Дискретная гетерогенность популяций биопленкообразующих бактерий и обратимые изменения интенсивности мутагенеза

Магданова, Лариса Альбертовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Дискретная гетерогенность популяций биопленкообразующих бактерий и обратимые изменения интенсивности мутагенеза
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Дискретная гетерогенность популяций биопленкообразующих бактерий и обратимые изменения интенсивности мутагенеза"

4оэ=ч

На правах рукописи

МАГДАНОВА Лариса Альбертовна

ДИСКРЕТНАЯ ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ПОПУЛЯЦИИ БИОПЛЕНКООБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ И ОБРАТИМЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ИНТЕНСИВНОСТИ МУТАГЕНЕЗА

03.02.03 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 О НОЯ 2011

Пермь-2011

4859419

Работа выполнена в лаборатории химического мутагенеза Учреждения Российской академии наук Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, Пермь

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Голясная Надежда Викторовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Октябрьский Олег Николаевич доктор медицинских наук Шишкова Юлия Сергеевна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва

Защита диссертации состоится » ноября 2011г. в « 15 » часов на заседании диссертационного совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, Пермь, ул. Голева, 13. Факс: (342)280-92-11

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Министерства образования и науки РФ (http://vak.ed.gov.ru) и сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан «24» октября 2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Максимова Юлия Геннадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Толерантность биопленок условно-патогенных микроорганизмов к воздействию антибактериальных веществ - одна из основных причин снижения эффективностей химиотерапии хронических инфекционных заболеваний и устойчивой контаминации медицинского оборудования [Lappin-Scott et al., 2003; Lens et al., 2003]. Особое внимание уделяют микробиологической коррозии элементов промышленных и водно-технических конструкций. В ряду важнейших факторов экстремальной толерантности биопленок, колонизирующих промышленное оборудование, рассматривают как сложный видовой состав микробиоценоза (разнообразие видов), так и гетерогенность популяций каждого вида (разнообразие фенотипов) [Lappin-Scott et al., 2003]. Последняя проявляется либо в виде различий реакций клеток на изменения среды [Бухарин и др., 2005; Zgur-bertok, 2007], либо в виде результата спонтанного и стимулируемого стрессом мутагенеза [Chopra et al, 2003; Boles et al., 2004]. Подавляющая масса клеток в составе бактериальных сообществ характеризуется чрезвычайно низкими частотами спонтанных мутаций (ЧСМ). Однако в популяции присутствуют клетки с мутаторным фенотипом, т.е. микроорганизмы, ЧСМ которых выше в 10-1000 раз [Drake, 1991]. Адаптивная роль таких бактерий в выработке устойчивости к химиотерапевтическим препаратам подтверждена в ряде исследований [Chao et al., 1983; LeClerc, 1998]. Она реализуется за счет высокой вероятности приобретения необходимых мутаций. При этом клетка приобретает как положительные, так и негативные изменения генов, поэтому выживание бактериальной популяции определяется поддержанием оптимального соотношения частот мутаций [Funchain, 2000; Kuhar, 2001].

Наиболее распространёнными причинами мутаторного фенотипа являются повреждения генов системы репарации ошибочно спаренных оснований (ММР) [Friedberg et al., 1995; LeClerc et al, 1996]. Мутации в этих генах обуславливают увеличение ЧСМ на 2-3 порядка. Недавние исследования популяций Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa выявили высокие проценты слабых мутаторов, с превышением интенсивности мутагенеза в 10-50 раз [Kenna et al., 2007; Turrientes et al., 2010], поднимая вопрос о превалирующей адаптивной роли слабого гипермутагенеза. В настоящее время предполагается, что гены ММР не принимают участия в развитии слабого гипермутагенеза [Kenna et al., 2007; Mena et al., 2008;

Oliver et al., 2000]. Однако максимальная изученность генов mutSL в контексте модуляции ЧСМ природных микроорганизмов делает их первыми кандидатами на роль причинных факторов гипермутагенеза.

Цель настоящего исследования - изучение характера и природы гетерогенности природных популяций сапротрофных микроорганизмов по уровню спонтанного мутагенеза.

Основные задачи исследования:

1. Изоляция и идентификация основных компонентов культивируемой сапротрофной микробиоты гидротехнического комплекса.

2. Скрининг частоты спонтанных мутантов, активности биопленкообразования и чувствительности компонентов бактериального сообщества к оксидирующим и неоксидирующим биоцидам.

3. Определение характера взаимосвязи активности биопленкообразования, интенсивности мутагенеза и чувствительности к биоцидам.

4. Исследование последовательностей генов mutS и mutL в клетках субпопуляций с разным уровнем мутагенеза.

Научная новизна

Впервые изучены уровень мутагенеза и активность биопленкообразования в популяциях микробиоценоза системы плавательных бассейнов. Доказаны стабильность сообщества культивируемых сапротрофных микроорганизмов и изогенное происхождение штаммов в пределах каждого исследованного вида. Экспериментально показана универсальность гетерогенности уровней мутагенеза и высокое содержание слабых и умеренных мутаторов в изогенных природных популяциях Bacillus sp., Acinetobacter sp., Stenotrophomonas sp. и P. aeruginosa. Обнаружена устойчивая дискретная гетерогенность бактерий с обособлением субпопуляций, отличающихся комплексом рассматриваемых признаков: частота мутантов, активность биопленкообразования, скорость роста, подвижность. Впервые показано, что субпопуляция умеренных мутаторов P. aeruginosa характеризуется аномалиями амплификации фрагментов генов ММР. Эти аномалии не стабильны в ряду поколений и исчезают вместе с мутаторным фенотипом. Умеренное повышение частоты мутантов обуславливается изменениями структуры генов mutS и mutL, Таким образом, выявлен механизм гипермутагенеза, занимающий промежуточное

положение между наследственным и временным, который реализуется за счет обратимых изменений нуклеотидных последовательностей генов ММР.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные данные расширяют представления об участии мутаторного фенотипа в развитии и адаптации популяций бактерий к условиям окружающей среды; отражают роль в этом процессе таких селективных факторов, как экспозиция с биоцидами и окислительный стресс.

Собрана коллекция природных штаммов, выделенных в пределах одного биотопа и характеризующихся вариациями уровней мутагенеза. Исследования позволили разработать программу сбора данных параметров функционирования гидротехнического комплекса, которая помогает понять вероятность и последствия образования биопленки в оборудовании для водоподготовки. На основании этой информации определяется стратегия мониторинга микробиологической коррозии, устранения специфических факторов, стимулирующих биопленкообразование и его распространение в водооборотных системах. Оценка, как микробиологической коррозии, так и интенсивности образования биопленки, определяет выбор схемы применения и дозировки биоцидов, позволяет повысить эффективность их действия в условиях постоянного контроля количественных и качественных параметров биоценоза.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Условно-патогенные бактерии (биопленкообразующие грамположительныс спорообразующие и грамотрицательные аэробные неферментирующие) доминируют в ряду культивируемых сапротрофных микроорганизмов исследуемого гидротехнического комплекса.

2. Пролонгированное и эпизодическое воздействие биоцидов, характерное для исследуемого биотопа, повышает общий резерв мутационной изменчивости в популяциях резидентных видов.

3. Гетерогенность популяций P. aeruginosa, Stenotrophomonas sp., Acinetobacter sp. и Bacillus sp. носит дискретный характер. В одном биотопе одновременно сосуществуют субпопуляции и варианты, отличающиеся сочетанием таких признаков, как частота мутаций и активность биопленкообразования.

4. Вариации уровней мутагенеза в изолятах P. aeruginosa вызваны временными хромосомными перестройками mutS и mutL.

Апробация работы и публикация

Материалы диссертации были представлены на IV Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (г. Москва, 2008), и на Четвертой международной Конференции по биопленкам (г. Винчестер, Великобритания, 2010). Всего по теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе статья в журнале «Экологическая генетика».

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 162 страницах машинописного текста, иллюстрирована 20 таблицами, 23 рисунками. Состоит из введения, 3 глав, заключения и выводов. Список использованных источников включает 290 наименований, из них 278 работ иностранных авторов.

Связь с научными программами

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Изучение процессов спонтанного и индуцированного мутагенеза в условиях экспериментальной и реальной химической нагрузки» (номер государственной регистрации 01.9.00017990). Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, проект № 07-04-96000-р_урал_а (2007-2009).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Отбор проб и изолятов бактерий производили с твердых поверхностей водно-инженерного сооружения, включающего три плавательных бассейна и их системы очистки, каждые 3 месяца в течение периода с февраля 2007 по июль 2009 гг. Изоляты выделяли из морфологически различающихся колоний. Физико-химические условия в бассейнах: температура воды 28°С; рН 7.2; жесткость - 3 - 6.5 мг-экв/л. Режимы бактерицидной обработки: континуальная - 0.3 мг/л NaCIO; дискретная - 5.6 мг/л гидроксипропилендиметиламмония хлорида два раза в месяц и 0.8 мг/л NaCIO раз в два месяца.

Инкубационные среды, культивирование бактерий, построение кривых роста периодической культуры осуществляли стандартными методами [Герхардт и др., 1984]. Удельную скорость роста (УСР) вычисляли по изменению оптической плотности при 600 нм в единицу времени в логарифмическую стадию периодического роста [Shehata etal., 1971].

Идентификацию бактерий осуществляли по определителю Берджи [Хоулт и др., 1997] на основе результатов биохимических тестов [Герхардт и др., 1984]. В качестве контрольных использовали штаммы P. aeruginosa АТСС 27853, Е. coli K12s (Е. coli Genetic Stock Center, США) и Staphylococcus epidermidis 33 (ГНИИСК им. Тарасевича, Россия).

Частоту мутантов (ЧМ) определяли на агаризованной среде LB с рифампицином (300 мкг/мл) методом, описанным ранее [Mena et al, 2008].

Активность образования биопченки (АБО) определяли колориметрическим методом с использованием красителя кристаллического фиолетового [Merritt et al., 2005].

Чувствительность к антибиотикам и биоцидам определяли методом серийных двукратных разведений в 96-луночном иммунологическом планшете [Watts, 2008]. Титры антибиотиков и биоцидов готовили, используя начальные растворы: 5 мг/мл ципрофлоксацина, 15 мг/мл рифампицина, 25 мг/мл стрептомицина; гидроксипропилен-диметиламмония хлорид (Desalgine® Jet, далее ДА) - 22.5%, полигексаметиленгуанидин гидрохлорид («Биопаг Д», далее БП) - 20%, гипохлорит натрия - 3%.

Полуколичественное определение интенсивности продукции рамнолипидов осуществляли, используя агар с метиленовым голубым и цетримидом [Pinzon et al, 2009; Siegmundetal, 1991].

Подвижность «роения» (swarming motility) определяли в 0.5% агаризованной минеральной среде следующего состава: 5.5 г Na2HP04, 3.0 г КН2Р04, 0.5 г NaCl, 5 г агара, 2 г глюкозы, 0.5 г гистидина в 1 л дистиллированной воды с 2 мМ MgS04, 1 мМ тиамина, 0.1 мМ СаС12 [Caiazza et al., 2005].

Чувствительность к пероксиду водорода определяли по Bjamsholt (2005). Выживаемость определяли как отношение концентрации КОЕ/мл клеток после окислительного стресса к концентрации КОЕ/мл в контрольных образцах.

Выделение хромосомной ДНК бактерий осуществляли согласно протоколу [Romero et al, 1999].

Полиыеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на термальном циклере MyCycler™ с использованием стандартных условий, рекомендованных производителями Taq-полимеразы, и температуры отжига Та, характерной для конкретной пары праймеров. Для амплификации и секвенирования гена 16s рРНК использовали универсальные праймеры 27F (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG) и 1492R (ACCTTGTTACGACTT) [Carter et al, 2010]. Амплификацию и секвенирование генов mutL и mutS представителей различных субпопуляций и вариантов P. aeruginosa проводили с помощью ранее опубликованных [Ciofu et al, 2010], а также специально подобранных праймеров (табл. 1).

Таблица 1.

Подбор праймеров для амплификации фрагментов гена mutL

№ п/п Праймеры Длина ПЦР-продукта Нуклеотидная последовательность (5'-3') Та Opt

1 mutL-1 744 п.о. 250F-ATYCGYRABCTKGARGAR 993R-RCGGTGCARVGTGCCRTA 58.0

2 mutL- 2 716 п.о. 969F-YTTYCTBTAYGGCACBYA 1684R-TGCCRTAYTCSAKVARRTC 56.9

3 VAmutL-l 1005 п.о. -23F-TGGCGGCCCAGTGATGAGYGA 992R-CGATGCARGGTGCCATAGAGG 63.3

4 VAmutL-2 1064 п.о. 951F-GGCGTTGGACCTCGACCTAT 2015R-G AGRAAGATGGCGGGAGGC 61.7

5 mutS-1 1032 п.о. 254F-ARTCRGTGGYGATCTGYG 1285R-CRTARCCGGYYTTS AKYA 58.0

6 mutS-2 1006 п.о. 1270F-MTS AARRCCGGYTAYGAC 2258R-GRTGCARGAANACRATGC 57.7

7 PAmutS-l 1339 п.о. -71F-GCTGAAAGCRGCCCGCACAG 1409R-GGCGAGTTCQCGATAGGTG 60.5

8 VAmutS-2 1106 п.о. 970F-AYGAYCGYCTCGATGACA 2075R-TTGCCGCATGTGGTGGAT 60.4

9 PA mutS-3 819 п.о. 1970F-GCTGGAGACRCCGTTGGTG 2588R-GCAGCTTGTGCGGTRGGTCC 59.9

Электрофорез ДНК фрагментов ДНК ПЦР-смесей проводили в 1% агарозе (Sigma) в трис-ацетатном (ТАЕ) буфере [Dekimpe et al., 2009; McKnight et al., 2000]. Маркеры молекулярных масс - фрагменты ДНК 100-3000 п.о.

Очистку шпликонов заданной длины осуществляли с помощью легкоплавкой агарозы (Sigma) [Wolfgang et al., 2010].

Секвенирование ДНК осуществляли на секвенаторе MegaBACE™ 1000 с использованием DYEnamic™ ET Dye Terminator Kit согласно рекомендациям производителя.

Дизайн вырожденных прагшеров выполнен с помощью программы GeneFisher2 - Interactive PCR Primer Design (Bielifeld University) используя нуклеотидные последовательности генов 16S ДНК, mutL и mutS в базе данных NCBI.

Выравнивание последовательностей ДНК осуществляли при помощи алгоритма BLAST (nucleotide BLAST). Для построения филогенетических дендрограмм применяли метод Fast Minimum Evolution [Desper et al., 2002].

Статистическую обработку полученных данных производили стандартными методами [Лакин, 1973]. Достоверность отличий параметров групп определяли с применением непараметрического U критерия Манна-Уитни. В случае р<0.05 отличия параметров двух независимых групп считали достоверными. Корреляцию уровней АБО и 4M вычисляли с помощью непараметрического коэффициента ранговой корреляции Спирмена.

Все эксперименты проводили в трех повторностях для каждого изолята.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Видовой состав сапротрофной флоры плавательного бассейна. Изоляция и комплексная идентификация микроорганизмов на основе биохимической характеристики и последовательности 16s рРНК позволила установить следующий видовой состав резидентной микрофлоры: Р. aeruginosa, Acinetobacter sp., Stenotrophomonas sp., Delftia sp., Chryseobacterium sp., Citrobacter sp., Bacillus sp., Paenibacillus sp., Pseudomonas sp. Транзитная, эпизодически встречающаяся, микрофлора представлена Klebsiella sp. и Enterobacter sp. Перечень содержит несколько условно-патогенных видов. Постоянная экспозиция резидентных бактерий

с биоцидами, может создавать риск «искусственной эволюции возбудителей инфекционных заболеваний» [Бухарин и др., 2005].

Виды представлены несколькими стабильными в ряду поколений фенотипами, каждому из которых соответствует определенная морфология колоний, профили биохимических свойств и чувствительности к биоцидам. Выявленные два варианта Stenotrophomonas sp. отличаются скоростью роста в жидкой и величиной колоний на агаризованной средах. Идентифицированы два нетипичных морфотипа P. aeruginosa: «морщинистый», далее WCV [Cornells, 2008; Kirisits et al., 2005], и вариант с гладкими малыми колониями, далее SCV. Вид Pseudomonas sp. представлен исключительно «морщинистым» вариантом, представителей с колониями дикого типа в системе не выявлено.

Структуры популяций бактерий по признаку частоты спонтанных мутантов. Для исследования структуры популяции выбирали виды, отвечающие следующим условиям: 1) сравнимые скорости роста; 2) широкая распространенность в биотопе; 3) условная патогенность; 4) отсутствие устойчивости к рифампицину. В ряду таких видов идентифицированы P. aeruginosa, Bacillus sp., Acinetobacter sp., Stenotrophomonas sp. Скрининг ЧМ изолятов производили с целью установить моду распределения и процент штаммов с мутаторным фенотипом, к которым относили изоляты, ЧМ которых в 10 и более раз превышала ЧМ контрольных штаммов: P. aeruginosa АТСС 27853, (2.8 ± 0.9) х Ю"8, и S. epidermidis 33, (4 ± 1.2) х 10"8 Сравнение полученных распределений ЧМ (рис. 1 А, Б) с данными публикаций результатов скрининга изолятов P. aeruginosa (Kenna et al, 2007), E. coli (Baquero et al, 2004), S. maltophila [Turrientes et al., 2010] и Bacillus simplex (Sikorski et al, 2005) показывает заметное смещение модальных частот в сторону больших значений ЧМ. Моды ЧМ исследуемых видов в 2-4 раза превышают моды распределений описанных в литературе популяций P. aeruginosa, Е. coli, S. maltophila, В. simplex.

Смещение пика частот максимально в группе изолятов P. aeruginosa, мода частоты мутантов которых приблизительно в 10 раз превышает значение (0.8-2.0) х 10"8, полученное в работе Kenna с соавт. (2007). Подобное явление описано для штаммов, выделенных из легких больных муковисцидозом (Oliver, 2002). Содержание вариантов со слабым и умеренным мутаторным фенотипом в популяциях Acinetobacter sp. и Stenotrophimonas sp. составляет соответственно 11.5% и 10%, тогда

как в группах изолятов P. aeruginosa и Bacillus sp. - 14% и 17% (рис 1 А, Б). Полученные значения превышают показатели, выявленные для природных и клинических штаммов P. aeruginosa (5%) (Kenna er al., 2007), клинических изолятов Е. coli (4%) (Baquero et al., 2004) и природных штаммов В. simplex (3-11%) (Sikorski et al., 2005).

и S-P> с

я 3"

Интервал частот мутагенеза, х10

а га

? е-

U 5

& i

са zr

Интервал частот мутагенеза, х 108

Рис. 1. Распределение частот мутантов в популяциях исследуемых видов.

А - Р. aeruginosa (J) и Stenotropho monas sp. (|); Б - Acinetobacter sp. (f§) и Bacillus sp.

С помощью скрининга 125 изолятов P. aeruginosa выявлен один изолят бактерий с гипермутаторным фенотипом. ЧМ штамма составляет 2.4 х 10"6 и превышает контрольный уровень в 80 раз. Встречаемость гипермутаторного фенотипа в исследованной популяции соответствует таковой среди клинических штаммов Е. coli и Salmonella (Baquero et al., 2004), тогда как в популяциях P. aeruginosa, вызывающих хронические инфекции дыхательных путей, составляет от 5% (на ранних стадиях развития инфекции) до 50% (через 15-20 лет развития) (Kenna et al., 2007).

Зависимость распределения активностей биопленкообразования и частот мутантов. Выявлено взаимозависимое распределение параметров ЧМ и АБО (рис. 2). Простую положительную корреляцию параметров наблюдали в случае Acinetobacter sp. (рис. 2 А) и Stenotrophomonas sp. (рис. 2 Б). Дробление популяции на подгруппы с выраженными различиями признаков наблюдали в группах изолятов Bacillus sp. (рис. 2 В) и P. aeruginosa (рис. 2 Г). Коэффициент корреляции АБО и ЧМ составляет 0.85 (р=0.004) в группе изолятов Acinetobacter sp. и 0.62 (р=0.004) - в группе изолятов Stenotrophomonas sp.. В случае Stenotrophomonas sp. выявили одновременно корреляцию параметров ЧМ и АБО и дифференциацию популяции на две субпопуляции (рис. 2 Б). На рисунке 2 субпопуляции бактерий с различающимися наборами фенотипических свойств обозначены номерами от 1 до 4. Дифференциация на субпопуляции в пределах Stenotrophomonas sp., P. aeruginosa, Bacillus sp. является статистически значимой. Представители описанных субпопуляций обнаружены в образцах различных дат забора проб, то есть выявленная дискретная гетерогенность популяций стабильна во времени.

Анализ публикаций показывает, что ранее оценки взаимосвязи параметров АБО и интенсивности мутагенеза не производили, тогда как неоднократно осуществлялись попытки найти зависимость чувствительности к антибиотикам от активности биопленкообразования либо частоты мутаций. Корреляция устойчивости к антибактериальным агентам с биопленкообразованием показана для P. aeruginosa [Oliveira et al., 2010], представителей рода Enterococcus [Saitou et a!., 2009]; взаимозависимость частоты мутантов с МИК антибиотиков выявлена для P. aeruginosa [Schaaff et al., 2002] и Staphylococcus aureus [Mandsberg et al., 2009]. Описанные закономерности предполагают наличие лучшего адаптивного потенциала в группах наиболее сильных биопленкообразователей либо гипермутабельных микроорганизмов.

1.0Е-09 1.0E-08 1.0E-07 Частота мутаций

Вт J

D вЬ I . 1Н I

н- п*ит

1.0E-09 1,0Е-08 1.0E-07 Частота мутаций

1,2 1

0,8 0,6 0,4 0,2 0

1.0E-06

03 О

ГЛ

s. I

•8 |

А С

О I

о vi а

0,8 0,6 0,4 0,2 0

,0Е-09 1.0Е-07 1.0Е-05 Частота мутаций

-1-1

а 0

п в Т I,

с» 1

п в

Т Н 1 т г

h-4 iW □

Гт

1,2 1

0,8 0,6 0,4 0,2 0

1,0Е- 1,0Е- 1,0Е- 1,0Е- 1,0Е-09 08 07 06 05

Частота мутаций

Рис. 2. Зависимость распределения интенсивностей мутагенеза и биопленкообразования в популяциях.

А - Acinetobacter sp.; Б - Stenotrophomonas sp.; В — Bacillus sp.; Г - Р. aeniginosa. Указаны средние значения и стандартные отклонения.

P. aeruginosa взяли для анализа способов формирования наблюдаемой неоднородности фенотипов. Этот вид наиболее изучен в контексте биопленкообразования и мутагенеза [Cornelis, 2008]. Вероятными претендентами на роль факторов, определяющих развитие выявленных фенотипов, являются системы чувства кворума. Ранее зарегистрирована корреляция встречаемости в клетках мутаторных мутаций и мутаций в генах lasR и rhlR, кодирующих регуляторные белки систем межклеточного сообщения P. aeruginosa [Bjarnsholt et al., 2010]. Явление объясняют последовательным развитием конститутивного мутаторного фенотипа на базе повышения чувствительности к АФК, вызванного нарушением систем чувства кворума.

Для проверки предположения о взаимосвязи чувства кворума и мутаторного фенотипа измерили интенсивность продукции рамнолипидов, чувствительность к пероксиду водорода и подвижность «роения», которые регулируются системами las и rhl. Однако дифференциация исследуемой популяции не показала явной взаимосвязи с системами чувства кворума, т.е. гетерогенность уровней ЧМ и ее взаимосвязь с изменениями активности биопленкообразования обусловлены иными причинами и не связаны с чувством кворума.

Исследование генов репарации неправильно спаренных оснований (ММР) mutS и mutL. Поскольку повреждения генов ММР являются наиболее подробно описанными и часто встречающимися причинами мутаторного фенотипа [Friedberg et al., 1995; LeClerc et al., 1996], для выявления причин вариаций частоты мутагенеза в популяции P. aeruginosa проводили исследование последовательностей ДНК генов mutS и mutL представителей различных субпопуляций и вариантов. Подобрали праймеры, позволяющие амплифицировать фрагменты генов mutS и mutL длиной (0.8-1.5) х 103 п.о (табл. 1). Провели амплификацию фрагментов генов mutS и mutL, используя в качестве матрицы хромосомную ДНК музейного штамма, а также изолятов каждой из четырех субпопуляций P. aeruginosa и двух морфотипических вариантов (P. aeruginosa WCV и P. aeruginosa SCV). Данные электрофореза реакций ПЦР на основе хромосомной ДНК различных субпопуляций и вариантов P. aeruginosa приведены в таблицах 2 и 3.

Штамм P. aeruginosa АТСС 27853, представители субпопуляций 1РА, 2РА и морфотипический вариант P. aeruginosa WCV выявили значительное сходство картин электрофоретической подвижности амплифицированных фрагментов ДНК, тогда как результаты ПЦР фрагментов mutS и mutL представителей субпопуляций 2РА, ЗРА и морфотипического варианта P. aeruginosa SCV показали выраженные отличия, включающие как полное отсутствие синтеза, так и амплификацию одного или нескольких фрагментов аномальной длины.

Таблица 2.

Результаты амплификации фрагментов гена mutS с праймерамн, специфичными для вида P. aeruginosa*

АТСС

1РА**

WCV

27853

праимеров

VAmutS-1

PAmutS-2

VAmutS-Ъ

Примечания. * - справа от дорожки с опытным образцом показана дорожка с маркерами молекулярных весов ДНК; цифры соответствуют длинам маркеров молекулярных весов в тысячах пар нуклеотидных оснований; стрелками обозначено местоположение целевого фрагмента; ** - номер/обозначение субпопуляции/варианта Р. аеп^тоэа.

Таблица 3.

Результаты амплификации фрагментов гена mutL с праймерами, специфичными для вида P. aeruginosa *

Набор прайм еров

PAmutLA

► J

?AmutL-\.\

PAmutL-2

АТСС 27853

1РА**

Ii I

Г 1

It'

flu

2РА

ЗРА

4РА

WCV

SCV

- -

* 1

шл

I?.1 u

I >,

** - номер/обозначение субпопуляции/варианта P. aeruginosa.

Выявленные различия характера амплификации генов ММР подтверждаются результатами ПЦР с праймерами, опубликованными Ciofu с соавт. [Ciofu et al., 2010], а также с вырожденными праймерами mutS-1 и mutS-2, специфичными для рода Pseudomonas. Реакции с использованием ранее опубликованных праймеров, специфичных для mutS и mutL P. aeruginosa, приводили к синтезу ДНК только в случае амплификации фрагментов, находящихся внутри рамок считывания (табл. 4). Фрагменты, включающие рамки считывания mutS и mutL, не амплифицировались вне зависимости от вариаций протоколов ПЦР. При этом комплексы фрагментов, полученных в результате ПЦР на основе хромосомной ДНК контрольного штамма P. aeruginosa АТСС 27853 и представителей различных субпопуляций, значительно отличаются друг от друга. Амплификация с праймерами, специфичными для mutS представителей рода Pseudomonas, подтвердила наличие изменений в соответствующей последовательности ДНК представителей субпопуляции 4РА и варианта SCV (рис. 3). Тогда как ПЦР с праймерами, специфичными для mutL представителей рода Pseudomonas, не дала продуктов, различимых при визуализации агарозных гелей.

Продукты ПЦР-реакций на основе хромосомной ДНК штаммов РА11В и РА402 и праймеров mutSF6-mutSR6, mutLF2-mutLR2, PAmutS-1, PAmutS-3, mutS секвенировали с праймерами mutSF4 (1611-1632 и.о.), mutSKW (1331-1310 н.о.) и mutL¥3 (797-815 н.о.) [Ciofu et al., 2010] с целью установить факт амплификации целевых фрагментов. Данные секвенирования подтвердили наличие в реакционных смесях фрагментов искомых последовательностей ДНК. Следовательно, наблюдаемые различия результатов ПЦР действительно отражают изменения в структуре либо состоянии генов ММР.

Результаты амплификации и выявленные частоты мутантов позволяют предположить, что различие характера амплификации обусловлено хромосомными перестройками в пределах генов mutS и mutL, при этом функция генов ММР практически не повреждена. Возможное объяснение наблюдаемым процессам дает модель адаптивного мутагенеза «амплификация - мутагенез» [Hendrickson et al., 2002; Roth et al., 2006]. Процесс адаптивного мутагенеза за счет амплификации заключается в инициации в стрессовых условиях многократной дупликации отдельных участков

Таблица 4.

Результаты амплификации фрагментов гена mutL с праймерами, специфичными для вида P. aeruginosa *

Набор праймеров

rautSF6-mutSRö

mutLF2-mutLR2

АТСС 27853

1.5 1

* -0.5

» -1

fei.5 *

В-0.5

1РА

4'РА

ч? •1.5

1-0.5

* i

f||gffB

■*§| 1.5

-0.5

-3

-1.5

-1

-0.5

-3

-1.5 -1

-0.5

4РА

» -3 1.5 Р-1 -0.5

■*"' V' 4—1 )

'Л 1

-0.5

WCV

1-3 р—1.5

г1

0.5

-1.5

-1

-0.5

SCV

gg-3 -1.5

-1 —0.5

1-1.5 0.5

Рис. 3. Результаты амплификации фрагментов генов ММР с праймерами, специфичными для рода Pseudomonas.

А - mutSA; Б - mutS-2; 1 - P. aeruginosa АТСС 27853; 2 - ДНК представителя субпопуляции 1РА P. aeruginosa; 3 -субпопуляции 2РА; 4 -субпопуляции 4РА; 5 - P. aeruginosa WCV; 6 - P. aeruginosa SCV; 7 - маркеры молекулярных весов; * - показаны размеры маркерных фрагментов в тысячах пар нуклеотидных оснований.

хромосомы с возникновением ряда копий находящегося под действием селекции гена. Каждая из этих копий может подвергаться процессу мутагенеза. При этом в геноме остаются копии гена дикого типа, то есть организму обеспечивается генетическая стабильность, гарантирующая выживание клетки даже в условиях приобретения негативных мутаций [Levassur et al., 2011]. В случае приобретения адаптивной аллели и преодоления стресса, менее удачные копии гена элиминируются [Reams et al., 2010].

С точки зрения механизма мутагенеза амплифицированной ДНК возможно объяснить сохранение активности ММР изолятов субпопуляций ЗРА и 4РА и, в то же время, снижение её эффективности за счёт появления мутантных копий гена, продукты экспрессии которых могут конкурировать за субстрат с корректными копиями белков MutL и MutS. Однако модель «амплификация - мутагенез» генов ММР не дает объяснений вариациям таких признаков, как морфология колоний, биопленкообразование и чувствительность к действию пероксида водорода.

Исследование филогенетических связей в популяции Р. aeruginosa. Определяли последовательности фрагмента 16s рРНК представителей исследуемой популяции Р. aeruginosa. По данным выравнивания, наиболее генетически близким для всех исследованных изолятов (99.3-99.8% гомологии ДНК) оказался штамм Р. aeruginosa Мб (GenBank: JF682387). Высокий процент гомологии свидетельствует в пользу изогенного происхождения всех выделенных в исследуемой системе изолятов Р. aeruginosa. В то же время, наличие различий последовательностей секвенированного фрагмента 16s рРНК позволяет проследить филогенетические связи внутри рассматриваемой популяции.

С помощью выравнивания и попарного сравнения последовательностей секвенированных фрагментов 16s рРНК построили FME-дендрограмму, взяв в качестве основы для сравнения последовательность ДНК Р. aeruginosa Мб (рис. 4). Результаты анализа показывают, что исследуемая популяция Р. aeruginosa распадается на две основных ветви, одной из которых принадлежат субпопуляции 1РА, 2РА, ЗРА и вариант Р. aeruginosa WCV, тогда как другой - субпопуляции 4РА и 4'РА и вариант Р. aeruginosa SCV. Особенности расположения Р. aeruginosa WCV на филогенетическом древе свидетельствует о его максимальной близости к предковому для всех субпопуляций и вариантов геному. Вероятно, ДНК вариантов Р. aeruginosa

WCV в значительно меньшей степени (по сравнению с наследственным материалом субпопуляций 1РА-4РА и 4'РА) подвержена изменениям. Причиной этого может быть как высокая продолжительность клеточного цикла, так и лучшая защищенность генетического материала от потенциально мутагенных повреждений. Тот факт, что штамм представитель субпопуляции P. aeruginosa 4РА (изолят РА252) филогенетически наиболее удалён от представителей P. aeruginosa субпопуляций P. aeruginosa 1РА и 2РА, обладающих фенотипом дикого типа, позволяет предполагать, что причиной дивергенции последовательности 16s рРНК явилось длительное пребывание бактерий в состоянии гипермутагенеза.

-• 4РАсубп.

SCV

-• 4'РА субп.

« P. aeruginosa strain Мб <

Г WCV

г—• 1РАсубп.

_, ЗРАсубп.

2РА субп.

Рис. 4. Филогенетическая FME-дендрограмма последовательностей гена 16S рРНК компонентов популяции P. aeruginosa.

Исходной для сравнения взята последовательность 16s рРНК штамма P. aeruginosa Мб (GenBank: AF094719.1).

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что сообщество культивируемых сапротрофных микроорганизмов исследованного гидротехнического комплекса постоянно во времени, состоит из популяций P. aeruginosa, Acinetobacter sp., Stenotrophomonas sp., Delftia sp., Chryseobacterium sp., Citrobacter sp., Bacillus sp., Paenibacillus sp., Pseudomonas sp.

2. Показано, что моды частот мутантов, характерных для изолятов таких резидентных видов, как, P. aeruginosa, Acinetobacter sp., Stenotrophomonas sp.,

Bacillus sp., в 2-10 раз превышают интенсивность мутагенеза в штамме с фенотипом дикого типа Р. aeruginosa 27853, S. epidermidis 33.

3. Выявлено, что в группах изолятов резидентных видов Acinetobacter sp. уровни активности биопленкообразования и частоты мутантов имеют положительную корреляционную зависимость. P. aeruginosa, Stenotrophomonas sp. и Bacillus sp. обладают дискретной герогенностью интенсивности мутагенеза и активности биопленкообразования. Субпопуляции P. aeruginosa отличаются по скорости роста и степени развития признаков, зависимых от активности систем чувства кворума.

4. Показано наличие в исследуемой популяции P. aeruginosa трех вариантов, резко отличающихся друг от друга комплексом фенотипических признаков, таких, как морфология колоний, активность образования биопленки, чувствительность к антибиотикам и биоцидам, удельная скорость роста в богатой питательной среде.

5. Выявлено, что мутаторный фенотип представителей субпопуляции 4РА P. aeruginosa в лабораторных условиях является временным в ряду поколений. Повышение частоты мутагенеза сопряжено с обратимыми нарушениями генов ММР.

6. Показана филогенетическая связь представителей различных субпопуляций и вариантов P. aeruginosa, подтверждающая микроэволюционную роль активации процесса мутагенеза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Магданова, Л.А. Факторы, влияющие на адаптивный мутагенез Staphylococcus epidermidis / Л.А. Магданова, Н.В. Голясная // Матер. Школы-семинара молод, ученых «Биомика - наука XXI века». Уфа. - 2007. - С. 96-97.

2. Магданова, Л.А. Роль механизма адаптивного мутагенеза в формировании генетической пластичности Staphylococcus epidermidis / Л.А. Магданова, Н.В. Голясная // Межд. Мол. Школа-конфер. «Актуальные аспекты совр. Микробиол.», Москва. - 2007. С. 68-70.

3. Магданова, Л.А. Генетическая лабильность бактерий -биопленкообразующих компонентов биоценоза системы плавательных

бассейнов / Л.А. Магданова, Н.В. Голясная // Тезисы IV Молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва. - 2008. - С. 100-101.

4. Магданова, JT. А. Влияние частоты адаптивного мутагенеза природных биопленкообразующих бактерий на развитие устойчивости к биоцидам // Тезисы V Молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва. - 2009. - С. 39-40.

5. Магданова, Л.А. Исследование видового разнообразия, мутационной и биопленкообразующей активностей представителей микробного биоценоза плавательного бассейна / Л.А. Магданова, Н.В. Голясная // Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов: Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием. Москва. - 2009. - С.119.

6. Магданова, Л.А. Генетическая и морфотипическая гетерогенность бактериальных популяций плавательных бассейнов / Л.А. Магданова, Н.В. Голясная // Экол. генет. — 2011. - Т. 9. - № 2. - С. 24-33.

7. Magdanova, L.A. Adaptive mutagenesis of Staphylococcus epidermidis // L.A. Magdanova, N.V. Golyasnaya // XX International Congress of Genetics, Berlin, Germany. - 2008. -N. P087/35/D.

8. Golyasnaya, N.V. Bacteriophage mediating species diversity / N.V. Golyasnaya, L.A. Magdanova // XX International Congress of Genetics, Berlin, Germany. - 2008. -N. A-065-0035-00920.

9. Magdanova, L. Mutability of polyspecies bacterial biofilm community members / L.A. Magdanova, N.V. Golyasnaya // Biofilms IV International conference, Winchester, UK, September 1-3. - 2010. - P. 20.

10. Magdanova L., Golyasnaya N. Transient changes of natural Pseudomonas aeruginosa mutS and mutL genes structures // The 4th International IMBG Conference for Young Scientists "Molecular Biology: Advances and Perspectives". - 2011. - P. 140.

МАГДАНОВА Лариса Альбертовна

ДИСКРЕТНАЯ ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ПОПУЛЯЦИЙ БИОПЛЕНКООБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ И ОБРАТИМЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ИНТЕНСИВНОСТИ МУТАГЕНЕЗА

Автореферат

Подписано в печать 19.10.2011. Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ № 2259/2011.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии центра «Издательство Пермского национального исследовательского

политехнического университета». Адрес: 614990, г. Пермь, Комсомольский проспект, 29, к. 113. Тел. (342)219-80-33.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Магданова, Лариса Альбертовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Гетерогенность бактерий.

1.1.1. Понятие гетерогенности бактерий.

1.1.2. Экологическое значение явления гетерогенности бактерий.

1.1.3. Виды гетерогенности бактерий.

1.1.2.1. Фенотипическая гетерогенность бактерий.

1.1.2.2. Генотипическая гетерогенность бактерий.

1.1.3. Роль биопленок в формировании гетерогенности бактериальной популяции.

1.1.3.1. Гетерогенность бактериальной популяции в структурированном сообществе биопленки.

1.1.3.2. Временный гипермутагенез.

1.1.3.3. Микроэволюционные процессы в биопленке.

1.2. Полиморфизм частоты спонтанных мутаций в популяции.

1.2.1. Молекулярно-генетические причины гипермутагенеза бактерий.

1.2.1.1. Мутации генов компонентов системы ММР.

1.2.1.2. Роль компонентов ММР в активации временного мутагенеза.

1.2.1.3. Восстановление антимутаторных аллелей генов ММР.

1.2.1.4. Умеренное повышение интенсивности мутагенеза.

1.2.2. Экологическое значение повышения частоты спонтанных мутаций.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Отбор проб и изолятов бактерий.

2.2. Материалы и оборудование.

2.3. Инкубационные среды, культивирование.

2.4. Биохимическая идентификация микроорганизмов.

2.5. Построение кривых роста периодической культуры.

2.6. Определение частот мутантов.

2.7. Определение активности биопленкообразования.

2.8. Чувствительность к антибиотикам и биоцидам.

2.9. Измерение удельной скорости роста культур.

2.10. Определение продукции рамнолипидов.

2.11. Определение подвижности клеток изолятов.

2.12. Определение чувствительности к Н2Ог.

2.13. Работа с ДНК.

2.13.1. Выделение хромосомной ДНК.

2.13.2. Полимеразная цепная реакция (ПНР).

2.13.3. Электрофорез ДНК.

2.13.4. Очистка ампликонов заданной длины.

2.13.5. Секвенирование ДНК.

2.14. Методы биоинформатики и статистики.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Видовой состав сапротрофной флоры плавательного бассейна.

3.2. Определение параметров роста периодических культур идентифицированных видов.

3.3. Чувствительность к антибиотикам и частоты мутантов представителей резидентной микрофлоры.

3.4. Чувствительность микроорганизмов к биоцидам.

3.5. Структуры популяций бактерий по признаку частоты спонтанных мутантов.

3.6. Структуры популяций бактерий по признаку активности образования биопленки.

3.7. Зависимость распределения активностей биопленкообразования и частот мутантов.

3.7.1. Корреляция уровней интенсивности биопленкообразования и мутагенеза.

3.7.2. Дифференциация исследуемых популяций по признакам частоты мутантов и активности образования биопленки.

3.7.3. Причины дискретной гетерогенности исследуемых видов.

3.7.4. Дифференциация популяции P. aeruginosa.

3.8. Морфотипические варианты P. aeruginosa.

3.9. Исследование генов ММР mutS и mutL.

ЗЛО. Исследование филогенетических связей в популяции

P. aeruginosa.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Дискретная гетерогенность популяций биопленкообразующих бактерий и обратимые изменения интенсивности мутагенеза"

Повсеместная вакцинация против наиболее сильных возбудителей инфекций привела к резкому сокращению их численности й освобождению экологической ниши для микроорганизмов — условных патогенов. Благодаря низкой вирулентности и образованию биопленки эти бактерии способны длительное время персистировать в инфицированном организме, несмотря на постоянное лечение антибиотиками [151].

Толерантность биопленок приводит к значительному снижению эффективностей химиотерапии хронических инфекционных заболеваний, санации медицинского оборудования и элементов разнообразных промышленных и водно-технических конструкций. Это одна из основных причин концентрации внимания исследователей на биопленкообразовании и сопутствующих процессах [160]. Проблема толерантности биопленок особенно актуальна в свете лечения пациентов с имплантированными приборами, поверхность которых колонизируют биопленкообразующие микроорганизмы, такие как Staphylococcus epidermidis [203], и пациентов, имеющих заражение дыхательных путей Pseudomonas aeruginosa и другими видами микроорганизмов на фоне муковисцидоза [221]. Эти две.проблемы характеризуются неэффективностью лечения и затяжным протеканием заболевания, часто приводящим к летальному исходу. За годы лечения количество использованных в терапии антибиотиков исчисляется килограммами [221]. Однако актуальность проблемы биопленок в клинике далеко не исчерпывается указанными ситуациями. Повсеместное распространение иммунодефицитов расширяет спектр хронических инфекций, не поддающихся химиотерапии [150], а способность бактерий длительное время выживать, в частности, в больничных водопроводах приводит к повышению опасности приобретения нозокомиальных заболеваний для пациентов и работников больниц [12].

В списке теоретических причин экстремальной толерантности бактерий в биопленках наиболее часто упоминают: 1) наличие экзополисахаридного матрикса, несущего барьерную функцию [172]; 2) замедленный рост бактерий в биопленках, приводящий к снижению значения повреждений при поражении мишени антибактериальным агентом [37]; 3) запуск специфических программ клеточного ответа на стресс, вследствие высокой концентрации клеток, приводящей к локальному исчерпанию кислорода и источников углерода, быстрому накоплению вредных метаболитов в малом объеме [151]; 4) интенсификацию горизонтального переноса генов (трансформации, трансдукции, конъюгации) [90]; 5) явление гетерогенности бактериальной популяции.

Гетерогенность может возникать в силу разнообразных причин: различий локализации клеток в структуре биопленки, стохастических вариаций, за счет генетических (повышения интенсивности мутагенеза, частоты фазовых вариаций) и эпигенетических (формирования персистеров, индукции лизогении, споруляции) механизмов [290]. Гетерогенность бактериальной популяции обеспечивает ей выживание в условиях постоянных стрессов и изменений среды. Основная масса микробиологических работ проводится на культурах, изначально позиционируемых как гомогенные совокупности клеток. Этот подход оправдан в рамках исследования' физиологии и генетики бактерий, однако если рассматривать экологию микроорганизмов, их эволюцию и поведение в природных системах, необходимо учитывать разнообразие фенотипов и генотипов единой популяции бактерий. Гетерогенность наиболее выражена в структурированных сообществах. Устойчивое разнообразие бактерий значительно возрастает после продолжительного роста в состоянии биопленки [35, 36].

Несмотря на то, что подавляющая масса клеток в составе бактериальных сообществ проявляет чрезвычайно низкие частоты спонтанных мутаций (ЧСМ), порядка 10"1° на нуклеотид за генерацию [75], в популяции присутствуют микроорганизмы, интенсивность мутагенеза которых значительно превышает соответствующий показатель в клетках дикого типа. Частые изменения среды либо сильное селективное давление обуславливают выживание и развитие таких гипермутабельных бактерий ввиду более высокой вероятности приобретения необходимого набора мутаций [50, 100]. Адаптивная роль гипермутагенеза в выработке устойчивости к химиотерапевтическим агентам действительно подтверждается рядом исследований [50, 157, 214]. Однако гипермутабельные штаммы с высокой частотой приобретают не только положительные, но и негативные изменения. Поэтому в стабильной во времени бактериальной популяции поддерживается оптимальное ч соотношение уровней мутагенеза [89, 148].

Гены системы репарации ошибочно спаренных оснований (ММР) являются наиболее известными и изученными антимутаторами, повреждение которых приводит к повышению уровня мутагенеза бактерий в 50-1000 раз. Мутаторный фенотип природных штаммов чаще всего обусловлен именно изменениями в генах ММР [86, 157]. Однако недавние исследования популяций Escherichia coli и Р. aeruginosa выявляют высокие пропорции слабых мутаторов, с превышением уровня мутагенеза в 10-50 раз [270]. Эти данные дают основания пересмотреть вопрос о роли сильного и слабого гипермутагенеза в изменчивости популяции. Ряд исследователей полагают, что именно слабый гипермутагенез ответственен за большую часть приобретаемых бактериями адаптивных мутаций [270]. В настоящее время предполагается, что гены ММР не принимают участия в развитии слабого мутагенеза [132, 185, 205]. Однако, поскольку эти гены наиболее часто ответственны за развитие мутаторного фенотипа и максимально изучены в контексте модуляции ЧСМ, они являются первыми кандидатами на роль причинных факторов как слабого, так и сильного гипермутагенеза.

Настоящее исследование направлено на изучение гетерогенности бактериальной популяции, образующей биопленки на поверхности водно-инженерного сооружения и подвергающейся постоянному селективному давлению биоцидов. Основной фокус в работе сделан на слабом мутаторном фенотипе и изменениях генов ММР как возможных факторов его формирования. Выбор системы плавательных бассейнов в качестве объекта исследования объясняется рядом причин. Во-первых, система характеризуется стабильностью и регулярностью физико-химических условий (рН, температура, жесткость воды). Это свойство исключает значительное количество дополнительно влияющих факторов среды, способных усложнять исследование. Во-вторых, система является открытой, т.е. организмы постоянно поступают из внешних источников (с водопроводной водой либо с поверхности кожи людей). Проточность системы обеспечивает вымывание неприкрепленных, планктонных, форм организмов, таким образом, высокая активность биопленкообразования (АБО) становится критерием выживания. Далее, микробиота плавательных бассейнов может являться резервуаром ряда оппортунистических патогенов, актуальность исследования которых обоснована выше. Наконец, плавательные бассейны постоянно подвергаются санации биоцидами, однако, несмотря на сильное селективное давление, бактерии биопленок выживают и продолжают свое развитие. Таким образом, исследуемый биотоп сочетает в себе относительную простоту условий, приближающую ее к экспериментальной системе, практическую важность спектра обитающих в ней микроорганизмов и частичную схожесть системы с моделью терапии хронической инфекции, характеризующейся постоянным поступлением антибактериальных веществ и отсевом планктонных клеток.

Цель настоящего исследования - изучение зависимости гетерогенности популяций микробиоценоза биопленок от уровня спонтанного мутагенеза в клетках с повреждениями генов тШБЬ системы репарации неправильно спаренных оснований.

Основные задачи исследования:

4. Исследование последовательностей генов mutS и mutL в клетках субпопуляций с разным уровнем мутагенеза.

Научная новизна

Впервые изучены уровень мутагенеза и активность биопленкообразования в популяциях микробиоценоза системы плавательных бассейнов. Доказаны стабильность сообщества культивируемых сапротрофных микроорганизмов и изогенное происхождение штаммов в пределах каждого исследованного вида. Экспериментально показана универсальность гетерогенности уровней мутагенеза и высокое содержание слабых и умеренных мутаторов в изогенных природных популяциях Bacillus sp., Acinetobacter sp., Stenotrophomonas sp. и P. aeruginosa. Обнаружена устойчивая дискретная гетерогенность бактерий с обособлением субпопуляций, отличающихся комплексом рассматриваемых признаков: частота мутантов, активность биопленкообразования, скорость роста, подвижность. Впервые показано, что субпопуляция умеренных мутаторов P. aeruginosa характеризуется аномалиями амплификации фрагментов генов ММР. Эти аномалии не стабильны в ряду поколений и исчезают вместе с мутаторным фенотипом. Умеренное повышение частоты мутантов обуславливается изменениями структуры генов mutS и mutL. Таким образом, выявлен механизм гипермутагенёза, занимающий промежуточное положение между наследственным и временным, который реализуется за счет обратимых изменений нуклеотидных последовательностей генов ММР. и

Теоретическая и практическая значимость работы

Основные положения, выносимые на защиту

1. Условно-патогенные бактерии (биопленкообразующие грамположительные спорообразующие и грамотрицательные аэробные неферментирующие) доминируют в ряду культивируемых сапротрофных микроорганизмов исследуемого гидротехнического комплекса. - .

3. Гетерогенность популяций P. aeruginosa, Stenotrophomonas sp., Acinetobacter sp. и Bacillus sp. носит дискретный характер. В одном биотопе одновременно сосуществуют субпопуляции и варианты, отличающиеся сочетанием таких признаков, как частота мутаций, активность биопленкообразования.

4. Вариации уровней мутагенеза в изолятах P. aeruginosa вызваны временными хромосомными перестройками mutS и mutL.

Апробация работы и публикация

Материалы диссертации были представлены на IV Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (г. Москва, 2008), и на Четвертой 1 международной Конференции по биопленкам (г. Винчестер, Великобритания, 2010). Всего по теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе статья в журнале «Экологическая генетика».

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 162 страницах машинописного текста, иллюстрирована 20 таблицами, 23 рисунками. Состоит из введения, 3 глав, заключения и выводов. Список использованных источников включает 290 наименований, из них 282 работы иностранных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Магданова, Лариса Альбертовна

выводы

1. Установлено, что сообщество культивируемых сапротрофных микроорганизмов исследованного гидротехнического комплекса постоянно во времени, состоит из популяций Р. aeruginosa, Acinetobacter sp., Stenotrophomonas sp., Delftia sp., Chryseobacterium sp., Citrobacter sp., Bacillus sp., Paenibacillus sp., Pseudomonas sp.

2. Показано, что моды частот мутантов, характерных для изолятов таких резидентных видов, как, P. aeruginosa, Acinetobacter sp., Stenotrophomonas sp., Bacillus sp., в 2—10 раз превышают интенсивность мутагенеза в штамме с фенотипом дикого типа P. aeruginosa 27853.

5. Выявлено, что мутаторный фенотип представителей субпопуляции 4РА V f

P. aeruginosa в лабораторных условиях является временным в ряду поколений. Повышение частоты мутагенеза сопряжено с обратимыми 1 нарушениями генов ММР. |

6. Показана филогенетическая связь представителей различных субпопуляций и вариантов P. aeruginosa, подтверждающая i микроэволюционную роль активации процесса мутагенеза. ]

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Магданова, Лариса Альбертовна, Пермь

1. Бухарин, О.В. Механизмы выживания бактерий / О.В. Бухарин, A.JI. Гинцбург, Ю.М. Романова, Г.И. Эль-Регистан. — М.: Медицина. 2005. -367 с.

2. Голясная, Н.В. Репарация неправильно спаренных оснований / Н.В. Голясная, Н.А. Цветкова // Молекулярная биология. 2006. - Т. 40. -N. 2.-С. 211-223.

3. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа. 1973. - 343 с.

4. Маниатис, Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. Издательство: -М.: Мир -1984. -480 с.

5. Методы общей бактериологии. В 3-х т. Т. 1.: Пер. с англ. / Под ред. Герхардта Ф. и др. М.: Мир. - 1984. - 536 с.

6. Методы общей бактериологии. В 3-х т. Т. 3.: Пер. с англ. / Под ред. Герхардта Ф. и др. М.: Мир. - 1984. - 264 с.

7. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т.1, Т. 2: Пер. с англ. / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита и др. М.: Мир. - 1997. - 432 с.

8. Тимофеев-Ресовский, Воронцов, Яблоков А. В. «Краткий очерк теории эволюции / Н.В. Тимофеев-Ресовский, Н.Н. Воронцов, А.В. Яблоков. — М.: Наука. 1969.-408 с.

9. Aertsen, A. Mrr instigates the SOS response after high pressure stress in Escherichia coli / A. Aertsen, C.W. Michiels // Mol. Microbiol. 2005. - V. 58.-N. 5.-P. 1381-1391.

10. Aguilera, A. The connection between transcription and genomic instability // EMBO J. 2002. - V. 21. - N. 3. - P. 195-201.

11. Allesen-Holm, M. A characterization of DNA release in Pseudomonas aeruginosa cultures and biofilms / M. Allesen-Holm, K.B. Barken, L. Yang et al. U Mol. Microbiol. 2006. -V. 59. - N. 4. - P. 1114-1128.

12. Anaissie, E.J. The hospital water supply as a source of nosocomial infections: a plea for action / E.J. Anaissie, S.R. Penzak, M.C. Dignani // Arch. Intern. Med. 2002. - V. 162. - N. 13. - P. 1483-1492.

13. Andersson, D.I. Evidence that gene amplification underlies adaptive mutability of the bacterial lac operon / D.I. Andersson, E.S. Slechta, J. Roth //Science. 1998.-V. 282.-N. 5391.-P. 1133-1135.

14. Andre, J. B. The evolution of mutation rates in finite asexual populations / J.B. Andre, B. Godelle // Genetics. 2006. - V. 172. - P. 611-626.

15. Anzai, Y. Phylogenetic affiliation of the pseudomonads based on 16S rRNA sequence / Y. Anzai, H. Kim, J.Y. Park et ¿2/. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. - V. 50. - N. 4. - P. 1563-1589.

16. Aronshtam, A. Dominant negative mutator mutations in the mutL gene of Escherichia coli / A. Aronshtam, M.G. Marinus // Nucleic Acids Res. — 1996.-V. 24.-N. 13.-P. 2498-2504.

17. Atlas R.M. Handbook of Microbiological Media. 3nd ed. / Eds. Atlas R.M. London: CRC Press, 2004. 2051 p.

18. Balaban, N.Q. Bacterial persistence as a phenotypic switch / N.Q. Balaban, J. Merrin, R. Chait et al. // Science. 2004. - V. 305. - N. 5690. - P. 1622-1625.

19. Ban, C. Crystal structure and ATPase activity of MutL: implications for DNA repair and mutagenesis / C. Ban, W.Yang // Cell. 1998. - V. 95. - N. 4.-P. 541-552.

20. Banin, E. Chelator-induced dispersal and killing of Pseudomonas aeruginosa cells in a biofilm / E. Banin, K.M. Brady, E.P. Greenberg // App. Environ. Microbial. 2006. - V. 72. - N. 3. - P. 2064-2069.

21. Baquero, M.R. Polymorphic mutation frequencies in Escherichia coli: emergence of weak mutators in clinical isolates / M.R. Baquero, A.I. Nilsson, M.C. Turrientes et al. H J. Bacteriol. 2004. - V. 186. - N. 16. -P. 5538-5542.

22. Barbour, A.G. Antigenic variation in vector-borne pathogens / A.G. Barbour, B.I. Restrepo // Emerg. Infect. Dis. 2000. - V. 6. - P. 449-457.

23. Barraud, N. Involvement of nitric oxide in biofilm dispersal of Pseudomonas aeruginosa / N. Barraud, DJ. Hassett, S.H. Hwang et al. H J. Bacteriol. — 2006.-V. 188.-N. 21.-P. 7344-7353.

24. Bjarnsholt, T. Pseudomonas aeruginosa tolerance to tobramycin, hydrogen peroxide and polymorphonuclear leukocytes is quorum-sensing dependent / T. Bjarnsholt, P.O. Jensen, M. Burmolle et al. //Microbiology. -2005. Y. 151.-N. 2.-P. 373-383.

25. Bjarnsholt, T. Quorum sénsing arid virulence of Pseudomonas aeruginosa during lung infection of cystic fibrosis patients / T. Bjarnsholt, P.0. Jensen, T.H. Jakobsen et al. H PLoS One. 2010. - V. 5. - N. 4. - elOl 15.

26. Bjedov, I. Stress-induced mutagenesis in bacteria /1. Bjedov, O. Tenaillon, B. Gérard et al. II Science. V. 300. - N. 5624. - P. 1404-1409.

27. Black, D.S. Autoregulation of hip, an operon that affects lethality due to inhibition of peptidoglycan or DNA synthesis / D.S. Black, B. Irwin, H.S. Moyed// J. Bacteriol.- 1994.-V. 176.-N. 13.-P. 4081-4091.

28. Blaser, M.J. Bacterial polymorphisms and disease in humans / M.J. Blaser, J.M. Musser//J. Clin. Invest.-2001. -V. 107. -N. 4. -P. 391-392.

29. Blázquez, J. Hypermutation as a factor contributing to the acquisition of antimicrobial resistance // Clin. Infect. Dis. 2003. - V. 37. - N. 9. - P. 1201-1209.

30. Blazques, J. PBP3 inhibition elicits adaptive responses in Pseudomonas aeruginosa / J. Blázquez, J.M. Gómez-Gómez, A. Oliver // Mol. Microbiol. 2006. - V. 62. - N. 1. - P. 84—99.

31. Boe, L. The frequency of mutators in populations of Escherichia coli / L. Boe, M. Danielsen, S. Knudsen et al. II Mutat Res. 2000. -V. 448. -N. l.-P. 47-55.

32. Boles, B.R. Endogenous oxidative stress produces diversity and adaptability in biofilm communities / B.R. Boles, P.K. Singh // PNAS. 2008. - V. 105. -N. 34.-P. 12503-12508.

33. Boles, B.R. Self-generated diversity produces "insurance effects" in biofilm communities / B.R. Boles, M. Thoendel, P.K. Singh // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2004. - V. 101.-N. 47.-P. 16630-16635.

34. Borriello, G. Oxygen limitation contributes to antibiotic tolerance of Pseudomonas aeruginosa in biofilms / G. Borriello, E. Werner, F. Roe et al. II Antimicrob. Agents Chemother. 2004. - V. 48. - N. 7. - P.2659-2664.

35. Bossi, L. Prophage contribution to bacterial population dynamics / L. Bossi, J.A. Fuentes, G. Mora, N. Figueroa-Bossi // J. Bacteriol. -2003. V. 185. -N. 21.-P. 6467-6471.

36. Brockhurst, M.A. The effect of a bacteriophage on diversification of the, opportunistic pathogen, Pseudomonas aeruginosa / M. A. Brockhurst, A.

37. Bucling, P.B. Rainey // Proc. Biol. Sei. 2005. - V. 272. - N. 1570. - P. 1385-1391.

38. Brooun, A. Dose-response study of antibiotic resitance in Pseudomonas aeruginosa biofilms / A. Brooun, S. Liu, K.A. Lewis // Antimicrob. Agents Chemother. 2000. - V. 44. - N. 3. - P. 640-646.

39. Brosh, R.M. A partially functional DNA helicase II mutant defective in forming stable binary complexes with ATP and DNA / R.M. Brosh, S.W. Matson // J. Biol. Chem. 1996. - V. 41. - P. 25360-25368.

40. Brown, E. W. Three R's of bacterial evolution: How replication, repair, and recombination frame the origin of species / E.W. Brown, J.E. LeClerc, M.L. Kotewicz et al.1 I Environ. Mol. Mutagen. 2001. - V. 38. - N. 2-3. - P. 248-260.

41. Brown, E.W. Phylogenetic evidence for horizontal transfer of mutS alleles among naturally occurring Escherichia coli strains / E.W. Brown, J.E. LeClerc, B. Li et al. // J. Bacteriol. 2001. - V. 183. - N. 5. - P. 1631— 1644.

42. Burbulys, D. Initiation of sporulation in Bacillus subtilis is controlled by a multicomponent phosphorelay / D. Burbulys, K.A. Trach, J.A. Hoch // Cell. 1991. -V. 64. -N. 3. - P. 545-52.

43. Caiazza, N.C. Rhamnolipids Modulate Swarming Motility Patterns of Pseudomonas aeruginosa / N.C. Caiazza, R.M.Q. Shanks, G.A. O'Toole // J. Bacteriol. -2005. -V. 187. -N. 21. -N. 7351-7361.

44. Cairns, J. The origin of mutants / J. Cairns, J. Overbaugh, S. Miller // Nature. -1988. -V. 335. -N.6186. P. 142-145.

45. Carter, I.W.J. PCR for Clinical Microbiology: an Australian and International Perspective / Eds. I.W.J. Carter, M. Schuller, G.S. James et al.. New York: Springer: 2010. 438 p.

46. Chao, L. Competition between high and low mutating strains of Escherichia coli / L. Chao, E.C. Cox // Evolution. 1983. - N. 37. - P. 125-134.

47. Chattopadhyaya, S. High frequency of hotspot mutations in core genes of Escherichia coli due to short-term positive selection / S. Chattopadhyaya, S. J. Weissmanb, V. Mininc et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. - V. 106.-N. 30.-P. 12412-12417.

48. Chia, N. A collective mechanism for phase variation in biofilms / N. Chia, C. Woese, N. Goldenfeld II Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2008. V. 105. -N. 38.-P. 14597-14602.

49. Chung, J.D. Gene expression in single cells of Bacillus subtilis: evidence that a threshold mechanism controls the initiation of sporulation / J.D. Chung, G. Stephanopoulos, K. Ireton, A.D. Grossman // J. Bacteriol. 1994. -V. 176.-N. 7.-P. 1977-1984.

50. Chuang, J.H. Functional bias and spatial organization of genes in mutational hot and cold regions in the human genome / J.H. Chuang, H.Li // PLoS Biol. -2004.-V. 2.-N. 2. e29.

51. Conibear, T.C.R. Role of mutation in Pseudomonas aeruginosa biofilm development / T.C.R. Conibear, S.L. Collins, J.S. Webb // PLoS One. -2009. V. 4. - N. 7. - e6289.

52. Cornelis P. Pseudomonas: genomics and molecular biology // Belgium: Caister Academic Press. 2008. - 244 p.

53. Costerton, J.W. Microbial biofilms / J.W. Costerton, Z. Lewandowski, D.E. Caldwell et al. H Annu. Rev. Microbiol. 1995. - V. 49. - P. 711- 745.

54. Court, D. L. A new look at bacteriophage genetic networks / D.L. Court, A. B. Oppenheim, S.L. Adhya // J. Bacteriol. 2007. - V. 189. -N. 2. - P. 298-304. . . .

55. Culham, D.E. An Escherichia coli reference collection group B2- and uropathogen-associated polymorphism in the rpoS-mutS region of the E. coli chromosome / D.E. Culham, J.M. Wood // J. Bacteriol. 2000. - V. 182. -N. 21. — P. 6272-6276.

56. Cuny, C. Investigation of the first events leading to loss of culturability during Escherichia coli starvation / C. Cuny, L. Dukan, L. Fraysse et al. II J. Bacteriol. 2005. - V. 187. - N. 7. - P. 2244-2248.

57. Davey, H.M. Flow cytometry and cell sorting of heterogeneous microbial populations: the importance of single-cell analyses / H.M.Davey, D.B. Kell // Microbiol. Rev. -1996. -V. 60. N. 4. - P. 641-696.

58. Davey, H.M. Using flow cytometry to quantify microbial heterogeneity / H.M. Davey, M.K. Winson // Curr. Issues Mol. Biol. 2003. - V. 5. - P. 915.

59. Dekimpe, V. Revisiting1 the 'quorum-sensing hierarchy in Pseudomonasaeruginosa: the transcriptional regulator RhlR regulates LasR-specificifactors / V. Dekimpe, E. Deziel // Microbiology. 2009. - V. 155. - N. 3. L1. P. 712-723. |

60. Denamur, E. Evolution of mutation rates in bacteria / E. Denamur, I. Matic // Mol. Microbiol. 2006. - V. 60. - P. 820-827.

61. Denamur, E. Evolutionary implications of the frequent horizontal transfer of mismatch repair genes // E. Denamur, G. Lecointre, P. Darlu et at. // Cell. -2000. —V. 103.-N. 5.-P. 711-721.

62. Denamur, E. High frequency of mutator strains among human uropathogenic Escherichia coli isolates / E. Denamur, S. Bonacorsi, A. Giraud et at. // J. Bacteriol. 2002. - V. 184. - N. 2. - P. 605-609.

63. Denamur, E. Intermediate mutation frequencies favor evolution of multidrug resistance in Escherichia coli / E. Denamur, O. Tenaillon, C. Deschamps // Genetics. 2005. - V. 171. - N. 2. - P. 825-827.

64. Denervaud, V. Characterization of cell-to-cell signaling-deficient Pseudomonas aeruginosa strains colonizing intubated patients / V. Denervaud, P. TuQuoc, D. Blanc et at. // J. Clin. Microbiol. 2004. - V. 42.-N. 2.-P. 554-562.

65. Desper, R. Fast and accurate phylogeny reconstruction algorithms based on the minimum-evolution principle / R. Desper, O. Gascuel // J. Comput. Biol. 2002. - V. 9. - N. 5. - P. 687-705.

66. Dobrindt, U. Analysis of genome plasticityin pathogenic and commensal Escherichia coli isolates by use of DNA arrays / U. Dobrindt, F. Agerer, K. Michaelis etat. // J. Bacteriol. 2003.-V. 185.-N. 6.-P. 1831-1840.

67. Doebeli, M. Adaptive dynamics of speciation: spatial structure / M. Doebeli, U. Dieckmann. In:Adaptive Speciation, eds. U. Dieckmann, M. Doebeli, J. A.J. Metz et al.. Cambridge University Press. 2004. - P. 140-167.

68. Drake, J.W. A constant rate of spontaneous mutation in DNA-based microbes //Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1991. -V. 88. -N. 16. - P. 7160-, 7164.

69. Drake, J.W. Spontaneous mutations //.:Annu. Rev. Genet. — 1991. -V. 25. ! P. 125-140.

70. Drake, J.W. The distribution of rates of spontaneous mutation over viruses, prokaryotes, and eukaryotes // Ann. N.Y. Acad. Sei. 1999. - V. 870. -P. 100-107.

71. Driffield, K. Increased mutability of Pseudomonas aeruginosa in biofilms / K. Driffield, K. Miller, J. M. Bostock et al. II J. Antimicrob. Chemother. -2008.-V. 61.-N. 5.-P. 1053-1056.

72. Dubnau, D. Bistability in bacteria / D. Dubnau, R. Losick // Mol. Microbiol. 2006. -V. 61. -N. 3. - P. 564-557.

73. Dubnau, D. DNA uptake in bacteria // Annu. Rev. Mcrobiol. 1999. - V. 53.-P. 217-244.

74. Eisen, J. A. A phylogenomic study of the MutS family of proteins // Nucleic Acids Res. 1998. - V. 26. - N. 18. - P. 4291-4300.

75. Fall, S. Horizontal gene transfer regulation in bacteria as a "spandrel" of DNA repair mechanisms / S. Fall, A. Mercier, F. Bertolla et al. II PLoS One. -2007. V. 2. - N. 10. - el055.

76. Feng, G. Depletion of the cellular amounts of the MutS and MutH methyl-directed mismatch repair proteins in stationary-phase Escherichia coli K-12 cells / G. Feng, H. C. Tsui, M. E. Winkler // J. Bacteriol. 1996. - V. 178. -N. 8.-P. 2388-2396.

77. Finkel, S.E. 2006. Long-term survival during stationary phase: evolution and the GASP phenotype II Nat. Rev. Microbiol. 2006. - V. 4. - N. 2. - P. 113-120.

78. Foster, P.L. Mechanisms of stationary phase mutation: a decade of adaptive mutation // Annu. Rev. Genet. 1999. - V. 33. - P. 57-88.

79. Foster, P.L. Stress responses and genetic variation in bacteria // Mutat. Res. -V. 569.-N. 1-2.-P. 3-11.

80. Friedberg, E.C. DNA repair and mutagenesis / E.C. Friedberg, G.C. Walker, W. Siede. Washington, D.C.: ASM Press. - 1995. 698 p.

81. Friedberg, E.C. Trading places: how do DNA polymerases switch during translesion DNA synthesis? / E. C. Friedberg, A. R. Leumann, R. P. Fuchs // Mol. Cell. -2005. -V. 18. -N. 5. -P. 499-505.

82. Funchain, P. Amplification of mutator cells in a population as a result of horizontal transfer // P. Funchain, A. Yeung, J. Stewart et al. // J. Bacteriol. -2001.-V. 183.-N. 12.-P. 3737-3741.

83. Fux, C.A. Chapter 11. The functional resistance of bacterial biofilms / C. A. Fux, P. Stoodley, M. Shirtliff. Antimicrobial Drug Resistance. Eds. Mayers D.L. New York: Humana Press. 2009. - P. 127.

84. Galhardo, R.S. DinB upregulation is the sole role of the SOS response in stress-induced mutagenesis in Escherichia coli / R.S. Galhardo, R. Do, M. Yamada etal. II Genetics. 2009. - V. 182. -N. 1. - P. 55-68.

85. Garrity G.M. Bergey's manual of systematic bacteriology. 2nd ed. / Eds. Brenner D.J., Garrity G.M., Krieg N.R., Staley J.T. New York: Springer, 2005. V. 2. 1388 p.

86. Gaur, A.H. The expanding spectrum of diseases caused by Bacillus cereus / A.H. Gaur, J.L. Shenep II Pediatr.Infect. Dis. J. 2001. - V. 20. - N. 5. - P. 533-534.

87. Gentry, D.R. Synthesis of the stationary phase sigma factor gs is positively regulated by ppGpp / D.R. Gentry, V.J. Hernandez, L.H. Nguyen et al. II J. Bacteriol. 1993. - V. 175. - N. 24. - P. 7982-7989.

88. Gerrish, P.J. The fate of competing beneficial mutations in an asexual population / P.J. Gerrish, R.E. Lenski // Genetica. 1998. -V. 102-103. -N. 1-6.-P. 127-144.

89. George, J.W. A dominant negative allele of the Escherichia coli uvrD gene encoding DNA helicase II a biochemical and genetic characterization / J.W. George, R.M. Brosh, S.W. Matson // J. Mol. Biol. 1994. - V. 235. - P. 1624.

90. Gibson, T.C. Fitness of an Escherichia coli mutator gene / T.C. Gibson, M. L. Scheppe, E.C. Cox // Science. 1970. -V. 169. -N. 946. - P. 686-688.

91. Gifford, G.D. Toxicity of hyperbaric oxygen to bacteria in relation to the cell cycle and catalase synthesis // J. Gen. Microbiol. 1968. - V. 52. - P. 375-379.

92. Giraud, A. Costs and benefits of high mutation rates: adaptive evolution of bacteria in the mouse gut / A. Giraud, I. Matic, O. Tenaillon et al. // Science. -2001. -V. 291. -N. 5513. P. 2606-2608.

93. Giraud, A. Mutator bacteria as a risk factor in treatment of infectious diseases / A. Giraud, I. Matic, M. Radman // Antimicrob. Agents Chemother. 2002. - V. 46. - N. 3. - P. 863- 865.

94. Giraud, A. The rise and fall of mutator bacteria / A. Giraud, M. Radman, I. Matic et al. I/ Curr. Opin. Microbiol. 2001. - V. 4. -N. 5. - P. 582-585.

95. Gonzalez-Pastor, J.E. Cannibalism by sporulating bacteria / J.E. GonzalezPastor, E.C. Hobbs, R. Losick// Science. -2003. -V. 301. P. 510-513.

96. Hallet, В. Playing Dr. Jekyll and Mr. Hyde: combined mechanisms of phase variation in bacteria // Curr. Opin. Microbiol. 2001. - V. 4. — N. 5. - P. 570-581.

97. Haagensen, J.A. Differentiation and distribution of colistin/SDS tolerant cells in Pseudomonas aeruginosa biofilms / J.A. Haagensen, M. Klausen, J. Ernst et al. II J. Bacteriol. 2006. - V. 189. - P. 28-37.

98. Habets, M.G.J.L. Spatial structure inhibits the rate of invasion of beneficial mutations in asexual populations / M.G.J.L. Habets, T. Czärän, R.F. Hoekstra et al. I/ Proc. Biol. Sei. 2007. - V. 274. - N. 1622. - P. 21392143.

99. Hamoen, L.W. Controlling competence in Bacillus subtilis: shared use of regulators / L.W. Hamoen, G. Venema, O.P. Kuipers // Microbiol. 2003. -Y. 149.-P. 9-17.

100. Hänninen, M.-L. Spontaneous mutation frequency and emergence of ciprofloxacin resistance in Campylobacter jejuni and Campylobacter coli / M.-L. Hänninen, M.J. Hannula //J. Antimicrob. Chemother. 2007. - V. 60. -N. 6.-P. 1251-1257.

101. Haußler, S. Biofilm formation by the small colony variant phenotype of Pseudomonas aeruginosa II Environ. Microbiol. 2004. - V. 6. - N. 6. - P. 546-551.

102. Hengge-Aronis, R. Back to log phase: as as a global regulator in the osmotic control of gene expression in Escherichia coli II Mol. Microbiol. 1996. — V. 21. —N. 5.-P. 887-893.

103. Henderson, I. Molecular switches: the on and off of bacterial phase variation /1. Henderson, P. Owen, J. Nataro // Mol. Microbiol. 1999. -V. 33. -N. 5.-P. 919-932.

104. Hernday, A. Self-perpetuating epigenetic pili switches in bacteria / A. Hernday, M. Krabbe, B. Braaten et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA.2002. V. 99. - N. 4. - P. 16470-16476.

105. Hill, W.G. The effect of linkage on the limits to artificial selection / W.G. Hill, A. Robertson // Genet.Res. 1966. - V. 8. - N. 3. - P. 269-294.

106. Miralles, R. Clonal interference and the evolution of RNA viruses / R. Miralles, P.J. Gerrish, A. Moya et al. II Science. -V. 285. N. 5434. - P. 1745-1747.

107. Hoenigsberg, H. Non-Darwinian and Darwinian prokaryotic and eukaryotic evolution an enigma in cell biology conservation // Genet. Mol. Res. —2003. -V. 2. -N. 3. P. 279-287.

108. Hogardt, M. Sequence variability and functional analysis of MutS of hypermutable Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates / M. Hogardt, S. Schubert, K. Adler et ah. II Int. J. Med. Microbiol. 2006. - V. 296. -N. 4-5.-P. 313-320.

109. Ho well-Adams, B. Molecular models accounting for the gene conversion reactions mediating gonococcal pili antigenic variation / B. Howell-Adams, H.S. Seifert // Mol. Microbiol. 2000. - V. 37. - P. 1146-1158.

110. Hughes, A.L. Pattern of nucleotide substitution at major histocompatibility complex class I loci reveals overdominant selection / A.L. Hughes, M. Nei // Nature. 1988. -V. 89. - P. 167-170.

111. Ingham, C.J. Population heterogeneity of Lactobacillus plantarum WCFS1 microcolonies in response to and recovery from acid stress / C.J. Ingham, M. Beerthuyzen, J. van Hylckama Vlieg // Appl. Environ. Microbiol. 2008. -V. 74. - N. 24. - P. 7750-7758.

112. Iyer, R. DNA mismatch repair: functions and mechanisms / R. R. Iyer, A. Pluciennik, V. Burdett et al. II Chem. Rev. 2006. - V. 2006. - P. 302323.

113. Janion, S. Some aspects of the SOS response system — A critical survey // Acta. Biochim. Pol. 2001. - V. 48. - N. 3. - P. 599-610.

114. Jatsenko, T. Molecular characteriazation of Rif mutations on Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas putida / T. Jatsenko, A. Tover, R. Tegova et al. // Mutat. Res. 2010. - V. 683. - N. 1-2.

115. Jishage, M. Regulation of RNA polymerase sigma subunit synthesis in Escherichia coli: intracellular levels of a70 and o38 / M. Jishage, A. Ishihama // J Bacteriol. 1996. - V. 178.-N. 18.-P. 5447-5451.

116. Johnson, T. Beneficial mutations, hitchhiking and the evolution of mutation rates in sexual populations // Proc. Biol. 1999. - 151. - P. 1621-1631.

117. Johnson, T., The approach to mutation-selection balance in an infinite asexual population, and the evolution of mutation rates // Proc. Biol. Sei. -1999. -V. 266. P. 2389-2397.

118. Junop, M.S. In vitro and in vivo studies of MutS, MutL and MutH mutants: correlation of mismatch repair and DNA recombination / M.S. Junop, W. Yang, P. Funchain et al. H DNA Repair (Amst). 2003. - V. 2. - N. 4. - P. 387-405.

119. Kearns, D.B. Cell population heterogeneity during growth of Bacillus subtilis / D. B. Kearns, R.Losick // Genes Dev. 2005. - V. 19. - N. 24. - P. 3083-3094.

120. Kell, D.B. Quantifying heterogeneity: flow cytometry of bacterial cultures / D.B. Kell, H.M. Ryder, A.S. Kaprelyants et al. II Antonie. Van Leeuwenhoek. 1991.-V. 60.-N. 3-4.-P. 145-158.

121. Kenna, D.T. Hypermutability in environmental Pseudomonas aeruginosa and in populations causing pulmonary infection in individuals with cystic fibrosis / D.T. Kenna, C.J. Doherty, J. Foweraker et al. II Microbiology. -2007.-V. 153.-N. 6.-P. 1852-1859.

122. Keren, I. Specialized persister cells and the mechanism of multidrug tolerance in Escherichia coli /1. Keren, D. Shah, A. Spoering et al. II J. Bacteriol. 2004. - V. 186. - N. 24. - P. 8172-8180.

123. Kirisits, M.J, Characterization of colony morphology variants isolated from Pseudomonas aeruginosa biofilms / M.J. Kirisits, L. Prost, M. Starkey et al. //Appl. Environ. Microbiol. 2005. - V. 71. -N. 8. - P. 4809-4821.

124. Kirkup, B.C. Antibiotic-mediated antagonism leads to a bacterial game of rock-paper-scissors in vivo / B.C. Kirkup, M. Riley // Nature. 2004. - V. 428.-P. 412-414.

125. Kirov, S.M. Biofilm differentiation and' dispersal in mucoid Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis / S.M. Kirov, J.S. Webb, C.Y. O'may et al. II Microbiology. 2007. - V. 153. - N. 10. - P. 3264-3274.

126. Kivisaar, M. Stationary phase mutagenesis: mechanisms that accelerate adaptation of microbial populations under environmental stress // Environ. Microbiol.-2003.-V. 5.-N. 10.-P. 814-827.

127. Klausen, M. Biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa wild type, flagella and type IV pili mutants / M. Klausen, A. Hey dorn, P. Ragas et al. II Mol. Microbiol. 2003. - V. 48,- N. 6.- -P. 1511-1524.

128. Koh, K.S. Phenotypic diversification and adaptation of Serratia marcescens MG1 biofilm-derived morphotypes / K.S. Koh, K.W. Lam, M. Alhede et al. II J. Bacteriol.-2007.-V. 189.-N. l.-P. 119-130.

129. Köhler, T. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili / T. Köhler, L.K. Curty, F. Barja et al. II J. Bacteriol. -2000. -V. 182. -N. 21. -P. 5990-5996.

130. Kolodner, R. Biochemistry and genetics of eukariotic mismatch repair // Genes Dev. 1996. -V. 10. -N. 12. P. 1433-1442.

131. Koomey, M. Effects of RecA mutations on pilus antigenic variation and phase transitions in Neisseria gonorrhoeae / M. Koomey, E. Gotschlich, K. Robbins et al. I I Genetics. 1987. - V. 117. - N. 3. - P. 391-398.

132. Korona, R. Evidene for multiple adaptive peaks from populations of bacteria evolving in a structures habitat / R. Korona, C.H. Nakatsu, LJ. Forney et al. II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1994. - V. 91. - N. 19. - P. 9037-9041.

133. Kreft, J.U. Biofilms promote altruism // Microbiology. 2004. - V. 150. -N. 8.-P. 2751-2760.

134. Ku, S.C. Clinical and microbiological characteristics of bacteremia caused by Acinetobacter Iwoffii / S.C. Ku, P.R. Hsueh, P.C. Yang et al. II Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2000. - V. 19. - N. 7. - P. 501-505.

135. Kugelberg, E. Multiple pathways of selected gene amplification during adaptive mutation / E. Kugelberg, E. Kofoid, A.B. Reams et al. II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -2006. V.-103. -N. 46. - P. 17319-17324.

136. Kugelberg, E. The tandem inversion duplication in Salmonella enterica: selection drives unstable precursors to final mutation types / E. Kugelberg, E. Kofoid, D.I. Andersson et al. II Genetics. 2010. - V. 185. - N. 1. - P. 65-80.

137. Kuhar, I. Colicin-usage basal regulation of colicin K synthesis by the stressvalarmone ppGpp /1. Kuhar, J. P. van Putten, D. Zgur-Bertok et al. II Mol. Microbiol. -2001. -V. 41. -P. 207-216.

138. Kunkel, T.A. DNA mismatch repair / T.A. Kunkel, D. Erie // Annu. Rev. Biochem. -2005. — V. 74.-P. 681-710.

139. Labat, F. Mutator phenotype confers advantage in Escherichia coli / F. Labat, O. Pradillon, L. Garry et al. II FEMS Immunol. Med. Microbiol. -2005. -V. 44. -N. 3. P. 317-321.

140. Lappin-Scott, H.M. Microbial biofilms. 2nd ed. / H.M. Lappin-Scott, W.J. Costerton. Cambridge University Press. 2003. - 328 p.

141. Lechevallier, M.W. Enumeration and characterization of standard plate count bacteria in chlorinated and raw water suppliest / M.W. Lechevallier, R.J. Eidler, T.M. Evans // Appl. and Envir. Microbiology. 1980. - V. 40. -N. 5.-P. 922-930.

142. Lee I.S. The stationary-phase sigma factor gs (RpoS) is required for sustained acid tolerance response in virulent Salmonella typhimurum / I.S. Lee, J. Lin, J.K. Hall et al. H Mol. Microbiol. 1995. - V. 17. -N. 1. - P. 155-167.

143. Leigh, E.G. Natural selection and mutability // Am. Nat. 1970. - N. 104. -P. 301-305.

144. Leigh, Jr.E.G. The evolution of mutation rates // Genetics. 1973. - V. 73. -P. 1-18.

145. LeClerc, J.E. Detection of mutator subpopulation in Salmonalla typhimurum LT2 by reversion of his alleles // Mutat. Res. 1998. - V. 400. - P. 89-97.

146. LeClerc, J.E. High mutation frequencies among Escherichia coli and Salmonella pathogens / J.E. LeClerc, B. Li, W.L. Payne et al. H Mutat. Res. 1996. -N. 274. — P. 1208-1211.

147. LeClerc, J.E. Promiscuous origin of a chimeric sequence in the Escherichia coli 0157:H7 genome / J.E. LeClerc, B. Li, W. L. Payne et al. II J. Bacteriol. -1999. V. 181. - N. 24. - P. 7614-7617.

148. LeClerc, J.E. Pseudomonas survival strategies in cystic fibrosis / J.E. LeClerc, T.A. Cebula // Science. 2000. - V. 289. - N. 5478. - P. 391-392.

149. Lens P. Biofilms in medicine, industry and environmental biotechnology: characteristics, analysis and control / Eds. P. Lens, P. Stoodley, T. Mahony et al.. IWAPublishing. 2003. - 610 p.

150. Levasseur, A. The role of duplications in the evolution of genomes highlights the need for evolutionary based approaches in comparative genomics / A. Levasseur, P. Pontarotti // Biol. Direct. 2011. - V. 6. - N. 11.

151. Lewis, K. Persister cells and the riddle of biofilm survival // Biochemistry. — 2005. V. 70. - N. 2. - P. 267-274.

152. Li, B. Molecular analysis of mutS expression and mutation in natural isolates of pathogenic Escherichia coli / .B. Li, H. C. Tsui, J. E. LeClerc et al.~\ II Microbiology.-2003.-V. 149.-N. 5.-P. 1323-1331.

153. Li, Y. PhoU is a persistence switch involved in persister formation and tolerance to multiple antibiotics and stresses in Escherichia coli / Y. Li, Y. Zhang II Antimicrob. Agents Chemother. 2007. - V. 51. - N. 6. - P. 20922099.

154. Lin, Z. The origins and early evolution of DNA mismatch repair genesmultiple horizontal gene transfers and co-evolution / Z. Lin, M. Nei, H. Ma II Nucleic Acids Res. 2007. - V. 35. - N. 22. - P. 7591-7603.

155. Loeb A.L. Multiple mutations and cancer / A.L. Loeb, K.R. Loeb, J.P. Anderson // PNAS. V. 100. - N. 3. - P. 776-781.

156. Lujan, A.M. Quorum-sensing-deflcient (lasR) mutants emerge at high frequency from a Pseudomonas aeruginosa mutS strain / A. M. Lujan, A. J. Moyano, I. Segura et al. // Microbiology. 2007. - V. 153. - N. 1. - P. 225-237.

157. Lynch, M. The cellular, developmental and population-genetic determinants of mutation-rate evolution // Genetics. 2008. - V. 180. - P. 933-943.

158. Maha, T.C. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents / T.C. Maha, G.A. O'Toole // Trends Microbiol. 2001. - V. 9. - N. 1. - P. 34-39.

159. Majewski, J. Barriers to genetic exchange between bacterial species: Streptococcus pneumoniae transformation / J. Majewski, P. Zawadzki, P. Pikerill et aL. II J. Bacteriol. 2000. - V. 182.-N. 4.-P. 1016-1023.

160. Mao, E.F. Proliferation of mutator in cell populations / E.F. Mao, L.Lane, J. Lee et al. II J. Bacteriol. 1997. -V. 179. - P. 417-422.

161. Marri, P.R. The role of laterally transferres genes in adaptive evolution / P.R. Marri, W. Hao, G.B. Golding // BMC Evol. Biol. 2007. -V. 7. -N. 1.-S8.

162. Martinez, J.L. Mutation frequence and antibiotic resistance/ J.L. Martinez, F. Baquero // Antimicrob. Agents Chemother. 2000. - V. 44. - N. 7. - P. 1771-1777.

163. Matic, I. Highly variable mutation rates in commensal and pathogenic Escherichia coli /1. Matic, M. Radman // Science. 1997. - V. 277. - N. 5333.-P. 1833-1834.

164. Matic, I. Interspecies gene exchange in bacteria: the role of SOS and mismatch repair systems in evolution of species /1. Matic, C. Rayssiguier, M. Radman// Cell. 1995. -N. 80. - P. 507-517.

165. Massey, R.C. Phenotypic switching of antibiotic resistance circumvents permanent costs in Staphylococcus aureus / R.C. Massey, A. Buckling, S.J. Peacock//Curr Biol. -2001. -V. 11.-N. 22.-P. 1810-1814.

166. McCann, K.S. The diversity-stability debate // Nature. 2000. -V. 405. - P. 228-233.

167. McKenzie, GJ. The SOS response regulates adaptive mutation / G.J. McKenzie, R.S. Harris, P.L. Lee et al. II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -2000. V. 97. - N. 12. - P. 6646-6651.

168. McKnight, S.L. The Pseudomonas quinolone signal regulates rhl quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa / S.L. McKnight, B.H. Iglewski, E.C. Pesci // J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - N. 10. - P. 2702-2708.

169. Medigue, C. Evidence for horizontal gene transfer in Escherichia coli speciation / C. Medigue, T. Rouxel, J. Vigier et al. II J. Mol. Biol. 1991. - V. 222. - N. 4. - P. 851-856.

170. Meier, P. Impact of mutS inactivation on foreign DNA acquisition by natural transformation in Pseudomonas stutzeri / P. Meier, W. Wackernagel // J. Bacteriol.-2005.-V. 187.-N. l.-P. 143-154.

171. Mena, A. Genetic adaptation of Pseudomonas aeruginosa to the airways of cystic fibrosis patients is catalyzed by hypermutation / A. Mena, E.E. Smith, J.L. Burns et al. II J. Bacteriol. - 2008. -V. 190. - N. 24. - P. 7910-7917.

172. Merritt, J.H. Growing and analyzing static biofilms/ J.H. Merritt, D.E. Kadouri, G.A. O'Toole // Current Protocols in Microbiology. 2nd ed. Eds. Coico R. New York: John Wiley & Sons, Inc., 2005. 1B.1.1-1B.1.17.

173. Miller, C. SOS response induction by beta-lactams and bacterial defense against antibiotic lethality / C. Miller, L.E. Thomsen, C. Gaggero // Science. -2004. -V. 305. -N. 5690. P. 1629-1631.

174. Miller, J.H. Spontaneous mutator in bacteria: Insights into pathways of mutagenesis and repair // Annu. Rev. Microbiol. — 1996. — N. 50. — P. 625— 643.

175. Modrich, P. Mismatch repair in replication fidelity, genetic recombination, and cancer biology / P. Modrich, R. Lahue // Annu. Rev. Biochem. 1996. — V. 65.-P. 101-33.

176. Montanari, S. Biological cost of hypermutation in Pseudomonas aeruginosa strains from patients with cystic fibrosis / S. Montanari, A. Oliver, P. Salerno etal.ll Microbiology. 2007. - V. 153.-N.5.-P. 1445-1454.

177. Moore, L.E. In vitro study of the effect of cationic biocides on bacterial population dynamics and susceptibility / L.E. Moore, R.G. Ledder, P. Gilbert et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2008. - V. 74. - N. 15. - P. 4825-4834.

178. Moxon, E.R. Adaptive evolution of highly mutable loci in pathogenic bacteria / E.R. Moxon, P.B. Rainey, M. Nowak et al. // Curr. Biol. 1994. - V. 4. - N. 1. - P. 24-33. (1994).

179. Mulec, J. A cka-gfp fusion reveals that the colicin K activity gene is induced in only 3 percent of the population / J. Mulec, Z. Podlesek, P. Mrak et al. II J. Bacteriol. 2003. - V. 185. - P. 654-659.

180. Negri, M.-C. Very low cefotaxime concentrations select for hypermutable Streptococcus pneumoniae populations / M.-C. Negri, M.-I. Morosini, M.-R. Baquero et al. II Antimicrob. Agents Chemother. 2002. - V. 46. - N. 2. -P. 528-530.

181. Notley-McRobba, L. Enrichment and elimination of mutY mutators in Escherichia coli populations / L. Notley-McRobb, S. Seeto, T. Ferenci // Genetics.-2002.-V. 162.-N.3.-P. 1055-1062.

182. Novick, A. Enzyme induction as an all-or-none phenomenon /A. Novick, M. Weiner //Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1957. -V. 43. -N. 7. - P. 553-566.

183. Nyc, O. Stenotrophomonas maltophilia: Significant contemporary hospital pathogen review / O. Nyc, J. Matejkovä // Folia Microbiol. (Praha). — 2010.-V. 55.-N. 3. P. 286-294., . - .

184. Ochman, H. Calibrating bacterial evolution / H. Ochman, S. Elwyn, N.A. Moran // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1999. - V. 96. - N. 22. - P. 1263812643.

185. Ochman, H. Evolution in bacteria: evidence for a universal substitution rate in cellular genomes / H. Ochman, A.S. Wilson // J. Mol. Evol. 1987. - V. 26.-N. 1-2.-P. 74-86.

186. O'gara, J. P. Staphylococcus epidermidis biofilms: importance and implications / J. P. O'gara, H. Humphreys // J. Med. Microbiol. 2001. - V. 50.-N. 7.-P. 582-587.

187. Ohmori H. The Y-family of DNA polymerases / E.C. Friedberg, R.P. Fuchs, M.F. Goodman et at. II Molecular Cell. 2001. - V.8. -N.l. - P.7-8.

188. Oliveira, M. Antimicrobial resistance and in vitro biofilm-forming ability of enterococci from intensive and extensive farming broilers / M. Oliveira, V. Santos, A. Fernandes et al. II Poult. Sei. 2010. - V. 89. - N. 5. - P. 1065-1069.

189. Oliver, A. Characterization of the GO system of Pseudomonas aeruginosa II FEMS Microbiol. Lett. -2002. -V. 217. -N. 1. P. 31-35.

190. Oliver, A. High frequency of hypermutable Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis lung infection / A. Oliver, R. Canton, P.Campo et al. 11 Science. 2000. - V. 288. - P. 1251-1253.

191. Oliver, A. The mismatch repair system (mutS, mutL and uvrD genes) in Pseudomonas aeruginosa molecular charachterization of naturally occurring mutants / A. Oliver., F. Baquero, J. Blazquez // Mol. Microbiol. 2002. - V. 43.-N. 6.-P. 1641-1650.

192. O'Neill, A.J. Lack of evidence for involvement of hypermutability in emergence of vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus / A.J. O'Neill, I. Chopra I I Antimicrob. Agents Chemother. 2003. - V. 47. - N. 4. -P. 1484-1485.

193. Orlen, H. Weak mutators can drive the evolution of fluoroquinolone resistance in Escherichia coli / H. Orlen, D. Hughes // Antimicrob. Agents Chemother. 2006. - V. 50. - N. 10. - P. 3454-3456.

194. Patriquin, G.M. Influence of quorum sensing and iron on twitching motility and biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa / G.M. Patriquin, E. Banin, C. Gilmour et al. II J. Bacteriol. 2008. - V. 190. - N. 2. - P. 662671.

195. Perfeito, L. The effect of spatial structure on adaptation in Escherichia coli / L. Perfeito, M.I. Pereira, P.R. Campos et al. II Biol. Lett. 2008. - V. 4. -N. l.-P. 57-59.

196. Pettersson, M.E. The amplification model for adaptive mutation — simulations and analysis / M.E. Pettersson, D.I. Andersson, J.R. Roth et al.~\ //Genetics.-2005.— V. 169.-N. 2.— P. 1105-1115.

197. Philippe, N. Evolution of global regulatory networks during a long-term experiment with Escherichia coli / N. Philippe, E. Crozat, R.E. Lenski, et al. II Bioessays. 2007. - V. 29. - N. 9. - P. 846-860.

198. Pinzon, N.M. Improved detection of rhamnolipid production using agar plates containing methylene blue and cetyltrimethylammoniumbromide / N.M. Pinzon, L.K. Ju II Biotechnol. Lett. 2009. - V. 31. - N. 10. - P. 1583-1588.

199. Radman, M. Evolution-driving genes / M. Radman, F. Taddei, I. Matic // Res. Microbiol. — 2000. V. 151. - P. 91—95.

200. Rainey, P.B. Adaptive radiation in a heterogeneous environment / P.B. Rainey, M. Travisano II Nature. 1998. - V. 394. - N. 6688. - P. 69-72.

201. Rando, O. Timescales of genetic and epigenetic inheritance / O. Rando, K. Verstrepen // Cell. V. 128, - N. 4. - P. 655-668.

202. Ratien, F. Cystic fibrosis / F. Ratjen, G. Döring // Lancet. 2003. - V. 361. -N. 9358.-P. 681-689.

203. Rayssiguier, C. The barrier to recombination between Escherichia coli and Salmonella typhimurum disrupted in mismatch-repair mutants / C. Rayssiguier, D.S. Thaler, M. Radman II Nature. 1989. - N. 342. - P. 396401.

204. Reams, A.B. Duplication frequency in a population of Salmonella enterica rapidly approaches steajdy state with or without recombination / A.B. Reams, E. Kofoid, M. Savageau et al. // Genetics. 2010. - V. 184. - N. 4. - P. 1077-1094.

205. Reid, S.D. Parallel evolution of virulence in pathogenic Escherichia coli / S, D. Reid, C.J. Herbelin, A.C. Bumbaugh et al. II Nature. 2000. - V. 406. -N. 6791.-N. 64-67. ■ ■•■.■ -■■■•■

206. Richardson, A.R. Mismatch repair and the regulation of phase variation in Neisseria meningitidis / A.R. Richardson, I. Stojiljkovic // Mol. Microbiol. — 2001.-V. 40.-P. 645-655.

207. Richardson, A.R. Mutator clones of Neisseria meningitidis in epidemic serogroup A disease / A.R. Richardson, Z. Yu, T. Popovic \et a/. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - V. 99. -N. 9. - P. 6103-6107.

208. Rodríguez-Rojas, A. The Pseudomonas aeruginosa pfpl gene plays an antimutator role and provides general stress protection / A. Rodríguez-Rojas, J. Blázquez // J. Bacteriol. 2009. - V. 191. - N. 3. - P. 844-850.

209. Romero, C. Improved method for purification of bacterial DNA from bovine milk for detection of Brucella spp. by PCR / C. Romero, I. Lopez-Goñi // Appl. -Environ. Microbiol. 1999. - V. 65. - N. 8. - P. 3735-3737.

210. Roche, R.J. Phenotypic variation of carbohydrate surface antigens and the pathogenesis of Haemophilus influenzae infections / R.J. Roche, E.R. Moxon // Trends Microbiol. 1995. - V. 3. - P. 304-309.

211. Rosche, W.A. Determining mutation rates in bacterial populations / W.A. Rosche, P.L. Foster // Methods. —2000. V. 20. - N. 1. - P. 4-17.

212. Rosenberg, S.M. Adaptive point mutation and adaptive amplification pathways in the Escherichia coli Lac system: stress responses producing genetic change / S.M. Rosenberg, P.J. Hastings 11 J. Bacteriol. 2004. -V. 186.-15.-P. 4838-4843.

213. Rosenberg, S.M. Transient and heritable mutators in adaptive evolution in the lab and in nature / S.M. Rosenberg, C. Thulin, R.S. Harrisa // Genetics. -1998.-V. 148.-N. 4.-P. 1559-1566.

214. Rossignol, G. Phenotypic variation in the Pseudomonas fluorescens clinical strain MFN1032 / G. Rossignol, D. Sperandio, J. Guerillon et al. II Res. Microbiol. 2009. - V. 160. - N. 5. - P. 337-344.

215. Roth, J.R. Origin of mutations under selection: the adaptive mutation controversy / J.R. Roth, E. Kugelberg, A.B. Reams et al. // Annu. Rev. Microbiol. -2006. -V. 60. -P. 477-501.

216. Saitou, K. Biofilm formation abilities and disinfectant-resistance of Pseudomonas aeruginosa isolated from cockroaches captured in hospitals / K. Saitou, K. Furuhata, Y. Kawakami et al. II Biocontrol. Sei. 2009. - V. 14.-N. 2.-P. 65-68.

217. Sandoz, K.M. Social cheating in Pseudomonas aeruginosa quorum sensing //PNAS. -2007. V. 104.-N. 40.-P. 15876-15881.

218. Sauer, K. Pseudomonas aeruginosa displays multiple phenotypes during development as a biofilm / K. Sauer, A.K. Camper, G.D. Ehrlich et al. II J. Bacteriol.-2002.- V. 184.-N. 4.-P. 1140-1154.

219. Schaaff, F. An elevated mutation frequency favors development of vancomycin resistance in Staphylococcus aureus / F. Schaaff, A. Reipert, G. Bierbaum // Antimicrob. Agents Chemother. 2002. - V. 46. - N. 11. - P. 3540-3548.

220. Schaber, J.A. Diversity of biofilms produced by quorum-sensing-deficient clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa / J.A. Schaber, A. Hammond, N.L. Carty et al. IIJ. Med. Microbiol. 2007. - V. 56. - P. 738-748.

221. Scher, K. Effect of heat, acidification, and chlorination on Salmonella enterica serovar Typhimurium cells in a biofilm formed at the air-liquid interface / K. Scher, U. Romling, S. Yaron // Appl. Environ. Microbiol. -2005.-V. 71.-N. 3.-P. 1163-1168.

222. Seifert, H. DNA transformation leads to pilin antigenic variation in Neisseria gonorrhoea / H. Seifert, R. Ajioka, C. Marchai et al. II Nature. -1988. V. 336. - N. 6197. - P.392-395.

223. Shehata, T.E. Influence of temperature on the growth of psychrophilic strains of Bacillus / T.E. Shehata,. A. Duran, E.B. Collins // J. Dairy Sei. -1971.-V. 54.-N. 11.-P. 1579-1582.

224. Sia, E.A. Genetic control of microsatellite stability / E.A. Sia, S. Jinks-Robertson, T.D. Petes II Mutat. Res. 1997. - V. 383. -N. 1. - P. 61-70.

225. Siegmund, I. New method for detecting rhamnolipids excreted by Pseudomonas species during growth on mineral agar // I. Siegmund, F. Wagner // Biotechnol. Tech. V. 5. - N. 4. - P. 265-268.

226. Sikorski, J. Adaptation and incipient sympatric speciation of Bacillus simplex under microclimatic contrast at "Evolution Canyons" I and II, Israel / J. Sikorski, E. Nevo // PNAS. 2005. - V. 102. - N. 44. - P. 1592415929.

227. Silverman, M.J. Phase variation in Salmonella: genetic analysis of a recombination switch / M. Silverman, J. Zieg, M. Hilmen, M. Somon // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1979. -V. 76. -N. P. 391-395.

228. Smith, B.T. Mutagenesis and more: umuDC and the Escherichia coli SOS response / B.T. Smith, G.C. Walker // Genetics. 1998. - V. 148. - N. 4. -P.1599-1610.

229. Smits, W.K. Phenotypic variation in bacteria: the role of feedback regulation / W.K. Smits, O.P. Kuipers, J.W. Veening II Nat. Rev. Microbiol. 2006. -V. 4.-P. 259-271.

230. Soberön-Chävez, G. Production of rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa / G. Soberon-Chävez, F. Lepine, E. Deziel // Appl. Microbiol. , Biotechnol.-2005.-V. 68.-N. 6.-P. 718-725.

231. Spoering, A.L. Biofilms and planctonic cells of Pseudomonas aeruginosa have similar resistance to killing by antimicrobials / A.L. Spoering, K. Lewis II J. Bacteriol. 2001. - V. 183. - P. 6746-6751.

232. Steinmoen, H. Competence-induced cells of Streptococcus pneumoniae lyse competence-deficient cells of the same strain during cocultivation / H. Steinmoen, A. Teigen, L.S. Hävarstein, // J. Bacteriol. 2003. - V. 185. - P. 7176-7183.

233. Steinmoen, H. Induction of natural competence in Streptococcus pneumoniae triggers lysis and DNA release from a subtraction of the cell population / H. Steinmoen, E. Knutsen, S. Havarstein // PNAS. 2002. - V. 99.-N. 11.-P. 7681-7686.

234. Stewart, E.J. Aging and death in an organism that reproduces by morphologically symmetric division // E.J. Stewart, R. Madden, G. Paul et al. II PLoS Biol. 2005. - V. 3. - N. 2. - e45.

235. Stewart, P.S. Physiological heterogeneity in biofilms / P.S. Stewart, M.J. Franklin // Nat. Rev. Microbiol. 2008. - V. 6. - P. 199-210.

236. Streisinger, G. Frameshift mutations and the genetic code / G. Streisinger, Y. Okada, J. Emrich et al. II Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1966. -V. 31.-P. 77-84.

237. Sutton, M.D. Managing DNA polymerases: coordinating DNA replication, DNA repair, and DNA recombination / M.D. Sutton, G.C. Walker // Proc. Natl, Acad. Sei.USA.-2001.-V. 98.-N. 15.-P. 8342-8349.

238. Szekely, E. DNA sequence adjacent to flagellar genes and evolution of flagellar-phase variation / E. Szekely, M. Simon // J. Bacteriol. 1983. -V. 155.-N. l.-P. 74-81.

239. Taddei, F. cAMP-dependent SOS induction and mutagenesis in resting bacterial populations / F. Taddei, I. Matic, M. Radman // Proc. Natl. Acad. J Sei. USA. -1995. V. 92. - N. 25. - P. 11736-11740.., ih i

240. Taddei, F. Role of mutator alleles in adaptive evolution / F. Taddei, M. Radman, J. Maynard-Smith et al. //Nature. 1997. -N. 19. -P.700-702.

241. Tegova, R. Involvement of error-prone polymerase IV in stationary-phase mutagenesis in Pseudomonas putida / R. Tegova, A. Tover, K. Tarassova et al. I I J- Bacteriol. 2004. - V. 186. - N. 9. - P. 2735-2744.

242. Townsend, J.P. Horizontal acquisition of divergent chromosomal DNA in bacteria: effects of mutator phenotypes / J.P. Townsend, K.M. Nielsen, D.S. Fisher, D.L. Hartl//Genetics.-2003.-V. 164.-N. 1.-P. 13-21.

243. Tröbner, W. Competition growth between Escherichia coli mutL and mut+ in.continuously growing cultures / W. Tröbner, R. Piechocki II Z. Allg. Mikrobiol. -1981. -V. 21. -N. 4. P. 347-349.

244. Tröbner, W. Selection against hypermutability in Escherichia coli during long term evolution / W. Tröbner, R. Piechocki // Mol. Gen. Genet. 1984. -V. 198.-N. l.-P. 177-178.

245. Tsui, H.T. Negative regulation of mutS and mutH repair gene expression by the Hfq and RpoS global regulators of Escherichia coli Kl 2 / H.T. Tsui, G. Feng, M.E. Winkler // J. Bacteriol. -1997. -V. 179. -N. 23. P. 74767487.

246. Turner, P.E. Tests of ecological mechanisms promoting the stable coexistence of two bacterial genotypes / P.E. Turner, V. Souza, R.E. Lenski // Ecology. 1996. - V. 77. - P. 2119-2129.

247. Turrientes, M.C. Polymorphic mutation frequencies of clinical and environmental Stenotrophomonas maltophilia populations / M.C. Turrientes,

248. M.R. Baquero, M.B. Sanchez et al. // Appl. Environ. Microbiol- 2010. -V. 76.-P. 1746-1758.

249. Walsh, C. Antibiotics: actions, origins, resistance / C. Walsh, J. Träger, p-Courvalin et al.. Washington, DC: ASM Press. 2003. - 335 p.

250. Webb, J.S. Bacteriophage and phenotypic variation in Pseudomonas aeruginosa biofilm development / J.S. Webb, M. Lau, S. Kjelleberg // J* Bacteriol.-2004.-V. 186.-N. 23.-P. 8066-8073.

251. Webb, J.S. Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofílm development / J.S. Webb, L.S. Thompson, S. James // J. Bacteriol. V. 185. - N. 15. - P. 4585-4592.

252. Wiegand, I. Mutator genes giving rise to decreased antibiotic susceptibility in Pseudomonas aeruginosa 71. Wiegand, A. K. Marr, E. B. Breidenstein et al. II Antimicrob. Agents Chemother. 2008. - V. 52. - N. 10. - P. 38103813.

253. Wilke, C.O. Evolution of digital organisms at high mutation rates leads to survival of the flattest / C.O. Wilke, L. Wang, C. Ofria et al. //Nature. -2001-V. 412.-P. 331-333. .

254. Witkin, E.M. Ultraviolet mutagenesis and the SOS response in Escherichia coli II Environ. Mol. Mutagen. 1989. - V. 16. -P. 30-34.

255. Wrande, M. Accumulation of mutants in "aging" bacterial colonies is due to growth under selection, not stress-induced mutagenesis / M. Wrande, J.R. Roth, D. Hughes // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2008. - V. 105. - N. 33. -P. 11863-11868.

256. Yachi, S. Biodiversity and ecosystem productivity in a fluctuating environment: the insurance hypothesis / S. Yachi, M. Loreau // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. V. 96. - P. 1463-1468.

257. Ysern, P. Induction of SOS genes in Escherichia coli and mutagenesis in Salmonella typhimurium by fluoroquinolones / P. Ysern, B. Clerch, M. Castaño, et al. II Mutagenesis. 1990. - V. 5. - N. 1. - P. 63-66.

258. Zawadzki P. The size and continuity of DNA segments integrated in Bacillus transformation / P. Zawadzki, F.M. Cohan // Genetics. 1995. - V. 141.-N. 4.-P. 1231-1243.

259. Zgur-bertok, D. Phenotypic heterogeneity in bacterial populations // Acta Agric. Slovenica. 2007. - V. 90. - N. 1. - P. 17-24.

Информация о работе

Магданова, Лариса Альбертовна
кандидата биологических наук
Пермь, 2011
ВАК 03.02.03

Диссертация

Дискретная гетерогенность популяций биопленкообразующих бактерий и обратимые изменения интенсивности мутагенеза - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы