах оснований; КД - круговой дихроизм; ЛД - линейный дихроизм в потоке; п.о. - пара оснований ДНК; ПЭГ - полиэтиленгликоль; ХЖД - холестерическая жидкокристаллическая дисперсия.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время в химиотерапии рака и вирусных инфекций наблюдается тенденция к замене традиционных лекарств, модифицирующих ДНК неселективным способом, новыми агентами, взаимодействующими нековалентно с ДНК и влияющими на процессы ее репликации и транскрипции. Поэтому большой интерес представляет конструирование низкомолекулярных лигандов, способных нековалентно и сайт-специфично связываться с ДНК в узкой бороздке. Такие сайт-специфичные соединения будут иметь важное значение для наведения их на определенные гены в геноме и для использования в химиотерапии.

В качестве базовой молекулы для конструирования новых ДНК-специфичных лигандов был выбран Хёхст 33258 (ХТ), широко используемый в цитологии в качестве флуоресцентного красителя. Выбор ХТ был обусловлен как его АТ-специфичностью: способностью взаимодействовать с двумя подряд расположенными А"Т-парами, так и способностью его аналога Хёхст 33342, проникать через клеточные мембраны, сохраняя при этом свои флуоресцентные свойства.

/=\

Хёхст 33258, Ы = Н Хёхст 33342, 11=СН2СНз

Мы полагали, что сохранение способности к флуоресценции позволит надежно детектировать даже незначительные количества новых лигандов, что будет выгодно отличать планируемые димерные молекулы Хёхст 33258 - бис-ХТ и ДББИ от синтезированных ранее

N . » „

У^ГЧ _ ГУ "

^линкер

о

бис-ХТ: н = ДББИ: к^-сомнчсн^з-щсн^

в нашей лаборатории АТ-специфичных лигандов - бис-нетропсинов, поскольку даст возможность использовать флуоресценцию для анализа взаимодействия бис-Хёстов с двухцепочечной ДНК и позволит следить за локализацией молекул бис-Хёхстов в клетке.

Целью работы являлось создание и исследование ДНК-сайт-специфичных бидентатных лигандов на основе флуоресцентного красителя Хехст 33258.

В задачи работы входило: (1) конструирование и разработка удобных методов получения ковалентных димеров молекулы Хёхста 33258, связанных линкерами различной длины и состава; (2) изучение их взаимодействия с ДНК различными оптическими методами; (3) исследование их в качестве ингибиторов ДНК-зависимых ферментов; (4) тестирование синтезированных соединений в качестве флуорохромов в цитологии.

Научная новизна. Разработан удобный метод синтеза ковалентно связанных димеров Хёхста - бис-ХТ и ДББИ. Он основан на конденсации гетероароматических диаминов с симметричными диимидоэфирами. Этот метод позволяет относительно легко варьировать длину и структуру линкера в молекулах бис-ХТ и ДББИ.

Показано, что бис-ХТ и ДББИ in vitro ингибируют ДНК-интегразу ВИЧ-1 в реакции 3'-процессинга. Установлено, эти соединения являются эффективными флуорохромами при дифференциальной окраске хромосом в цитологии.

Практическая значимость. Разработаны удобные методы синтеза ранее не описанных ковалентно связанных димеров Хёхста - бис-ХТ и ДББИ. Соединения бис-ХТ оказались новыми эффективными флуоресцентными красителями, способными проникать через клеточную и ядерную мембраны и окрашивать ядра клеток. Бис-ХТ перспективны в цитогенетических исследованиях для дифференциальной окраски хромосом человека и животных. Было установлено, что бис-ХТ и ДББИ in vitro ингибируют в микро/наномолярных концентрациях ДНК-интегразу ВИЧ-1, один из ключевых ферментов репликации вируса иммунодефицита человека, причём ингибирующая активность ДББИ оказалась примерно на порядок выше, чем у бис-ХТ.

Апробация результатов работы. Основные результаты работы представлены на двух ежегодных научных конференциях аспирантов Института молекулярной биологии им. В.А. Эн-гельгардта РАН в 2003 и 2004 г., на XVI зимней молодежной научной школе "Перспектив- ные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2004 г.) и на XIV Конгрессе Международного Общества Аналитической Цитологии (Будапешт, 2008 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 статей и двое тезисов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего ИЗ источников. Работа изложена на \2-С, страницах машинописного текста, содержит ¿4 рисунков и 3 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Молекулярное моделирование.

Молекулярное моделирование было использовано для конструирования ДНК-специфичных бидентатных лигандов на основе бисбензимидазольного мотива, используемого в качестве АТ-специфичного блока. Структура лигандов предполагала их локализацию в узкой бороздке, а длина соответствовала примерно одному витку ДНК. Как и в случае бис-ХТ, линкеры между двумя бисбензимидазольными фрагментами ДББИ были выбраны на основе олиго-метиленовой или олигоэтилеигликолевой цепочек с учетом их конформационной подвижности и низкого сродства к сахарофосфатному остову и парам оснований ДНК. Структура линкеров должна позволять молекулам бис-ХТ и ДББИ принять форму, изоспиральную узкой бороздке ДНК, а их параметры обеспечить молекулам роль бидентатного лиганда. Это означает, что оба бисбензимидазольных фрагмента (отвечающие за высокое сродство к АТ-последовательностям ДНК) должны одновременно находиться в положении, создающим оптимальные условия формирования водородных связей между атомами азота N1 бензимидазолов и основаниями ДНК (атомами 02 тиминов и/или атомами N3 аденинов, выступающих в роли акцепторов водородной связи). Оценка параметров взаимодействия бпс-ХТ и ДББИ (энергия, ккал/моль) с дуплексом (1(0СТТТШСАААА0С)2 выполнены методом молекулярной механики АМВЕЮ (совместно с В.А. Олейниковым, ИБХ РАН). Сравнение соответствующих параметров взаимодействия с этим дуплексом трёх бнс-ХТ и трёх ДББИ (с аналогичными линкерами) (табл. 1) свидетельствует о том, что ДББИ должны образовывать более прочный комплекс, чем бис-ХТ.

Расчеты свидетельствуют, что молекулы ДББИ, по-видимому, более перспективны по сравнению с соответствующими молекулами бис-ХТ, поскольку они показали наибольшее уменьшение энергии системы в результате связывания с дуплексом <1(ОСТТТТССААААОС)2 (табл. 1). Структура дуплекса при этом искажается наиболее сильно. Как было отмечано ранее (БикЪапоуа А., е! а!. 2002; ЕгпшЬоу М., е! а/. 2000), увеличение степени искажения ДНК при связывании с ингибитором, действующим по супрессивному механизму (ВаШу С. 2000), усиливает его ингибирующий эффект. Это также указывает на перспективность использования бис-ХТ и ДББИ в качестве базовых соединений для синтеза потенциальных ингибиторов ДНК-зависимых ферментов.

Таблица 1. Параметры взаимодействия бис-ХТ и ДББИ (энергия, ккал/моль) различной химической структуры с дуплексом й(ОСТТТТОСААААОС)2. Обозначение фрагментов лигаи-дов (А и В) приведено под таблицей. Расчеты энергий выполнены методом молекулярной механики АМВЕЯЗ.

Лиганд Обозначение ЕсвЯГ АЕднк

О бис-ХТ(5) -93.43 11.59 5.94

(Ти-А) бис-ХТ(7) -98.85 16.78 8.09

—^ н ^— (Щ) | о ^ ^^ о 1 СНз биc-XT(NMe) -95.20 24.74 11.12

бис-ХТ(8) -105.17 13.14 5.62

О О (ны?> ^^ ^^ ДББИ(5) -110.09 15.69 6.58

ДББИ(7) -115.18 20.55 5.45

ДББИ(8) -113.57 20.85 4.18

,—N

О

НзС \

НзС'

СНз

Есча. - энергия связи (энергия, выделяющаяся при образовании комплекса лиганда с дуплексом). Она определяется как разность энергий: энергия системы ДНК/лиганд минус суммарная энергия ДНК и лиганда, изолированных друг от друга.

АЕднк - величина, позволяющая оценить степень изменения структуры ДНК в результате связывания лиганда. Это разность энергии молекулы ДНК в конфигурации, формируемой в результате связывания лиганда (но в отсутствии лиганда) и энергии ДНК в свободном состоянии. В результате связывания структура ДНК изменяется, что отражается в увеличении энергии по сравнению с энергией той же молекулы в оптимальной для данных условий конфигурации.

АЕмг .-величина, аналогичная ДЕдой но рассчитанная для лиганда. ДЕЛ1И определяли как разность между энергией лиганда в «искаженной» взаимодействием с ДНК конфигурации и энергий лиганда в оптимальной форме в отсутствии окружения.

2. Синтез бис-XT и ДББИ.

2.1. Синтез серии бнс-ХТ.

Для получения ковалентных димеров Хсхста 33258 были апробированы три метода синтеза на примере создания бис-ХТ(5). Первоначально мы синтезировали ряд диальдегидов (IVa-г) алкилированием а,<а-дибромалканами алкоголята 4-гидроксибензальдегида с целью их дальнейшей конденсации с диамином (III) для получения димерных бисбензимидазолов (схема 1). Диамин (III) был синтезирован конденсацией диамина (I), полученным ранее (Loewe et al. 1974), с имидоэфиром (II), описанным (Fairlcy et al. 1993). Однако выяснилось, что продолжительное нагревание диамина (Ш) с бензальдегидом (ГУа) в этаноле в инертной атмосфере в присутствии и-бензохинона с целью получения бнс-ХТ(5) не приводит к желаемым результатам из-за существенного осмоления компонентов реакционной смеси (схема 1), поэтому соединения (IV б-г) не использовали в дальнейшем для получения соответствующих бис-ХТ.

н3с.

Схема 1. Подходы к синтезу бис-ХТ(5). НзС

(IVa) R = СНО; и = 5 (выход 95%) (IV6) R- СНО;л = 2(выход 23%) (IVB) R - СНО; л = 3 (выход 88%) (TVr) R = СНО; я = 4 (выход 90%) (V) R = СООМе; я = 5 (выход 82%)

н3с

бис-ХТ(5)

При апробации второго пути - конденсации диамина (Ш) с метиловым эфиром 4-{5-[4-метоксикарбонил)фенокси]пентилокси) бензойной кислоты (V) в присутствии Р2О5 в метан-сульфокислоте (Sun et al. 2002) (схема 1) - в первые 15 мин начиналось образование соединения бис-ХТ(5), но в дальнейшем происходил распад молекул бис-ХТ(5) с образованием мезильного производного ХТ (по данным MALDI-TOF-масс-спектрометрии). Поэтому это направление

-7-

дальше не разрабатывалось. Успешным оказался метод конденсации диамина (III) с имидатами (VIIIa-r) (схема 2).

Схема 2. Синтез бис-ХТ(5,7,8) и 6Hc-XT(NMe).

Н,0 1. SOC1,, С,Н,,кипяч. 4ч.

HO-^-^NHj + Cl-^OH 2 » HO^-^N^^OH - 2М -►

кипяч. Н 2- NajC03

24 ч. (выход 55%)

Н

(выход 53%)

1. НСНО, 80 С, 1 ч.

2. НС02Н, 85°С, 1 ч.

1

сн3

(Vir) (выход 86%)

он

NaH, DMF, t°

X'RX

(Vla-r)

(VIIa-r)

| HCVEtOH

(a)X-Br, R = (CH2)5 (б) X = Br, R = (CHj)7

(b)X = C1, R = (CH2)20(CH2)20(CH2)2 (r)X-Cl, R=(CH2),-N(CH,HCH2),

(Vila), выход 96%; (VD6), выход 86%; (MIß), выход 71%; (Vllr), выход 39%.

iC1 (VIIIa-r) (выход-100%)

chj

T

4'|Л/™ бис-ХТ(5), R = (CH2)5

5" kj^ 7" бис-ХТ(7), R = (CH2), (.1

Ae- 6HC-XT(8),R = (CH2)20(CH2)20(CH2)2 £ 5'" fiuo-YTiNlUol и /пл \ и/ru ига 4 i

I

H,c

6HC-XT(NMe), RKCHjij-NiCHjHCHj),

CH,

Диимидаты (VIIIa-г) были получены по реакции Пиннера, исходя из динитрилов (Vlla-г). Последние были синтезированы при алкилировании в DMF алкоголята п-гидроксибензо-нитрила соответствующими а.одигалоидалканами (IVa-в) и специально синтезированным 3-хлор-У-(3-хлорпропил)-ЛЧметилпропан-1-амином (Vir) (схема 2). Бис-ХТ(5,7,8) и бнс-XT(NMe) были получены при кипячении диамина (III) с дихлоргидратами диимидоэфиров (VIIIa-г) в ледяной уксусной кислоте в атмосфере азота в течение 20-30 мин с выходами на последней стадии, 29.4, 24.8, 23.3 и 19.6% соответственно.

2.2. Синтез серии ДББИ.

В процессе синтеза димерных бисбеизимидазолов (ДББИ), как и ранее при синтезе серии бис-ХТ, ключевым моментом является конденсация р-фенилендиамина (XI) с дихлоргидратами диимидоэфиров (VIIIa-в), полученными по схеме 2. о-Фенилендиамин (XI) синтезировали по схеме 3. При кипячепии хлоргидрата имидоэфира (II) в метаноле с 3,4-

Схема 3. Синтез диамина (XI).

диаминобензойной кислотой образуется 2-(4-амино-3-нитрофенил)-1//-бензимидазол-6-карбоновая кислота (IX). Она с помощью 1,1'-карбонилдиимидазола была введена в конденсацию с З-диметиламино-1-пропиламином с образованием 2-(4-амино-3-нитрофенил)-Лг-[3-Сдиметиламиио)пропил]-1//-бепзимидазол-6-карбоксамида (X). После гидрирования соединения (X) над палладием на угле полученный о-фенилендиамин (XI) конденсировали с дихлор-

гидратами диимидоэфиров (\'Ша-в) кипячением в ледяной АсОН в инертной атмосфере (схема 4). Синтезированные ДББИ(5), ДББИ(7) и ДББИ(8) представляли собой гексахлоргидраты, выходы на последней стадии составили 9.5, 19.0 и 20.3%, соответственно.

Схема 4. Синтез ДББИ(5,7,8).

Все синтезированные новые соединения были гомогенным по данным ТСХ, их структура была подтверждена данными 'Н-ЯМР-спектроскопии и МАи31-ТОР масс-спектрометрии. В таблице 2 приведены данные 'Н-ЯМР-спектроскопии для димерных бисбензимидазолов бис-ХТ и ДББИ.

Таблица 2. Данные 'Н-ЯМР спектров хлоргидратов бис-ХТ(5,7,8), бllc-XT(NMe) и ДББИ(5,7,8),

снятых в ДМСО-^й при 23°С.

Соединенне, б, м.л.

Протоны* Бис-ХТ(5)** Бис-ХТ(7) Бпс-ХТ(8)** Биc-XT(NMe) ДББЩ5) ДББЩ7) ДББЩ8)

Н, 0(СН2),СН2 + ШСН2СН2 1.46, м

4 Н, ШСН2 3.4, м 3.39, н 3.38, м

Н, СН2Ы(СН,)2 3.14, м 3.14, м

12Н,ЫСН, 2.77, Д, / 4,4 2.79, с 2.77, д,/3.7

4 Н, ЫНСН2СН2 1.86, м 1.98, м

1Н, 0(СН2)2СН2 3.35, м 1.94, квин. /7.9

9 Н, ЫСН, 2.85, у шс

Ш,(СН,)2ЫСП2 3.13, м

Н, КЮ(СН2)2ОЕ1 3.71, с 3.66, с

4 Н, РЬ0СН2СН20 3.85, т,/4.8 3.80, м

6Н, 0(СН2)2(СН2), 1.46, м

Н, ОСН2СН2СН2 1.69, м 1.64, м

4н,осн2сн2 1,91, м 1.78, м 2.25, квин., /6.5 1.99, м 1.77, м

6 Н, ЫСНз 2.85, с 2.85, с 2.85,с

8 Н, Н(3"', 5'") 3.37, м 3.21, м 3.37, м 3.12, м***

8Н,Н(Г,6'") 3.57, м 3.54, м 3.59, м 3.36, м***

4 Н, РЮСН2 4.19, т,/6.3 4.10, т,/6.2 4.26, т, /4.8 4.23, м 4.2, т,/6.2 4.1, т,/6.2 4.21, м

4 Н, Н(2,6) 7.14, Д./8.7 7.16, д, / 8.7 7.14, Д./8.7 7.22, д, / 8.7 7.22, Д./8.7 7.17, Д,/8.1

6 Н, Н(2,6, 7") 7.18, м

2 Н, Н5" 7.15, дд, / 1.9, /9.0 7.30, дд, У 1.2, /9.0 7.18 дд, /1.9,/9.0 7.28 дд, /1.9,/9.3 8.25, Д,/8.7

2 Н, Н7' 7.23, д,Л.9 7.17, с 7.24, Д,/1.9 8.73, с 8.55, с 8.58, с

2 Н, Н4" 7.6, д.У9.0 7.7, д./9.0 7.6, Д, / 9.0 7.67, д./9.3 7.78, д, /8.7 8.04, Д, / 8.7 7.71, Д, / 8.7

2Н.Н4' 7.76, д, У 8.4 7.87, Д, / 8.7 7.77, Д,/ 8.7 7.86, Д, / 8.7 7.93, Д, / 8.7 8.00, Д./8.7 7.85, Д,/8.1

2 Н, Н5' 8.12, дд, /1.6,78.4 8.19, дд, /1.2,/8.7 8.13 дд, /1.2, /8.7 8.24 д./8.7 7.96, Д, /8.7 7.85, д./8.7 7.89, д./8.1

4 Н, Н(3,5) 8.22, д./8.7 8.25, д,/8.7 8.22, Д,/8.7 8.30, д./8.7 8.17, д./8.7

2 Н, Н7 8.51, с 8.59, с 8.54, с 8.62, с 8.28, с 8.28, с

8Н, Н(3, 5,5", 7) 8.25,м

6Н,Н(3,5,5") 8.38, м

2 Н, СОШ 8.90, т,/4.7 8.82, т,/4.9 8.89, м

----^-—-----—

* Протоны МН-групп бензимидазольных колец в Н-ЯМР-спектрах каходшшсь в районе

10.5 -11.2 м.д. и обычно проявлялись только частично. ** Для уточнения отнесения сигналов в области 3.0-4.0 м.д. и 7.0-8.5 м.д. спектр снят при 107°С. *** Для уточнения отнесения сигналов в области 3.0-4.0 м.д снят спектр бпс-ХТ(Т\Ме) в виде свободного основания.

3. Спектральные методы исследования комплексов ДНК из тимуса телёнка с бис-ХТ и ДББИ.

3.1. Бис-ХТ(1ЧМе) как ДНК-специфичный лиганд.

Исследование взаимодействия Хёхстов 33258 и 33342 с ДНК, П0ли((1А)'П0ли(с1Т) и дуплексами олигодезоксирибонуклеотидов имеет давнюю историю (Ьоопйек Р.О. е!а1, 1990; Родин С.А. и др., 2001). В них было показано, что Хёхсты могут образовать с ДНК несколько типов комплексов, в том числе: мономерный, сандвичевый и агрегационный. Отличием бис-ХТ(!\'Ме) от Хёхстов является то, что сандвич (внутримолекулярный димер) бис-ХТ существует в растворе при любых концентрациях лиганда. Поэтому для изучения взаимодействия бис-ХТ^Ме) с тимусной ДНК был использован ряд оптических методов: флуоресценции», УФ- и видимая адсорбционная спектроскопия, круговой и линейный дихроизм в потоке. Из серии бис-ХТ было выбрано соединение бис-ХТ(ТЧМе), поскольку обладало наибольшей растворимостью в воде при нейтральных рН. Комплексы его с ДНК готовились смешиванием равных объёмов растворов ДНК и лиганда с последующим выдерживанием их при 4°С в течение трёх суток. Семейство спектров поглощения бис-ХТ^Ме) было исследовано с помощью оптической спектроскопии при нескольких концентрациях лиганда и меняющейся концентрации ДНК. На рис. 1 приведено семейство спектров флуоресценции бис-ХТ(КМе) в отсутствие и присутствии меняющейся концентрации ДНК. Из приведенного семейства кривых следует, что краситель взаимодействует с ДНК и интенсивность его флуоресценции в присутствии избытка ДНК возрастает в - 350 раз (максимумум эмиссии при 475 нм, максимумум возбуждения при 365 нм).

400 450 500 550 600 650

Длина волны, (нм)

На рис. 2 приведено семейство спектров поглощения бнс-ХТ(1Ч'Мс) в присутствии меняющейся концентрации ДНК. По мере увеличения концентрации ДНК оптическая плотность при 338 нм вначале падает по сравнению с оптической плотностью свободного красителя, а затем возрастает. Следовательно, бис-ХТ^Ме) образует с ДНК, по крайней мере, два типа комплекса.

Рис. 2. Семейство спектров поглощения бнс-ХТ^Ме) в концентрации 7.59-10"6 М в присутствии меняющейся концентрации ДНК. (1) - свободный бнс-ХТ(№У1е), (2) -1.23,(3)-2.46, (4)-3.69, (5)-4.92, (6) - 7.38, (7)-9.84, (8)-14.76,(9)- 19.68, (10)-29.52, (11)-49.2, (12)-73.8, (13)-110.7,(14)-172.2, (15)-246, (16) - 369-10"6 М ДНК. Вставка - начальная область зависимости поглощения при 338 нм бпс-ХТ(>с'Ме) в концентрации 7.5910"6 М от концентрации добавленной ДНК. Длина оптического пути кюветы 5 мм. Буфер: 1 мМ како-дилат натрия, рН 6.8, 25% (об/об) СР3СН2ОН.

Об образовании по меньшей мере двух типов комплексов бис-ХТ^Ме) с ДНК свидетельствуют также результаты измерения ЛД при 360 и 270 нм в присутствии меняющейся концентрации лиганда, представленные на рис. 3. Действительно, по мере увеличения концентрации бнс-ХТ^Ме) величина ЛД при 360 нм (кривая 1) вначале растет, а затем падает и становится отрицательной.

Длина волны, (нм)

'"> 2Г I2

0 1 2 3 4 5 6

Концентрация бис-ХТ(ГШе) х 106, (М)

Рис. 3. Зависимость величин ЛД комплексов бис-ХТ^Ме) с ДНК в концентрации 6.25-10"6 М от концентрации добавленного лиганда. ЛД при 360 нм - левая ось, кривая 1. ЛД при 270 нм - правая ось, кривая 2. Длина оптического пути кюветы 1 мм. Буфер, как в подписи к рис. 1.

Изменение величины ЛД при 360 нм с положительной на отрицательную, по мере роста концентрации лиганда, коррелирует с уменьшением амплитуды ЛД при 270 нм (кривая 2).

Однако, наиболее чувствительным к комплексообразовакию бис-ХТ^Ме) с ДНК оказался метод КД. Так на рис. 4 и 5 приведены семейства спектров КД, полученных при титровании молекулами ДНК соединения бис-ХТ^Ме) в концентрациях 7.59-10"6 М и 3.23-10"6 М, соответственно. При низких концентрациях добавленной ДНК длинноволновый максимум КД находился при 360 нм (спектр 4, рис. 4; спектр 1, рис. 5 ), по мере увеличения концентрации полимера он смещался к 335 нм (спектр 6, рис. 4; спектр 2, рис. 5). При ещё больших концентрациях ДНК максимум спектра КД оказывается при 370 нм (спектр 15, рис. 4). Такое разнонаправленное движение максимума КД в зависимости от концентрации добавленной ДНК говорит об образовании в растворе при разных соотношениях лиганд/ДНК трёх спектрально различных типов комплексов бис-ХТ^Ме)-ДНК. Значительные спектральные различия между комплексами 1-го, 2-го и 3-го типов позволили определить стехиометрию этих комплексов.

Длина волны, (нм)

300 350 400 450 Длина волны, (нм)

7.59-10"6 М в присутствии различных концентрации ДНК. Спектр КД свободного лиганда вычтен. (1) - 1.23, (2) - 2.46, (3) - 3.69, (4) -4.92, (5) - 7.38, (6) - 9.84, (7) - 14.8, (8) - 19.7, (9) - 29.5, (10) - 49.2, (11) -73.8,.(12)- 110.7, (13)-172.2, (14) - 246, (15) - 369-Ю"4 М ДНК. Длина оптического пути кюветы 5 мм. Буфер, как в подписи к рис. 1.

Рис. 4. Семейство спектров КД бис-ХТ^Ме) в концентрации

Рис. 5. Семейство спектров КД бис-ХТ^Ме) в концентрации 3.23-10'6 М в присутствии различных концентраций ДНК.

Спектр КД свободного лиганда вычтен. (1)-5.1, (2)-10.1, (3) - 15.2, (4)-20.3, (5)-30.4, (6)-40.6, (7) - 60.9-10"6 М ДНК.

Длина оптического пути кюветы 5 мм. Буфер, как в подписи к рис. 1.

3.2. Первый тип комплекса Giic-XT(NMc) с Д11К.

Связывание раскрытой линейной формы 6nc-XT(NMe) с ДНК. К первому типу комплекса мы относим комплекс, образующийся при низких отношениях лиганд/ДНК и имеющий максимум в спектре КД при 370 нм. По своим спектральным характеристикам: максимуму поглощения при 362 нм; положительному знаку КД с максимумом при 370 нм; положительному знаку ЛД с максимумом при 365 нм; флуоресценции с максимумом при 475 км (интенсивность которой возрастает в - 350 раз по сравнению со свободным лигандом) первый тип комплекса бнс-XT(NMe) с ДНК соответствует специфическому типу комплекса Хёхст 33258 с poly[d(A-T)]-poly[d(A-T] (Steiner et al. 1979, Kim et al. 1996).

Q рис. 1.

3

Концентрация ДНК x 10 , (M)

4

Рис. 6. Зависимость КД при 370 нм для первого типа комплекса бнс-ХТ(^'Ме) с ДНК от концентрации ДНК. Концентрация бис-ХТ(КМе) - 2.08-10"6 М. Длина оптического пути кюветы 5 мм. Буфер, как в подписи к

Измерение КД при 370 нм регистрирует, в основном, образование именно первого типа комплекса. На рис. 6 представлена зависимость КД бис-ХТ(КМе) при 370 нм от концентрации добавленной ДНК. Через экспериментальные точки проведены две касательные: в области малых и больших добавлений ДНК. Касательная при больших добавлениях ДНК означает, что весь присутствующий в растворе бис-ХТ^Ме) связался с ДНК. К начальной области кривой, когда концентрация ДНК много меньше концентрации лиганда, также можно провести касательную. Поскольку свободный бис-ХТ(ГШе) не обладает КД, следовательно измеренная величина КД пропорциональна концентрации связанного красителя.

Абсцисса точки пересечения касательных в этом случае соответствует добавлению в раствор такого количества ДНК, которого достаточно, чтобы связать весь присутствующий в нём ли-ганд. Таким образом, знание абсциссы точки пересечения касательных позволяет определить стехиометрию интересующего нас типа комплекса, поскольку концентрация бис-ХТ(>«Ме) нам известна. Практически же, когда константа связывания лиганда неизвестна, эксперименты надо проводить при нескольких концентрациях лиганда, увеличивая его концентрацию до тех пор, пока величина стехиометрии не перестанет уменьшаться.

Абсцисса пересечения касательных к начальному и конечному участкам кривой представленной на рис. 6 (концентрация бнс-ХТ^Ме) - 2.0810"6 М) оказалась равна 2.1-10"3 М ДНК, что

соответствует связыванию одной молекулы л и гак да на 10 по ДНК. Аналогичные зависимости били построены для титрования молекулами ДЙК 6ис-ХТ(!ЧМ«.} в концентрациях 3.23 и 7.59\0"6 М (кривые не приводятся). Они дали значение стехиометрии 13.4 и 8 8 п.о. на молекулу бис-ХТ^Ме), соответственно. Таким образом, среднее значение стехиометрии оказалось 11 п.о. на одну молекулу бнс-ХТ(№1е). Это означает, что первый тип комплекса с ДНК образует мономер бис-ХТ(МЧе) в раскрытой форме. Действительно, чтобы накрыть виток ДНК, молекула бнс-хт(от1е) должна быть максимально развернута. Предполагаемая пространственная структура этого типа комплекса представлена на рис. 7.

3.3. Второй тип комплекса бнс-ХТ^'Ме} с ДНК.

Комплекс, характеризующийся максимумом КД при 335 нм, мы называем вторым типом комплекса бнс-ХТ(ГЧМе) с ДНК. Интенсивность флуоресценции этого типа комплекса примерно равна интенсивности флуоресценции свободного ли ганда, а её максимум смещается в красную сторону спектра, по отношению к свободному лмганду, и располагается при 490 нм. ЛД второго типа комплекса имеет отрицательный знак 360 нм. Для определения стехиометрии этого типа комплекса бнс-ХТ(ММе) в концентрации 2.08- Ю'6 М был проппрован ДНК и измерен КД при 330 нм. Полученная зависимость представлена на рис. 8.

Рис. 7. Модель первого типа комплекса молеклы бис-ХТ(Р*Ме) в раскрытой линейной форме с дуплексом ¿(ОСТТТГОСААА АбС)г .Молекула лнганда представлена шариками большего размера.

4

Концентрация ДНК х 10 , (М)

Рис. 8. Зависимость КД при 330 нм для второго типа комплексов бнс-ХТ(1\Ме) с ДНК от ее концентрации. Концентрация бис-ХТ(ММе) -2.08-10"6 М. Длина оптического пути кюветы - 5 мм. Буфер, как в подписи к рис. 1.

Определение стехиометрии второго типа комплекса было проведено по методике, описанной выше для первого типа комплекса. Были проведены касательные к начальной и конечной частям кривой и найдена абсцисса их пересечения. Оказалось, что эта форма комплекса бис-ХТ(Ш1е)-ДНК занимает на ДНК 5 п.о., реально несколько больше (на 1-2 п.о.), так как часть лиганда адсорбирована на стенках кюветы и эффективная концентрация лиганда в растворе была несколько меньше, чем её расчетная величина. Такая стехиометрия соответствует связыванию бис-ХТ(ММе) на ДНК или в виде внутримолекулярного сандвича, или межмолекулярного сандвича из двух молекул бис-ХТ^Ме) в раскрытой форме. До сих пор, однако, не определена локализация этого комплекса Хёхст 33258 на ДНК, некоторые авторы предполагают частичную интеркаляцию (ВаШу е/ а1. 1993-4), другие - внешнее присоединение (АШикагу е1 аI. 2004). Мы предполагаем, что и сандвич бис-ХТ(Ш1е), и межмолекулярный димер молекул бис-ХТ^Ме) в раскрытой форме могут располагаться в узкой бороздке ДНК. Соответствующая пространственная модель второго (сандвнчевого) типа комплекса представлена на рис. 9.

Рис. 9. Модель второго типа комплекса молекул ы-Гжс-ХТШМе) в форме внутримолекулярного сандвича с дуплексом ¿(ССТТТТОСААААСС)3, Молекула лиганда представлена шариками большего размера

3.4. Третий тин комплекса бис-ХТ^Ме) с ДНК.

Третий тип комплекса бнс-ХТ(ММс) с ДНК характеризуется максимумом КД ггри 360 им и наблюдается при высоких отношениях бнс-ХТ(№Ме)/ДНК. При образовании этого типа комплекса не наблюдается какого-либо роста интенсивности флуоресценции, однако, происходит значительное падение оптической нлотности, измеренной при 338 лм.

Гис. IС. Зависимости оптической плотности при 338 ¡гм для третьего типа комплекса Вис-ХТ(^Ме) с ДНК от ее концентрации. Концентрации бне-ХТрчМе) 7.83 10^' М. Длина оптического пути кювета 5 мм. Буфер, как в подписи к рис. 1.

4

Концентрация ДНК х 10 , (м)

В образцах, содержащих небольшие концентрации ДНК, как обычно, наблюдалось уменьшение оптической плотности по сравнению со свободным лигандОМ, нп, если для образцов, постоявших после орщгугоыкшш комплекса трое суток и содержавших, большие конце«-

0.06 г

0.00

1

!

трации ДНК, наблюдался рост оптической плотности (см. рис. 2), то в данном эксперименте даже при соотношении 1:18 (молекул бнс-ХТ(М1е) к п.о. ДНК) такого роста не наблюдалось. Этот факт позволяет нам считать, что в этих специфических условиях образуется только один, именно третий тип комплекса, и определить его стехиометрию. Как и выше, для бис-ХТ(М1с) в концентрации 7.83-10"6 М была построена зависимость оптической плотности при 338 им от концентрации добавленной ДНК. Она представлена на рис. 10. К полученной кривой в области низких и высоких концентраций ДНК были проведены две касательные и по абсциссе точки их пересечения была определена стехиометрия образовавшегося комплекса. Она оказалась > 2 п.о. на молекулу бпс-ХТ^'Мс). Такая стехиометрия может соответствовать связыванию на одном сайте ДНК не одного, а двух сандвичей. Нам представляется наиболее вероятным, что второй сандвич бис-ХТрЧМе) свяжется на уже адсорбированном на ДНК сандвиче бнс-ХТ(.\Ме) с образованием димера из сандвичей.

3.5. ДББИ как ДНК-спсцифичныс лиганды.

Было показано, что спектральные изменения, наблюдаемые на рис. 11 для комплекса ДББИ(8) с ДНК аналогичны таковым для комплексов третьего типа бнс-ХТ(\Ме) с ДНК. В этом типе комплекса, как мы полагаем, на молекулах ДНК адсорбируются димеры сандвичей ДББИ.

300 350 400 Длина волны, (нм)

Рис. 11. Спектры поглощения ДББИ(8) в отсутствие (кривая 1) и в присутствии 1.35 (2) и 5.40 (3) мкг/мл ДНК. Концентрация ДББИ(8) -1 х 10"5 М; 0.3 М N3« + 2 мМ Ка-фосфатный буфер, рН 6.86.

Заметим, что изолированная молекула димерного бисбензимидазола, в частности молекула ДББИ(8), может находиться в растворе в двух конформациях: раскрытой и Сандвичевой. Сандвичевой мы называем конформацию молекулуы, в которой первый бензимидазольный фрагмент молекулы вступает в стекинг-взаимодействие с четвертым, а второй - с третьим (см. рис. 9).

3.5.1. Спектры кругового дихроизма ДББЩ8) в комплексе с ДНК.

На рис. 12, в качестве примера приведены спектры КД холестерической жидкокристаллической дисперсии (ХЖД) ДНК в отсутствие и присутствии ДББИ(8).

____3

--

1

\\ /3

\И2

1

240 280 320 360 Длина волны, (нм)

Рис. 12. Спектры КД ХЖД ДНК в растворе в отсутствие (кривая 1) и присутствии 0.6 (2) и 2.5 мкМ (3) ДББЩ8). Концентрация ДНК -16.2 мкг/мл; концентрация ПЭГ(4000) -170 мг/мл; 0.3 М ЫаС1 + 2 мМ N3-фосфатный буфер, рН 6.86.

Появление интенсивной отрицательной полосы в спектре КД в области поглощения оснований ДНК (кривая I) свидетельствует об образовании ХЖД ДНК. Видно, что по мере увеличения концентрации лиганда в растворе в спектре КД появляется интенсивная положительная полоса в области поглощения хромофоров лиганда (кривые 2, 3), при этом отрицательная полоса в области поглощения ДНК меняется незначительно. Проведенный расчет показывает, что величина молярного КД (Ае) положительной полосы составляет примерно 300 М"1 см"1, что по порядку величины сопоставимо с величиной Де ХЖД ДНК. Положительный знак полосы в области поглощения хромофоров лиганда указывает на то, что их угол наклона в составе комплекса с молекулой ДНК находится в пределах 0 - 54°.

Из этого следует, что ДББИ(8) не является интеркалхтором ДНК, а при образовании комплекса располагается в ее узкой бороздке. В КД-спекграх ХЖД ДНК в присутствии ДББИ(5) и ДББИ(7) интенсивные полосы в области поглощения этих соединений не индуцируются, при этом наблюдается значительное уменьшение амплитуды отрицательной полосы КД в области поглощения хромофоров ДНК. Поскольку спектры поглощения ДББИ(5) и ДББИ(7) подтверждают взаимодействие этих лигандов с ДНК, а отсутствие КД в их длинноволновой полосе поглощения свидетельствует о расположении хромофоров этих лигандов в комплексе с ДНК под углом близким к 54° по отношению к ее спиральной оси, то они также как и ДББИ(8),

являются узкобороздочными лиганяамн. Уменьшение амплитуды отрицательной полосы по мерс увеличения ймгцентраиии комплекса ДНК-лнганд есть, по-видимому, следствие искажения вторичной структуры двух цепочечной ДНК при образовании комплекса.

3.6.1 Дифференциальное окрашивание хромосом.

Идентификация хромосом а большинстве патогенетических исследований проводится Щ рисунку дифференциальной окраски При не пользовании методик, основанных на гибридизации последовательностей ДНК т situ с их последующим флуоресцентным выявлением (fluorescence in situ hybridization, FISH) обычно используют различные виды так называемого Q-окрэшивания, основанного на выявлении АТ-специфичнымн флуорохромами неравномерного распределения АТ/СС-пар вдоль хромосом. Для получения рисунка дифференциального окра-шизания хромосом в ряде случаев используется Хёхет3325$ (Hilwigetat 1972).

В совместной работе с К.В Поповым (ИМБ РАН) при обработке хромосом каждым из синтезированных флуорохромиых красителей Еис-ХТ(5,7,8) бьи обнаружен рисунок дифференциального окрашнаання. Наиболее контрастным оказался рисунок при окраске хромосом бие-ХТ(7) (рис 13). Он сопоставим по качеству с рисунком, получаемым при дифференциальной окраске хромосом красителем DAPI (4\6-диамидино-2-фенилнндолом), обычно используемым в практической цитогенетикс человека

3.6.2. Определение способности лнгандов проникать через клеточные мембраны.

Известно, что краситель Хёхст 33342 способен проникать через неповрежденные мембраны клеток (АгшЫоут е/ а!, 1984). Для определения способности веществ Проникать в живые клетки (с неповреждённой клеточной мембраной) сравнивали яркость флуоресценции ядер препаратов живых и фиксированных клеток (с нарушенной клеточной мембраной). Изучение способности бноХТ(5,7,8) проникать в живые клетки фнбробластов человека показало, что яркости флуоресценции ядер как живых, так и фиксированных клеток, окрашенных

Рнс. 13. Негативное изображение мстафазных хромосом клеток промоноцитарнон лейкемии человека HL60. окрашенных бнс-ХТ(7). Масштабная линейка -10 мкм.

бис-ХТ(5,7,8), мало отличались друг от друга, что непосредственно свидетельствовало о проникновении молекул ХТ(5,7,8) в живые клетки. Ядра живых клеток, окрашенных бис-ХТ(8), светились значительно слабее фиксированных. Однако временная динамика проникновения красителей в клетки нами не была исследована.

Таким образом, синтезирование соединения - бис-ХТ(5,7,8) - являются новыми перспективными флуоресцентными красителями, способными проникать через клеточную и ядерную мембраны и эффективно окрашивать ядра клеток.

3.7. Биохимическое исследование ДББИ в качестве ингибиторов реакции 3'-процессинга, осуществляемой ДНК-интегразой ВИЧ-1 (далее интеграза). Интеграза - один из трех основополагающих ферментов ВИЧ-1, необходимых для репликации вируса (Geist et al. 1999). Она ответственна за включение вирусной ДНК в хромосому хозяина. Интеграза представляет собой весьма привлекательную мишень для антивирусной терапии. До сих пор не описаны ее клеточные гомологи у млекопитающих, поэтому можно предположить, что ингибиторы интегразы будут относительно нетоксичны. Интеграза специфически узнает концевые последовательности участков U3 и U5 длинных концевых повторов вирусной ДНК и отщепляет динук-леотид GT с 3'-концов обеих цепей ДНК (Pommier et al. 2005). Эта первая выполняемая инте-гразой функция называется З'-процессингом. Затем интеграза осуществляет свою вторую функцию - встраивание вирусной ДНК в хромосомную ДНК.

В совместной работе с М Б. Готтих (HI® физико-химической биологин им. А.Н. Белозерского) на модельном 21-звенном дуплексе U5B/U5A, имитирующим концевую последовательность U5 участка ДНК ВИЧ-1:

USB 5 ' -GTGTGGAAAATCTCTAGCAIGT USA З'-САСАСС TTTTAGAGATCGTCA была исследована ингибирующая активность бис-ХТ и ДББИ в реакции З'-процессинга (см. табл. 3).

Таблица 3. Ингибирование ДНК-интегразы ВИЧ-1 в реакции З'-процессинга дуплекса U5B/U5A.

Соединение ICso*, мкМ Соединение 1Сзо*, мкМ

бис-ХТ(5) 3.2 ДББЩ5) 0.5

бпс-ХТ(7) 2.6 ДББЩ7) 0.2

бис-ХТ(8) 40.0 ДББЩ8) 5.0

* 1Сзо - концентрация ингибитора, при которой ферментативная реакция подавляется на 50%.

Следует отметить, что сам Хёхст 33258 не ипгибировал реакцию З'-ироцессинга вплоть до концентрации 100 мкМ. Итак, димеризация молекулы Хёхст 33258 в бис-ХТ или ДББН привела к появлению у последних нового качества - ингибиторной активности, отсутствующей у Хёхста 33258.

Таким образом, установлено, что in vitro бнс-ХТ и ДББИ ингибируют в микро/наномоляр-ных концентрациях ДНК-интегразу ВИЧ-1, один из ключевых ферментов репликации вируса иммунодефицита человека. Более того, как видно из попарного сравнения структурно соответствующих друг другу соединений (табл. 3) ингибирующая активность молекул ДББИ примерно на порядок активнее молекул бис-ХТ.

ВЫВОДЫ

1. Синтезированы семь ковалентно связанных димеров Хёхста 33258 (бис-ХТ и ДББИ), соединённые гибкими линкерами различной длины и состава.

2. На примере 6nc-XT(NMe) установлено, что при взаимодействии с ДНК синтезированные димерные лиганды образуют три типа комплексов:

" первый тип имеет максимум КД при 370 нм, интенсивность его флуоресценции в присутствии избытка ДНК возрастает в ~ 350 раз (максимумум эмиссии при 475 нм, максимумум возбуждения при 365 нм), он образуется при низких заполнениях ДНК лигандом (ли-ганд/ДНК < 0.05);

■ второй тип имеет максимумом КД при 335 нм, не обладает заметной флуоресценцией, образуется при промежуточных заполнениях ДНК лигандом (0.05 < лиганд/ДНК < 0.1);

■ третий тип имеет максимумом КД при 360 нм, не обладает заметной флуоресценцией, образуется при высоких заполнениях ДНК лигандом (лиганд/ДНК >0.1).

3. Показано, что в комплексе с ДНК бис-ХТи ДББИ локализуются в узкой бороздке ДНК.

4. Синтезированные соединения (бис-ХТ) являются новыми перспективными флуоресцентными красителями, способными проникать через клеточную и ядерную мембраны живых клеток и окрашивать ядра. Соединения бис-ХТ перспективны в цитогенетических исследованиях для дифференциальной окраски хромосом человека и животных.

5. Установлено, что in vitro бис-ХТи ДББИ ингибируют в микро/наномолярпых концентрациях ДНК-интегразу ВИЧ-1, один из ключевых ферментов репликации вируса иммунодефицита человека.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Громыко А.В., Стрельцов С. А., Жузе A.JI. ДНК-специфичный димерный бисбензимидазол. // Биоорган, химия. 2004 . Т. 30. №4.446-448.

2. Громыко А.В., Попов К.В., Мозолева А.П., Стрельцов С.А., Гроховский С.Л., Олейников В.А., Жузе А.Л. Лиганды, специфичные к определённым последовательностям пар оснований ДНК. XII. Синтез и цитологические исследования димерных молекулы Хёхст 33258. //Биоорган, химия. 2005. Т. 31. № 4. С. 385-393.

3. Streltsov S.A., Gromyko A.V., Oleinikov V.A., Zhuze A.L. The Hoechst 33258 covalent dimmer covers a total turn of the double-stranded DNA. // J. Biomol. Struct. & Dyn. 2006. V. 24. №3. P. 285-302.

4. Громыко A.B., Салянов В.И., Стрельцов С.А., Олейников В.А., Королев С.П., Готтих М.Б., Жузе А.Л.. Лиганды, специфичные к определённьм последовательностям пар оснований ДНК. XIII. Новые димерные молекулы Хёхста 33258 - ингибиторы интегразы ВИЧ-1 in vivo. II Биоорган, химия. 2007. Т. 33. № 6. С. 613-623.

5. Zhuze A.L., Gromyko A.V., Ivanov А.А., Salyanov V.I., Popov K.V., Korolev S.P., Gottikh M.B., Oleinikov V.A., Streltsov S.A. New highly fluorescing bis-Hoechsts: physicochemical, biochemical and cytological studies. // J. Biomol. Struct & Dyn. 2007. V. 24. №6. P. 666-668.

6. Попов K.B., Егорова Е.И., Иванов A.A., Громыко А.В., Жузе А.Л., Большева Н.Л., Семенова О.Ю., Муравенко О.В., Зеленин А.В. Димерные красители на основе Hoechst 33258 - новые ДНК-специфичные флуорохромы для цитогенетики человека и растений, // Биологич. мембраны. 2008. Т. 25. № 3. С. 173-180.

Тезисы:

1. Громыко А.В. Синтез и изучение ДНК-специфичного димерного бис-бензимидазола. // XVI зимняя молодёжная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии." Москва, 9-12 февраля 2004 г., С. 57-58.

2. Zelenin A.V., Popov K.V., Egorova E.I., Ivanov A.A., Gromyko A.V., Zhuze A.L., Bolsheva N.L, Yurkevich O.U., Muravenko O.V. Novel AT-specific DNA-binding dimeric bis-benzimidazoles as efficient fluorochromes for cytogenetics and chromosome analysis. // Abstracts of XIV Interntional Congress of ISAC (International Society of Analytical Cytology), Budapesht, 17-21 May 2008, poster № 149, P. 188.

Подписано в печать:

02.03.2009

Заказ № 1650 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Громыко, Александр Викторович

Список использованных сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Обзор литературы.

1.1. Основные способы связывания низкомолекулярных органических соединений с двухцепочечной ДНК.

1.2. Внешнее связывание.

1.3. Интеркаляция. 7 1.4 Связывание лигандов по узкой или широкой бороздкам ДНК.

1.4.1. Широкобороздочные лиганды.

1.4.2. Узкобороздочные лиганды.

1.4.2.1. АТ-специфичные лиганды.

1.4.2.2. GC-специфичные лиганды.

ГЛАВА 2. Обсуждение результатов.

2.1. Требования к ДНК-сайт-специфичным соединениям.

2.2. Молекулярное моделирование.

2.3. Синтез димерных бисбензимидазолов - бис-ХТ и ДББИ.

2.3.1. Серия бис-ХТ(5,7,8) и 6nc-XT(NMe).

2.3.2. Серия ДББИ(5,7,8).

2.4. Результаты оптических исследований комплексов бис-ХТ и ДББИ с ДНК. 57 2.4.1. Исследование комплексов 6nc-XT(NMe) с ДНК.

2.4.1.1. Первый тип комплекса бис-ХТ(NMe) с ДНК.

2.4.1.2. Второй тип комплекса 6nc-XT(NMe) с ДНК.

2.4.1.3. Третий тип комплекса 6nc-XT(NMe) с ДНК.

2.4.1.4. Исследования комплексов ДББИ с ДНК.

2.5. Биохимические исследования бис-ХТ и ДББИ.

2.6. Цитологические исследования бис-ХТ(5,7,8).

ГЛАВА 3. Экспериментальная часть.

3.1. Материалы.

3.2. Синтез димерных бисбензимидазолов бис-ХТ и ДББИ.

3.2.1. Синтез бис-ХТ(5,7,8).

3.2.2. Синтез бис-ХТ(ТЧМе).

3.2.3. Синтез ДББИ(5,7,8).

3.3. Оптические методы исследования комплексов бис-ХТ, 6nc-XT(NMe) и ДББИ с ДНК.

3.3.1. Приборы.

3.3.2. Приготовление комплексов бис-ХТ, 6nc-XT(NMe) и ДББИ с ДНК.

3.4. Ингибирование реакции З'-процессинга ДНК-интегразы ВИЧ-1.

3.5. Исследование способности бис-ХТ(5,7,8) дифференциально окрашивать хромосомы и проникать в живые клетки.

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "ДНК-специфичные лиганды на основе димеров Хёхста 33258"

В настоящее время активно развивается область исследований, посвященная изучению взаимодействия с двухцепочечной ДНК низкомолекулярных органических соединений: антибиотиков, красителей, олигопептидов и других биологически активных соединений, взаимодействующих преимущественно с узкой бороздкой ДНК. Эти соединения являются не только объектами самостоятельного изучения, но и находят широкое применение в противоопухолевой и противовирусной терапии, а также в качестве ДНК-специфичных молекулярных зондов в медицинских и научных исследованиях.Перспективность развития исследований в области ДНК-специфичной фармакологии связана с возможностью создания низкомолекулярных соединений, способных проникать внутрь клетки и выполнять сложные биологические функции регуляторных белков: избирательно связываться с определенными последовательностями пар оснований ДНК и оказывать направленное воздействие на функционирование генома и клетки в целом. При этом важно отметить, что низкомолекулярные соединения обычно легко выводятся из организма и не вызывают нежелательных реакций иммунного ответа.В последнее время в химиотерапии рака и противовирусной терапии наблюдается тенденция замены традиционных лекарств на основе интеркаляторов и алкилирующих агентов, повреждающих ДНК неселективным способом, новыми агентами, нековалентно взаимодействующими с ДНК и влияющими на процессы ее репликации и транскрипции.Поэтому большой интерес представляет конструирование и синтез низкомолекулярных органических соединений, которые могли бы нековалентно и сайт-специфично связываться с узкой бороздкой ДНК.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Громыко, Александр Викторович

Синтезированы семь ковалентно связанных димеров Хёхста 33258 (бис-ХТ и ДББИ), соединённые гибкими линкерами различной длины и состава.На примере 6nc-XT(NMe) установлено, что при взаимодействии с ДНК синтезирован ные димерные лиганды образуют три типа комплексов: первый тип имеет максимум КД при 370 нм, интенсивность его флуоресценции в присутствии избытка ДНК возрастает в 350 раз (максимумум эмиссии при 475 нм, максимумум возбуждения при 365 нм), он образуется при низких заполнениях ДНК лигандом Глиганд/ДНК < 0.05); второй тип имеет максимумом КД при 335 нм, не обладает заметной флуоресценцией, образуется при промежуточных заполнениях ДНК лигандом (0.05 < лиганд/ДНК < 0.1); третий тип имеет максимумом КД при 360 нм, не обладает заметной флуоресцен цией, образуется при высоких заполнениях ДНК лигандом (лиганд/ДНК > 0.1).Показано, что в комплексе с ДНК бис-ХТ и ДББИ локализуются в узкой бороздке Синтезированные соединения (бис-ХТ) являются новыми перспективными флуоресцентными красителями, способными проникать через клеточную и ядерную мембраны живых клеток и окрашивать ядра. Соединения бис-ХТ перспективны в цитогенетических исследованиях для дифференциальной окраски хромосом человека и животных.Установлено, что in vitro бис-ХТи ДББИ ингибируют в микро/наномолярных концентрациях ДНК-интегразу ВИЧ-1, один из ключевых ферментов репликации вируса иммунодефицита человека.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Громыко, Александр Викторович, Москва

1. Tse W.C., Boger D.L. (2004) Sequence-selective DNA recognition: natural products and Nature's lessons. Chemistry & Biology, 11, 1607-1617.

2. Ouameur A.A., Tajmir-Riahi H.A. (2004) Structural analysis of DNA interactions with biogenic polyamines and cobalt (III) hexamine studied by fourier transform infrared and capillary electrophoresis. J. Biol. Chem.. 279, 42041-42054

3. Haworth I.S., Rodger A., Richards W.G. (1991) A molecular mechanics study of spermine complexation to DNA: a new model for spermine-poly(dG-dC) binding. Proc. Biol. Sci.. 244. 107-116.

4. Feuerstein B.G., Williams L.D., Basu H.S., Marton L.J. (1991) Implications and concepts of polyamine-nucleic acid interactions. J. Cell. Biochem., 46, 37—47.

5. Zakrzewska K., Pullman B. (1986) Spermine-nucleic acid interactions: a theoretical study. Biopolymers, 25, 375-392.

6. Korolev N.. Lynbartsev A.P., Laaksonen A., Nordenskiold L. (2002) On the competition between water, sodium ions, and spermine in binding to DNA: a molecular dynamics computer simulation study. Biophys. J., 82, 2860-2875.

7. Raspaud E., Olvera de la Cruz M., Sikorav J.L., Livolant F. (1998) Precipitation of DNA by polyamines: a polyelectrolyte behavior. Biophys. J.. 74, 381-393.

8. Braunlin W.H., Strick T.J., RecordM.T. Jr. (1982) Equilibrium dialysis studies of polyamine binding to DNA. Biopolymers. 21, 1301-1314. 9a. Long E.C., Barton J.K. (1990) On demonstrating DNA intercalation. Ace. Chem. Res.. 23,271-273.

9. Wilson W.D. (1999) DNA intercalators, in DNA and Aspects of Molecular Biology. Elsevier Science, New York, 417-476.

10. Remers W.A. (1979) The Chemistry of Antitumor Antibiotics. Wiley, NewYork, 1-301.

11. Arcamone F. (1981) Doxorubin. Academic Press, New York, 1-349.

12. Priebe W. ed. (1993) Anthracyclines Antibiotics, American Chemical Society, Washington, DC, 1-343.

13. Williams L.D., Egli M., Qi G., Bash P., van der Marel G.A., van Boom J.H., Rich A., Frederick С A. (1990) Structure of nogalamycin bound to a DNA hexamer. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 87, 2225-2229.

14. Hannon M.J. (2007) Supramolecular DNA recognition. Chem. Soc. Rev., 36, 280-295.

15. Goldberg I. Я, Rabinowitz M., Reich E. (1962) Basis of aclinomycin action. I. DNA binding and inhibition of RNA-polymers synthetic reaction by actinomycin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48, 2094-2101.

16. De Santis P., Rizzo R., Ughetto G. (1972) Conformational studies on actinomycin. Biopolimers, 11, 279-289.

17. Chen F.-M., Jones СМ., Johnson Q.L. (1993) Dissociation kinetics of actinomycin D from oligonucleotides with hairpin motifs. Biochemistry, 32, 5554-5559.

18. Huifen C, Chen Я , Patel D.J. (1995) Solution structure of the menogaril - DNA complex. J. Am. Chem. Soc, 117, 5901-5913

19. Wang A.H.-J., Ughetto G., Quigley G.J., Hakoshima Т., van der Marel G.A., van Boom J.H., Rich A. (1984) The molecular structure of DNA-triostin A complex. Science, 225, 1115-1121.

20. Lee J.S., Waring M.J. (1978) Interaction between synthetic analogues of quinoxaline antibiotics and nucleic acids. Changes in mechanism and specificity related to structural alterations. Biochem. J., 173, 129-144.

21. Low C.M.L., Fox K.R., Olsen R.K., Waring M.J. (1986) DNA sequence recognition by under-methylated analogues of triostin A. Nucleic Acids Res., 14, 2015-2033.

22. Le Pecq J.-B., Le Bret M., Barbet J., Roques B.P. (1975) DNA polyintercalating drugs: DNA binding of diacridine derivatives. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 2915-2919.

23. Gaugain В., Barbet J., Oberlin R., Roques B.P., Le Pecq J.-B. (1978) DNA bifunctional intercalators. 1. Synthesis and conformational properties of an acridine ethidium heterodimer. Biochemistry, 17, 5071-5078.

24. Becker MM., Dervan P.B. (1979) Molecular recognition of nucleic acid by small molecules. Binding affinity and structural specificity of bis(methidium)spermine. J. Am. Chem. Soc, 101, 3664-3666.

25. Ughetto G., Wang A.H.-J., Quigley G.J., van der Marel G.A., van Boom J.H., Rich A. (1985) A comparison of the structure of echinomycin and triosin A complexed to DNA fragment. Nucleic Acids Res., 13, 2305-2323.

26. Tjandra N., Tate S., Ono A., Kainosho M., Box A. (2000) The NMR structure of a DNA dodecamer in an aqueous dilute liquid crystalline phase. J. Am. Chem. Soc, 122, 6190-6200.

27. Beveridge D.L., McConnell K.J. (2000) Nucleic acids: theory and computer simulation, Y2K. Curr. Opin. Struct. Biol., 10, 182-196.

28. Корка M.L., Yoon C, Goodsell D., Pjura P., Dickerson R.E. (1985) The molecular origin of DNA - drug specificity in netropsin and distamycin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 1376-1380.

29. Zasedatelev A.S., Gursky G.V., Zimmer Ch, Thrum H. (1974) Binding of netropsin of DNA and synthetic polinucleotides. Mol. Biol. Repopts, 1, 337-342.

30. Zimmer Ch. (1975) Effects of the antibiotics netropsin and distamycin A on the stracture and function of nucleic acids. Prog. Nucl. Acid. Res. Mol. Biol., 15, 285-318.

31. Корка M.L., Yoon C, Goodsell D., Pjura P., Dickerson R.E. (1985) Bindig of an antitumor drug to DNA? Netropsin and CGCGAATT-BrC-GCG. J. Mol. Biol.. 183, 553-563.

32. Zimmer C, Wahnert U. (1986) Nonintercalating DNA-binding ligands: speci.city of the interaction and their tools in biophysical, biochemical and biological investigations of the genetic material. Prog. Biophvs. Mol. Biol., 47, 31-112.

33. Nunn СМ., Gorman E., Neidle S. (1997) Crystal structure of DNA decamer d(CGCAATTGCG)2 complexed with the minor groove binding drug netropsin. Biochemistry, 36, 4792-4799.

34. Goodsell D.S., Корка M.L., Dickerson R.E. (1995) Refinement of netropsin bound to DNA: bias and feedback in electron density map interpretation. Biochemistry, 34, 4983-4993.

35. Abrescia N.G., Malina L., Suhrirana J. A. (1999) Stacking interaction of guanine with netropsin in the minor groove of d(CGTATATACG)2. J. Mol. Biol.. 294, 657-666.

36. Pelton J.G., Wemmer D.E. (1998) Structural modeling of the distamycin A - (CGCGAATTCGCG)2 complex using 2D NMR and molecular mechanics. Biochemistry. 27, 8088-8096.

37. Coll M, Frederick C.A., Wang A.H.-J., Rich A. (1987) A bifurcated hydrogen- bonded conformation in the d(A-T) base pairs of the DNA dodecamer d(CGCAAATTTGCG) and its complex with distamycin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84, 8385-8389.

38. Pelton J.G., Wemmer D.E. (1990) Binding modes of distamycin A with d(CGCAAATTTGCG)2 determined by two-dimensional NMR. J. Am. Chem. S o c 112, 1393-1399.

39. Luck G, Triebel H., Waring M.J., Zimmer C. (1974) Conformation dependent binding of netropsin and distamycin to DNA and DNA model polymers. Nucleic Acids Res., 1, 503-530.

40. Marky L.A., Breslauer K.J. (1987) Origins of netropsin binding affinity and specificity: correlations of thermodynamic and structural data. Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 4359-4363.

41. Dann O., Bergan G, Dement E., Volz G. (1971) Trypanocide Diamidine des 2-phenyl- benzofurans, 2-phenylindenes and 2-phenylindols. Liebigs Ann. Chem., 749, 68-89.

42. Narin R.S., Dodson M.L., Humphery R.M. (1982) Comparsion of ethidium bromide and 40,6 - diamidino-2-phenylindole as quantitive fluorescent stains for DNA in agarose gels. J. Biochem. Biophys. Methods, 6, 95-103.

43. Sun Z., McLaughlin L. (2007) Probing the nature of three-centered hydrogen bonds in minor-groove ligand-DNA interactions: the contribution of fluorine hydrogen bonds to complex stability. J. Am. Chem. Soc, 129, 12531-23536.

44. Vlieghe D., Spone, S., Meervelt L. V. (1999) Crystal structure of d(GGCCAATTGG)2 complexed with DAPI reveals novel binding mode. Biochemistry, 38, 16443-16451.

45. Trotta E., D'Ambrosio R, Del Grosso N.. Ravagnan G., Cirilli M., Pad M. (1993) *H- NMR Study of d(GCGATCGC).2 and its interaction with minor groove binding 4',6-diamidino-2-phenylindole. J. Biol. Chem., 268, 3944-3951.

46. Trotta E., D'Ambrosio E., Ravagnan G., PadM. (1995) Evidence for DAPI intercalation in GC sites of DNA oligomer d(CGACGTCG).2: a ! H NMR study. Nucleic Acids Res.. 23, 1330-1340.

47. Trotta E., D'Ambrosio E., Ravagnan G., Pad M. (1996) Simultaneous and different binding mechanisms of 4',6-diamidino-2-phenylindole to DNA hexamer (d(CGATCG))2. J. Biol. Chem., 271, 27608-27614.

48. Greenhill J. V., Lue P. (1993) Amidines and guanidines in medicinal chemistry. Prog. Med. Chem.. 30, 203-325.

49. Pilch D.S., Kirolos M.A., Plum G.E., Breslauer K.J. (1995) Berenil 1,3- Bis(4-ami- dinophenyl)triazene. binding to DNA duplexes and to a RNA duplex: evidence for both intercalative and minor groove binding properties. Biochemistry, 34, 9962-9976.

50. Pilch D.S., Kirolos M.A., Plum G.E. , Breslauer K.J. (1995) Berenil binding to higher ordered nucleic acid structures: complexation with a DNA and a RNA triple helix. Biochemistry, 34, 16107-16124.

51. Lynen L., Van Damme W. (1992) Local application of diminazene aceturate: an effective treatment for cutaneous leishmaniasis? Ann. Soc. Belg. Med. Trop., 72, 13-19.

52. Brown D.G., Sanderson M.R., Skelly J. V., Jenkins T.C., Brown Т., Garman E., Stuart D.I., Neidle S. (1990) Crystal structure of a berenil-dodecanucleotide complex: the role of water in sequence-specific ligand binding. EMBO J„ 9, 1329-1334. I l l

53. Brown D.G., Sanderson M.R., Garman E., Neidle S. (1992) Crystal structure of a berenil d(CGCAAATTTGCG)2 complex. An example of drug-DNA recognition based on sequence-dependent structural features. J. Mol. Biol., 226, 481-490.

54. Apted F.I.C. (1980) Present status of chemotherapy and chemoprophylaxis of human trypanosomiasis in the eastern hemisphere. Pharmacol. Ther., 11, 391—413.

55. Tidwell R.R., Bell С A. (1993) Pentamidine and related compounds in the treatment of Pneumocystis carinii infection, in Pneumocystis carinii, ed. P. Walzer, Marcel Decker: New York, 561-583.

56. Luck G., Zimmer Ch, Schweizer D. (1988) DNA binding studies of the nonintercalative ligand pentaidine: dA-dT base pair preference. Studia Biophysica, 125, 107-119

57. Fox K.R., Sansom C.E., Stevens M.P.G. (1990) Footprinting studies on the sequence selective binding of pentamidine to DNA. FEBS Lett.. 266, 150-154.

58. Loewe H., Urbanietz J. (1974) Basic-substituted 2,6-bisbenzimidazole derivates, a novel class of substances with chemotherapeutic activity. Arzneim.-Forsch. (Drug Res.), 24, 1927-1933.

59. Latt S.A., Wohlleb J.C (1975) Optical studies of the interaction of 33258 Hoechst with DNA, chromatin, and metaphase chromosomes. Chromosoma, 52, 297-316.

60. Latt S.A., Stetten G. (1976) Spectral studies on 33258 Hoechst and related bisbenzimi- dazole dyes useful for fluorescent detection of deoxyribonucleic acid synthesis. J. Histochem. Cytochem., 24, 24-33.

61. Steiner R.F., Sternberg H. (1979) The interaction of Hoechst 33258 with natural and biosynthetic nucleic acids. Arch. Biochem. Biophys., 197, 580-588.

62. Заседателев A.C., Михайлов M.B., Крылов A.C., ГурскийГ.В. (1980) Механизм узнавания AT пар ДНК молекулами красителя «Хёхст 33258». Доклады АН СССР, 225, 756-760.

63. Stokke Т., Steen Н.В. (1985) Multiple binding modes for Hoechst 33258 to DNA. J. Histochem. Cytochem., 33, 333-338.

64. Muller W., Gautier F. (1975) Interactions of heteroaromatic compounds with nucleic acids. A - T-specific non-intercalating DNA ligands. Eur. J. Biochem., 54, 385-394.

65. Zimmer C, Waehnert U. (1986)Nonintercalating DNA-binding ligands: specificity of the interaction and their use as tools in biophysical, biochemical and biological investigations of the genetic material. Prog. Biophys. Mol. Biol., 47, 31-112.

66. Jorgenson K.F., Varshney U., van de Sonde J.H. (1988) Interaction of Hoechst 33258 with repeating synthetic DNA polymers and natural DNA. J. Biomol. Struct. Dyn.. 5. 1005-1023.

67. Martin R.F., Holmes N. (1983) Use of an 125I-labelled DNA ligand to probe DNA structure. Nature. 302, 452-454.

68. Harshman K.D., Dervan P.B. (1985) Molecular recognition of B-DNA by Hoechst 33258. Nucleic Acids Res., 13, 4825-4835.

69. Portugal J., Waring M. J. (1988) Assignment of DNA binding sites for 4',6-diamidine-2- phenylindole and bisbenzimide (Hoechst 33258). A comparative footprinting study. Biochim. Biophys. Acta, 949, 158-168.

70. Drobyshev A.S., Zasedatelev A.S., Yershov G.M, Mirzabekov A.D. (1999) Massive parallel analysis of DNA-Hoechst 33258 binding specificity with a generic oligodeoxyribo-nucleotide microchip. Nucleic Acids Res., 27, 4100-4105.

71. Adu-Daya A., Brown P.M., Fox K.R. (1995) DNA sequence preferences of several AT- selective minor groove binding ligands. Nucleic Acids Res.. 23, 3385-3392.

72. Piura P.E.. Grzeskowiak K.. Dickerson R.E. (1987) Binding of Hoechst 33258 to the minor groove of B-DNA. J. Mol. Biol.. 197, 257-271.

73. TengM.K., Usman N., Frederick C. A., WangA.H. (1988) The molecular structure of the complex of Hoechst 33258 and the DNA dodecamer d(CGCGAATTCGCG). Nucleic Acids Res., 16, 2671-2690.

74. Spink N., Brown D. G, Skelly J. V., Neidle S. (1994) Sequence-dependent effects in drug- DNA interaction: the crystal structure of Hoechst 33258 bound to the d(CGCAAATTTGCG)2 duplex. Nucleic Acids Res.. 22, 1607-1612.

75. QuintanaJ.R., Lipanov A.A., Dickerson R.E. (1991) Low-temperature crystallographic analyses of the binding of Hoechst 33258 to the double-helical DNA dodecamer C-G-C-G-A-A-T-T-C-G-C-G. Biochemistry, 30, 10294-10306.

76. Searly M.S., Embry K.J. (1990) Sequence-specific interaction of Hoechst 33258 with the minor groove of an adenine-tract DNA duplex studied in solution by !H NMR spectroscopy. Nucleic Acids Res., 18, 3753-3762.

77. Parkinson J.A., Barber J., Douglas К. Т., Rosamond J., Sharpies D. (1990) Minor-groove recognition of the self-complementary duplex d(CGCGAATTCGCG)2 by Hoechst 33258: a high-field NMR study. Biochemistry. 29, 10181-10190.

78. Han F, Taulier N.. Chalikian T. V. (2005) Association of the minor groove binding drug Hoechst 33258 with d(CGCGAATTCGCG)2: volumetric, calorimetric, and spectroscopic characterizations.Bjojchemistry, 44, 9785-9794.

79. Kakkar R., Grover R. (2005) Theoretical study of molecular recognition by Hoechst 33258 derivatives. J. Biomol. Struct. Dyn., 23, 37-47.

80. SatzA.L., Bruice T.C. (2000) Synthesis of fluorescent microgonotropens (FMGTs) and their interactions with dsDNA. Bioorg. Med. Chem., 8, 1871-1880.

81. Родин C.A., Писъменский В.Ф., Никитин A.M., Суровая A.LI., Гурский Г.В. (2001) Связывание красителя Хёхст 33342 в форме мономера и сандвича с nonnd(AT).-polyd(AT). и самокомплементарным додекамером 5'-CGTATATATACG-3'. Докл. АН, 379 , 256-260.

82. Bontemps J., Houssier C, Fredericq E. (1975) Physico-chemical study of the complexes of "33258 Hoechst" with DNA and nucleohistone. Nucleic Acids Res., 2, 971-984.

83. Comings D.E. (1975) Mechanisms of chromosome banding. VIII. Hoechst 33258-DNA interaction. Chromosoma (BerL), 52, 229-243.

84. Bailly C, Colson P., Henichart J.-P., Houssier C. (1993) The different binding modes of Hoechst 33258 to DNA studied by electric linear dichroism. Nucleic Acids Res., 21, 3705-3709.

85. Bailly C, Colson P., Houssier C, Wang H, Bathini Y, Lown J W. (1994) Mode of DNA binding of bis-benzimidazoles and related structures studied by electric linear dichroism. J. Biomol. Struct. Dyn., 12, 173-181.

86. Adhikary A., Buschmann V., Midler C, Sauer M. (2003) Ensemble and single-molecule fluorescence spectroscopic study of the binding modes of the bis-benzimidazole derivative Hoechst 33258 with DNA. Nucleic Acids Res., 31, 2178-2186.

87. Pellon J.G., Wemmer D.E. (1989) Structural characterization of a 2:1 distamycin A- d(CGCAAATTGGC) complex by two-dimensional NMR. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 5723-5727.

88. Hofman K. (1953) The Chemistry of Heterocyclic Compaunds, Part I, Imidazole and Its Derivatives. Ed., A. Weissberg., Interscience Publishers, New York.

89. Tidwell R.R., Boykin W.D. (2003) In DNA and RNA Binders: From Small Molecules to Drugs, Vol. 2, Chapter 16, pp. 414-460. Eds., M. Demeunynck, С Bailly, W.D. Wilson., Wiley-VCH.

90. Breusegem S.Y, Sadat-Ebrahimi S.E., Douglas K.T., BichenkovaE. V., CleggR.M., 1.oontiens F.G. (2001) Experimental precedent for the need to involve the primary hydration layer of DNA in lead drug design. J. Med. Chem., 44, 2503-2506

91. Sun X.-W., Neidleb S., Manna J. (2002) Synthesis of a novel dimeric bis-benzimidazole with site-selective DNA-binding properties. Tetrahedron Lett., 43, 7239-7241.

92. Khan Q., Barbieri C., Srinivasan A., Wang Y.-H., LaVoie E., Pilch D. (2006) Drag self- association modulates the cellular bioavailability of DNA minor groove-directed terbenzimidazoles. J. Med. Chem., 49, 5245-5251.

93. Ji Y.H., Bur D., Hasler W., Runtz Schmitt V., Dorn A., Bailly C, Waring M.J., Hochstrasser R., Leupin W. (2001) Tris-benzimidazole derivatives: design, synthesis and DNA sequence recognition. Bioorg. Med. Chem., 9, 2905-2919.

94. Clark G.R., Gray E.J., Neidle S., Li Y.H., Leupin W. (1996) Isohelicity and phasing in drug-DNA sequence recognition: crystal structure of a tris(benzimidazole) - oligonucleo tide complex. Biochemistry, 35, 13745-13752.

95. Reddy P., Toporowski J., Kahane A., Bruice T. (2005) Recognition of a 10 base pair sequence of DNA and stereochemical control of the binding affinity of chiral hairpin polyamide-Hoechst 33258 conjugates. Bioorg. Med. Chem. Lett.. 15, 5531-5536.

96. Tanada M., Tsujita S., Sasaki S. (2006) Design of new bidentate ligands constructed of two Hoechst 33258 units for discrimination of the length of two A3T3 binding motifs. J. Ore. Chem.. 71, 125-134.

97. Das B.P., Boykin D. W. (1976) Synthesis and antiprotozoal activity of 2,5-bis(4-guanyl- phenyl)furans. J. Med. Chem., 20, 531-536.

98. SteckE.A., Kinnamon K.E., Davidson D.E., DuxburyR.E., Johnson A.J., Masters R.E. (1982) Trypanosoma rhodesiense: Evaluation of antitrypanaosomal action of 2,5-bis(4-guanylphenyl)furan dihydrochloride. Exp. Parasitol., 3, 133-134.

99. Blagburn B.L., Drain K.L., Land T.M., Moore P.H., KinardR.G., Lindsay D.S., Kumar A., Shi J., Boykin D. W., Tidwell R.R. (1998) Dicationic furans inhibit development of Cryptosporidium parvum in HSD/ICR suckling Swiss mice. J. ParasitoL 84, 851-856.

100. Boykin D.W., Kumar A., Spychala J., Zhou M., Lombardy R.J., Wilson W.D., Dykstra C.C., Jones S.K., Hall J.E. (1995) Dicationic diarylfurans as anti-Pneumocystis carinii agents. J. Med. Chem., 38, 912-916.

101. Tanious F.A., Spychala J., Kumar A., Greene K, Boykin D.W., Wilson W.D. (1994) Different binding mode in AT and GC sequences for unfused-aromatic dications. J. Biomol. Struct. Dyn., 11, 1063-1083.

102. Mazur S., Tanious F., Ding D., Kumar A, Boykin D. W., Simpson I. J., Neidle S., Wilson W.D. (2000) A thermodynamic and structural analysis of DNA minor-groove complex formation. J. Mol. Biol., 300, 321-337.

103. Guerri A., Simpson I. J., Neidle S. (1998) Visualization of extensive water ribbons and network in a DNA minor groove drug complex. Nucleic Acids Res., 26, 2873-2878.

104. Simpson I.J., Lee M., Kumar A., Boykin D.W., Neidle S. (2000) DNA minor groove interactions and the biological activity of 2,5-bis-4-(N-alkylamidino)phenyl.furans. Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, 2593-2597.

105. Trotta E., D 'Ambrosio E., Ravagnan G, Paci M. (1995) Evidence for DAPI intercalation in GC sites of DNA oligomer d(CGACGTCG).2: a 'bl NMR study. Nucleic Acids Res.. 23,1333-1340.

106. Trotta E., D 'Ambrosio E,, Ravagnan G., Paci M. (1996) Simultaneous and different binding mechanisms of 4',6-diamidino-2-phenylindole to DNA hexamer (d(CGATCG))2. A lU NMR study. J. Biol. Chem., 271, 27608-27614.

107. Nunn СМ., Neidle S. (1995) Sequence dependent drug binding to the minor groove of DNA: crystal structure of the DNA dodecamer d(CGCAATTGCG)2 complexed with propamidine. J. Med. Chem., 38, 2317—2325.

108. Colson P., Houssier C, Bailly С (1995) Use of electric linear dichroism and competition experiments with intercalating drugs to investigate the mode of binding of Hoechst 33258, berenil and DAPI to GC sequences. J. Biomol. Struct. Dyn., 13, 351- 366.

109. Matesoi D., Kittler L., Bell A., Unger E., Lober G. (1996) Determination of microscopic binding constants at individual DNA base sequences for the minor groove binders Hoechst 33258, DAPI and pentamidine. Biochem. Mol. Biol. Int., 38, 123-132.

110. Colson P., Bailly C, Houssier С (1996) Electric linear dichroism as a new tool to study sequence preference in drug binding to DNA. Biophys. Chem., 58, 125-140.

111. Jansen K, Lincoln P., Norden B. (1993) Binding of a DAPI analogue 2,5-bis(4- amidinophenyl)furan to DNA. Biochemistry, 32, 6605-6612.

112. Coury J.E., McFail-Isom L., Williams L.D., Bottomley L.A. (1996) A novel assay for drug-DNA binding mode, affinity, and exclusion number: scanning force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 12283-12286.

113. Chaires J.B., Ren J., Hamelberg D., Kumar A., Pandya V., Boykin D.W, Wilson W.D. (2004) Structural selectivity of aromatic diamidines. J. Med. Chem., 47, 5729-5742.

114. Wang L., Bailly C, Kumar A., Ding D., Bajic M., Boykin D. W., Wilson W.D. (2000) Specific molecular recognition of mixed nucleic acid sequences: an aromatic dication that binds in the DNA minor groove as a dimmer. Proc. Nat. Ac. Sci. USA, 97, 12-16.

115. Mallena S, Lee M., Bailly C, Neidle S, Kumar A., Boykin D. W., Wilson W.D. (2004) Thiophene-based diamidine forms a "super" AT binding minor groove agent. J. Am. Chem. Soc, 126, 13659-13669.

116. Patrick D.A., Boykin D. W., Wilson W.D., Tanious F.A., Spychala J., Bender B.C., Hall J.E., Dykstra C.C., Ohemeng K.A., Tidwell R.R. (1997) Anti-Pneumocystis carinii pneumonia activity of dicationic carbazoles. Eur. J. Med. Chem., 32, 781-793.

117. Tanious FA., Ding D., Patrick D.A., Tidwell R.R., Wilson W.D. (19970 A new type of DNA minor-groove complex: Carbazole dication-DNA interactions. Biochemistry. 36, 15315-15325.

118. Bailly C, Chaires J.B. (1998) Sequence specific DNA minor groove binders: design and synthesis of netropsin and distamycin analogs. Bioconjug. Chem., 9, 513-538.

119. Reddy B.S.P., Sondhi S.M., Lown J. W. (1999) Synthetic DNA minor groove-binding drugs. Pharmacol. Ther., 84, 1-111.

120. Hou M. H., Wang, A.H.-J. (2005) Mithramycin forms a stable dimeric complex by chelating with Fe(II): DNA-interacting characteristics, cellular permeation and cytotoxicity. Nucleic Acids Res., 33, 1352-1361.

121. Wemmer D.E. (2000) Designed sequence-specific minor groove ligands. Annu. Rev. Biophvs. Biomol. Struct.. 29, 439-461.

122. Chenoweth D.M., Poposki J.A., Marques M.A., Dervan P.B. (2007) Programmable oligomers targeting 5-GGGG-3' in the minor groove of DNA and NF-&B binding inhibition. Bioorg. Med. Chem., 15, 759-770.

123. Chen A. Y., С Yu., Gatto В., Liu L.F. (1993) DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 8131-8135.

124. Lyubimova N. V., Coutlas P. G., Yuen K, Martin R.F. ( 2001) In vivo radioprotection of mouse brain endothelial cells by Hoechst 33342. Brit. J. Radiol., 74, 77-82.

125. Ermishov M., Sukhanova A., Kryukov, E., Grokhovsky S., Zhuze A., Oleinikov V., Jardillier J.-C, Nabiev I. (2000) Raman and surface-enhanced Raman scattering spectroscopy of bis-netropsins and their DNA complexes. Biopolymers, 57, 272-281.

126. Bailly C. (2000) Topoisomerase I poisons and suppressors as anticancer drugs. Curr. Med. Chem.. 7, 39-58.

127. Harris S., Gavathiotis E., Searie M., Orozco M, Laughton C. (2001) Cooperativity in drug-DNA recognition: A molecular dynamics study. J. Am. Chem. Soc, 123, 12658-12663

128. Громыко A.B., Стрельцов C.A., Жузе А.Л. (2004) ДНК-специфичный димерный бисбензимидазол. Биоорган, химия, 30, 446-448.

129. Joubert A., SunX.-W., Johansson E., Bailly C, Mann J., Neidle S. (2003) Sequence- selective targeting of long stretches of the DNA minor groove by a novel dimeric bis-benzimidazole. Biochemistry, 42, 5984-5992.

130. Norden B. (1978) Application of linear dichroism spectroscopy. Applied Spectroscopy Reviews. 14, 157-248.

131. Pommier Y., Johnson A.A., Marchand С (2005) Integrase inhibitors to treat HIV/AIDS. Nat. Rev. Drug Discov., 4, 236-248.

132. Arndt-Jovin D.J., Jovin T.M. (1989) Fluorescence labeling and microscopy of DNA. Methods Cell Biol.. 30, 417-448.

133. Macgregor H.C, Varley J.M. (1983) Working with animal chromosomes. Wiley & Sons.

134. Lin M.S., Comings D.E., Alfi O.S. (1977) Optical studies of the interaction of 4',6- diamidino-2-phenylindole with DNA and metaphase chromosomes. Chromosoma, 60. 15-25.

135. Hilwig L, Gropp A. (1972) Staining of constitutive heterochromatin in mammalian chromosomes with a new fluorochrome. Exper. Cell Res., 75, 122-126.

136. Синтезы органических препаратов. M.: ИЛ. 1953, Т. 4. 46-47.

137. Granier С, Guilard R. (1995) First unequivocal synthesis of 1 or 8-N-monosubstituted 1,4,8,12-tetraazacyclopentadecane. Tetrahedron, 51, 1197-1208.

138. Макаров В.Л., Стрельцов C.A., Венгеров Ю.Ю., Хорлгт А.А., Гурский Г.В. (1983) Пространственная структура комплекса ДНК с олигопептидом - дансилгидразидом тривалина. Молекуляр. биология, 17, 1089-1102.

139. Wells R.D., Larson J.E., Grant R.C., Shortle B.E., Cantor CR. (1970) Physicochemical studies on polydeoxyribonucleotides containing defined repeating nucleotide sequences. J. Mol. Biol., 54, 465-497.

140. LehK, BrodinP., Bischerour J., DeprezE., Tauc P., BrochonJ., LeCam E., Coulaud D., Auclair C, Mouscadet J. (2000) Determinants of Mg2+-dependent activities of recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase. Biochemistry, 39, 9285-9294.

141. Rothfels К.Н., Siminovitch L. (1958) An air-drying technique for flattening chrosomes in mammalian oells grown in vitro. Stain Technol., 33, 73-77.