Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ДНК-диагностика вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) и связь статуса коров по ВЛКРС с генеалогической принадлежностью и уровнем молочной продуктивности

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "ДНК-диагностика вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) и связь статуса коров по ВЛКРС с генеалогической принадлежностью и уровнем молочной продуктивности"

На правах рукописи ВИНОГРАДОВА ИРИНА ВАЛЕРЬЕВНА //

ДНК-ДИАГНОСТИКА ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА (ВЛКРС) И СВЯЗЬ СТАТУСА КОРОВ ПО ВЛКРС С ГЕНЕАЛОГИЧЕСКОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТЬЮ И УРОВНЕМ МОЛОЧНОЙ ПРОДУКТИВНОСТИ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

03.02.07 -Генетика 06.02.07 - Разведение, селекция и генетика сельскохозяйственных животных

005047399 1 ЗЛЕН 2012

Дубровицы - 2012 г.

" ' Л

/

/

005047399

Работа выполнена в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных Государственного научного учреждения Всероссийского научно-исследовательского института животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор, академик РАСХН Зиновьева Наталия Анатольевна

кандидат биологических наук, Гладырь Елена Александровна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Калашникова Любовь Александровна,

ФГУ ВНИИ племенного дела, заведующая лабораторией ДНК-технологий

кандидат биологических наук, Иванова Людмила Александровна, ВНИИ экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко (ВИЭВ), ведущий научный сотрудник лаборатории лейкозологии

Ведущее учрелвдение: ФГБОУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина.

Защита состоится декабря 2012 года, в 10 часов, на заседании совета по

защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.013.03 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии. ;

Адрес института: 142132 Московская область, Подольский район, пос. Дубровицы, ГНУ ВИЖ, т/факс (4967) 65-11-01

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГНУ ВИЖ.

Автореферат разослан «2^» ноября 2012 года.

Ученый секретарь Совета Д 006.013.03 / ' - И.В. Гусев

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Селекция крупного рогатого скота на повышение молочной продуктивности обуславливает развитие у высокопродуктивных коров так называемого метаболического стресса (Clarkson M.J. et al., 1996), следствием которого является нарушение некоторых энергетических процессов в организме, влияющих, в частности, на состояние здоровья (Oltenacu Р.А., Broom D.M., 2010). Ассоциированный с лактацией метаболический стресс оказывает влияние на профиль иммунного ответа высокопродуктивных коров (Kimura К. et al., 1999), что, в свою очередь, приводит к повышению чувствительности к заболеваниям (van Dorp Т.Е. et al., 1998; Heringstad В. et al., 2000, 2007; Ingvartsen K.L., 2003; Калашников B.B. и др., 2011). С ростом молочной продуктивности связывают широкое распространение лейкоза среди молочного скота (Wu М.С. et al., 1989; Pollary F.L. et al., 1992).

Лейкозы животных одни из наиболее распространенных заболеваний, которые встречаются во всех странах мира (Гулюкин М.И., 2004). Применяемая сегодня технология диагностики лейкоза, основанная на реакции иммунной диффузии (РИД), позволяет выявлять носителей вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЖРС), только начиная с 6-и месячного возраста. В связи с этим, актуальным является разработка высокочувствительных тест-систем для ранней диагностики ВЖРС (Гулюкин М.И. и др., 2005; Шаров А.Н., 2006). С другой стороны, высокая степень мутирования вирусов предъявляет особые требования к разработке тест-систем для ДНК-диагностики ВЖРС.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы явилось усовершенствование способов ДНК-диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота и изучение связи ВЖРС-статуса высокопродуктивных коров различных генеалогических линий с уровнем молочной продуктивности.

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Идентифицировать участок ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота, характеризующегося наибольшей консервативностью, на основании мониторинга баз данных последовательностей ДНК.

2. Разработать тест-систему для диагностики ВЖРС методом «гнездовой» ПЦР и выполнить анализ ее специфичности, чувствительности, точности (прецизионности) и воспроизводимости.

3. Изучить связь принадлежности коров к генеалогической линии с инфицированностью ВЖРС.

4. Оценить связь статуса коров по ВЖРС с уровнем молочной продуктивности коров черно-пестрой породы.

5. Усовершенствовать приемы диагностики ВЖРС.

6. Определить генотипы ВЖРС в стаде высокопродуктивных коров черно-пестрой породы.

Научная новизна исследований. Определены консервативные участки ВЖРС как матричные последовательности для отжига праймеров. Изучено влияние номера лактации на инфицированность коров ВЖРС. Выполнено исследование степени инфицированное™ ВЖРС коров с различными продуктивными характеристиками (удой, содержание жира и белка в молоке,

выход молочного жира и белка): «высокими» (более Хср+а), «средними» (в пределах Хср±ст) и «низкими» (менее Хср-а). Выполнен анализ молочной продуктивности коров из разных генеалогических линий в зависимости от статуса по ВЛКРС.

Практическая значимость. Разработана тест-система диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота на основе «гнездовой» ПЦР, характеризующаяся специфичностью более 99,0%, чувствительностью не менее 6,0* 10"3 копий/мкл, точностью (прецизионностью) и воспроизводимостью более 99,0%. Усовершенствованы приемы диагностики ВЛКРС, позволяющие идентифицировать телят-носителей провирусной формы ВЛКРС, начиная с 7-дневного возраста, и коров-носителей с использованием в качестве исходного материала пробы кожи (ушной выщип). Определены генотипы ВЛКРС в стаде высокопродуктивных коров черно-пестрой породы ФГУП «Кленово-Чегодаево».

Апробация работы. Результаты исследований были доложены и обсуждены на международной конференции «ЕС - Россия: 7-я Рамочная программа в области биотехнологии, сельского, лесного, рыбного хозяйства и пищи», г. Уфа: БашГАУ, 2010 г., на научной конференции-школе «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», п. Дубровицы: ВИЖ, 2012 г., на конференциях Центра биотехнологии и молекулярной диагностики животных ПТУ ВИЖ Россельхозакадемии, 2011, 2012 гг.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Тест-система диагностики ВЛКРС, характеризующаяся высокой специфичностью, чувствительностью, точностью и воспроизводимостью.

2. Увеличение доли животных со статусом ВЛКРС+ с увеличением числа лактаций.

3. Достоверное повышение степени инфицированности ВЛКРС с увеличением уровня показателей молочной продуктивности (удой, содержание жира и белка в молоке, выход молочного жира и белка).

4. Усовершенствованные приемы ДНК-диагностики ВЛКРС, позволяющие выявлять телят-носителей, начиная с 10-дневного возраста.

Публикации результатов исследований. Всего по теме диссертационной работы опубликовано 5 работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ («Сельскохозяйственная биология», «Проблемы биологии продуктивных животных», «Достижения науки и техники АПК»).

Структура и объем работы. Диссертация написана на 131 страницах, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы. Диссертационная работа содержит 35 таблиц и 16 рисунков. Список литературы включает 229 источников, в том числе 165 источника на иностранном языке.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводили в лаборатории молекулярной генетики животных Центра биотехнологии и молекулярной диагностики животных

Государственного научного учреждения Всероссийского научно-исследовательского института животноводства Россельхозакадемии в период с 2009 по 2012 гг.

Объектом исследований служили коровы и телята голштинизированной популяции черно-пестрого скота ФГУП «Кленово-Чегодаево». Исследование статуса по ВЖРС проводили у 415 коров, в том числе 382 коров, с законченной 1-й лактацией, 253 коров с законченной 2-й лактацией и 197 коров с законченной 3-й лактацией. Исследуемые животные относились к 7 генеалогическим линиям: Вис Бэк Айдиал (ВБА, п=188), Монтвик Чифтейна (МЧ, п=77), Рефлекшн Совернга (РС, п=128), Силинг Трайджун Рокита (СТР, п=15), Уэс Идеала (п=1), Файн Телике Грейлинд (п=5) и Франса (п=1).

В качестве материала для исследований были использованы пробы крови и данные зоотехнического учета молочной продуктивности коров.

Исследования проводили по схеме, представленной на рисунке 1.

Анализ последовательностей ВЛКРС в Gene Bank

Ж

Идентификация консервативных участков ВЛКРС

□Е

Разработка тест-системы ДНК-диагностики ВЛКРС методом «гнездовой» ГСЦР

Проведение исследовательских

Оценка результативности тест-системы

Ранняя диагностика ВЛКРС в крови

телят с 10 дн. возраста, п=222

Применение проб кожи в качестве исходного материала

испытании 31

>ч

СГ

оэ

Генотипир ование ВЛКРС по гену env

Степень инфицированности ВЛКРС коров черно_ пестрой породы (п=41 5)

Номер лактации

Уровень молочной продуктивности

о

+

о. о

л'

'i t. а:

e=t о.

я-х

>£ о

S 8-S £ Ш V

Принадлежность к генеалогической линии

Рис. 1. Схема исследований

В проведении исследований было использовано оборудование Центра коллективного пользования «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии.

Идентификацию консервативных участков последовательности ВЛКРС проводили на основании анализа последовательностей, имеющихся в генном банке (www.ncbi.nlm.nih.gov).

Выделение ДНК из проб крови крупного рогатого скота проводили с помощью колонок фирмы Nexttec (Германия) и с использованием набора реагентов для выделения ДНК Diatom™ DNA PreplOO.

Для создания выборки референтных образцов исследовали животных, положительных по результатам РИД и гематологических исследований, общим количеством 30 голов с использованием подхода, предложенного Beier D. с соавторами (2001).

Разработку тест-системы осуществляли на основе использования метода «гнездовой» ПЦР. Праймеры подбирали к наиболее консервативным участкам генома ВЛКРС. При разработке программ и методик исследовательских испытаний тест-системы учитывали требования ГОСТ 15.101.98 «Порядок выполнения научно-исследовательских работ» и ГОСТ 24026-80 «Исследовательские испытания». Разработку проекта инструкций по применению тест-системы проводили с учетом требований ГОСТ Р 51088-97. Оценку тест-системы установленным требованиям проводили по следующим параметрам: (1) специфичность - способность выявлять носителей вне зависимости от типа провирусной ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота; (2) чувствительность - способность выявлять определенное число копий провирусной ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота; (3) точность (прецизионность) - совпадение результатов исследований реферетных образцов; (4) воспроизводимость - совпадение результатов при повторных исследованиях.

Проведение ПЦР осуществляли согласно «Методическим рекомендациям ...» (Зиновьева H.A. и др., 1998). По результатам ПЦР-анализа особям присваивали статус BJIKPC+ (носители) или ВЛКРС" (не носители).

Генотипирование ВЛКРС проводили методом ПЦР-ПДРФ анализа с применением рестрикционных ферментов Ksp22I (Bell), PvuII и BamHI, используя тест-систему, разработанную Beier D. с соавторами (2001).

Показатели молочной продуктивности (удой за 305 дн. лактации, кг; содержание жира и белка в молоке, %) определяли согласно данным зоотехнического учета; выход молочного жира и белка (кг) вычисляли, умножая величину удоя (кг) на содержание, соответственно, жира и белка в молоке (%) и деля это значение на 100. В зависимости от полученных значений коров разделяли на три группы: с низкой (менее среднего значения за вычетом стандартного отклонения - <Хср-и), средней (в пределах стандартного отклонения от среднего - XepiCT) и высокой (превышение среднего более чем на стандартное отклонение - >Хср.+ст) продуктивностью.

Статистическую обработку данных зоотехнического учета проводили по стандартным методикам (Меркурьева Е.А. и др., 1991) на основании сравнения коэффициента достоверности со значениями по таблице Стьюдента с использованием программного обеспечения MS Excel.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Разработка тест-системы диагностики вируса лейкоза крупного

рогатого скота методом «гнездовой» ПЦР 3.1.1. Выбор и обоснование метода, лежащего в основе тест-системы

Анализ последовательностей ВЛКРС, представленных в генном банке, позволил выявить 190 последовательностей ВЛКРС различной длины со степенью гомологии (сходства) с базовой последовательностью (№ АР257515.1) от 93 до 100%. Проведенный анализ показал наибольшую степень консерватизма последовательности гена ет. Более детальные сравнительные исследования позволили выявить консервативные участки гена ет, которые послужили матрицей для отжига праймеров при разработке тест-системы диагностики ВЛКРС.

Нами были разработаны требования к тест-системе, которые включали следующие характеристики и их параметры: (1) специфичность: должна быть способна выявлять носителей вне зависимости от типа ВЛКРС; должна быть протестирована на австралийском и бельгийском типах вируса; (2) чувствительность: должна обеспечивать выявление менее 104 копий/мл'ДНК ВЛКРС; (3) точность (прецизионносать): не менее 99%; должна быть оценена на референтных образцах; (4) воспроизводимость: совпадение результатов при повторных исследованиях не менее 99%.

В результате проведенных исследований нами были разработаны два варианта технических решений тест-системы, из которых по результатам проведенных исследовательских испытаний был выбран один (рис. 2).

515 п.о.

^-- 241 п.о. -?

Примечание: первая и последняя позиции амплифицируемых фрагментов указаны согласно Gene Bank Accession No. AF033818; длины амплифицируемых фрагментов указаны в парах оснований (п.о.); фрагмент длиной 515 п.о. является результатом амплификации ПЦР-1; фрагмент длиной 241 п.о. является результатом амплификации ПЦР-2.

Рис. 2. Схема тест-системы для выявления провирусной ДНК ВЛКРС методом «гнездовой» ПЦР Результаты проведенных исследовательских испытаний показали соответствие оцениваемых характеристик установленным требованиям: установлена способность тест-системы выявлять австралийский и бельгийский типы вируса, чувствительность составила 6*10-3 копий/мл, показано 100% совпадение результатов исследований референтных образцов; выявлено 100% совпадение результатов повторных исследований 30 образцов.

В ходе выполнения диссертационной работы нами созданы экспериментальные образцы тест-системы в количестве 20 наборов, которые были использованы для проведения исследований по теме диссертации.

3.2. Изучение статуса коров по ВЛКРС в зависимости от генеалогической принадлежности и уровня молочной продуктивности

Характеристика уровня молочной продуктивности коров изучаемой выборки и по генеалогическим линиям приведена в таблицах 1, 2.

Табл. I. Уровень молочной продуктивности коров изучаемой выборки

Лактация Число голов, п Удой, кг Жир, % Молочный жир, кг Белок, кг Молочный белок, кг

1-я 382 6079±52 3,99±0,02 243,0±2,5 3,13±0,01 189,9±1,7

2-я 253 6527±80 4,05±0,02 264,5±3,7 3,24±0,01 211,0±2,5

3-я 197 6712±85 4,09±0,02 274,6±3,9 3,27±0,01 218,9±2,7

Табл. 2. Уровень молочной продуктивности и живой вес коров различных

генеалогических линий__

Линия Число голов, п Удой, кг Жир, % Молочный жир, кг Белок, % Молочный белок, кг

1-я лактация

ВБА 175 6072±74 3,97±0,03 241,3±3,7 3,12±0,01 189,3±2,3

МЧ 76 5868±108 3,95±0,04 232,3±5,1 3,12±0,02 182,7±3,4

РС 110 6182±107 4,07±0,04 251,6±5,0 3,15±0,02 194,3±3,4

СТР 15 6549±271 3,85±0,07 253,0±12,9 3,14±0,03 205,6±8,6

ФТГ 5 5973±351 4,07±0,07 242,0±10,7 3,07±0,08 183,3±11,4

2-я лактация

ВБА 110 6771±116 4,02±0,04 272,2±5,9 3,23±0,02 216,2±3,4

МЧ 52 5898±185 4,16±0,04 245,3±8,2 3,32±0,03 195,5±6,2

РС 75 6753±142 4,03±0,04 272,3±6,4 3,21±0,02 216,3±4,4

СТР 10 6307±242 4,01±0,09 254,2±13,1 3,24±0,05 205,3±10,1

ФТГ 5 6343±662 4,05±0,12 256,9±28,2 3,24±0,07 203,7±18,3

3-я лактация

ВБА 83 6807±124 4,09±0,04 278,7±6,1 3,27±0,02 222,5±4,0

МЧ 41 6132±206 4,17±0,06 255,6±9,3 3,28±0,03 200,9±7,0

РС 59 6982±152 4,04±0,04 281,8±6,6 3,25±0,02 226,5±4,7

СТР 8 6561±251 4,05±0,08 265,0±9,9 3,34±0,07 218,5±8,4

ФТГ 5 7131±328 4,19±0,10 299,0±14,7 3,16±0,07 225,8±11,9

3.2.1. Связь линейной принадлежности коров с инфицированностью

вирусом лейкоза

Результаты анализа распределения носителей ВЛКРС среди коров различных генеалогических линий представлены в таблице 3.

Табл. 3. Распределение доли носителей ВЛКРС среди коров различных __генеалогических линий

Генеалогическая линия Исследовано коров, п В т.ч. ВЛКРС «+»

п %

ВБА 188 55 29,3±3,3

МЧ 77 25 32,5±5,3

PC 128 33 25,8±3,9

СТР 15 5 33,3±12,1

ФТГ 5 1 20,0±18,2

Как следует из данных таблицы 3, наименьшая степень инфицированности коров ВЖРС отмечена у коров линии ФТГ (20,0±18,2%) наибольшая - у коров линий МЧ (32,5±5,3) и СТР (33,3±12,1).

3.2.2. Связь статуса по ВЛКРС с уровнем молочной продуктивности коров

Анализ распространения носителей ВЖРС среди коров различных лактаций (рис. 3) показал увеличение доли коров, имеющих положительный статус по ВЖРС, с увеличением номера лактации. Так, доля носителей ВЖРС среди коров с законченной 2-й лактацией была выше на 4,3%, а среди коров с законченной 3-й лактацией - выше на 7,6% по сравнению с группой коров с законченной 1-й лактацией.

Проведенный корреляционный анализ показал наличие ряда корреляционных зависимостей между инфицированностью коров ВЖРС и показателями молочной

продуктивности. Так, отмечена слабая положительная корреляция между статусом по ВЛКРС и уровнем удоя (р<0,99), количеством молочного жира (р<0,995) и белка (р<0,95).

Проведенные исследования не выявили достоверных различий между статусом коров по ВЛКРС и их принадлежностью к генеалогической линии. Таким образом, анализ связи уровня продуктивности со статусом коров по ВЛКРС проводили на всей выборке без учета линейной принадлежности коров.

1 -я л акт. 2-ялакт. 3-ялакт. ЕШ Доля носителей ВЛКРС по

лактациям, % -•-Доля носителей ВЛКРС в среднем по стаду, %

Рис. 3. Распределение доли носителей ВЛКРС в группах коров разных лактаций

Характеристика продуктивных показателей коров 1-й лактации в группах с различным уровнем показателей молочной продуктивности приведена в таблице 4.

Табл. 4. Характеристика продуктивных показателей коров 1-й лактации в

группах с различным уровнем признаков молочной продуктивности

Показатель Продуктивные показатели коров в группах

«низкий» «средний» «высокий»

(<(Хсп-о)), Х™±а >(Х.п+о)

Удой, кг1 4569±50"* 6053±33"" 7731±68"'

Число голов, п 59 265 58

Жир, % 3,90±0,04' 4,01±0,03* 4,02±0,04'

Молочный жир, кг 178,0±2,7" 242,5±2,0"' 311,3±4,9"

Белок, % 3,13±0,02 3,13±0,01 3,10±0,02

Молочный белок, кг 142,6±1,7"' 189,6±1,2"' 239,7±2,4"'

Жир, %' 3,45±0,01"' 3,98±0,0Г* 4,61±0,02"*

Число голов, п 67 253 58

Удой, кг 5918±97 6130±69 6004±116

Молочный жир, кг 204,4±3,5 244,4±2,9*" 278,2±5,8"

Белок, % 2,97±0,01"' 3,15±0,01*" 3,21±0,03"*

Молочный белок, кг 176,2±3,0"' 192,7±2,Г" 192,7±3,6*"

Молочный жир, кг1 173,1±1,7"' 242,2±1,7*" 318,6±3,8"*

Число голов, п 63 258 61

Удой, кг 4709±62*" 6091±41*" 7440±99"'

Жир, % 3,69±0,03"' 3,99±0,02'" 4,30±0,04"'

Белок, % 3,06±0,02 3,15±0,01 3,12±0,02

Молочный белок, кг 143,8±1,6"* 191,4±1,3"' 231,5±3,3'"

Белок, %' 2,88±0,01*" 3,12±0,0Г" 3,42±0,01"*

Число голов, п 60 264 58

Удой, кг 6093±131 6131±64" 5824±116'

Жир, % 3,74±0,06"' 3,99±0,02"' 4,30±0,04"'

Молочный жир, кг 228,7±6,6 245,0±3,0 247,5±3,6

Молочный белок, кг 176,0±3,8 191,1±2,0 199,3±4,0

Молочный белок, кг1 143,1±1,4"" 190,0±1,0" 241,9±1,9*"

Число голов, п 68 253 61

Удой, кг 4694±57"" 6076±36"' 7634±77"*

Жир, % 3,82±0,04'" 4,02±0,02"' 4,06±0,04'"

Молочный жир, кг 178,8±2,6"' 243,9±1,9" 310,9±4,6"'

Белок, % 3,06±0,02**-*** 3,13±0,01" 3,17±0,02'"

Примечание: 'анализируемый признак, на основании которого проводили отнесение коров к группе; 'р<0,99, р<0,995, р<0,999

Как следует из данных таблицы 4, сформированные группы коров достоверно различались по анализируемым признакам (р<0,999). Кроме того, группа коров с «низким» уровнем удоя достоверно отличалась по содержанию жира в молоке от групп со «средним» и «высоким» удоями (-0,11 и -0,12% абс., соответственно, р<0,99). Как следствие достоверных различий в уровне удоя, отмечена достоверная разница в количестве молочного жира (р<0,999) и белка

ю

(р<0,999). Анализируя продуктивные показатели групп коров с различным содержанием жира в молоке, следует отметить так же их достоверные отличия по выходу молочного жира (р<0,999). Кроме того, у коров с «низким» содержанием жира в молоке по сравнению с другими группами отмечено достоверное более низкое содержание белка в молоке (р<0,999) и, как следствие, более низкий выход молочного белка (р<0,999). Анализ продуктивных показателей групп коров с различным выходом молочного жира (р<0,999), показывает, что эти отличия были обусловлены, как разницей в уровне удоя (р<0,999), так и содержания жира в молоке (р<0,999). Кроме того, достоверная разница в уровне удоя между группами при незначительных различиях в содержании белка обуславливала достоверную разницу в выходе молочного белка (р<0,999). Группы коров, отличающиеся по содержанию белка в молоке (р<0,999), так же достоверно различались по содержанию жира в молоке (р<0,999). Вышеназванные отличия при отсутствии существенной разницы в уровне удоя между группами обуславливали достоверные различия в выходе молочного белка и жира, при этом группы коров с более высоким выходом молочного белка (р<0,999) характеризовались более высоким выходом молочного жира (р<0,95). Анализ уровня молочной продуктивности в группах коров с различным выходом молочного белка (р<0,999) показывает, что эти отличия были обусловлены, в большей степени, разницей в уровне удоя (р<0,999). Различия в уровне удоя, а так же достоверно меньшее содержание жира в молоке в группе коров с «низким» выходом молочного белка обуславливали достоверную разницу в выходе молочного жира между группами (р<0,999). Аналогичные закономерности отмечены при сравнении групп коров с «высоким», «средним» и «низким» уровнем продуктивности 2- и 3-й лактаций (данные в автореферате не приведены).

Распределение носителей ВЛКРС в группах коров с различным уровнем молочной продуктивности приведено в таблице 5.

Табл. 5. Распределение носителей ВЛКРС в группах коров 1-й лактации с различным уровнем молочной продуктивности

Показатель

Удой, кг

Хер

6079

1019

Распространение носителей ВЖРС, %

«низкии»

16,9*4,9'

«средний»

29,4±2,8

«высокий»

>(Хс,+°)

36,2±6,3

Жир, %

Молочный жир, кг

3,99

0,39

19,4*4,8

243,0

Белок, %

Молочный белок, кг

3,13

48,8

12,7*4,2

30,4*2,9

30,6*5,9

0,18

189,9

32,3

21,7*5,3

31,0*2,9

34,4*6,1

17,6*4,6'

30,7*2,8

25,9*5,8

тгтг

30,3*2,9

32,8*6,0*

Примечание: р<0,95, "р<0,98, "'р<0,995, ""р<0,999 Как следует из данных таблицы 5, наблюдается на 9,0-21,7% достоверно более высокая степень инфицированности коров 1-й лактации ВЛКРС со «средним» и «высоким» уровнем продуктивности по сравнению с группами коров с «низким» уровнем продуктивности. Анализируя полученные данные в аспекте отдельных продуктивных показателей, следует отметить, что

наибольшие различия выявлены между группами коров с различным выходом молочного жира: доля коров со статусом ВЛКРС «+» в группе с «низким» выходом молочного жира была ниже на 18,3% (р<0,999) по сравнению с группой коров со «средним» выходом молочного жира и ниже на 21,7% (р<0,999) по сравнению с группой коров с «высоким» выходом молочного жира. Достоверных различий в степени инфицированности ВЛКРС между группами коров с различным содержанием белка в молоке выявлено не было, в то время как по показателю выхода молочного белка отмечена на 12,7% (р<0,98') и 15,2% (р<0,95) меньшая доля носителей ВЛКРС в группе коров с «низким» выходом белка по сравнению с группами со «средним» и «высоким» выходом молочного белка, соответственно. По всей видимости, показатель выхода молочного жира наиболее полно отражает различия между группами в «весе» метаболического груза и, как следствие, в степени метаболического стресса. Выявленные закономерности, в большинстве случаев, сохранялись для коров 2-й и 3-й лактаций (рис. 4).

Как показано на рисунке 4, доля носителей ВЖРС в группе коров с «низким» уровнем удоя была ниже на 11,6, 7,0 и 6,0% абс. у коров 1-, 2- и 3-й лактаций соответственно, а в группе коров с «высоким» уровнем удоя - выше среднего значения данного показателя у коров соответствующих лактаций лактаций на 7,7, 7,2 и 1,4% абс. Анализ данных в аспекте содержания жира в молоке и выхода молочного жира показывает, что доля вирусоносителей с «низким» уровнем продуктивных показателей была ниже по содержанию жира в молоке на 9,1, 15,4 и 17,1% абс. и выходу молочного жира - на 15,8, 17,2 и 10,0% абс. Различия между группами коров с различным содержанием белка в молоке по степени распространения ВЛКРС были наименее выражены. Использование в качестве критерия показателя выхода молочного белка не выявило однозначных зависимостей у коров различных лактаций. Так, если по результатам анализа коров 1- и 2-й лактаций отмечалась тенденция повышения доли носителей ВЖРС с увеличением выхода молочного белка, то у коров 3-й лактации данная тенденция не прослеживалась. Приведенные выше данные подтверждают, что состояние метаболического стресса, в большей степени, определяется повышенным синтезом молочного жира. Анализ данных в аспекте отдельных лактаций показывает, что с увеличением числа лактаций наблюдается снижение различий между группами по степени инфицированности ВЛКРС, что может быть вызвано повышением среднего уровня продуктивных показателей, и, как следствие, повышением доли коров, находящихся в состоянии метаболического стресса в т.ч. в группе с «низким» уровнем продуктивности.

20 15 10 5 0 -5 -10 -15 -20

А. Удой, кг

7-

.-I И.8 .7)0 .7,2-

-0,3

11.fi

20 15 10 5 0 -5 -10 -15 -20

В. Мол, жир, кг

5,95Х

—гМг

83

15.8

о,:

-10,0

-17,2

20 15 10 5 О -5 -10 -15 -20

Д. Мол, белок, кг

10,4

"■ЗиГ 3и

-0.5

-10,9

-9,5

-12,8

20 15 10 5 0 -5 -10 -15 -20

Г. Белок

9,4

■

4 0,4 -0,4

-¿,Ь '''-3,7

1 2 3

Примечание: ось X - номер лактации; ось У - отклонение (+/-) степени инфицированности ВЛКРС коров от среднего значения по всей выборке коров соответствующих лактации; си - группа коров с

«низким» (менее Хср-а) уровнем продуктивных показателей; ЩИ -группа коров со «средним» (в пределах Хср±а) уровнем продуктивных показателей; ша - группа коров с «высоким» (более Хср+а) уровнем продуктивных показателей.

Рис. 4. Различия (+/-) в степени инфицированности коров ВЛКРС в группах с различным уровнем продуктивных показателей по сравнению со средним значением у коров соответствующих лактаций

Учитывая влияние генеалогической линии на уровень молочной продуктивности коров, нами был проведен анализ продуктивных показателей коров с различным статусом по ВЛКРС внутри генеалогических линий, при

этом в анализе были использованы три линии, представленные наибольшим числом голов: Вис Бэк Айдиала, ВБА (п=175), Монтвик Чифтейна, МЧ (п=76) и Рефлекшн Совернга, РС (п=110) (табл. 6).

Табл. 6. Молочная продуктивность коров 1-й лактации различных генеалогических линий в зависимости от статуса по ВЛКРС

Генеалогическая линия Уровень молочной продуктивности в группах коров с различным статусом по ВЛКРС

ВЛКРС «+» ВЛКРС «-»

п хса±м. п

Удой, кг ВБА 50 6233±125 125 6008±90

МЧ 24 6074±158 52 5774±140

РС 29 6506±219 81 6066±120

Жир, % ВБА 50 4,05±0,06 125 3,93±0,04

МЧ 24 4,11±0,07"' 52 3,88±0,04"'

РС 29 4,00±0,08 81 4,09±0,04

Мол. жир, кг ВБА 50 251,9±5,7* 125 237,1±4,6*

МЧ 24 250,0±8,2" 52 224,2±6,1"

РС 29 261,2±11,5 81 248,2±5,3

Белок, % ВБА 50 3,15±0,02 125 3,11±0,02

МЧ 24 3,12±0,03 52 3,12±0,02

РС 29 3,08±0,03 81 3,17±0,02

Мол. белок, кг ВБА 50 195,6±3,7 125 186,8±2,9

МЧ 24 189,0±4,8 52 179,7±4,4

РС | 29 200,0±6,8 81 192,3±3,9

Примечание: р<0,05, р<0,02, р<0,01

Как следует из данных таблицы 6, наблюдается тенденция повышения большинства продуктивных показателей (уровня удоя, содержания жира в молоке, выхода молочного жира и белка) у коров 1-й лактации - носителей ВЛКРС. Наиболее выраженные различия отмечены по показателю выхода молочного жира на 14,8, 25,8 и 13,0 кг в линиях ВБА (р<0,05), МЧ (р<0,02) и РС, соответственно. Это еще раз подтверждает, что показатель выхода молочного жира в наиболее полной мере характеризует степень метаболического стресса, обусловленного лактацией. Аналогичные тенденции наблюдались и при анализе коров 2- и 3-й лактаций.

Таким образом, приведенные нами данные убедительно показывают связь статуса по ВЛКРС с уровнем молочной продуктивности коров 1-3 лактаций: с увеличением уровня удоя, содержания жира в молоке и выхода молочного жира и белка наблюдается повышение степени инфицированности коров ВЛКРС, что, по всей видимости, связано с изменениями в иммунном статусе высокопродуктивных коров вследствие метаболического стресса, обусловленного лактацией.

3.3. Усовершенствование приемов диагностики вируса BJIKPC

В настоящее время разработанные программы оздоровления стад от лейкоза основаны на как можно более раннем выявлении носителей ВЛКРС и их отделении от не носителей. С другой стороны, встает задача оптимизации отбора проб для исследований, так как взятие крови у животных сопряжено со стрессом, что может привести к снижению уровня молочной продуктивности.

Проведенные нами в рамках выполнения диссертационной работы исследования были направлены, с одной стороны, на разработку метода ранней диагностики ВЛКРС, с другой стороны, - на оценку возможности использования проб ткани уха, отобранных и законсервированных с использованием системы TypiFix™, как исходного материала для диагностики ВЛКРС.

С применением разработанной на этапе 3.1. тест-системы «гнездовой» ПЦР было исследовано 222 головы телят, рожденных от матерей-вирусоносителей в период одного календарного года. ПЦР-диагностику выполняли начиная с возраста 10 дней до 6 мес. с интервалом в 15 дней для выявления вектора развития напряженности вирусного процесса. До получения результатов первого тестирования телята содержались индивидуально. В сформированных по результатам анализа группах ПЦР «негативных» и ПЦР «положительных» животных проводили мониторинг частоты встречаемости ВЛКРС (табл.7).

Табл. 7. Использование гнездовой ПЦР для ранней диагностики ВЛКРС

Статус ВЛКРС

ПЦР+ ПЦР-

Всего, проб ПЦР+, %

10 дн.

42 180 222 18,92

0,6-1

25 83 108 23,15

1,5-2

Возраст, мес.

21 108 129 16,28

2,5-3

13 70 83 15,66

3,5-4

47 53 11,32

4,5-5 1

34

35 2,86

5,5-6

_1_

11 12 8,33

Итого, тестов 109 533 642 16,98

Анализ полученных результатов (табл. 7) показал эффективность использования разработанной тест-системы «гнездовой» ПЦР для выявления вирусоносителей среди телят 10-и дневного возраста, доля которых составила 18,92%.

Сравнение эффективности выявления носителей ВЛКРС с использованием разных диагностических приемов показало (табл. 8), что наибольшее количество инфицируемых животных диагностируется при комплексном подходе, основанном на использовании результатов РИД и ПЦР диагностики методом «гнездовой» ПЦР двух видов проб - крови и ушного выщипа. Так, при проведении только ПЦР диагностики доля выявленных вирусоносителей находится на уровне 37,5-62,5 % от числа РИД-позитивных животных. Объединение информации, получаемой с применением двух взаимодополняющих подходов (РИД и ПЦР), позволяет повысить процент выявляемых вирусоносителей на 18,8-31,3% от выявляемых только методом

Табл. 8. Эффективность комплексных подходов в диагностике ВЛКРС

Результат ВЛКРС+, гол. % от РИД +

Совпадение по трем системам: 2 12,5

РИД+ 16 100,0

ПЦР+(ткань) 6 37,5

ПЦР+ (кровь) 10 62,5

Суммарно РИД+ПЦР( кровь) 19 118,8

Суммарно РИД+ПЦР( кровь)+ПЦР (ткань) 21 131,3

Результаты генотипироваиия ВЛКРС приведены в таблице 9. Табл. 9. Распределение коров-носителей по типам ВЛКРС

Показатель Число голов %

Исследовано коров-носителей в т. ч. по типам ВЛКРС: 30 100,0%

Бельгийский тип 12 40,0

Австралийский тип 17 56,7

Бельгийский + австралийский типы 1 3,3

Как показано в таблице 9, доля коров, инфицированных австралийским типом вируса, составила 56,7% от общего числа животных-носителей, подтвержденных методами РИД и ПЦР. У восьми коров, находящихся на гематологической стадии заболевания лейкозом, установлено наличие изучаемых типов ВЛКРС, как австралийского, так и бельгийского, в соотношении 1:1. Выявлена тенденция возрастания процента инфицированности бельгийским типом ВЛКРС у коров черно-пестрой породы с 40 до 50 % при переходе заболевания в гематологическую стадию. Данный факт, вероятно, говорит о менее травматическом воздействии вируса бельгийского типа на организм хозяина, что позволяет животному сохранять полноценную воспроизводительную и молочную функции. Одно животное было инфицировано смешанной инвазией двух типов вируса одновременно.

4. ВЫВОДЫ.

1. Предложена тест-система диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), основанная на методе «гнездовой» ПЦР фрагмента гена ет. По результатам проведенных исследовательских испытаний показано соответствие оцениваемых характеристик установленным требованиям: показана способность тест-системы выявлять австралийский и бельгийский типы вируса, чувствительность составила 6* 10"3 копий/мл, показано 100% совпадение результатов исследований референтных образцов; выявлено 100% совпадение результатов повторных исследований 30 образцов.

2. Показано увеличение степени инфицированности коров вирусом лейкоза с увеличением числа лактаций. Исследование статуса по ВЛКРС 382

коров 1-й лактации, 253 коров 2-й лактации и 197 коров 3-й лактации показало увеличение доли коров носителей BJIKPC с 28,5% у коров 1-й лактации до 36,1% у коров 3-й лактации.

3. Установлена на 9,0-21,7% достоверно более высокая степень инфицированности коров 1-й лактации BJIKPC со «средним» (в пределах Хср±0) и «высоким» (более Хср+а) уровнем продуктивных показателей (удой, содержание жира и белка в молоке, выход молочного жира и белка) по сравнению с группами коров с «низким» (менее Хср-а) уровнем продуктивности. Выявлены наибольшие различия между группами коров с различным выходом молочного жира (18,3-21,7%, р<0,999). Установленные закономерности, в большинстве случаев, сохранялись для коров 2-й и 3-й лактаций.

4. Установлена тенденция повышения большинства продуктивных показателей (уровня удоя, содержания жира в молоке, выхода молочного жира и белка) у коров различных генеалогических линий со статусом BJIKPC «+» по сравнению BJIKPC «-».

5. Показана результативность разработанной тест-системы на основе «гнездовой» ПЦР в выявлении носителей BJIKPC у телят, начиная с 10-и дневного возраста. Исследование 222 телят выявило 18,92% носителей BJIKPC.

6. Показано, что применение комплексного подхода, основанного на использовании РИД и ПЦР-анализа двух видов проб (крови и ткани уха), повышает результативность идентификации носителей ВЛКРС на 18,8-31,3% от числа выявляемых только методом РИД.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Лабораториям молекулярно-генетической экспертизы и ветеринарным диагностическим лабораториям рекомендуем использовать разработанную нами тест-систему «гнездовой» ПЦР для проведения ранней диагностики телят на носительство вируса лейкоза крупного рогатого скота, начиная с 10-и дневного возраста, и в качестве элемента комплексного подхода для повышения результативности выявления коров-носителей ВЖРС.

Список опубликованных работ по теме диссертации

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Виноградова, И.В. Сравнительная оценка результативности РИД и ДНК-диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота / Виноградова И.В., Гладырь Е.А., Зиновьева H.A. // Проблемы биологии продуктивных животных - 2011, JVb 1. - С.15-16.

2. Виноградова, И.В. Геногеографические исследования вируса лейкоза крупного рогатого скота / Виноградова И.В., Гладырь Е.А., Ковалюк Н В Петропавловский И.М., Донник И.М., Эрнст Л.К., Зиновьева H.A. // Достижения науки и техники АПК.- 2011, JY° 10,- С. 34-37.

3. Гладырь, Е.А. Молочная продуктивность коров в зависимости от инфицированности вирусом лейкоза и генотипа по BOLA-DRB3 / Гладырь Е.А.,

Зиновьева H.A., Быкова A.C., Виноградова И.В., |Эрнст JI.K] // Достижения науки и техники АПК,- 2012, № 8.- С. 46-48.

4. Зиновьева H.A. Распространение вируса лейкоза крупного рогатого скота у коров черно-пестрой породы с различным уровнем молочной продуктивности / Зиновьева H.A., Гладырь Е.А., Виноградова И.В., Молофеева Л.А., Михайлова М.Е. Эрнст Л.К. // Сельскохозяйственная биология, 2012, № 6, с. 49-55.

Статьи в других изданиях

5. Виноградова И.В. Применение различных молекулярно-генетических методов диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота / Виноградова И.В., Гладырь Е.А., Зиновьева H.A. II В сборнике Международной конференции «ЕС - Россия: 7-я Рамочная программа в области биотехнологии, сельского, лесного, рыбного хозяйства и пищи», г. Уфа: БашГАУ, 29 сент. - 5 окт. 2010 г., с. 75-77.

Издательство ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии Тел. (4967)65-13-18 (4967)65-15-97

Сдано в набор 22.11.2012. Подписано в печать 23.11.2012. Заказ № 60. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз.

Отпечатано в типографии ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Виноградова, Ирина Валерьевна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Геном вируса лейкоза крупного рогатого скота.

2.2. Лейкоз крупного рогатого скота.

2.3. Распространение вируса лейкоза крупного рогатого скота в Российской Федерации и за рубежом.

2.4. Методы диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота.

2.5. Генотипирование вируса лейкоза крупного рогатого скота

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Объекты и материалы исследований.

3.2. Материально-техническое обеспечение исследований.

3.3. Методы исследований.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Разработка тест-системы диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота методом «гнездовой» ПЦР.

4.1.1. Выбор и обоснование метода, лежащего в основе тест-системы.

4.1.2. Состав тест-системы для диагностики ВЛКРС.

4.1.3. Разработка программы и методики исследовательских испытаний.

4.1.4. Проведение исследовательских испытаний тест-системы.

4.1.5. Создание экспериментальных образцов тест-системы.

4.1.6. Разработка проекта инструкции по применению тест-системы.

4.2. Изучение ВЛКРС-статуса коров в аспекте генеалогической структуры стада и уровня молочной продуктивности.

4.2.1. Влияние принадлежности коров к генеалогической линии на инфицированность вирусом лейкоза.

4.2.2. Изучение связи статуса по ВЛКРС на уровень молочной продуктивности коров.

4.3. Усовершенствование приемов диагностики ВЛКРС.

4.3.1. Оценка результативности тест-системы для ранней диагностики ВЛКРС в крови телят.

4.3.2. Оценка результативности тест-системы при использовании проб кожи в качестве исходного материала

4.4. Генотипирование вируса лейкоза крупного рогатого скота

5. ВЫВОДЫ.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

7. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "ДНК-диагностика вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) и связь статуса коров по ВЛКРС с генеалогической принадлежностью и уровнем молочной продуктивности"

Лейкозы животных одни из наиболее распространенных заболеваний, которые встречаются во всех странах мира (Гулюкин М.И., 2004 г.). Массовое распространение вируса лейкоза (BJIKPC) в молочных стадах крупного рогатого скота представляет сегодня огромную проблему в молочном скотоводстве (Кузнецов А.П., Никитин И.Н., 1993, Кузин А.И., Закрепина E.H., 1997, Shanks R.D. et al., 1993, Yang D., 1993). Экономический ущерб, причиняемый лейкозом хозяйству, является следствием снижения количества и качества продукции, преждевременного падежа или вынужденной выбраковки и убоя больных животных, затрат на обеззараживание молока (пастеризацию, так как сырое молоко от зараженных животных запрещено использовать для питания людей), недополучения молодняка, потери его племенной ценности и ограничения в реализации, запрета на племенную продажу скота, затрат на проведение противолейкозных мероприятий (Гулюкин М.И., 2005, Ковалюк Н.В. и др., 2006; Смирнов П.И. , 2007). Применяемая сегодня технология диагностики лейкоза, основанная на реакции иммунной диффузии (РИД) позволяет выявлять вирусоносителей, только начиная с 6-и месячного возраста. В силу особенностей инфекционного процесса лейкоза диагностика его серологическими методами исследования не позволяет одномоментно выявить всех инфицированных животных, что приводит к практически неконтролируемому распространению заболевания у телят и существенно повышает процент вирусоносителей.

В связи с этим, актуальным является разработка высокочувствительных тест-систем для ранней диагностики по выявлению провируса лейкоза крупного рогатого скота не только в крови взрослых животных, но и в крови телят раннего постнатального развития.

По данным Гулюкина М.И. с соавторами (2005) и Шарова А.Н. (2006) известно, что метод ПЦР выявляет до 16% животных, зараженных вирусом лейкоза среди РИД-негативных животных, а число зараженных телят достигает до 11,6%. Кроме того, высокая чувствительность метода ПЦР позволяет использовать его для рекогносцировочных исследований путем определения возбудителя в сборном молоке (Сюрин В.Н. и др., 2000, Kuckleburg et al., 2003).

Довольно часто выявляется несоответствие результатов ПЦР и РИД. ПЦР-позитивные особи выявляются среди РИД-отрицательных животных, а ПЦР-негативные - среди РИД-позитивных (Макаров В.В., Гринишин Д.П., 2005). Вполне вероятно, что, несмотря на очень высокую чувствительность ПЦР, в развитии лейкозного процесса бывают такие периоды, когда уровень провирусной ДНК минимален. Постепенно выводя из стада РИД-позитивных животных, теоретически возможно добиваться полного оздоровления хозяйства от лейкоза, но, тем не менее, в оздоровленных стадах, не имевших контактов с другими, через несколько месяцев, или даже лет, выделяют животных с антителами к ВЛКРС. Это можно объяснить характерным для лейкоза явлением иммунологической толерантности, когда наблюдают вирусоносительство без антителообразования, или уровень антител, находится ниже порога чувствительности РИД (Beier D. et al., 1992, Blankenstein P. et al., 1998).

Проводимая в течение ряда поколений селекция коров на повышение уровня молочной продуктивности обуславливает изменения в статусе здоровья животных (Oltenacu P.A., Broom D.M., 2010). Рост молочной продуктивности ведет к перераспределению в организме доступной энергии, увеличивая долю ее использования на синтез молока. Это приводит к отрицательному балансу энергии, для покрытия которого используются резервы организма, что, в свою очередь, ведет к потере части кондиций. Повышенная нагрузка на организм высокопродуктивных коров вследствие синтеза и секреции молока получила название метаболического груза, а обусловленное метаболическим грузом нарушение некоторых энергетических процессов в организме, влияющих, в частности, на воспроизводство и состояние здоровья, получило название метаболического стресса (Clarkson M.J. et al., 1996). Метаболический стресс, ассоциированный с лактацией, оказывает влияние на профиль иммунного ответа, что было подтверждено данными Kimura К. с соавторами (2002), наблюдавшими изменение распределения лейкоцитов у мастэктомированных коров голштинской породы по сравнению с нормально лактирующими коровами. Изменение иммунного профиля у высокопродуктивных коров связывают с их повышенной чувствительностью к заболеваниям (van Dorp Т.Е. et al., 1999, Heringstad В. et al., 2000, Heringstad B. et al., 2007, Калашников B.B. и др., 2011, Ingvartsen K.L., 2003). Так, показана положительная генетическая корреляция между уровнем удоя и чувствительностью к маститам, которая варьировала от 0,24 до 0,55 (Heringstad В. et al., 2000). Ingvartsen K.L. с соавторами (2003) установили нежелательные генетические корреляции между уровнем удоя и частотой возникновения кетозов (0,26-0,65), кист яичников (0,23-0,42), маститов (0,15-0,68), проявлением хромоты (0,24-0,48). С ростом молочной продуктивности связывают широкое распространение лейкоза среди молочного скота. У коров голштинской породы канадской селекции, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) в латентной стадии, отмечен более высокий уровень удоя по сравнению с серонегативными животными (Pollary F.L. et al., 1992). Установлен более высокий генетический потенциал коров, инфицированных ВЛКРС, по удою, который для животных, находящихся в стадии персистентного лимфоцитоза составил +204 кг, а для гематологически нормальных - +136 кг по сравнению с серонегативными животными (Wu М.С. et al., 1989). На выборке коров черно-пестрой породы показана тенденция увеличения ряда продуктивных показателей у коров-первотелок -носителей ВЛКРС по сравнению с не носителями (Гладырь Е.А. и др., 2012).

Цель и задачи исследования.

Целью диссертационной работы явилось усовершенствование способов ДНК-диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота и изучение связи ВЛКРС-статуса высокопродуктивных коров различных генеалогических линий с уровнем молочной продуктивности.

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Идентифицировать участок ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота, характеризующегося наибольшей консервативностью, на основании мониторинга баз данных последовательностей ДНК.

2. Разработать тест-систему для диагностики ВЛКРС методом «гнездовой» ПЦР и выполнить анализ ее специфичности, чувствительности, точности (прецизионности) и воспроизводимости.

3. Изучить связь принадлежности коров к генеалогической линии с инфицированностью ВЛКРС.

4. Оценить связь статуса коров по ВЛКРС с уровнем молочной продуктивности коров черно-пестрой породы.

5. Усовершенствовать приемы диагностики ВЛКРС.

6. Определить генотипы ВЛКРС в стаде высокопродуктивных коров черно-пестрой породы.

Научная новизна исследований. Определены консервативные участки ВЛКРС как матричные последовательности для отжига праймеров. Изучено влияние номера лактации на инфицированность коров ВЛКРС. Выполнено исследование степени инфицированности ВЛКРС коров с различными продуктивными характеристиками (удой, содержание жира и белка в молоке, выход молочного жира и белка): «высокими» (более Хс?+о), «средними» (в пределах Хср.±о) и «низкими» (менее Хср.-ст). Выполнен анализ молочной продуктивности коров из разных генеалогических линий в зависимости от статуса по ВЛКРС.

Практическая значимость. Разработана тест-система диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота на основе «гнездовой» ПЦР, характеризующаяся специфичностью более 99,0%, чувствительностью не менее 6,0*10" копий/мкл, точностью (прецизионностью) и воспроизводимостью более 99,0%. Усовершенствованы приемы диагностики ВЛКРС, позволяющие идентифицировать телят-носителей провирусной формы ВЛКРС, начиная с 10-дневного возраста, и коров-носителей с использованием в качестве исходного материала пробы кожи (ушной выщип). Определены генотипы ВЛКРС в стаде высокопродуктивных коров черно-пестрой породы ФГУП «Кленово-Чегодаево».

Апробация работы. Результаты исследований были доложены и обсуждены на международной конференции «ЕС - Россия: 7-я Рамочная программа в области биотехнологии, сельского, лесного, рыбного хозяйства и пищи», г. Уфа: БашГАУ, 2010 г., на научной конференции-школе «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», п. Дубровицы: ВИЖ, 2012 г., на конференциях Центра биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии, 2011, 2012 гг.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Тест-система диагностики ВЛКРС, характеризующаяся высокой специфичностью, чувствительностью, точностью и воспроизводимостью.

2. Увеличение доли животных со статусом ВЛКРС+ с увеличением числа лактаций.

3. Достоверное повышение степени инфицированности ВЛКРС с увеличением уровня показателей молочной продуктивности (удой, содержание жира и белка в молоке, выход молочного жира и белка).

4. Усовершенствованные приемы ДНК-диагностики ВЛКРС, позволяющие выявлять телят-носителей, начиная с 10-дневного возраста.

Публикации результатов исследований. Всего по теме диссертационной работы опубликовано 5 работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ («Сельскохозяйственная биология»,

Проблемы биологии продуктивных животных», «Достижения науки и техники АПК»).

Структура и объем работы. Диссертация написана на 131 страницах, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы. Диссертационная работа содержит 35 таблиц и 16 рисунков. Список литературы включает 229 источников, в том числе 165 источников на иностранном языке.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Виноградова, Ирина Валерьевна

выводы.

1. Предложена тест-система диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), основанная на методе «гнездовой» ПЦР фрагмента гена ет. По результатам проведенных исследовательских испытаний показано соответствие оцениваемых характеристик установленным требованиям: показана способность тест-системы выявлять австралийский и бельгийский типы вируса, чувствительность составила 6*1 О*3 копий/мкл, показано 100% совпадение результатов исследований референтных образцов; выявлено 100%) совпадение результатов повторных исследований 30 образцов.

2. Показано увеличение степени инфицированности коров вирусом лейкоза с увеличением числа лактаций. Исследование статуса по ВЛКРС 382 коров 1-й лактации, 253 коров 2-й лактации и 197 коров 3-й лактации показало увеличение доли коров носителей ВЛКРС с 28,5%о у коров 1-й лактации до 36,1% у коров 3-й лактации.

3. Установлена на 9,0-21,7%) достоверно более высокая степень инфицированности коров 1-й лактации ВЛКРС со «средним» (в пределах Хср±о) и «высоким» (более Хср+о) уровнем продуктивных показателей (удой, содержание жира и белка в молоке, выход молочного жира и белка) по сравнению с группами коров с «низким» (менее Хср-а) уровнем продуктивности. Выявлены наибольшие различия между группами коров с различным выходом молочного жира (18,3-21,7%), р<0,999). Установленные закономерности, в большинстве случаев, сохранялись для коров 2-й и 3-й лактаций.

4. Установлена тенденция повышения большинства продуктивных показателей (уровня удоя, содержания жира в молоке, выхода молочного жира и белка) у коров различных генеалогических линий со статусом ВЛКРС «+» по сравнению ВЛКРС «-».

5. Показана результативность разработанной тест-системы на основе «гнездовой» ПЦР в выявлении носителей ВЛКРС у телят, начиная с 10-и дневного возраста. Исследование 222 телят выявило 18,92% носителей ВЖРС.

6. Показано, что применение комплексного подхода, основанного на использовании РИД и ПЦР-анализа двух видов проб (крови и ткани уха), повышает результативность идентификации носителей ВЛКРС на 18,8-31,3% от числа выявляемых только методом РИД.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Лабораториям молекулярно-генетической экспертизы и ветеринарным диагностическим лабораториям рекомендуем использовать разработанную нами тест-систему «гнездовой» ПЦР для проведения ранней диагностики телят на носительство вируса лейкоза крупного рогатого скота, начиная с 10-и дневного возраста, и в качестве элемента комплексного подхода для повышения результативности выявления коров-носителей ВЛКРС.